Biotecnologia Aplicada A La Medicina - Jesús A. F.-Tresguerres - 349 Pag

ZZZPHGLOLEURVFRP
BIOTECNOLOGA APLICADA
A LA MEDICINA
Jess A. F.-Tresguerres
Catedrtico. Dpto. de Fisiologa
Fac. Medicina. Univ. Complutense. Madrid
Vicente Martnez Fernndez

Vctor Navas Serrano
Dpto. Mdico. Laboratorios Serono. Madrid
BIOTECNOLOGA APLICADA
A LA MEDICINA
ZZZPHGLOLEURVFRP
DIAZ DE SANTOS
Reservados todos los derechos.

No est permitida la reproduccin total o parcial de este libro,
ni su tratamiento informtico, ni la transmisin de ninguna
forma o por cualquier medio, ya sea electrnico, mecnico
por fotocopia, por registro u otros mtodos, sin el permiso
previo y por escrito de los titulares del Copyright.
Jess A. F.-Tresguerres, 2003
Ediciones Daz de Santos, S. A.
Doa Juana I de Castilla, 22 28027 Madrid
Espaa
Internet: http://www.diazdesantos.es/ediciones
E-Mail: ediciones@diazdesantos.es
ISBN: 84-7978-543-8
Depsito legal: M. 43.358-2002
Diseo de cubierta: ngel Calvete
Fotocomposicin: FER, S. A.
Impresin: Edigrafos, S. A.
Encuadernacin: Rstica-Hilo
Impreso en Espaa
Directores
Jess A. F.-Tresguerres. Catedrtico.
Dpto. de Fisiologa. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid.
Vicente Martnez Fernndez. Dpto.

Mdico. Laboratorios Serono. Madrid.
Vctor Navas Serrano. Dpto. Mdico.
Laboratorios Serono. Madrid.
Autores
Elvira lvarez Garca. Dpto. Bioqumica. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid.
Jess Argente. Unidad de Endocrinologa Peditrica. Hospital del Nio
Jess. Madrid.
Enrique Blzquez Fernndez. Dpto.
Bioqumica y Biologa Molecular.
Facultad de Medicina. Universidad
Complutense. Madrid.
Antonio Campos del Olmo. Dpto.
Biotecnologa. Laboratorios Serono.
Trescantos. Madrid.
Jos Casatorres Hernndez. Dpto.
Biotenologa. Laboratorios Serono.
Trescantos. Madrid.
Julie Chowen. Unidad de Endocrinologa Peditrica. Hospital del Nio Jess.
Madrid.
Elena Cueva. Servicio de Bioqumica.
Hospital La Paz. Madrid.
Begoa Ezquieta. Serv. Bioqumica.

Hospital Gregorio Maran. Madrid.
Fco. Javier Fernndez. Servicio de
Bioqumica. Hospital La Paz. Madrid.
M.a Cruz Garca Martn. Dpto.
Bioqumica y Biologa Molecular. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid.
Josefa P. Garca-Ruiz. Dpto. Biologa
Molecular. Facultad de Ciencias. Universidad Autnoma. Madrid.
M.a Luisa Gaspar. Serv. Inmunologa.
C. N. Biologa Fundamental. Instituto
Salud Carlos III. Madrid.
Carlos Jariego. Servicio de Bioqumica. Hospital La Paz. Madrid.
M.a Jess Lorenzo-Benayas. Dpto.
Bioqumica Biologa Molecular y
Gentica. Facultad de Veterinaria.
Universidad de Extremadura. Cceres.
VIII
BIOTECNOLOGA APLICADA A LA MEDICINA
Alfredo Martnez Mogarra. Dpto.

Biotecnologa. Laboratorios Serono.
Trescantos. Madrid.
Isabel Roncero. Dpto. Bioqumica y

Biologa Molecular. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid.
David Martnez-Selva. Unidad de

Investigacin Biomdica. Hospital Materno Infantil Vall dHebron. Barcelona.
Juan Miguel Ruiz Albusac. Dpto.

Bioqumica y Biologa Molecular. Facultad de Medicina. Universidad
Oscar Martnez-Tirado. Unidad de

Investigacin Biomdica. Hospital Materno Infantil Vall dHebron. Barcelona.
Ruth Milln Gonzlez. Dpto. de Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid.
ngel Santos Ruiz. Dpto. Bioqumica y

Biologa Molecular. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid.
Pilar Santisteban. Instituto de Investigaciones Biomdicas. CSIC. Madrid.
Francina Munell. Unidad de Investigacin Biomdica. Hospital Materno

Infantil Vall dHebron. Barcelona.
Bernat Soria Escoms. Instituto de

Bioingeniera. Universidad Miguel
Hernndez. Elche. Alicante.
Toms Pino. Unidad de Investigacin

Biomdica. Hospital Materno Infantil
Vall dHebron. Barcelona.
Elena Vara. Dpto. Bioqumica y Biologa Molecular. Facultad de Medicina.

Universidad Complutense. Madrid.
Jos Regueiro. Dpto. Inmunologa.

Facultad de Medicina. Universidad
Jos Manuel Varela. Servicio de Bioqumica. Hospital La Paz. Madrid.
Jaume Revents. Unidad de Investigacin Biomdica. Hospital Materno

Infantil Vall dHebron. Barcelona.
Esther Velzquez Snchez. Dpto. Bioqumica y Biologa Molecular. Facultad

de Medicina. Universidad Complutense.
Madrid.
Presentacin
La biotecnologa es la ciencia que se ocupa de la utilizacin de procesos biolgicos ms o menos espontneos para obtener productos de inters industrial.
En realidad, es un proceso que viene utilizndose, desde la antigedad para elaborar una serie de alimentos que como el pan, el vino, la cerveza, el vinagre, el
yogur y el queso, forman parte de nuestro acervo alimentario, desde hace miles de
aos. No es, pues la biotecnologa una metodologa moderna.
Si lo es, sin embargo, el hecho de utilizar esas mismas tcnicas pero modificadas segn los avances aportados por la gentica molecular.
En 1944 Avery, McLeod y McCarty en la Universidad Rockefeller descubrieron
que la informacin gentica se albergaba en las molculas de ADN. Nueve aos ms
tarde Watson y Crick desentraaron la estructura de dicho compuesto, lo que abri
las puertas a la comprensin de los procesos de replicacin, transcripcin y traduccin del ADN y por ende a explicar el cdigo gentico.
A partir de ese momento, se introdujo la distincin entre el material gentico y
el producto de su expresin, conceptos que permanecieron implcitos en toda la biologa posterior.
En un corto periodo de tiempo, una nueva ciencia empez a desarrollarse,
pasando de la investigacin de una serie de sustancias proticas de inters biomdico al estudio de los mecanismos de su produccin y a las posibles alteraciones en
los mismos. Haba nacido la biologa molecular. La posibilidad de influir en los procesos de sntesis de las sustancias de inters teraputico a travs de las tcnicas de
ADN recombinante abra nuevas posibilidades de lavieja biotecnologa y la haca
brillar de nueva con luz propia hasta el punto que para muchos y de forma errnea
constitua un nuevo concepto.
Lo que s eran nuevos eran toda una serie de elementos que venan de la mano
de las nuevas tecnologas. La gentica molecular, conjuntamente con la terapia
gnica y la ingeniera gentica, formaban los tres pilares de la nueva biotecnologa.
Gentica molecular, con un inters clnico diagnstico e ingeniera gentica, con

una serie de productos muy importantes para la industria farmacutica y la teraputica se han desarrollado de manera espectacular, mientras la terapia gnica todava
est en sus comienzos, absolutamente experimentales.
Este libro es el resultado final de un curso sobre introduccin a la biotecnologa,
patrocinado por la Ctedra Serono de Avances de Medicina que tuvo lugar en la
Facultad de Medicina de la Universidad Complutense, en Noviembre de 2000.
En el mismo se pretende hacer una puesta al da de los conceptos bsicos de la
nueva biotecnologa para los profesionales biosanitarios, dada la importancia creciente que est adquiriendo esta ciencia. Como estos profesionales necesitan refrescar
y poner al da toda una serie de conocimientos, se realiza primeramente un repaso a
la bioqumica de los procesos que conducen a la sntesis proteica, con un breve recuerdo a las bases de la informacin gentica, con especial hincapi en el ADN y su replicacin, a la estructura del ARN, la traduccin del mensaje gentico y la regulacin del
mismo. sta parte es necesaria para entender el lenguaje del resto del contenido.
Para completar la primera parte del libro, hay un captulo sobre el reconocimiento de antgenos y los genes que los regulan, otro sobro oncogenes y genes
mutadores, otro sobre apptosis y su regulacin gnica y finalmente, uno sobre las
bases de la terapia gnica, que aunque en sus comienzos presenta grandes expectativas. Todos los autores de sta parte, son profesores de bioqumica y biologa molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense y de la
Universidad Autnoma de Madrid.
En la segunda gran parte del libro, se hace una introduccin a la biotecnologa.
Hay dos lecciones sobre ingeniera gentica y otras dos ms sobre la produccin
industrial de frmacos recombinantes. Estas lecciones estn escritas por los responsables de la planta de produccin de GH, por tcnicas de ADN recombinante en
clulas de mamferos de Laboratorios Serono, en Madrid, con sobrada experiencia
pesonal en los temas que tratan.
La tercera parte del libro aborda las bases moleculares de las enfermedades
endocrinas y abarca, desde las tcnicas generales para crear ratones transgnicos o
KO (aquellos en los que se elimina selectivamente algn gen de su genoma) que
permiten la constatacin de las actividades potencialmente pleyotrpicas de los
mismos, a la descripcin individualizada de los aspectos genticos de una serie de
enfermedades endocrinas que comprenden desde las alteraciones del crecimiento a
la Hiperplasia Suprarrenal Congnita, la Diabetes Mellitus, los pseudohermafroditismos, las Neoplasias Endocrinas Mltiples (MEN) y el hipotiroidismo congnito.
Con todo ello, ste libro pretende ser el primero de una serie, que aborde las
bases moleculares de distintos tipos de enfermedades y que pueda suponer una
ayuda para todos aquellos que quieran profundizar en el mejor diagnstico y tratamiento de muchas de ellas.
Jess A. F.-Tresguerres
Vicente Martnez Fernndez
Vctor Navas Serrano
ndice
Autores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VII
Presentacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
IX
1. Concepto de informacin gentica. cidos nucleicos, estructura

del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
E. Blzquez Fernndez
Flujo de la informacin gnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

cidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
El ADN como molcula portadora de la informacin gentica . . . . . . .
La estructura tridimensional del ADN muestra una doble hlice con
cadenas complementarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Conformaciones del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Desenrrollamiento y superenrollamientos del ADN . . . . . . . . . . . . . . .
Aspectos estructurales y funcionales de la cromatina . . . . . . . . . . . . . .
Aspectos estructurales y funcionales del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ADN mitocondrial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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2. Replicacin del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

M.a C. Garca Martn
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Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Caractersticas generales de la replicacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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XII
Replicacin en procariotaes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1. Iniciacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2. Elongacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. Terminacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4. Regulacin de la replicacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Replicacin en eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Estructura de la cromatina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Papel de las polimerasas eucariticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Orgenes de replicacin en eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Replicacin en los extremos de los cromosomas lineales . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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3. Estructura y procesamiento del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

I. Roncero
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Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Estructura del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Estructura primaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Estructura secundaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Estructura terciaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Clases de ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Procesamiento del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ARN mensajero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Procesamiento del ARNm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Adicin del casquete 5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Adicin de la cola de poli(A) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Eliminacin de intrones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ARN de transferencia (ARNt) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Procesamiento del ARNt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ARN ribosmico (ARNr) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Procesamiento del ARNr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Transporte del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Degradacin del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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4. Mecanismo de la transcripcin: regulacin de la iniciacin . . . . . . .

A. Santos
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Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ARN polimerasas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Procariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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NDICE
XIII
Iniciacin: Promotores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Promotor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Procariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Regulacin de la iniciacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Procariotas: Factores m. Operacin lactosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Eucariotas: Regulacin de la expresin gnica por hormonas
tiroideas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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5. Sntesis de protenas: Traduccin y transporte . . . . . . . . . . . . . . . . .

E. lvarez Garca
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Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
El cdigo gentico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Activacin de los aminocidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Etapas de la sntesis de protenas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Iniciacin de la biosntesis de protenas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Elongacin de la biosntesis de protenas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Terminacin de la biosnesis de protenas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Antibiticos que inhiben la sntesis proteica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Destino y transporte de protenas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Importacin al ncleo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Importacin a las mitocondrias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Importacin al ER y distribucin desde el aparato de Golgi . . . . . . .
Importacin a los lisosomas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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6. Fundamentos de regulacin de la expresin gnica. Diferenciacin

celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
E. Velzquez Snchez y J. M. Ruz Albusac
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Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Niveles de control de la expresin gnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Visin general del control de la transcripcin: regiones reguladoras . . .
Principales motivos de unin al ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Motivo hlice-giro-hlice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Protenas con homeodominio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Dedos de zinc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cremallera de leucina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Motivo hlice-bucle-hlice (HBH) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Dimerizacin de protenas. Control combinatorio. Importancia en la expresin gnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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XIV
Regulacin de la actividad de las protenas reguladoras . . . . . . . . . . . .

Control de la expresin gnica en la diferenciacin celular: Miognesis
Etapas de la miognesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
a) Etapa de Determinacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
b) Etapa de Proliferacin/Migracin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
c) Etapa de Diferenciacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Protenas reguladoras de la miognesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Factores Musculares Reguladores (FMR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
MEFs (Muscle Enhancer Binding Factors) . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Estructura de los FMR y MEFS. Control combinatorio en la miognesis
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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7. Genes para la presentacin y el reconocimiento de antgenos . . . .

R. Milln Gonzlez y J. R. Regueiro
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Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
La inmunidad y la autotolerancia innatas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
La inmunidad adaptativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Linfocitos B y su receptor para el antgeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Linfocitos T y su receptor para antgeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
El TCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
El sistema HLA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Fases de la inmunidad adaptativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tolerancia adaptativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Delecin clonal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tolerancia B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Enfermedades autoinmunes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Diabetes mellitus tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Enfermedad de Graves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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8. Oncogenes. Protenas tumorales. Mecanismos de activacin de

proto-oncogenes. Genes supresores de tumores. Genes mutadores .
J. M. Ruz Albusac y E. Velzquez Snchez
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Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Etapas del desarrollo del cncer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Sistemas de sealizacin celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Genes y cncer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Oncogenes. Protenas tumorales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Retrovirus transformantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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101
101
NDICE
Funciones de los proto-oncogenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

I. Factores de crecimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
II. Receptores de factores de crecimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
III. Transductores intracelulares de seal . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
IV. Factores de transcripcin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
V. Reguladores de la muerte celular programada (protenas
antiapoptticas) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
VI. Protenas que controlan el ciclo celular . . . . . . . . . . . . . . . . .
Activacin de proto-oncogenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Genes supresores de tumores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
El gen Rb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
El gen APC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
El gen p53 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Genes mutadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
XV
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9. Apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
E. Vara
Muerte celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cambios bioqumicos y estructurales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Genes implicados en la apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Acoplamiento entre estmulo y apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Papel del p53 en la apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Papel de la apoptosis en los procesos fisiopatolgicos . . . . . . . . . . . . .
Modulacin de la apoptosis por xido ntrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Efectos proapoptticos del NO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Efectos antiapoptticos del NO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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10. Terapia gnica en clulas somticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129

Josefa P. Garca-Ruz
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Elementos de los genes eucariticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Inicio de la transcripcin de un gen codificante para una protena . . . .
Transferencia de un gen a una clula somtica . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Vectores derivados de oncorretrovirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Vectores derivados de los lentivirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Clulas diana de la terapia gnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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137
XVI
Logro de la terapia gnica en la inmunodeficiencia severa combinada

(SCID)-X1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
11. Introduccin a la Biotecnologa y generalidades sobre cultivos

celulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
A. Martnez Mogarra
Definicin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Resea histrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Produccin de frmacos por Biotecnologa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cultivo in-vitro de clulas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Medida de crecimiento bacteriano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cultivo de clulas eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Clulas inmortalizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Contaminacin y prevencin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tipos de cultivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cultivo discontinuo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cultivo continuo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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12. La ingeniera gentica I. Herramientas y Metodologa . . . . . . . . . . . 155

J. Casatorres Hernndez
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tcnicas de ADN recombinante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Herramientas de la ingeniera gentica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Nucleasas de cidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ADNasa I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Exonucleasa III . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
h Exonucleasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Nucleasa S1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Nucleasa Bal31 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ribonucleasa A (ARNasa A) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ribonucleasa H (ARNasa H) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Enzimas de restriccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Enzimas de restriccin Tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Polimerasas de cidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ADN polimerasa I (ADNpol I) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Fragmento Klenow de la ADNpol I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ADN polimerasa de T7 (ADNpol T7) y Secuenasa . . . . . . . . . . .
Polimerasas termorresistentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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NDICE
XVII
Transcriptasas reversas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Transferasa terminal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ARNpolimerasas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Poli-A polimerasas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Enzimas de modificacin de cidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ligasas de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Quinasas de cidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Fosfatasas de cidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Procedimientos de ingeniera gentica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mtodos de obtencin purificacin de AN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mtodos de deteccin de cidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mtodos de deteccin-cuantificacin directos . . . . . . . . . . . . . . .
Mtodos de deteccin por hibridacin: Southern y Northern . . . .
Mtodos de secuenciacin de cidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Secuenciacin del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mtodos de secuenciacin automtica del ADN . . . . . . . . . . . . . . . .
Secuenciacin del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Aplicaciones de la secuenciacin de cidos nucleicos . . . . . . . . . . .
Reaccin en cadena de la polimerasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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13. La ingeniera gentica II. Protenas recombinantes . . . . . . . . . . . . . . 181

Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Aislamiento del gen. (Clonaje y subclonaje) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Insercin del gen en un vector adecuado: Vectores de ADN . . . . . . . . .
Transferencia del vector de recombinante al hospedador . . . . . . . . . . .
Mtodos de Transferencia del ADN a clulas hospedadoras . . . . . .
Eleccin de las clulas hospedadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Hospedadores procariticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Hospedadores eucariticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Seleccin de los organismos que expresan el gen de inters . . . . . . . .
Caracterizacin del producto y clulas productoras . . . . . . . . . . . . . . .
Caracterizacin del producto clonado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Caracterizacin de las clulas productoras (bancos celulares) . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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192
14. Produccin industrial de frmacos recombinantes . . . . . . . . . . . . . . 195

A. Martnez Mogarra
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
Cultivos procariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
El medio de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
XVIII
Parmetros de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Control de temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Control del pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Aporte de oxgeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Agitacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Volumen de los cultivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cultivo de clulas eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Biorreactores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Control de pH y aireacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Biorreactores airlift . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Clulas en suspensin y clulas dependientes de anclaje . . . . . . . . .
Cultivo en microcarriers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Biorreactores de lecho fluido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Monitorizacin de procesos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Qu controlar? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
El medio de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
El agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Los materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Las clulas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
El cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Equipos de control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Utilities y Layout . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Autoridades reguladoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tipo de proceso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Consideraciones ambientales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Principales agentes causantes de contaminaciones . . . . . . . . . . .
Prevencin de la contaminacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Impacto ambiental y bioseguridad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Clasificacin y prevencin de riesgos en las industrias biotecnolgicas.
Riesgos biolgicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Riesgos qumicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Exposicin a la radiacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Gestin de residuos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Residuos biolgicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Residuos qumicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Residuos radiactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Purificacin de protenas recombinantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cromatografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Filtracin molecular (Size Exclusin) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cromatografa de adsorcin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Garanta de calidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
GMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Documentacin de procesos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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210
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212
NDICE
XIX
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
15. Presente y futuro de la Biotecnologa en las ciencias de la salud:
productos obtenidos mediante biotecnologa . . . . . . . . . . . . . . . . . 215
A. Campos de Olmo
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Productos obtenidos mediante biotecnologa en ciencias de la salud . .
Produccin industrial de hormona de crecimiento recombinante
(r-hGH) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Upstream . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Downstream . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Produccin industrial de r-hFSH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Upstream . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Downstream . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Modificacin gentica en animales. Transgnicos . . . . . . . . . . . . . . . . .
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
El concepto de transgn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tcnica de generacin de animales transgnicos . . . . . . . . . . . . . . . . .
Microinyeccin pronuclear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Transgnicos Knock Out . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mutagnesis condicional. Sistema Cre/lox P . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Los transgnicos en la industria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Produccin de rganos para xenotrasplantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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215
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226
227
16. Biologa molecular y endocrinologa: El ejemplo de los animales

transgnicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229
J. Reventos, D. Martnez-Selva, O. Martnez-Tirado, T. Pino, F. Munell
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mtodos utilizados para generar animales transgnicos . . . . . . . . . . . .
Mtodos clsicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Transferencia mediada por espermatozoides . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Recombinacin homloga . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Eliminacin de una alelo en un animal: el ejemplo de los ratones
knock-out . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Animales transgnicos de expresin inducible . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ejemplos de utilizacin de los animales transgnicos en biomedicina .
Oncologa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Creacin de animales con enfermedades genticas . . . . . . . . . . . . . .
Ratones transgnicos como modelos para terapia por genes . . . . . . .
Endocrinologa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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237
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XX
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
17. Bases moleculares de la deficiencia y resistencia a la accin
de la hormona de crecimiento: Entidades sindrmicas . . . . . . . . 243
J. A. Chowen y J. Argente
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bases moleculares del hipocrecimiento armnico . . . . . . . . . . . . . . . .
I. Hipocrecimiento por deficiencia gentica de hormona de crecimiento.
A. Deficiencia aislada de GH familiar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DAGH IA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DAGH IB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DAGH II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DAGH III . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
B. Deficiencia combinada de hormonas hipofisarias . . . . . . . . . . . .
C. Alteraciones embriolgicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Holoprosencefalia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Sndrome de Rieger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Displasia septo-ptica o sndrome de Morsier . . . . . . . . . . . . . . .
Sndrome de ectrodactilia-displasia ectodrmica-labio leporino .
Anemia de Franconi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Sndrome de Bloom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Sndrome de Aarskog . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
II. Hipocrecimiento por resistencia gentica a la hormona de
crecimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Anomala Post-receptor de GH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Delecin del gen de IGF-I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Pigmeos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Resistencia a IGF-I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
III. Hipocrecimiento por anomala en genes de los gonosomas . . . .
IV. Hipocrecimiento de origen prenatal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Consideraciones finales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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256
18. Patologa molecular de la hiperplasia suprarrenal congnita . . . . . 263

B. Ezquieta, E. Cueva, FJ. Fernndez, JM. Varela y C. Jariego
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Pacientes y mtodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Sujetos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mtodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Anlisis directo del gen de la esteroide 21-hidroxilasa . . . . . . . . . .
Anlisis indirecto de CYP21B mediante microsatlites en la
regin HLA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Resultados y discusin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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NDICE
Anlisis del gen de 21-OH en poblacin espaola . . . . . . . . . . . . . .

Correlacin genotipo-fenotipo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Aportaciones del anlisis gentico molecular en la deficiencia de
21-OH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Diagnstico prenatal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
XXI
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19. Terapia celular de la diabetes mellitus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279

B. Soria Escoms
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Qu es la ingeniera celular? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Obtencin de clulas beta artificiales mediante tcnicas de
bioingeniera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ingeniera de clulas de origen tumoral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Produccin de insulina en otros tejidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ingeniera celular de precursores. Estmulo y control de crecimiento,
regeneracin y neognesis de islotes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Clonacin teraputica y diferenciacin in vitro de clulas betas . . . .
Trasplante de clulas beta obtenidas a partir de clulas madre
embrionaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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20. Aproximacin gentica a los pseudohermafroditismos . . . . . . . . . . 289

M. L. Gaspar
Determinacin y diferenciacin sexual. Pseudohermafroditismos . . . .
Dficit de respuesta testicular a la gonadotropina corinica y a la
hormona luteinizante: mutaciones del gen de su receptor . . . . . . . . .
Dficit enzimticos en la biosntesis de andrgenos . . . . . . . . . . . . . . .
Anomalas en la accin de los andrgenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
a) Defectos en el metabolismo intracelular de la testosterona:
mutaciones del gen de la 5_ reductasa-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
b) Resistencia a la accin de los andrgenos: mutaciones del gen
de su receptor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mutuaciones de los genes implicados en la accin de la hormona
antimulleriana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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21. Patologa molecular de la neoplasia endocrina mltiple

(MEN-1, MEN-2A, MEN 2B) y del Carcinoma medular
de tiroides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
XXII
M.a J. Lorenzo-Benayas
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Neoplasia endocrina mltiple de tipo 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Caractersticas clnicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bases moleculares del MEN 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
La protena MENIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Deteccin del MEN 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Neoplasia endocrina mltiple de tipo 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Caractersticas clnicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bases moleculares del MEN 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Efectos de las mutaciones de ret en el MEN 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Deteccin del MEN 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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302
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307
22. Mecanismos moleculares implicados en el hipotiroidismo

congnito, Terapia gnica en enfermedades tiroideas . . . . . . . . . . 309
P. Santisteban
.
Mecanismos moleculares implicados en el hipotiroidismo congnito . .
Factores de transcripcin especficos de tiroides . . . . . . . . . . . . . . . . .
Factor de transcripcin TTF-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Factor de transcripcin TTF-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Factor de transcripcin Pax-8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Desarrollo de la glndula tiroidea y expresin de TTF-1,
TTF-2 y Pax-8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Funcin de los factores de transcripcin tiroideos: Generacin
de ratones knock-out . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Factores de transcripcin tiroides en el hipotiroidismo congnito . . . .
Terapia gnica en enfermedades tiroideas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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310
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NDICE ANALTICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321
1
Concepto de informacin gentica.
cidos nucleicos, estructura
del ADN
E. Blzquez Fernndez
Flujo de la informacin gnica

La vida tiene un fundamento qumico y los procesos que la hacen posible estn
protagonizados por biomolculas, que para llevar a cabo sus efectos biolgicos utilizan entre otros, sistemas capaces de generar, transmitir o perpetuar una informacin. Entre ellos destacan la transmisin del impulso nervioso, la recepcin y transduccin de seales generadas por hormonas, factores de crecimiento y
neurotransmisores, el funcionamiento del sistema inmune, los mecanismos implicados en la muerte celular programada o apoptosis, y en la transmisin de la herencia y perpetuacin de las especies. La expresin de la informacin gentica permite que un organismo pueda replicarse dentro de unos cnones preestablecidos. En
las clulas la informacin necesaria para ello se encuentra codificada en una molcula conocida como cido desoxirribonucleico o ADN (1), la cual es transferida a una
molcula de cido ribonucleico mensajero (ARNm) mediante un proceso conocido
como transcripcin del ADN (Fig. 1.1). Los ARNm transcritos son traducidos en
protenas especficas. Otras formas de ARN son los de transferencia (ARNt) implicados con el aporte de los diferentes aminocidos para la sntesis de protenas, y los
que forman parte de los ribosomas o ARN ribosomal (ARNr).
Las unidades de informacin son conocidas como genes, localizados dentro de
los cromosomas y que son controlados en su expresin por protenas reguladoras,
que se unen a sitios especficos presentes en regiones cercanas a las zonas codificantes. Aparte de su especificidad en la expresin gnica, sta tiene un efecto amplificador ya que a partir de un solo gen se pueden producir miles de ARN transcritos,
y a partir de una molcula de ARNm pueden ser traducidas miles de copias de una
cadena polipeptdica, con lo que la informacin presente en un gen puede generar
millones de copias de una protena especfica.
CLULA EUCARIOTA
CLULA PROCARIOTA
ADN
NCLEO
Exn Intrn
ADN
Transcripcin
Transcripcin
preARNm
ARNm
Procesamiento
ARN
Traduccin
ARNm
Protena
ARNm
Traduccin
Protena
CITOPLASMA
Figura 1.1. Caractersticas de la transferencia de informacin desde ADN a protenas en clulas procariotas y eucariotas.
La transferencia de la informacin gnica es un proceso ms sencillo en las

clulas procariotas que en las eucariotas (Fig. 1.1). Las clulas bacterianas carecen
de ncleo y organelas y la informacin gentica est codificada de forma ininterrumpida en el ADN, mientras que en las clulas eucariotas que son ricas en organelas, tienen un ncleo celular donde ocurren la replicacin y transcripcin del
ADN. En esta molcula existen las secuencias codificantes conocidas como exones, que estn separados por los intrones o segmentos de ADN no codificantes.
Para la sntesis de una protena en las clulas eucariotas, el gen completo con sus
exones e intrones es expresado en una molcula de ARN conocido como transcrito primario o pre ARNm, que en una etapa posterior es procesado por enzimas que
cortan y empalman los exones liberando de esta forma los intrones. El ARNm
resultante abandona el ncleo para en el citoplasma dirigir la sntesis de una protena especfica.
cidos nucleicos
Aunque a finales del siglo XIX se saba que la informacin ligada a los caracteres hereditarios estaba presente en los cromosomas, hasta mediados del siglo XX no
se supo que el ADN era la molcula que guardaba dicha informacin. En 1869
Meischer obtuvo ncleos celulares a partir de leucocitos obtenidos de los vendajes
CONCEPTO DE INFORMACIN GENTICA
de pacientes intervenidos quirrgicamente, a los que trat con cido clorhdrico. El

tratamiento posterior de los ncleos con una solucin alcalina produjo un sedimento que contena fsforo, carbono, nitrgeno, hidrgeno y oxgeno al que llam
nuclena, y ms tarde al conocerse su carcter cido denomin cido nucleico. El
conocimiento de la estructura de esta molcula se consigui a travs de un proceso
muy lento, que necesit ms de 60 aos hasta que se demostr que la nuclena era
el ADN. Los estudios qumicos pertinentes revelaron que la subunidad repetitiva del
ADN era un nucletido que contena 2-desoxi-D-ribosa, un grupo fosfato y una de
las cuatro bases nitrogenadas heterocclicas, de las cuales la adenina y guanina son
bases pricas, y las otras dos citosina y timina son bases pirimidnicas (Fig. 1.2).
Tanto el ADN como el ARN son cidos nucleicos constituidos por polmeros de
nucletidos que se diferencian en que el ARN tiene ribosa en vez de desoxirribosa,
la base uracilo en vez de la timina, y que se manifiesta como una sola hebra mientras que el ADN lo hace en forma de doble hlice.
Con posterioridad se encontr que las bases estn unidas al C-1 de la pentosa
mediante un enlace -N-glicosdico, constituyendo lo que se conoce como nuclesido, as como que el fosfato puede unirse al C-3 o al C-5 del azcar, en cuyo caso
se forma un nucletido (Fig. 1.3). Tambin se descubri que los nucletidos se
unen por un enlace covalente fosfodister entre el grupo hidroxilo de un nucletido
y el grupo fosfato de otro nucletido, que unen los carbonos 5 y 3 de los residuos
de la pentosa formando enlaces 5-3 fosfodister, que de esta forma facilitan la formacin de una cadena polinucleotdica. En consecuencia el ADN es un polmero
lineal de residuos de 2-desoxirribonucletidos unidos por enlaces fosfodister 5-3,
que contienen cuatro residuos de nuclesidos distintos dA, dT, dC y dG. El prefijo
d indica que la pentosa es la desoxirribosa y sirve para distinguirlo de los ARN que
poseen como azcar la ribosa. Los nmeros con prima () indican que el tomo pertenece al carbono, mientras que los nmeros que no los llevan pertenecen al anillo
prico o pirimidnico. Las cadenas polinucleotdicas son direccionales, partiendo
del C-5 de la pentosa y con el siguiente fosfato unido al C-3 del azcar. Por ello
los extremos de las cadenas polinucleotdicas se denominan 5 y 3 para indicar su
direccin.
Cuando a finales de los aos cuarenta se hicieron valoraciones de la composicin de bases en el ADN de distintos organismos, se encontr que el nmero de
moles A y T por una parte eran iguales y el de G y C por otra tambin eran iguales,
lo cual no se entendi en aquel momento pero actualmente sabemos que se debe al
apareamiento de bases entre las dos hebras del ADN. No obstante las cantidades de
C+G y de A+T para una molcula de ADN no suelen ser iguales, con oscilaciones
del 35 % al 70 % entre las diferentes especies. De acuerdo con lo representado en la
Figura 1.3, los componentes presentes en la cadena polinucleotdica pueden mostrarse de una forma simplificada utilizando lneas verticales y diagonales, y an ms
abreviadamente se designa al polinucletido como G-T-A-C.
Determinadas bases del ADN de procariotas y eucariotas (a excepcin de levaduras e insectos) estn metiladas, las cuales son reconocidas por protenas implicadas en funciones del ADN, tales como la iniciacin de la sntesis y recombinacin
A
PIRIMIDINAS
NH2
N
O
CH
HN
CH
HN
C CH3
CH
CH
CH
N
H
N
H
N
H
Citosina
Timina
Uracilo
PURINAS
O
NH2
C
HC
HN
N
CH
CH
2HN
N
H
Adenina
N
H
Guanina
B
CH3
CH3
H
C
H
HO
CH
NH
HC
C
O
N
H
CH
C
N
Adenina
NH
C
C
Timina
HC
N
H
CH
NH
C
H O
N
H
Citosina
Guanina
Figura 1.2. Estructuras de las bases pricas y pirimidnicas (A) y emparejamiento por puentes
de hidrgeno de las bases adenina con timina y citosina con guanina (B).
NH2
C
N
HN
CH
HC
O P O P O P OCH2
O
N
O
H
HO
CH
N
O P O P O P OCH2
C CH3
HO
Desoxiadenosina-5-trifosfato (dTTP)
Desoxiadenosina-5-trifosfato (dATP)
B
Extremo 5
OP
O
3
O
CH2
OH
H
O
OP
O
CH2
OP
5 G T A C 3
O
O
CH2
H
A
H
H
H
O
OP
H
O
O
O
CH2
Extremo 3
C
H
H
H
HO
Figura 1.3. Estructuras de nuclesidos trifosfato (A) y de una cadena polinucleotdica con sus
correspondientes abreviaciones (B). G: guanina. T: timina. A: adenina. C: citosina.
del ADN. Despus de la sntesis de ADN las metilasas Dam y Dem llevan a cabo su
actividad cataltica, utilizando la S-adenosilmetionina como donador de grupos
metilo; la metilasa Dam acta sobre los residuos de adenina de la secuencia GATC,
mientras que la metilasa Dem acta sobre los residuos citosina de la cadena opuesta de la citada secuencia. A veces una base puede ser metilada antes de ser incorporada al ADN.
El ADN como molcula portadora

de la informacin gentica
El conocimiento que el ADN contiene la informacin gentica es una adquisicin relativamente reciente, ya que hasta 1944 se consideraba que las protenas
cromosmicas tenan esa informacin, mientras que el ADN jugaba un papel
secundario. No obstante la utilizacin experimental de neumococos de la cepa S
(del ingls smooth) llamados de esta forma por su apariencia lisa consecuencia de
la presencia de una cpsula responsable de su patogenicidad, y de los neumococos de la cepa R (del ingls rough) carentes de la cpsula y de actividad patgena, fue de gran ayuda para obtener nuevos horizontes. En efecto, cuando se
inyect a ratones neumococos R vivos y neumococos S muertos por calor la mezcla fue letal, mientras que cada uno de ellos por separado no lo fueron. Curiosamente los ratones muertos contenan neumococos S vivos, lo que sugiri que
los neumococos S muertos haban transformado a los neumococos R vivos en
neumococos S vivos. Tambin se observ que este fenmeno ocurra in vitro,
mediante la transformacin de clulas en cultivo de la cepa R en otros de la cepa
S por la adicin de un extracto libre de clulas S muertas por calor. Todo ello dio
lugar al concepto de principio transformador. En 1944, O. Avery, C. McLeod y
M. McCarthy (2) descifraron la naturaleza qumica de este principio considerndolo un cido nucleico del tipo desoxirribosa. Esta demostracin fue un hito trascendental en la historia de la Biologa, que posteriormente fue confirmada por los
estudios de la infeccin del bacteriofago T2 en la bacteria E. coli. Para ello el
ADN del virus fue marcado radiactivamente con 32P mientras que las protenas de
su cubierta se marcaron con 35S. A continuacin el E. coli fue infectado con el
fago doblemente marcado que se uni a la bacteria, procedindose inmediatamente despus a la homogenizacin de la preparacin para proceder a la separacin de virus y bacterias. La centrifugacin posterior de la suspensin permiti
sedimentar las bacterias en el fondo del tubo y localizar las vesculas pequeas en
el sobrenadante. De esta forma se encontr que la mayor parte del ADN del fago
se encontraba en la bacteria mientras que la inmensa mayora de la protena del
virus permanecieron en el sobrenadante. Estudios realizados ms tarde mostraron
que el 30 % del 32P parental aparecan en los descendientes mientras que slo el 1 %
del 35S fue transferido desde el fago a la progenie. Todo ello mostr el papel del
ADN como material gentico.
La estructura tridimensional del ADN muestra una

doble hlice con cadenas complementarias
En 1953, James Watson y Francis Crick (3) describieron la estructura tridimensional del ADN basados en los estudios de difraccin de rayos X. Por este
trabajo pionero que inici el desarrollo de la Biologa Molecular, Watson, Crick
y Wilkins recibieron el premio Nobel, que quizs hubieran compartido con R.
Franklind si ella no hubiese muerto vctima de cncer antes de la concesin de
ese galardn.
El ADN es una doble hlice, donde cada una de las dos hebras se enrolla alrededor del eje central, generalmente en forma de hlice dextrgira. Las dos hebras
avanzan en direccin opuesta, por lo que se las considera antiparalelas. En ellas las
unidades de fosfato y desoxirribosa se encuentran en el exterior formando ngulos
casi rectos con las bases (Fig. 1.3), y stas se encuentran en el interior en planos que
son perpendiculares al eje de la hlice. El dimetro de sta es de 20 , estando las
bases adyacentes separadas 3,4 a lo largo del eje de la hlice y desplazadas por
una rotacin de 36 grados. Dado que la estructura helicoidal en cada hebra se repite cada 34 , en ellas tienen cabida 10 residuos. Ambas hebras del ADN permanecen unidas por puentes de hidrgeno entre determinados pares de bases. Las interacciones hidrofbicas y de van de Waals entre las bases apiladas adyacentemente
tambin contribuyen a la estabilidad de la estructura del ADN. La geometra de la
estructura doble helicoidal se mantiene por el apareamiento de una purina que es
una molcula ms grande con una pirimidina. En el ADN nativo la adenina se une
siempre a la timina por dos puentes de hidrgeno, y la guanina lo hace siempre con
la citosina mediante tres puentes de hidrgeno (Fig. 1.2). Este emparejamiento o
complementariedad de las bases es el aspecto ms importante de la doble hlice del
ADN. Por otra parte la secuencia precisa de bases transmite la informacin gentica
y sugiere un mecanismo para la replicacin del ADN. De hecho Watson y Crick (4)
propusieron que una de las cadenas de cada molcula hija del ADN se sintetiza de
nuevo, mientras que la otra procede de la molcula de ADN parental. Por ello esta
forma de replicacin se denomina semiconservativa.
Los enlaces glicosdicos entre las pentosas y las bases de un par de nucletidos
del ADN no se encuentran directamente opuestas entre s, de manera que pueden
reconocerse alrededor de la hlice dos surcos de distinta anchura: como consecuencia de elllo el saliente de la hlice con ms de 180 desde un enlace glicosdico a otro se denomina vrtice mayor y da lugar al surco mayor, mientras que el que
forma menos de 180 da lugar al surco menor.
Conformaciones del ADN

La conformacin B-ADN descubierta por Watson y Crick (3) y citada en el prrafo anterior es la ms frecuente en la naturaleza, pero dependiendo de la composicin
de bases y bajo diferentes condiciones fsicas se pueden encontrar las conformaciones A-ADN y Z-ADN (5,6). Los cambios de conformacin del ADN no modifican
la informacin contenida en el ADN, pero si pueden alterar la regulacin de la
expresin gnica ya que los cambios conformacionales pueden afectar la unin de
protenas al ADN.
Cuando disminuye el contenido de agua y sales en los cristales de B-ADN, la
apariencia fina de esta molcula se transforma en otra gruesa y corta correspondiente al A-ADN, con un surco mayor ms profundo y ancho y un surco menor
superficial y ancho. Tambin en comparacin con el B-ADN, que tiene un paso de
hlice de 3,4 nm y un nmero de bases por vuelta de 10,4, la molcula de A-ADN
tiene respectivamente 2,46 nm y 11 bases. Aunque esta forma es poco frecuente se
encuentra en las hlices ARN-ARN y ARN-ADN. En las conformaciones B-ADN
y A-ADN la pentosa y la base se sitan en lados opuestos al enlace glicosdico, o en
conformacin anti, con una repulsin mnima entre ambos grupos. Pero con altas
concentraciones de cationes algunos nucletidos experimentan una rotacin que
sitan a la pentosa y a la base en el mismo lado del enlace glicosdico, constituyendo lo que se conoce como conformacin sin. As en una cadena de nucletidos con
guanina y citosina alternantes, la conformacin del enlace glicosdico con ms posibilidades es anti para la citosina y sin para la guanina. Este efecto zig-zagueante de
las conformaciones anti y sin es lo que se denomina como Z-ADN. Esta forma es
ms larga y estrecha que el B-ADN, con 12 pares de bases por vuelta, una vuelta de
hlice de 4,56 nm y un dimetro de hlice de 1,84 nm frente a los 2,37 nm del BADN. Asimismo en el Z-ADN el surco mayor prcticamente desaparece por el
desarrollo de una superficie convexa, y el surco menor se convierte en una hendidura profunda que gira alrededor de la estructura.
Desenrollamiento y superenrollamientos del ADN

Localmente la doble hlice del ADN se desenrolla durante la recombinacin
gnica, replicacin y transcripcin del ADN, como consecuencia de la ruptura de
los puentes de hidrgeno que unen las bases. Un desenrollamiento completo o desnaturalizacin del ADN puede ocurrir in vitro tras la elevacin de la temperatura por
encima de un punto determinado. La desnaturalizacin del ADN puede medirse
espectroscpicamente, ya que esta molcula tiene el mximo de absorcin de la luz
ultravioleta a 260 nm, pero ello aumenta un 37 % cuando est totalmente desenrrollado. Con la representacin grfica de los cambios de la absorcin frente a las temperaturas a las que se somete una muestra de ADN, se obtiene una curva sigmoidea
llamada curva de fusin del ADN, que refleja las interacciones entre los pares de
bases unidos por puentes de hidrgeno y los efectos cooperativos del apilamiento
de bases. La temperatura de fusin del ADN est condicionada por la composicin
de bases, dado que el par adenina-timina tiene un enlace de hidrgeno menos que
el par citosina-guanina, y por tanto son menos estables. Todo ello indica que los segmentos ricos en adenina-timina sern los primeros en desenrollarse y tienen una Tm
(temperatura de fusin) ms baja que los poseedores de fragmentos ricos en citosina-guanina que tienen las propiedades opuestas. Tras la separacin de las dos
hebras y con las condiciones apropiadas de temperatura se pueden renaturalizar
adquiriendo con ello el enrollamiento previo.
Muchas molculas de ADN son circulares, como las presentes en el genoma de
los procariotas y de bastantes virus, as como el ADN presente en las mitocondrias
y cloroplastos. Como en el caso del ADN lineal la elevacin de la temperatura y del
pH destruyen los enlaces de hidrgeno y otros tipos de interacciones que estabilizan la doble hlice de las molculas de ADN circular. Sin embargo las dos hebras
del ADN circular no se pueden desenrollar o separarse, a menos que una de las
hebras sea cortada y despus se las someta a desnaturalizacin. La ruptura de un
ADN circular puede ocurrir durante la replicacin del ADN, y se puede inducir en
el laboratorio mediante la ruptura de un enlace fosfodister con el uso de concentraciones bajas de desoxirribonucleasa. Tras un desenrollamiento local del ADN se
genera una tensin que se contrarresta con un superenrollamiento (7) del ADN restante. Desenrollamientos y superenrollamientos ocurren durante la replicacin,
transcripcin, unin de protenas al ADN circular, o por fijacin de grandes hebras
de ADN dentro de los cromosomas. Los superenrollamientos son reconocidos y
regulados por enzimas llamadas topoisomerasas (8).
Los superenrollamientos pueden ser negativos y positivos, encontrndose los
primeros in vivo y los segundos in vitro. El grado de superenrollamiento de una
molcula de ADN se puede verificar cuantitativamente, mediante el nmero de
veces que una cadena de ADN circular cruza a la otra cadena, lo cual define el
nmero de superenrollamientos topolgicos (9). Este nmero puede modificarse slo
por la ruptura de un enlace fosfodister en una o dos cadenas con reenrrollamiento
y cierre del nuevo crculo. Las enzimas que realizan estos procesos reciben el nombre de topoisomerasas, y son responsables de la introduccin o eliminacin de superenrollamientos. La topoisomerasas I rompen una cadena de ADN y relaja el superenrollamiento negativo, mientras que la topoisomerasa II rompe ambas cadenas de
ADN y aade superenrollamientos negativos. Ambas enzimas son importantes para
la replicacin del ADN.
Estas topoisomerasas han sido tenido en cuenta como dianas de molculas con
acciones antimicrobianas o antitumorales, tales como la camptotecina, antraciclina
y amioacridina. Estos agentes actan inhibiendo parcialmente la actividad enzimtica impidiendo la unin de las hebras de ADN, con lo que convierten a las topoisomerasas en agentes rompedores de ADN, que finalmente producen la muerte
celular. En este sentido se ha podido demostrar una correlacin entre la actividad
antitumoral de varios derivados de la camptotecina y sus capacidades para inhibir
la actividad de la topoisomerasa I. Asimismo los altos niveles de topoisomerasa I
encontrados en el cncer de colon y otros tumores humanos han contribuido al
efecto teraputico de la camptotecina sobre estas neoplasias. Por otra parte distintos agentes antitumorales como las antraciclinas y los derivados de la acridina ejercen su efecto teraputico actuando sobre la topoisomerasa II. Neoplasias como las
leucemias linfocticas y no linfocticas, enfermedad de Hodgkin y linfomas no
10
Hodgking se tratan con uno o ms inhibidores de la topoisomerasa II acompaados

o no de agentes citotxicos (10).
Aspectos estructurales y funcionales de la cromatina

La denominacin de cromatina procede de las observaciones con el microscopio ptico de ncleos correspondientes a clulas eucariotas teidos con distintos colorantes, en los que se encontraron zonas bandeadas, llamndose cromatina a las que estaban coloreadas. Ms tarde, se encontr que la cromatina al
igual que la nuclena se comportaba de una forma semejante con las soluciones
cidas y alcalinas, por lo que se asumi que se trataba de la misma sustancia.
Esta conclusin result ser parcialmente cierta, ya que la cromatina contiene
ADN, que adems est fuertemente unido a protenas. En los estadios de reposo
celular, la cromatina tiene una estructura amorfa y dispersa por el ncleo con
estructuras de 30 nm de espesor. Sin embargo antes de la divisin celular la cromatina se perfila en estructuras ms compactas en forma de fibras conocidas
como cromosomas.
La presencia de la cromatina es muy importante para el empaquetamiento del
ADN eucaritico, ya que en ella es decisivo la interaccin del ADN con las protenas histonas y no histonas. Estas ltimas se encuentran en pequesimas cantidades y constituyen un grupo de varios centenares de protenas ntimamente relacionadas con la organizacin del cromosoma, replicacin y expresin gnica. No
obstante el componente proteico mayoritario est constituido por las cinco histonas: H1, H2A. H2B, H3 y H4, que son protenas bsicas ricas en arginina y lisina,
cuyas cargas positivas se unen inmediatamente con las cargas negativas del ADN.
La cromatina se presenta en forma muy condensada, organizada como un mdulo
repetitivo cada 10 nm constituido por ADN e histonas. Cuando la cromatina se
trata con disoluciones de ClNa de gran fuerza inica sus componentes se distorsionan, observndose al microscopio electrnico imgenes que recuerdan a un
collar de cuentas llamado polinucleosoma, en el que la unidad elemental o nucleosoma se repite regularmente. El hilo de ese collar es ADN libre y las cuentas son
el ADN enrollado sobre las histonas. Estos ltimos complejos de ADN-protenas
constituyen los nucleosomas formados por dos copias de cada histona H1, H2A,
H2B, H3 y H4, y por un segmento de 200 pares de bases de ADN. La digestin
parcial con nucleasas produce la hidrlisis de una cuarta parte del ADN y la liberacin de H1, lo que da lugar al nucleosoma lmite que contiene 146 pares de
bases de ADN y dos copias de las histonas H2A, H2B, H3 y H4, que reciben el
nombre de octmero de histonas. Los nucleosomas son fibras de 10 nm de dimetro, que cuando producen un triple empaquetamiento dan lugar a fibras de 30 nm
de dimetro, que se mantienen unidas por las interacciones cooperativas de la histona H1. El empaquetamiento del ADN en el nucleosoma y luego en las fibras de
30 nm, reduce su longitud en un factor de 50, pero antes de la divisin celular esta
reduccin alcanza un factor de 8.000.
11
Aspectos estructurales y funcionales del ADN

Existen grandes diferencias en los tamaos del ADN, desde varios millares
de pares de bases en los virus pequeos hasta millones en el ADN cromosmico
de bacterias y miles de millones de pares de bases en el ADN cromosmico de los
animales. En humanos el genoma haploide contiene 3,5 109 pares de bases, con
120 106 pares de bases por cromosoma, y aunque se crea que tenan 100.000
genes, tras la informacin que se est obteniendo con el programa del genoma
humano se cree que son 35.000 genes los presentes en clulas humanas. Salvo
excepciones la cantidad de ADN por clula aumenta con la complejidad de la funcin celular. En ocasiones algunas clulas de anfibios, peces y plantas tienen
mayores cantidades de ADN que las clulas de mamferos, pero ello es debido a
la reiteracin de secuencias de nucletidos y no representan un aumento real del
tamao en trminos de secuencias nicas.
Las endonucleasas de restriccin cortan las cadenas de ADN en secuencias especficas que hacen posible la ruptura del ADN en fragmentos ms pequeos. Son
autnticos bisturs qumicos que han facilitado la secuenciacin de bases del ADN.
Estas enzimas producen un corte en cada hebra del ADN y reconocen secuencias de
cuatro o seis nucletidos de longitud, conocidas como palndromes y caracterizadas
por una completa simetra de repeticin invertida.
Tambin el mtodo de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) descrito por
K. Mullis en 1984, con capacidad para amplificar secuencias especficas de ADN (11),
ha sido determinante en el progreso conseguido en la secuenciacin y clonacin del
ADN. Tambin este proceder tiene una gran aplicabilidad en medicina, como en la
deteccin temprana de cnceres mediante el estudio de las mutaciones de genes
implicados en el control del crecimiento, en el seguimiento de la quimioterapia
aplicada a pacientes con cncer, o en la deteccin temprana del virus de la inmunodeficiencia adquirida (HIV-1) en personas en las que an no se ha detectado los
correspondientes anticuerpos, y en la identificacin de Mycobacterium tuberculosis
en muestras de tejido, que es un proceder muy lento y laborioso por los mtodos
convencionales. Asimismo en Medicina Forense y Legal, esta tcnica es de gran utilidad para determinar el parentesco en casos de disputa de paternidad, o mediante
el anlisis del PCR de cabellos, manchas de sangre y semen suministran informacin acerca de casos de crmenes o violaciones.
Con la ayuda de la tcnica del PCR se han podido descifrar genes de muestras
muy antiguas (12) correspondientes a momias egipcias y restos arqueolgicos de
hace 7.500 aos (13), o de una termita fosilizada en mbar (14) del perodo del Mioceno
con 30 millones de aos, con lo cual se ha obtenido informacin enriquecedora
sobre la evolucin de determinadas especies.
Tambin las sondas de ADN son de gran utilidad diagnstica en la clnica mdica. Estas sondas son oligonucletidos cortos monocatenarios complementarios de
secuencias especficas de inters en un ADN genmico. Las sondas tienen una longitud mnima de 15 nucletidos, porque fragmentos ms pequeos podran ser complementarios a secuencias que de una forma aleatoria estn presentes en un ADN
12
genmico. La utilizacin de sondas es un procedimiento de gran valor en el diagnstico de tumores o de alteraciones genticas como por ejemplo la anemia falciforme, la enfermedad de la hemoglobina C, y la fenilcetonuria. Tambin se utilizan
para el diagnstico selectivo de infecciones por bacterias, como ciertos tipos de sfilis, identificacin de microorganismos responsables de la lepra, o neumonas producidas por Clamydia pneumoniae entre otras.
En procariotas, un elevado porcentaje del ADN cromosmico codifica protenas especficas, en contraposicin con el ADN eucaritico donde gran parte no es
codificante y se considera de relleno porque no se ha podido asignar alguna funcin. Actualmente se piensa que podra desempear un papel importante en la
regulacin de la expresin gnica durante el desarrollo. Por otra parte los genes
eucariticos estn separados por una media de 40 kb, y dentro de ellos estn interrumpidos por secuencias nucleotdicas interpuestas o intrones (Fig. 1.1) que se
eliminan con el procesamiento del preARNm, con lo que la expresin gnica slo
se realiza a travs de los exones. La funcin de los intrones no est clara, aunque
su presencia en las clulas eucariotas parece que est relacionada con la evolucin
gnica, ya que ellos no se encuentran en los procariotas ni en los eucariotas inferiores como las levaduras.
Otra diferencia importante entre el ADN de clulas procariotas y eucariota, es
que en las primeras las repeticiones de secuencias de ADN son escasas mientras que
en las eucariotas el ADN repetitivo puede constituir en el genoma de los vertebrados entre el 25 %-35 % del total. Las secuencias pueden ser de copia nica, moderada y altamente reiteradas, y de repeticiones invertidas. Aunque aproximadamente la mitad del genoma humano est compuesto de secuencias nicas, slo una
pequea fraccin codifica protenas. Ello se debe a que una parte importante del
ADN son pseudogenes, o secuencias que presentan analogas con el gen funcional,
pero tienen mutaciones que impiden su expresin. Estos pseudogenes que se presentan con una frecuencia elevada contribuyen significativamente al tamao del
genoma eucaritico pero no a su expresin.
En determinadas enfermedades humanas como, la distrofia miotnica, la enfermedad de Huntington, la ataxia espinocerebelar, el sndrome de Kennedy relacionado con la atrofia muscular bulbar y espinal ligada al cromosoma X frgil y el
cncer de colon, se han observado secuencias de ADN reiterado en forma tres
pares de bases (15). Estas enfermedades se encuentran asociadas a la expansin de
algunas repeticiones de tripletes que estn representadas en exceso en el genoma
humano. De esta forma la ataxia espinocerebelar I se caracteriza por la expansin
del triplete CAG, y el sndrome del cromosoma X frgil por la expansin del triplete GCC. Las enfermedades asociadas con un incremento de estos tripletes se
caracterizan por un aumento de la gravedad a lo largo de las sucesivas generaciones. Por ejemplo, en el sndrome del cromosoma X frgil, se encuentran 30
copias del triplete CGG asociados con el gen de la enfermedad FMR-1, las cuales
se pueden incrementar a 300 en los portadores de mutaciones del gen, e incluso
pueden presentarse con varios millares de copias en los individuos que manifiestan la enfermedad.
13
ADN mitocondrial
Una estructura circular de doble cadena, con 16569 pb y 37 genes constituye el
ADN mitocondrial. De ellos 24 genes codifican para 2 ARN ribosomales y 22 ARN
de transferencia especficos para la mitocondria, y los 13 genes restantes codifican
protenas que son esenciales para la formacin del ATP mitocondrial.
Dado que las mitocondrias de los espermatozoides no penetran en el huevo fertilizado los genes mitocondriales slo tienen herencia materna. Las mutaciones son
ms frecuentes en el ADN mitocondrial que en el genmico, como consecuencia
de una baja fidelidad en la replicacin del ADN, menor capacidad reparadora del
mismo, y el efecto masivo de radicales libres generados por la mitocondria. Esas
mutaciones producen desequilibrios en la fosforilacin oxidativa, y se cree que
pueden estar implicadas en el envejecimiento y en el desarrollo de las enfermedades degenerativas (16). De hecho durante el envejecimiento de humanos y ratones se
han descrito cinco deleciones diferentes del ADN mitocondrial que no se manifiestan en individuos jvenes. Tambin en pacientes con miopatas mitocondriales
con frecuencia se observa la delecin de grandes fragmentos del ADN, lo cual tambin ocurre en los tejidos sanos de ancianos. Ya que el ADN mitocondrial muta con
facilidad y es reparado escasamente, y que en los tejidos de ancianos se acumulan
mayor cantidad de radicales libres que pueden actuar sobre el ADN mitocondrial,
se ha propuesto que el envejecimiento puede estar relacionado con la acumulacin
de mutaciones en el ADN mitocondrial (17). Sin embargo no slo estos factores
deben tenerse en cuenta sino que otros genticos y ambientales deben ser considerados.
La epilepsia mioclnica se manifiesta con contracciones musculares incontrolables, fibras rojas deshilachadas, y con una mutacin en el gen de un ARNt mitocondrial. Tambin mutaciones en el ADN mitocondrial causan la neuropata ptica
hereditaria de Leber, entidad nosolgica transmitida por va materna y caracterizada por la prdida de visin en la vida adulta por degeneracin del nervio ptico. Esta
enfermedad puede aparecer por una mutacin en el gen de la NADH deshidrogenasa del complejo I, que produce la sustitucin de una arginina por una histidina, y
como consecuencia de ello a mitocondrias con una capacidad limitada para el transporte electrnico y la sntesis de ATP. Tambin esta enfermedad puede ser la consecuencia de un solo cambio de bases en el gen mitocondrial que codifica para el
citocromo b.
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2
Replicacin del ADN
M.a C. Garca Martn
Introduccin
La replicacin del ADN es el proceso mediante el cual el ADN se utiliza como
molde para su propia sntesis. En este proceso juegan un papel importante las ADN
polimerasas, enzimas capaces de alargar o extender cadenas de ADN en crecimiento. Estas enzimas catalizan la incorporacin de unidades de desoxiribonuclesidos
5 trifosfato, de forma consecutiva, al grupo hidroxilo 3 terminal de dichas cadenas,
de forma que slo pueden crecer en la direccin 3-5. La identidad de los nucletidos que se incorporan est determinada por la necesidad de aparearse con la
correspondiente base del molde.
La exactitud de este proceso es muy elevada, slo se produce un error cada
10 8-10 9 pares de bases. Esta fidelidad de la replicacin es consecuencia de las
caractersticas especiales de las polimerasas. La mayor parte de estas enzimas, adems de la actividad polimerizante 3-5, poseen actividad exonuclesica en direccin 3-5, opuesta a la direccin de sntesis, que les permite eliminar los nucletidos introducidos de forma errnea. Con esta actividad correctora de pruebas las
ADN polimerasas pueden comprobar el resultado de cada polimerizacin antes de
catalizar la incorporacin del siguiente nucletido (1-5).
En E. coli se han aislado tres formas distintas, las polimerasas I, II y III que
desempean diferentes papeles en la clula. La ADN polimerasa I consiste en una
nica cadena polipeptdica con tres actividades enzimticas, una actividad polimerizante de nucletidos 3-5, una actividad exonucleasa correctora de pruebas, que
elimina los nucletidos desapareados a partir del hidroxilo 3 terminal, y una actividad exonucleasa 5-3 capaz de actuar sobre un ADN de doble hebra (o un segmento ADN-ARN) que contenga una mella. Esta ltima actividad, coordinada con
la actividad polimerasa, permite a la enzima sustituir regiones de una hebra de ADN
16
por material de nueva sntesis y tiene dos funciones: participa en la reparacin del
ADN daado y elimina los cebadores durante la replicacin del ADN.
Las tres actividades de la ADN polimerasa I se localizan en dos regiones diferentes de su cadena polipeptdica: un fragmento mayor (o fragmento de Klenow)
contiene los dominios polimerasa y 3 exonucleasa y un fragmento menor contiene
el dominio 5 exonucleasa. La forma en que se disponen estos tres lugares catalticos en el espacio es importante para comprender cmo acta cada una de las actividades exonucleasas en coordinacin con la polimerasa (1-4).
La polimerasa II acta en mecanismos de reparacin del ADN daado.
La ADN polimerasa III es un complejo enzimtico formado al menos por 10
subunidades distintas, tres de ellas (designadas como _, ` y e) forman el ncleo
cataltico, en el que residen las actividades polimerasa y exonucleasa correctora de
pruebas. La asociacin de dos ncleos catalticos en presencia de dos subunidades
o forman un dmero, al unirse a las otras subunidades (`, a, b, b, r y s) forman un
dmero asimtrico conocido como holoenzima de la ADN polimerasa III. Estas protenas accesorias aumentan la procesividad de la enzima, es decir, su capacidad de
mantenerse unido al molde-cebador durante sucesivas etapas de polimerizacin.
Estudios estructurales de estas protenas accesorias muestran que la subunidad
` es la responsable directa del aumento de la procesividad de la enzima, dos subunidades ` forman un anillo cerrado que rodea el molde de ADN y acta como una
pinza permitiendo a la polimerasa deslizarse sobre el molde sin disociarse de l.
Las otras subunidades, que componen el complejo a, se han identificado como
igualadores moleculares que utilizan la energa de la hidrlisis de ATP para unir
el ADN a la pinza deslizante (6).
Las clulas eucariotas contienen cinco polimerasas (_, `, a, b y ) con diferente localizacin y funcin celular. Las polimerasas _, b y intervienen en la replicacin del ADN nuclear, la polimerasa a participa en la replicacin del ADN mitocondrial (8,9), mientras que las polimerasas ` y intervienen en mecanismos de
reparacin.
Caractersticas generales de la replicacin

La replicacin del ADN presenta varias caractersticas comunes en sistemas
procariotas y eucariotas.
Es un proceso semiconservativo, en el que cada hebra de ADN parenteral se utiliza como molde para la sntesis de una nueva hebra complementaria.
La replicacin transcurre de forma ordenada y secuencial. Es un proceso bidireccional que se inicia en puntos fijos del cromosoma, con dos horquillas de replicacin que parten de esos orgenes. Cada horquilla est formada por dos hebras
hijas que se extienden sobre sus moldes originales de manera simultnea al desenrollamiento de la doble hlice parenteral.
Las ADN polimerasas no pueden iniciar la sntesis de nuevas cadenas y necesitan una molcula cebadora con un extremo 3hidroxilo libre sobre el que las poli-
REPLICACIN DEL ADN
17
merasas puedan adicionar nuevos nucletidos. Los cebadores son en general cortos
segmentos de ARN sintetizados por enzimas especializadas o primasas, aunque en
algunos casos tambin pueden actuar las ARN polimerasas.
La replicacin del ADN es semidiscontinua, pues debe de extender las dos
hebras de ADN antiparalelas en la misma direccin siguiendo el movimiento de la
horquilla de replicacin. La hebra de ADN que se sintetiza de forma continua
siguiendo el movimiento de la horquilla, se llama hebra conductora, mientras que la
hebra retardada, es la que crece en sentido contrario al movimiento de la horquilla
y se sintetiza de forma discontinua, en forma de pequeos fragmentos, llamados
fragmentos de Okazaki, que luego se unen para formar una hebra continua (1-4).
Aunque de forma general el proceso de replicacin es comn a todos los seres
vivos, existen diferencias importantes entre procariotas y eucariotas.
Replicacin en procariotas
Estudios realizados en E. coli han permitido proponer un modelo de replicacin
que, con algunas excepciones, puede considerarse un esquema bsico para la replicacin del ADN en muchas otras clulas.
1. Iniciacin
La sntesis de ADN comienza en un punto especfico del cromosoma, denominado origen de la replicacin (OriC en E. coli). El OriC consiste en una secuencia
de 245 pares de bases, que contiene cuatro repeticiones de una secuencia de nueve
nucletidos, que une la protena de iniciacin dnaA, y tres repeticiones directas de
una secuencia de 13 nucletidos, ricas en pares de bases A-T fcilmente desnaturalizables. Adems, el origen contiene 11 sitios de metilacin reconocidos por la enzima metilasa Dam y varios sitios de unin a protenas bsicas (HU e IHF) que facilitan que el ADN se doble, un paso importante en la secuencia que conduce a la
iniciacin de la replicacin.
En la iniciacin de la replicacin participan seis protenas diferentes (dnaA,
dnaB,dnaG, HU, topoisomerasa II y protenas SSB). El proceso se inicia con la
unin de una molcula de dnaA a cada una de las cuatro dianas de nueve nucletidos siempre que estas dianas estn completamente metiladas. A continuacin, varias
molculas adicionales de dnaA (entre 20-40) se aaden consecutivamente por un
proceso cooperativo formando un complejo al que tambin se unen las protenas
HU e IHF. La formacin de este complejo dobla el ADN de manera bastante brusca y crea una tensin superhelicoidal negativa que desenrolla el ADN en las regiones de 13 pares de bases, con la apertura de un corto bucle de hebra sencilla. A
continuacin, un complejo formado por seis monmeros de la protena dnaC y un
hexmero dnaB es guiado por la dnaA hacia la regin abierta donde la protena
dnaB, que es una enzima con actividad helicasa, contina desenrollando esta estructura y crea una burbuja de inicio de unos pocos centenares de pares de bases. La
18
Molde
superenrollado
ori C
Segmentos de 9 bp
Segmentos
de 13 bp
HU
ATP DnaA
Complejo
inicial
Insensibles a P1
2
20
38
5 mM ATP
Complejo
abierto
Sensibles a P1
38
3
Complejo
pre-iniciador
Sensibles a P1
4
Iniciacin
y rplica
Figura 2.1.
Inicio de la replicacin del ADN.
DnaB
DnaC
ATP
REPLICACIN DEL ADN
19
energa para la formacin de la burbuja se obtiene del ATP a travs de una reaccin
catalizada por la topoisomerasa II (Fig. 2.1).
La sntesis de un ARN cebador comienza con la adicin de la primasa dnaG al
dnaB para formar el primosoma. El primosoma interacciona con un molde de ADN
en cada una de las dos horquillas creadas por la burbuja de iniciacin y empieza la
sntesis de los ARN cebadores en las dos hebras conductoras. A continuacin, el
dnaB interacciona con la ADN polimerasa III formando el replisoma.
Para que tenga lugar la formacin de las nuevas cadenas es imprescindible la
separacin previa de las hebras del ADN parenteral. Las helicasas, son enzimas que
separan las hebras de ADN al frente de la horquilla de replicacin. Su efecto es el
de desestabilizar la interaccin entre pares de bases complementarias utilizando la
energa del ATP. Se mueven con una polaridad definida a lo largo de una u otra
hebra de ADN. En E. coli la principal helicasa implicada en el mecanismo de replicacin es la protena dnaB que se mueve a lo largo del molde de la hebra retardada.
Una topoisomerasa II alivia la tensin torsional creada por la helicasa.
5
3
Topoisomerasa
Doble hebra de ADN original
Helicasa de la hebra
conductora
Protena de
unin a hebra
sencilla
Primosoma
ARN cebador
Molde de la hebra retardada
Molde
de la hebra
conductora
ADN
polimerasa I
ADN de la
hebra
conductora
recin sintetizado
Fragmento de
Okazaki
ADN polimerasa
replicativa dimrica
Figura 2.2.
Horquilla de replicacin del ADN.
ADN de la hebra
retardada
ADN
ligasa
20
Cuando se han separado las hebras de ADN, las regiones de hebra sencilla generadas se estabilizan mediante su unin a protenas especficas, llamadas protenas
fijadoras de monohebra (SSB), que se unen al ADN de forma cooperativa (1,4).
2. Elongacin
Una molcula de la holoenzima de la ADN polimerasa III cataliza la formacin
de las hebras conductora y retardada. La sntesis de ambas hebras se produce de
forma coordinada pues en el molde de la hebra retardada se crea un bucle, originado por un giro de 180, que sita ambas hebras en la misma orientacin. Cuando el
extremo 5 de un fragmento de Okazaki naciente alcanza el extremo 3 de un fragmento sintetizado previamente, se rompe el bucle y se libera la hebra retardada,
entonces, la subunidad de la polimerasa III de la hebra retardada, que es poco procesativa, se disocia de su pinza deslizante que la une al molde de ADN, y se une
a la pinza en otro punto de la hebra retardada, donde la primasa ha sintetizado ya
un nuevo cebador. Finalmente los segmentos de ARN cebador de los distintos fragmentos de Okazaki son eliminados y reparados por la ADN polimerasa I y la unin
de los mismos catalizada por una ADN ligasa da lugar a hebras de ADN intactas.
(Fig. 2.2), (2,4,6).
3. Terminacin
La replicacin del ADN en el cromosoma circular de E. coli termina cuando las
dos horquillas de replicacin se encuentran en una regin terminal, que contiene
varias copias de una secuencia de 23 pares de bases llamada ter. Estas secuencias ter
detienen el movimiento de la horquilla de replicacin pues proporcionan un sitio de
unin a las protenas Tus que actan como contrahelicasas, interfiriendo la accin
de la dnaB.
Las protenas Tus son asimtricas y slo pueden detener el avance de los replisomas que alcanzan el complejo Ter-Tus desde una direccin especfica, pues de lo
contrario desplazaran la protena Tus de su unin a la secuencia ter. Cada replisoma debe traspasar todos los sitios que estn orientados en la direccin opuesta antes
de llegar a un sitio Tus que presenta la orientacin adecuada para la terminacin, lo
que impide que el replisoma se disocie del ADN hasta que se encuentre con otro
replisoma que entra en regin ter por el extremo opuesto. De esta manera se asegura la replicacin completa del cromosoma y se evita la sobrerreplicacin.
Los productos resultantes de la replicacin son dos cromosomas hijos concatenados, que son separados por accin de una topoisomerasa tipo II (7).
4. Regulacin de la replicacin
La regulacin de la replicacin tiene lugar en la etapa de iniciacin. En E. coli
el origen de replicacin contiene 11 copias de una secuencia susceptible de ser
metilada por la enzima metilasa Dam y el grado de metilacin del OriC regula la
REPLICACIN DEL ADN
21
disponibilidad de los sitios de unin a dnaA, as como la concentracin de dnaA.

Una vez iniciada la replicacin, el OriC hemimetilado, interacciona con la membrana plasmtica impidiendo el acceso de la dnaA a sus sitios de unin. Adems, la
unin del ADN cercano al OriC a la membrana celular secuestra el gen dnaA que
esta situado cerca del OriC, como resultado se inhibe la sntesis de dnaA, disminuyendo su concentracin celular (2,3).
Replicacin en eucariotas
La replicacin del ADN en eucariontes es un proceso esencialmente parecido al
que se da en procariontes. La formacin de una horquilla de replicacin, sntesis de
cebadores, creacin y maduracin de fragmentos de Okazaki son paralelos a las etapas correspondientes que se dan en procariontes, sin embargo el proceso en general
es bastante ms complejo, debido fundamentalmente al mayor tamao del ADN y
a su diferente empaquetamiento en la cromatina.
Estructura de la cromatina
El ADN se encuentra asociado con varias tipos de protenas formando la cromatina. El componente proteico de la cromatina, que constituye algo ms de la
mitad de su masa, se compone de dos tipos de protenas: las histonas, conjunto de
pequeas protenas bsicas, muy ricas en Lys y Arg, que participan en el plegamiento del ADN eucaritico y las protenas cromosmicas no histonas. La cromatina contiene tambin un pequeo porcentaje de ARN.
En todos los organismos eucariotas se han encontrado cinco tipos de histonas:
las histonas nucleosmicas H2A, H2B, H3 y H4 responsables del plegamiento del
ADN en los nucleosomas (unidades estructurales bsicas de la cromatina) y la histona H1. Las histonas nucleosmicas son protenas muy conservadas, mientras que
las histonas H1 son protenas ms grandes, de carcter ms bsico y ms especficas de especie y tejido. En vertebrados existe una histona adicional, la histona H5,
que tiene una funcin similar a la H1.
Las histonas se diversifican an ms mediante algunas modificaciones posttranslacionales de algunos aminocidos, como reacciones de acetilacin, fosforilacin, ADP-ribosilacin o metilacin.
Las protenas no histonas constituyen un grupo de protenas muy heterogneo.
Muchas de las protenas no histonas son enzimas o protenas reguladoras, otras
estn implicadas en la organizacin del cromosoma.
En la cromatina, el ADN y las histonas se organizan en unidades repetitivas llamadas nucleosomas. Cada nucleosoma (o partcula central del nucleosoma) es una
estructura en forma de disco, compuesta por dos unidades de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4 y una cadena de ADN de 146 pares de bases que se enro-
22
lla alrededor de este octmero de histonas como una superhlice negativa. Las histonas estn en contacto con el surco menor de ADN, dejando libre el surco mayor
para posibles interacciones con protenas reguladoras. Los nucleosomas incorporan
una molcula de histona H1 que interacciona con ambos extremos del ADN a la
entrada y a la salida del nucleosoma para formar el cromatosoma.
Las fibras de cromatina estn constituidas por una larga cadena de nucleosomas
unidos por una regin de ADN de longitud variable (de aproximadamente 15-55
pares de bases) denominado ADN de unin.
La formacin de los polinucleosomas representa el primer nivel de estructuracin o empaquetamiento del ADN eucaritico, dando lugar a la denominada fibra de
10nm. Sin embargo, gran parte de la cromatina del ncleo esta todava ms compactada. La histona H1 juega un papel clave en el siguiente nivel de compactacin
al servir como puente de unin entre nucleosomas adyacentes para formar una hlice solenoidal con 6 o 7 nucleosomas por vuelta que constituye la fibra de 30 nm.
Se cree que el siguiente nivel de organizacin ocurre cuando los filamentos de
cromatina de la fibra de 30 nm se organizan en dominios condensados en forma de
bucles de tamao variable segn los organismos. Estos bucles estn anclados en su
base a un andamiaje de protenas (matriz nuclear), compuesto por histona H1 y
otras protenas no histonas incluyendo una topoisomerasa tipo II que podra regular posibles superenrollamientos. La condensacin de los cromosomas mitticos
resulta probablemente de la disposicin de la fibra de 30nm en forma de enrollamientos helicoidales estrechamente apilados (10,11).
Parece probable que la estructura de la cromatina sea dinmica, con cambios
locales a medida que el ADN se replica o se transcribe. Los cambios en el empaquetamiento y por tanto, la transicin entre las diferentes formas de la cromatina,
parecen estar controladas por medio de modificaciones covalentes en las histonas.
Las histonas H3 y H4 pueden experimentar una acetilacin reversible dependiente
del ciclo celular en el grupo -amino de los restos de Lys, mediante dos enzimas
diferentes, una histona acetilasa y una histona desacetilasa. El grupo hidroxilo del
residuo N-terminal Ser de la histona H4 puede ser fosforilado mediante una quinasa. La acetilacin y fosforilacin cambian la carga de la regin N-terminal de estas
histonas de positiva a negativa y promueve la descondensacin de la cromatina. La
fosforilacin de la histona H1 en los grupos de hidroxilo de restos de Ser est correlacionada con la condensacin de la cromatina para dar lugar a los cromosomas
metafsicos (11,12).
Para que el ADN eucaritico sea accesible a la ADN polimerasas, los nucleosomas deben desensamblarse, a medida que avanza la horquilla de replicacin y luego
reensamblarse en las molculas de ADN hijas, segn una de las hiptesis propuestas cada nucleosoma se dividira durante la replicacin en dos medios nucleosomas permitiendo el acceso de la ADN polimerasa al ADN nucleosmico desenrollado. Adems, en base al mayor contenido en ADN de las clulas animales y a la
menor actividad de sus ADN polimerasas, el ciclo de replicacin de la clula eucaritica tardara mucho tiempo en completarse si no entraran en accin factores de
compensacin.
REPLICACIN DEL ADN
23
Las clulas eucariticas contienen un gran nmero de molculas de ADN polimerasas en comparacin con las bacterias. Adems las polimerasas inician la sntesis bidireccional no en uno, sino en varios puntos de iniciacin a lo largo del cromosoma. Los segmentos de ADN situados entre dos puntos de iniciacin se
denominan replicones.
Papel de las polimerasas eucariticas

A diferencia de lo que ocurre en procariotas, en los que la sntesis de ADN est
catalizada por dos subunidades diferentes de la ADN polimerasa III, en eucariotas
este proceso es realizado por enzimas diferentes (polimerasas _ y b).
La ADN polimerasa _ es una protena tetramrica, la subunidad mayor tiene
actividad polimerizante 5-3 y en algunos tipos celulares tambin dispone tambin
de actividad exonuclesica 3-5, otras dos subunidades de menor tamao confieren
a la enzima actividad primasa. El complejo ADN polimerasa _/primasa parece iniciar la sntesis en ambas hebras de ADN al sintetizar un segmento de ARN-cebador
cuyo extremo 3-hidroxilo es extendido por la actividad polimerasa para formar una
corta secuencia de ADN llamada ADN i. La ADN polimerasa _, a diferencia de
otras polimerasas ms complejas, no puede catalizar la sntesis procesativa de ADN
y se disocia del molde despus de la sntesis del cebador. Los segmentos de ARNADN sern luego extendidos por la ADN polimerasa b (o ).
La ADN polimerasa b es una polimerasa de alta procesividad que cataliza la
elongacin de las hebras conductora y de los fragmentos de Okazaki de la hebra
retardada. Esta enzima contiene una subunidad de mayor tamao dotada de actividad polimerizante 5-3 y exonuclesica 3-5 correctora de pruebas.
La elevada procesividad de la ADN polimerasa b se atribuye a la presencia de
un factor accesorio conocido como antgeno de proliferacin nuclear (PCNA), pues
se encuentra en grandes cantidades en los ncleos de las clulas proliferativas. Tres
molculas de PCNA estrechamente asociadas forman un anillo cerrado en torno al
ADN que acta como una pinza deslizante impidiendo la disociacin de la enzima. Esto sugiere que en los eucariotas el PCNA es el equivalente funcional de la
subunidad ` de la ADN polimerasa III de E. coli.
El factor de replicacin C (RFC) es otra protena accesoria que parece interaccionan con la ADN polimerasa b favoreciendo su asociacin al PCNA.
Alternativamente, el RFC podra participar en el establecimiento de un enlace entre
las ADN polimerasas _ y b. La sntesis del ADN eucaritico requiere la participacin del factor de replicacin A que es el equivalente funcional de las protenas
procariotas (SSB). En eucariotas, las helicasas no parecen estar relacionadas con la
actividad primasa, sino que se asocian a la ADN polimerasa (1,2,8,9).
En la maduracin de los fragmentos de Okazaki, el ARN cebador es eliminado por la accin consecutiva de dos endonucleasas: ARNasa I y FEN1.
Alternativamente, podra actuar primero una helicasa, la Dna2, desplazando el ARN
cebador, para crear una estructura en forma de fleco sobre la que puede actuar la
24
A. ARNasa H1/FEN1
ARN
primer
3
B. Dna2/FEN1
ADN
3
5
ARNasa H1
3
5
3
Dna2 helicasa
FEN1
FEN1
3
5
Figura 2.3. Mecanismos de eliminacin del ARN cebador por accin de la ARNasa H1 (A) y la
ADN helicasa (B).
endonuclesa FEN1 (Fig. 2.3). Tambin se ha sugerido que la helicasa Dna2 podra
desplazar toda la secuencia ARN-ADNi sintetizada por la ADN polimerasa, para ser
sustituida por nuevos desoxirribonucletidos, lo que representara una ventaja significativa para el mantenimiento de la integridad de genoma, pues la ADN polimerasa _ no parece presentar actividad correctora de pruebas (8).
La ADN polimerasa es una protena monomrica grande dotada de actividad
polimerasa, exonucleasa 3-5 correctora de pruebas y exonucleasa 5-3, que podra
participar en la reparacin del ADN y el relleno de los fragmentos de Okazaki, de
forma anloga a la polimerasa I de E. coli.
Orgenes de replicacin en eucariotas
Los orgenes de replicacin en eucariotas han sido identificados en levaduras y
reciben el nombre de secuencias de replicacin autnoma (ARS). Los ARS tienen
entre 100 y 120 pares de bases y constan de una regin central A y tres elementos
B. La regin central A contiene varias secuencias de consenso de 11 pares de bases
que parecen anlogas a las secuencias de 13 nucletidos del OriC.
La unin de protenas a estas secuencias forma el complejo de replicacin
(ORC) que promueve la apertura de las hebras de ADN en las secuencias centrales
ricas en A-T. La regin abierta de ADN se estabiliza por protenas de unin a monohebra RPA y una helicasa extiende la regin abierta permitiendo el acceso de las
REPLICACIN DEL ADN
25
polimerasas. Cerca de la regin A, los elementos B1 y B2 ayudan a la formacin del

ORC mientras que los elementos B3 estn asociados al factor de transcripcin
ABF1 (2,13).
En eucariotas la replicacin tiene lugar durante la fase sinttica (fase S) del
ciclo celular. Se produce bidireccionalmente a partir de mltiples orgenes creando
burbujas de replicacin que crecen de manera independiente hasta que se fusionan copiando todo el cromosoma. No todos los orgenes inician la replicacin al
mismo tiempo, el proceso de copia empieza en centenares de orgenes, algunos de
los cuales son activados al principio de la fase S mientras otros son activados al final
de la misma. Coordinar la sntesis de ADN en clulas eucariticas significa coordinar la copia de millares de pares de bases, distribuidos en numerosos cromosomas
y slo en el momento adecuado del ciclo celular. Resultados recientes indican que
el complejo ORC no acta slo en el control de la iniciacin, una o ms protenas
adicionales, que podran estar implicadas en el control del ciclo celular, pueden interaccionar en los orgenes de replicacin al final de la mitosis y permanecer unidas
a ellos, inhibiendo la formacin de un nuevo complejo ORC hasta el inicio de la
fase S. Otra hiptesis alternativa sugiere que protenas iniciadoras o factores permisivos necesarios para la replicacin, podran unirse dbilmente a los orgenes de
replicacin y seran destruidos o inactivados por el paso de la horquilla de iniciacin (13,14).
Replicacin en los extremos de los cromosomas lineales

Los cromosomas lineales necesitan una serie de pasos adicionales que permitan
la replicacin de sus extremos. En eucariotas existe un mecanismo para la replicacin de los telmeros que implica la participacin de la enzima telomerasa. Esta
enzima reconoce la cadena rica en G de una secuencia telomrica repetida y la alarga en direccin 5-3. En ausencia de una cadena de ADN complementario, la telomerasa sintetiza una copia de la secuencia repetida empleando un molde de ARN
que es componente de la propia enzima. Despus de varios ciclos de extensin por
la telomerasa, se puede completar la replicacin empleando dichas extensiones
como molde para la sntesis de la cadena complementaria por la ADN polimerasa.
El proceso de recorte y recuperacin est equilibrado solo aproximadamente, cada
extremo de cromosoma contiene un nmero variable de repeticiones en tndem de
varios cientos de pares de bases de longitud (15).
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3
Estructura y procesamiento del ARN
I. Roncero
Introduccin
El proceso global de transferencia de la informacin en la clula puede representarse mediante el esquema:
ADN A ARN A PROTENAS
La expresin de la informacin gentica contenida en un segmento de ADN,
siempre tiene lugar a travs de una molcula de ARN. Con la excepcin de los genomas de ARN de ciertos virus, todas las molculas de ARN se forman a partir de la
informacin contenida en el ADN. Mediante un proceso llamado transcripcin, un
sistema enzimtico convierte la informacin gentica contenida en un segmento de
ADN en una cadena de ARN con una secuencia de bases complementaria a una de
las cadenas de ADN.
Estructura del ARN

Estructura primaria
El ARN es un polmero lineal de ribonuclesidos 5monofosfato. Las bases que
forman el ARN son: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y uracilo (U). El azcar
que forma los nuclesidos en el ARN es la ribosa, en lugar de la 2 desoxirribosa
que aparece en el ADN. Los nuclesidos estn unidos entre s por enlaces 3, 5 fosfodister originando una cadena a partir de la cual se extienden las bases.
Qumicamente el ARN es muy similar al ADN, con las nicas diferencias del
grupo OH en la posicin 2 del azcar y la sustitucin de la base timina por uracilo. Sin embargo, estas pequeas diferencias confieren al ARN una mayor diversidad
estructural y funcional que el ADN. Las molculas de ARN no slo transportan y
28
expresan informacin sino que tambin actan como catalizadores. Por otra parte,
el ADN est diseado para ser estable, mientras que las molculas de ARN han de
variar a lo largo del desarrollo celular, por lo tanto, estas pequeas diferencias
estructurales podran ser tambin marcadores que permitan a enzimas especficos
reconocer y degradar selectivamente el ARN. La longitud de las molculas de ARN
en eucariotas vara desde unos 65 hasta unos 200.000 nucletidos.
Estructura secundaria
A diferencia del ADN, el ARN es una molcula monohebra que est presente en
la clula predominantemente como una cadena simple. Una cadena sencilla de ARN
puede plegarse de forma que las bases formen pares semejantes a los del ADN,
dando lugar a una estructura secundaria como resultado de la presencia de pequeas regiones de apareamientos intramoleculares entre bases.
En el ARN existe una cantidad considerable de estructura helicoidal, incluso en
regiones sin apareamientos moleculares de Watson y Crick, debida sobre todo a
fuerzas de apilamiento de bases entre residuos de A, G y C.
Aunque el ARN bicatenario forma una hlice dextrgira parecida a la del ADN,
las estructuras helicoidales del ARN son en general del tipo A, una hlice ms
compacta que la del tipo B, con ms pares de bases por vuelta y en la que los
pares de bases estn inclinados con respecto al eje de la hlice. Las regiones de
doble hlice en el ARN se denominan horquillas y las regiones sin emparejar
bucles. La estructura de las horquillas es variable al igual que el tamao y el
nmero de bucles.
Estructura terciaria
Las estructuras funcionales reales del ARN son ms complejas que las hlices
por apareamiento o apilamiento de bases antes mencionados. Adems de la estructura secundaria, las molculas de ARN se pliegan sobre s mismas, dando lugar a
una estructura terciaria en la que se establecen un gran nmero de enlaces por puentes de hidrgeno y otros tipos de interacciones dbiles. Los brazos y bucles se pliegan en conformaciones especficas que se mantienen no slo por los emparejamientos de bases tradicionales de Watson y Crick, sino tambin por interacciones
entre bases que implican a ms de dos nucletidos. El grupo 2-OH de la ribosa es
un dador y aceptor de hidrgeno, contribuyendo de forma importante al mantenimiento de la forma plegada de la molcula de ARN.
Clases de ARN
Segn la funcin que cumplen, existen tres clases principales de ARN:
ESTRUCTURA Y PROCESAMIENTO DEL ARN
29
ARN mensajero (ARNm): Es el portador de la secuencia de bases que codifican

la secuencia de aminocidos de uno o ms polipptidos especificados en un gen o
conjunto de genes. Las molculas de ARNm sirven como molde para la sntesis de
protenas y llevan la informacin desde el ADN hasta los ribosomas.
ARN de transferencia (ARNt): El ARNt acta como un adaptador que lee la
informacin codificada en el ARNm y transfiere el aminocido adecuado a la cadena polipeptdica en crecimiento durante la sntesis de protenas. Los ARNst transfieren los aminocidos especficos desde los pools de aminocidos solubles a los
ribosomas y aseguran el ordenamiento de estos aminocidos en la secuencia adecuada antes de la formacin del enlace peptdico. Existe, al menos, un ARNt especfico para cada uno de los 20 aminocidos que forman las protenas.
ARN ribosmico (ARNr): Los ARNsr forman, junto con protenas la compleja
maquinaria que cataliza la sntesis proteica: los ribosomas. Los ribosomas son partculas subcelulares formados por, al menos tres molculas diferentes de ARNr y de
70 a 80 protenas ribosmicas.
Procesamiento del ARN

Gran parte de las molculas de ARN en procariotas y virtualmente todas las
molculas de ARN de eucariotas son modificadas en mayor o menor grado despus
de su sntesis. Una molcula de ARN recin sintetizada se llama transcrito primario
y ste debe ser modificado posteriormente para dar una molcula de ARN madura,
funcionalmente activa.
Las reacciones que dan lugar a las formas maduras del ARN comprenden:
Adicin de secuencias o nucletidos no codificados por los genes correspondientes.
Modificacin covalente de determinadas bases o residuos de ribosa.
Separacin de diferentes secuencias por accin de nucleasas especficas.
Transporte del ARN desde el ncleo al citoplasma.
Degradacin completa del ARN para ser reemplazado por ARN recin sintetizado.
El procesamiento del ARN est relacionado con la estabilidad. Generalmente
niveles elevados de procesamiento se corresponden con ARNs muy estables, si bien
la estabilidad depende tambin del grado de estructura secundaria. En este sentido,
las molculas estables de ARNt y ARNr con vidas medias del orden de horas a das,
constituyen un caso extremo. Estas molculas, como se ver ms adelante, presentan estructuras secundarias con alto grado de apareamiento de bases y estructuras
terciarias que les confieren resistencia a nucleasas celulares ubicuas. Tanto en procariotas como en eucariotas, estas especies de ARN resultan de un procesamiento
extenso de los transcritos primarios. En el extremo opuesto estn las molculas de
mARN procaritico que tienen vidas medias de minutos. Estas molculas carecen
de una estructura secundaria particular y raramente son procesadas. Entre estos dos
30
extremos estn las molculas de ARNm eucaritico, cuyas vidas medias son del
orden de horas. Aunque carecen de estructura secundaria definida, estas molculas
sufren un proceso extenso de maduracin.
La inclusin del procesamiento entre la transcripcin del ARN y la actividad
completa del mismo supone para la clula un punto importante de regulacin de la
expresin gnica. El procesamiento del ARN tiene lugar en el ncleo de la clula y
slo cuando este proceso se ha completado el ARN es transportado al citoplasma.
Estudiaremos a continuacin la estructura y el procesamiento de cada uno de las
tres clases principales de ARN.
ARN mensajero
Los ARNm son los portadores directos de la informacin gentica desde el
ncleo a los ribosomas. Son productos de la transcripcin del ADN genmico, con
unas caractersticas especiales que los destinan a unirse a los ribosomas.
Cada ARNm eucaritico contiene informacin para una sola cadena polipeptdica, por lo que se llaman monocistrnicos, mientras que las especies de ARNm
policistrnicas de procariotas pueden codificar ms de una protena.
Los ARNm eucariticos maduros tienen rasgos estructurales nicos que no aparecen en las molculas de ARNt ni en las de ARNr (Fig. 3.1A). El extremo 5 del
ARNm de eucariotas comienza con una estructura llamada casquete o caperuza
(cap) formado por una base nitrogenada metilada, generalmente 7 metil guanosina
(m7G), unida al primer nucletido del transcrito mediante enlaces 5,5-fosfotrister en lugar de los enlaces 3,5-fosfodister habituales. El primer nucletido transcrito es generalmente una purina y est metilado en el 2OH de la ribosa. A continuacin del casquete viene una secuencia que no se traduce, llamada secuencia
conductora o leader, seguida de la secuencia o codn de iniciacin, que generalmente es AUG y a continuacin el mensaje que se ha de traducir o regin codificadora. Al final de la regin codificadora se encuentra una secuencia o codn de terminacin (UAG, UGA o UAA) que seala el final de la sntesis del pptido. Sigue
una secuencia no traducida, secuencia remolque (trailer) que termina con una serie
de cidos adenlicos, llamada cola de poli(A) que constituye el extremo 3 de la
molcula de mARN y puede tener una longitud de 20 a 200 nucletidos.
Procesamiento del ARNm

Los rasgos estructurales que acabamos de describir para las molculas de
ARNm maduro de eucariotas no estn presentes en los transcritos primarios, stos
los adquieren en el ncleo durante el proceso de maduracin que comprende:
Adicin del casquete 5.
Adicin de la cola de poli(A) 3 terminal.
31
A
Transcrito primario
3
5
AUG
UAG
Procesamiento
RNAm
3
5
7
m Gppp
CAP
UAG
AUG
Secuencia
conductora
no traducida
Secuencia codificadora
traducida
(AAAA)n
Secuencia final no
traducida
B
3
5
OH 3
3
3 OH
G
A
G
P
G
A
P
G
U
A
A
G
U
G
A
OH-A
G
U
A
A
G
U
G
A
G
P
G
A
A
G
P
G
A
5
+
G
U
A
A
G
U
Figura 3.1. Estructura y procesamiento del ARNm. (A) Estructura del ARNm eucaritico.
(B) Mecanismo de eliminacin de intrones.
Modificacin covalente de nucletidos.

Eliminacin de secuencias no codificantes (splicing).
Adicin del casquete 5

El extremo 5 de los transcritos primarios del ARNm eucaritico, es modificado covalentemente antes de que finalice completamente la transcripcin. A medida
que el complejo de transcripcin se desplaza a lo largo del ADN, las enzimas encargadas de la unin del casquete modifican el extremo 5 del ARNm naciente. La
modificacin tiene lugar de la siguiente forma:
El grupo a-fosfato del nuclesido trifosfato terminal se escinde por accin de
una fosfohidrolasa.
32
El grupo 5-difosfato resultante reacciona con el fosfato en posicin _ de una

molcula de GTP para generar un enlace 5,5-trifosfato. Esta reaccin est
catalizada por la guanililtransferasa que junto con la fosfohidrolasa de la
reaccin anterior, forman una enzima dimrica que est asociada al extremo
C-terminal de la ARN polimerasa II.
En la mayora de los eucariotas los ARNms son metilados en el nitrgeno en
posicin 7 de la guanina recin aadida a expensas de S-adenosil metionina
como dadora del grupo metilo. El casquete puede a su vez ser modificado de
diferente forma segn la especie de que se trate. As, puede metilarse el
grupo 2-OH del ltimo nucletido del transcrito original o los grupos 2-OH
de los dos ltimos nucletidos.
La funcin del cap es importante ya que interviene en diferentes procesos. As:
1) protege al ARNm de las actividades 5 exonucleolticas al bloquear el extremo 5
de la molcula; 2) convierte a los precursores del ARNm en sustrato de las siguientes etapas de procesamiento; 3) constituye un sitio de reconocimiento por factores
de iniciacin de la traduccin; 4) se une a protenas nucleares que dirigen el transporte de las molculas de ARNm maduras desde el ncleo al citoplasma; y 5) sirve
de centro de anclaje a los ribosomas.
Adicin de la cola de poli(A)

Los precursores del ARNm eucaritico son tambin modificados en el extremo 3. Una vez que la ARN polimerasa II ha sobrepasado el extremo 3 terminal de
la regin codificadora del ADN, el ARN es escindido por una endonucleasa cerca
de un sitio especfico cuya secuencia consenso es AAUAAA. La escisin tiene
lugar a unos 15-20 nucletidos hacia el extremo 3 del sitio de reconocimiento
AAUAAA y depende tanto de secuencias adicionales como de la estructura secundaria del precursor del ARNm. La escisin endonucleoltica genera un nuevo extremo 3 que puede ser utilizado como cebador para la adicin de residuos de adenosina en reaccin catalizada por la poli A polimerasa. Este proceso, que requiere ATP
y puede aadir hasta 250 nucletidos, puede representarse:
ARNm precursor + nATP A ARN(AMP)n + nPPi
El proceso de poliadenilacin no suele estar acoplado a la terminacin de la
transcripcin, que puede continuar cientos de nucletidos detrs del sitio de rotura
3 terminal. La longitud de la cola de poli(A) vara desde 50 a 250 nucletidos,
dependiendo de la especie y de otros factores, como el tipo de ARNm y el estado de
desarrollo de la clula. Tambin depende de la edad del ARNm, ya que la cola se va
acortando con el tiempo, de hecho se acorta en 50-100 nucletidos en el tiempo que
transcurre hasta que el ARNm maduro alcanza el citoplasma. Esta reduccin se
debe a la accin de exonucleasas especficas del extremo 3 terminal del ARN. As
la cola de poli(A) retrasa la llegada de estas exonucleasas a la regin codificadora
33
del ARNm, protegindole de su degradacin enzimtica. La colas de poli(A) se asocian con una protena de 78 kD formando un complejo que posiblemente contribuye a la estabilidad del ARNm.
Eliminacin de intrones
En eucariotas, los ARNm citoplasmticos son ms cortos que sus transcritos
primarios, los cuales tienen secuencias internas y terminales adicionales. Un transcrito primario de un ARNm eucaritico contiene generalmente secuencias que
abarcan un gen. Sin embargo, las secuencias que codifican un polipptido no son
contiguas. En la mayora de los transcritos primarios, las secuencias codificantes,
llamadas exones, estn interrumpidas por secuencias no codificantes llamadas
intrones (Fig. 3.1). En el proceso llamado de corte y empalme (splicing) se eliminan los intrones del transcrito primario y se unen los exones para formar una
secuencia contigua que codifica un polipptido.
El descubrimiento de los intrones a mediados de los aos setenta, cambi la idea
que se tena sobre la organizacin de los genes. Hasta entonces, se asuma que el
ARNm maduro era una copia exacta de la hebra molde del ADN, y era traducido de
un extremo a otro ntegramente. Este concepto se basaba en experimentos realizados con bacterias, en los que el orden y la distancia entre mutaciones en un gen eran
idnticos al orden y la distancia entre los aminocidos modificados en la protena
correspondiente. As, las secuencias de aminocidos en las protenas parecan estar
codificadas por el ADN sin interrupcin. Hoy da est bien establecido que esto ocurre slo en bacterias y en unos pocos eucariotas, en los que la secuencia de ADN que
codifica una protena es continua.
Los intrones se cortan del transcrito primario y se empalman los exones formando el ARN maduro funcional, en un proceso que tiene lugar mediante reacciones sucesivas de transesterificacin y en el que algunas de las enzimas que intervienen estn constituidas por ARN y no por protena. Adems algunas de estas
molculas de ARN estn localizadas en los propios intrones, donde autocatalizan su
eliminacin.
Cmo reconoce la clula las secuencias pertenecientes a los intrones y que por
tanto debe eliminar y las que deben permanecer en el ARN maduro? Los sitios de
corte de las molculas precursoras de ARNm contienen secuencias consenso relacionadas entre s. Adems, a una distancia de entre 10 y 40 nucletidos del extremo
3 terminal del intrn, existe una secuencia consenso, denominada sitio de ramificacin, que tiene un papel muy importante en el proceso de corte y empalme.
Estas secuencias se representan en el esquema siguiente:
Sitio de ramificacin
5AGGUAAGUAYYYYYYYYYYAGG3
exn5
intrn
exn3
34
y tienen como caractersticas: 1) en todos los genes eucariticos aparece la secuencia GU en el punto en el que el extremo 5 del intrn se une al exn 5. 2) la secuencia AG marca el punto de unin del extremo 3 terminal del intrn con el exn 3;
y 3) un residuo de adenosina situado entre 10 y 40 nucletidos ms arriba del sitio
de corte 3 forma parte del sitio de ramificacin. En el esquema anterior, Y puede
ser cualquier nucletido de pirimidina.
La importancia de estas secuencias se manifiestan por los efectos que su alteracin produce en el proceso de corte y empalme, que se ve afectado cuando en ellas
se sustituye algn nucletido sobre todo en AG y GU. En muchas especies el proceso es alterado por mutaciones espontneas en estas secuencias. As, en el hombre,
pueden aparecer mutaciones que alteran el patrn de procesamiento normal de los
genes de las globinas _ y `, dando lugar a cadenas anormales en la hemoglobina
(talasemias). Por ejemplo, una mutacin de G a A en la secuencia GU por la que
empiezan todos los intrones, implica que la maquinaria de empalme no la reconocer como tal secuencia y pasar por alto la unin exn-intrn, dando como resultado la aparicin de secuencias adicionales en el ARNm de la ` globina o la eliminacin de secuencias en el mismo. En cualquier caso, la cantidad de ` globina
funcional estar reducida.
En los precursores de los ARNm eucariticos, los intrones son eliminados
mediante dos reacciones de transesterificacin, una entre el sitio de corte 5 del
intrn y un resto de adenilato del sitio de ramificacin y otra entre el exn 5 y el
sitio de corte 3 del intrn. Los productos de estas reacciones son los dos exones
ligados entre s y el intrn separado en forma de lazo (Fig. 3.1B). Estas reacciones
estn catalizadas por un complejo de protena y ARN de gran tamao (3.103 kD)
y complejidad denominado complejo de splicing o espliceosoma. Las molculas de
ARN que forman este complejo pertenecen a una clase de ARN eucaritico llamado ARN nuclear pequeo (ARNsn) y se asocian con protenas dando lugar a complejos denominados ribonucleoprotenas nucleares de pequeo tamao (RNPsn).
En las reacciones de corte y empalme intervienen cinco tipos de molculas de
ARNsn: U1, U2, U4, U5 y U6 (U es la abreviatura de uracilo, una base muy frecuente en este tipo de molculas). Cada una de las molculas U1, U2, U5 constituyen el ncleo de una RNPsn determinada. U4 y U6 forman parte conjuntamente
de la estructura de otra RNPsn. Adems cada RNPsn contiene protenas que son
comunes a todas las snRNPs y otras que son exclusivas de cada complejo snRNP
particular (Tabla 3.1).
Mecanismo del corte y empalme: El proceso empieza con la unin del complejo RNPsnU1 al sitio de corte 5 del intrn. ARNsnU1 contiene una secuencia complementaria a la secuencia consenso del extremo 5 del intrn y la unin se realiza
mediante el apareamiento entre estas secuencias complementarias en el ARNU1 y
el ARNm precursor. Este apareamiento convierte al intrn en diana del mecanismo
subsiguiente de eliminacin. A continuacin, RNPsnU2 se une al sitio de ramificacin del intrn y U1 y U2 se asocian acercando entre s los extremos 5 y 3 del
intrn, lo que permite que U1 se aparee tambin con el centro de empalme 3. El
complejo U4 U5 U6 previamente formado, se une al formado por U1 U2 y el pre-
Tabla 3.1.
35
Molculas de ARNsn y RNPsn que forman el espliceosoma.
ARNsn
RNPsn
U1
snRNPU1
Unin al centro de empalme 5y

despus al centro de empalme 3
U2
snRNPU2
Unin al sitio de ramificacin
U5
snRNPU5
Unin al centro de empalme 5
U4
SnRNPU4U6
U6
Funcin
Enmascarar la actividad cataltica de U6

Catalizar el empalme
cursor del ARNm, dando lugar al espliceosoma completo pero inactivo. La ruptura
del apareamiento entre U4 y U6, libera la actividad cataltica de U6, que junto con
los dems componentes del espliceosoma llevarn a cabo la reaccin completa de
corte y empalme. As pues, U4 acta como un inhibidor que enmascara a U6 hasta
que todos los centros especficos de empalme estn perfectamente alineados. El
resultado de la reaccin es el corte preciso del intrn y la unin de los exones para
dar lugar al ARNm maduro. El proceso requiere ATP, aunque parece que ste es
necesario para el ensamblaje del espliceosoma pero no para las reacciones de corte
y empalme del ARN. En este proceso, las molculas de snARN juegan un papel
clave en el alineamiento de los centros de empalme y en la catlisis. Por otra parte,
la escisin de cada intrn comporta el ensamblaje y desensamblaje de un espliceosoma.
En eucariotas, los transcritos primarios pueden tener seales moleculares para
dos o ms rutas alternativas de maduracin, de modo que se pueden producir uno o
ms mARN segn la ruta escogida. La maduracin diferencial del ARN da lugar a
mltiples productos a partir de un gen: Una nica secuencia de ADN puede dar
lugar a diferentes protenas debido a cortes y empalmes alternativos en el transcrito primario. La regulacin del proceso de splicing puede generar diferentes versiones de una protena en diferentes tipos celulares, de acuerdo con las necesidades de
la clula.
ARN de transferencia (ARNt)

El ARNt transporta los residuos de aminocidos para ser adicionados a las cadenas polipeptdicas crecientes durante la sntesis de protenas. El ARNt reconoce las
secuencias de tres bases que codifican para un aminocido (codones) en el ARNm
transfiriendo el aminocido correcto a la cadena polipeptdica en formacin. Desde
el punto de vista estructural, las molculas de ARNt presentan dos centros activos:
la secuencia CCA en el extremo 3, a la cual se une enzimticamente el aminocido especfico y una secuencia de tres bases (anticodn) que se aparea especficamente con el codn correspondiente en el ARNm. Cada ARNt puede transferir un
solo tipo de aminocido.
36
A pesar de las diferencias en sus estructuras primarias, todas las molculas de

ARNt tienen una estructura secundaria comn con apariencia de hoja de trbol,
que se divide en varios lazos y brazos (Fig. 3.2). El triplete del anticodn se
encuentra en una de las hojas del trbol, mientras que la secuencia aceptora del
aminocido, CCA, se encuentra en el tallo. Las molculas de ARNt se pliegan
sobre s mismas dando lugar a una estructura terciaria en forma de L, como consecuencia de apareamientos de Watson y Crick entre bases y de otras interacciones
dbiles. Aunque las estructuras de todos los ARNt son muy similares, presentan
diferencias estructurales sutiles que permiten que cada ARNt sea reconocido por
una aminoacil ARNt sintetasa especfica que cataliza la unin de un determinado
aminocido a su extremo 3.
Procesamiento del ARNt

Los precursores del ARNt se modifican por corte, adicin y modificacin de
bases. Los ARNt proceden de precursores ms largos por eliminacin enzimtica
de nucletidos en los extremos 5 y 3. En algunos casos, los transcritos primarios
de ARNt tienen tambin intrones en la regin del anticodn que deben ser eliminados.
En primer lugar, el transcrito primario es recortado de forma inespecfica para
dar lugar a un precursor con extensiones en los extremos 3 y 5 relativamente cortas. A continuacin una endonucleasa llamada ribonucleasa P (ARNasa P), que es
una ribozima, elimina los nucletidos extra del extremo 5 mediante un corte endonucleoltico y los del extremo 3 son eliminados por una o ms nucleasas entre las
que se encuentra una exonucleasa, llamada ARNasa D. Tras la eliminacin de la
extensin 3, se realiza la sntesis del extremo CCA, catalizada por la ARNt nucleotidil transferasa, que utiliza como sustratos ATP y CTP. Los intrones se eliminan
5
ARNasa P
A 3
C
C
ARNasa D
ATP
CTP
A 3
C
C
Nucleotidiltransferasa
Brazo aceptor
5
Endonucleasa
Ligasa
ATG
Intrn
Transcrito primario
Figura 3.2.
Estructura y procesamiento del ARNt.
Bucle del
anticodn
tARN maduro
37
por un sistema enzimtico de dos componentes, uno es una endonucleasa que elimina el intrn y el otro una ligasa, resella la cadena nucleotdica.
Los nucletidos de los ARNt son los que se encuentran ms modificados de
todos los cidos nucleicos. En todos los ARNt se encuentran bases poco frecuentes
que se forman por modificacin enzimtica de los nucletidos normales. La mayora de las modificaciones consisten en metilacin, desaminacin o reduccin y se
llevan a cabo por enzimas que son especficas para un determinado sitio o para una
secuencia de nucletidos, pero no para una determinada molcula de ARNt. Todas
las modificaciones se producen postranscripcionalmente y la mayor parte se completan antes de que los precursores sean procesados a ARNt maduros.
ARN ribosmico (ARNr)

La sntesis de protenas tiene lugar en los ribosomas, que son complejos supramoleculares formados por protenas y ARN.
Los ribosomas de procariotas, con un coeficiente de sedimentacin de 70S,
estn formados por dos subunidades de tamao diferente (Fig. 3.3). La subunidad
mayor (50S), contiene una molcula de ARNr 5S, una de 23S y 34 protenas. La
subunidad menor (30S), est formada por una molcula de ARNr de 16S y 21 protenas. Las protenas se designan L1 a L34 las de la subunidad mayor y S1 a S21 las
de la subunidad menor.
Los ribosomas en eucariotas (80S) son mayores y ms complejos que los de procariotas. Tambin constan de dos subunidades cuyo tamao vara segn las especies, pero que por trmino medio tienen un coeficiente de sedimentacin de 60S y
40S respectivamente. La subunidad pequea tiene un ARNr 18S y la grande una
molcula de cada uno de los ARNr de 5S, 5,8S y 28S. En conjunto, los ribosomas
eucariticos contienen ms de 80 protenas diferentes, con excepcin de los de las
mitocondrias y los cloroplastos que son ms sencillos. Tanto en procariotas como en
eucariotas las dos subunidades tienen forma irregular y se encajan de manera que
entre ellas queda una hendidura, a travs de la cual pasa el ARNm a medida que el
ribosoma se desplaza a lo largo de dicho ARNm durante la traduccin y de la que
emerge la cadena polipeptdica recin sintetizada.
Los ARNr constituyen el 80 % del ARN celular total y son metablicamente
estables. Esta estabilidad, necesaria para el funcionamiento repetido del ribosoma,
se ve aumentada por su estrecha asociacin con las protenas ribosmicas.
Procesamiento del ARNr

El procesamiento del ARNr tiene lugar en el nucleolo e incluye rotura del precursor para obtener el tamao funcional, emparejamiento interno de bases, modificacin de determinados nucletidos y asociacin con protenas ribosmicas para dar
una conformacin terciaria estable.
38
Ribosoma procaritico
Ribosoma eucaritico
70S
80S
50S
60S
ARNr 5S
ARNr 23S
34 protenas
30S
ARNr 16S
21 protenas
Figura 3.3.
ARNr 5S
ARNr 28S
ARNr 5,8S
49 protenas
40S
ARNr 18S
33 protenas
Estructura de los ribosomas.
Tanto en bacterias como en eucariotas, los ARNr se forman a partir de precursores ms largos llamados ARNs prerribosmicos, que incluyen tambin secuencias
de entre una y cuatro molculas de ARNt. En bacterias, los ARNr de 16S, 23S y 5S
surgen de un nico precursor de 30S. Durante la sntesis del precursor se aparean
bases de regiones distantes de la molcula, de manera que los fragmentos de 16S,
23S y 5S del ARNr aparecen formando parte de grandes lazos. EL corte en regiones de doble hebra del precursor por la ARNasa III, produce precursores ms pequeos, cada uno de los cuales contiene una nica molcula de ARNr de 16S y 23S y
es probable que ocurra igual con el ARNr 5S. Los precursores individuales son an
demasiado grandes y deben experimentar un procesamiento posterior en ambos
extremos 5 y 3. Este procesamiento depende de protenas ribosmicas concretas
que empiezan a ensamblarse en los ARNrs precursores mientras la transcipcin
contina an realizndose.
En eucariotas, el producto inicial de la transcripcin es un ARN prerribosmico
de 45S que contiene las secuencias de los ARNrs de 28S,18S y 5,8S. El ARNr 5S
39
de la mayora de los eucariotas se forma como un transcrito separado. Al igual que

en el ARNm, la maduracin de precursores de ARNr se lleva a cabo mediante grandes complejos multimricos de ARN y protenas. Para la maduracin son imprescindibles al menos tres tipos de ARN en forma de complejos pequeos de ribonucleoprotena nucleolar (snoRNP). Una serie de cortes enzimticos libera los ARNr
18S, 28S y 5,8S, mientras que el ARNr 5S aparece de forma separada.
Transporte del ARN

En eucariotas, todos los ARNs sintetizados en el ncleo deben ser exportados al
citoplasma para que puedan intervenir en la sntesis de protenas. El transporte tiene
lugar a travs de los poros de la membrana nuclear y constituye otro de los niveles
de regulacin de la expresin gnica.
En el caso del ARNm, las molculas maduras son probablemente reconocidas
por protenas receptoras en el poro nuclear y transportadas activamente al citoplasma. En el transporte participan protenas que forman complejos con el ARNm
(RNPms) y que contienen una seal de exportacin del ncleo que estimula su
transporte activo. Un complejo nuclear se asocia con el casquete 5 de la molcula
de ARNm y conduce al ARNm al citoplasma. Mediante un mecanismo no bien
conocido, en el citoplasma las protenas se separan del ARNm y son reemplazadas
por protenas citoslicas. Las protenas nucleares son transportadas de nuevo al
ncleo por un mecanismo anlogo al de salida.
Otros ARNs, como ARNt y ARNr, que carecen del casquete 5, deben asociarse tambin con protenas y ser transportados al citoplasma como parte de estos
complejos. La seal de exportacin se encuentra probablemente en estas protenas
y se activa despus de la unin con las molculas de ARN, pero se desconoce hasta
el momento la naturaleza de estas seales.
Degradacin del ARN

La degradacin del ARNm es un punto importante de regulacin de la expresin
gnica. Los procesos de degradacin aseguran que las molculas de ARNm no se
acumulen en la clula y se produzca la sntesis de protenas no necesarias. Las tasas
de degradacin varan, as cuando el producto de un gen se necesita solo puntualmente, la vida media de su ARNm puede ser slo de minutos o incluso segundos.
Los productos de genes que se necesitan de forma constante, tienen ARNms estables durante generaciones. En bacterias, la vida media de las molculas de ARNm
es de 1-2 minutos, lo que les permite adaptarse rpidamente a los cambios ambientales. La degradacin del ARNm en bacterias se lleva a cabo en un primer paso por
endonucleasas que reconocen secuencias diana para el ataque endonucleoltico
como consecuencia del cual se liberan fragmentos que son degradados a continuacin hasta nucletidos por accin de exonucleasas que generalmente actan en
40
direccin 5 A 3. Dado que la traduccin tambin se realiza en la direccin 5 A 3,

se asegura que el ARNm no se degradar antes de haber sido traducido. Entre las
enzimas que intervienen en el proceso de degradacin del ARNm se encuentran la
ribonucleasa E, la polinucletido fosforilasa (PNPasa) y una helicasa. La estabilidad
del ARNm en eucariotas est regulada por la presencia o ausencia de elementos
desestabilizantes, tales como la secuencia repetida AUUUA, que promueve la desadenilacin y degradacin consecutiva del ARNm.
Bibliografa
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4
Mecanismo de la transcripcin:
regulacin de la iniciacin
A. Santos
Introduccin
La transcripcin se define como el proceso de sntesis de ARN dirigido por una
molcula de ADN. En la inmensa mayora de los seres vivos la informacin gentica esta codificada en molculas de ADN de doble cadena, siendo el proceso de
transcripcin el primer paso en la lectura de dicha informacin, es decir, el primer
paso en la expresin gnica. Es un proceso fuertemente regulado, particularmente a
nivel de la etapa de iniciacin, constituyendo por tanto, un punto esencial de la
regulacin de la expresin gnica. La regulacin de la expresin gnica es la clave
de procesos como la diferenciacin y el desarrollo. Los organismos multicelulares
complejos, entre los que se incluye el ser humano, estn formados por miles de
millones de clulas que incluye muchos tipos celulares diferentes. Sin embargo
todas ellas, con la excepcin de algunas clulas inmunitarias, poseen la misma
informacin gentica. Por qu clulas con la misma informacin gentica tienen
morfologas tan diferentes y son capaces de desarrollar funciones tan diversas? La
respuesta es que leen partes diferentes de la informacin gentica, siendo la transcripcin el primer paso en dicha lectura.
La transcripcin es un proceso asimtrico, ya que en cada gen nicamente se
copia una de las dos cadenas de ADN, la denominada hebra codificadora. Lo llevan
a cabo los enzimas ARN polimerasas-ADN dependientes o simplemente ARN polimerasas. Se divide en tres etapas: iniciacin, elongacin y terminacin. En la iniciacin se selecciona la secuencia de ADN donde se va a empezar la transcripcin
y se sintetizan los primeros enlaces fosfodister entre nucletidos, originndose
una pequea cadena de ARN complementario de la cadena de ADN que le sirve de
molde o templete (hebra templete, sin sentido o hebra ) y que tiene la misma
secuencia de bases, pero en nucletidos de ribosa, que la otra hebra (hebra codificadora, con sentido o hebra +). En este captulo nos vamos a centrar en la iniciacin
42
de la transcripcin, y estudiaremos su regulacin mediante ejemplos en organismos

procariotas y eucariotas que nos permitan comprender los aspectos ms bsicos de
este proceso.
ARN polimerasas
Son las enzimas (1,2) que catalizan la reaccin de polimerizacin de ribonucletidos trifosfato utilizando como molde una molcula de ADN:
(ARN)n + NTP = (ARN)n+1 + PPi.
Requieren para llevar a cabo su funcin: un molde, una molcula de ADN de
doble cadena normalmente, ribonucletidos 5-trifosfato (ATP, GTP, CTP y UTP) y
Mg++. Siempre sintetizan el ARN en la direccin 5-3 y por tanto, leen la hebra
molde en la direccin 3-5. Seleccionan el nucletido adecuado, de entre los cuatro posibles, por complementaridad de bases con el correspondiente nucletido de
la molcula molde.
Procariotas
Como ejemplo utilizaremos la eubacteria Escherichia coli. Este microorganismo tiene una nica ARN polimerasa que interviene en la transcripcin, adems
tiene otras ARN polimerasas implicadas en otros procesos, como por ejemplo la
replicacin. Dicha enzima est formado por cuatro cadenas polipeptdicas diferentes, y que se denominan _, `, ` y m, en una estequiometra de dos subunidades _
y una de cada una de las otras tres. El complejo 2_``m se denomina holoenzima y
es competente para llevar a cabo correctamente y de forma eficiente todas las etapas de la transcripcin: iniciacin, elongacin y terminacin. Tras la iniciacin y
para poder abandonar el sitio de iniciacin en la molcula de ADN, promotor, el
holoenzima pierde su subunidad _, siendo la enzima 2_``, enzima ncleo, la que
realmente lleva a cabo el trabajo de sntesis del ARN. La velocidad de sntesis de la
enzima ncleo es de aproximadamente 40 nucletidos por segundo a 37 C. La funcin de la subunidad m es permitir a la enzima encontrar el sitio en la molcula de
ADN donde ha de empezar la transcripcin, tarea que es incapaz de conseguir la
enzima ncleo por s sola. Las subunidades ` y ` forman el centro activo de la enzima y _ es necesaria para ensamblar todo el complejo. La holoenzima tiene un tamao de 465 kDa y un canal de 2,5 nm de anchura y 5,5 nm de longitud donde se aloja
una parte del ADN que se asocia con la enzima y donde reside el centro activo. La
enzima en realidad protege 75-80 pares de bases (pb) indicando que el ADN se
dobla al estar unido a la holoenzima ya que por su longitud, 16 nm, slo podra proteger 45-50 bp de ADN estirado. Inicialmente la enzima se une a la doble hebra de
ADN en conformacin nativa formando un complejo cerrado, posteriormente la
enzima separa ambas hebras del ADN en el punto de iniciacin formando lo que se
MECANISMOS DE LA TRANSCRIPCIN: REGULACIN DE
43
denomina un complejo abierto, paso que es crtico para el inicio de la transcripcin. La separacin de las dos hebras de ADN para constituir la denominada burbuja de transcripcin, se produce en el canal de la enzima que hemos descrito y se
pone de manifiesto por la accin de agentes qumicos que son capaces de alterar las
bases del ADN, pero nicamente cuando ambas hebras estn separadas. En funcin
del agente qumico utilizado se estima que la regin separada, burbuja de transcripcin, flucta entre 10 y 20 pb.
En los organismos procariticos tambin se pueden encontrar formas de ARN
polimerasas ms simples, formadas por una sola cadena polipeptdica, que son muy
eficientes pero muy limitadas en cuanto carecen de flexibilidad o posibilidades de
regulacin y actan sobre un nmero de promotores muy limitados. Tal es el caso
de las ARN polimerasas virales, algunas de las cuales son de gran utilidad en el
laboratorio.
Eucariotas
En las clulas animales hay 3 ARN polimerasas diferentes en el ncleo y una en
la mitocondria. La ARN polimerasa mitocondrial es una enzima simple de una sola
cadena polipeptdica y las nucleares son multimricas. Las nucleares se denominan
ARN polimerasa I, que es la encargada de transcribir los genes que codifican para
el ARN ribosmico (ARNr) y se concentra por tanto en el nucleolo. La ARN polimerasa II, que transcribe la inmensa mayora de los genes incluidos todos aquellos
que codifican una protena y algunos que codifican para ARN de pequeo tamao.
Finalmente la ARN polimerasa III, que transcribe el ARNr 5S, los ARN de transferencia y los restantes ARN de tamao pequeo. A partir de este momento, siempre
que hablemos de transcripcin en eucariotas nos referiremos a la transcripcin realizada por la ARN polimerasa II.
La ARN polimerasa II esta formada por al menos 10 cadenas polipeptdicas
diferentes. Las dos cadenas polipeptdicas de mayor tamao se denominan RPB1 y
RPB2 y tienen homologa respectivamente con las subunidades ` y ` de la enzima
procariota. La subunidad RPB1 se caracteriza por tener un dominio carboxilo terminal (CTD) muy especial, que est formado por repeticiones del siguiente heptapptido rico en el aminocido serina: Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. El nmero de
repeticiones es de 52 en los mamferos y este CTD es esencial ya que clulas cuyo
gen rpb1 carece de este dominio no son viables. RPB3 tiene homologa con la subunidad _ de procariotas y RPB5, 6 y 8 son subunidades comunes a las tres polimerasas nucleares. A pesar de su mayor complejidad, la ARN polimerasa eucaritica
no es capaz de encontrar el promotor e iniciar la transcripcin con una mnima
eficiencia, es decir, no es el equivalente a la holoenzima de los procariotas.
A pesar de las similitudes, las ARN polimerasas de eucariotas y procariotas son
diferentes, permitiendo que drogas que bloquean la funcin de la enzima procariota no sean capaces de inhibir el enzima eucariota. Algunas de estas sustancias se utilizan consecuentemente como antibiticos para combatir ciertas infecciones.
44
Ejemplo de ello son las rifamicinas naturales y sus derivados sintticos las rifampicinas.
Iniciacin: Promotores
Una vez formado el complejo abierto, se produce la formacin de los primeros
enlaces fosfodister, siendo seleccionados los nucletidos que participan en funcin
de su complementaridad con las bases de la hebra templete. Los enlaces fosfodister se forma por un ataque nucleoflico del OH 3 del nucletido anterior al fosfato
_ del siguiente nucletido 5-trifosfato. Una vez que se ha sintetizado un fragmento de ARN de aproximadamente 17 nucletidos en procariotas y de 30-40 nucletidos en los eucariotas termina la iniciacin y comienza la elongacin que lleva implcita algunos cambios en la enzima. Estos cambios como hemos comentado
consisten en la prdida de la Subunidad m en los procariotas y cambios ms complejos en los eucariotas. El ARN sintetizado permanece unido a la ARN polimerasa y al ADN, formando una hlice ARN-ADN de aproximadamente 7 pb con la
hebra molde.
Promotor
Procariotas
El promotor es aquella regin o secuencia del ADN en la que se asienta la ARN
polimerasa y se inicia la transcripcin. En la eubacteria E. coli, el promotor es una
regin pequea del ADN, de aproximadamente 45 nucletidos. Dado que el genoma de E. coli contiene aproximadamente 2.000 promotores, esto supone que el
ADN que hace de promotor es nicamente un 0,02 % del ADN del cromosoma de
esta bacteria. Esta pequea fraccin del ADN es la que la ARN polimerasa debe
encontrar con eficacia y precisin rastreando todo el genoma de la bacteria. En el
caso de las clulas eucariotas la tarea de encontrar el promotor es mucho ms
compleja. La estructura del promotor (nos referimos siempre a la secuencia de la
hebra codificadora) reconocido por la holoenzima que porta la subunidad m70
estndar es la siguiente: La posicin correspondiente al nucletido +1 es siempre
una purina (A o G) y por tanto ser una A o una G el primer nucletido en el ARN.
Entre los 45 nucletidos del promotor hay dos secuencias cortas conservadas, que
contienen los nucletidos con los que contacta la ARN polimerasa y son necesarios
por tanto para que esta enzima reconozca dicho punto como el sitio donde ha de
iniciarse la transcripcin. Son la caja Pribnow y la secuencia -35. La caja Pribnow
est en la posicin -10 (recordemos que la numeracin es negativa en la direccin
5 y positiva en la direccin 3 a partir del primer nucletido transcrito) y es una
secuencia muy rica en pares de bases A/T. La secuencia consenso en la posicin
-35 es TTGACAT (Fig. 4.1).
45
PROMOTOR PROCARIOTA (E. Coli m70)

35
TTGACAT
Conservacin (%)
171
10
+1
TATAAT
CA/GT
84 82 79 64 53 45 41
79 95 44 59 51 96
Secuencia 35
Caja Pribnow
5/8
55 51/42 48
PROMOTOR EUCARIOTA (RNA polimerasa II)

CTF
200 CBF
ccatt
Sp1
gggcgg
25
+1
TATAAAA
Pyr2 CA Pyr5
82 97 93 85 63 83 58
Conservacin (%)
Inr
Caja TATA
ESTIMULADOR
PROMOTOR PROXIMAL
Figura 4.1.
40
+40
PROMOTOR NCLEO
Esquema de la regin promotora en organismos eucariotas y procariotas.
Un promotor determinado es tanto ms eficiente cuanto ms se ajusta a esta

secuencia consenso, sera lo que denominamos un promotor fuerte y puede iniciar
la transcripcin con una frecuencia de una vez cada 1-2 segundos. Por el contrario
los promotores dbiles, presentan numerosas variaciones con respecto a la secuencia consenso e inician la transcripcin con una frecuencia tan baja como una vez
cada 10 minutos (recordemos que el ciclo vital de E. coli es de 20 minutos). De esta
forma tan sencilla se logra que unos genes, de los que se requiere mayor concentracin de protena, se expresen ms que otros de los que se requiere menor concentracin de protena.
Eucariotas
El concepto de promotor en los eucariotas es ms complejo (Fig. 4.1), y sus elementos estn peor definidos (3). Nosotros consideraremos las siguientes partes:
1. El promotor ncleo que incluye el sitio de iniciacin de la transcripcin y la
regin del ADN donde se une la ARN polimerasa. Comprende una regin que va de
aproximadamente de la posicin -40 a +40, que es aproximadamente la regin del
ADN protegida por la unin de la polimerasa.
2. Regin proximal hasta -200 aproximadamente.
3. Estimuladores o potenciadores (enhancers) (4).
Adems de estos elementos hay regiones silenciadoras (silencers) (5) que bloquean la transcripcin y elementos frontera o aislantes (boundary) (6) que bsicamente delimitan la regin del ADN sobre el que pueden actuar los dems elementos ennumerados. Estos elementos estn peor definidos y el nmero de ejemplos de
los mismos es muy limitado por lo que no hablaremos de ellos.
46
1. El promotor ncleo es el elemento mnimo para que se pueda iniciar la transcripcin con precisin in vitro. La ARN polimerasa eucariota a diferencia de la procariota no es capaz de iniciar la transcripcin ella sola y requiere la participacin de
otras protenas que en su conjunto reciben el nombre de factores generales de la
transcripcin ya que son necesarios para la iniciacin en la inmensa mayora de los
genes. Con el concurso de estos factores, la ARN polimerasa ya es capaz de iniciar
con precisin y eficiencia in vitro. En el caso de la ARN polimerasa II, elementos
caractersticos de este promotor ncleo son: la caja TATA que est en posicin -25;
el elemento de reconocimiento del factor general de transcripcin TFII-B (BRE); el
iniciador (Inr) que es una secuencia rica en pirimidinas; y el elemento 3 del promotor o DPE (Downstream Promoter Element). En combinaciones apropiadas
dichos elementos dirigen la transcripcin, aunque slo pueden dar cuenta de un
nivel mnimo in vivo, requirindose por lo menos el promotor proximal para observarse actividad promotora. Muchos autores consideran que en eucariotas lo que
debiramos denominar promotor sera la suma del promotor ncleo y el promotor
proximal.
El promotor mejor conocido es aquel que posee una caja TATA o caja GoldbergHogness e iniciador y es el que vamos a utilizar como modelo de iniciacin en eucariotas (7,8) (Fig. 4.2). La secuencia consenso de la caja TATA es 5-TATAAA-3 y se
sita a 25-30 nucletidos del sitio de iniciacin (Fig. 4.1). El primer paso de la iniciacin sera el reconocimiento de esta secuencia por el factor de transcripcin
general de la ARN polimerasa II, el TFII-D (Fig. 4.2). Este factor es un multmero
formado por la protena TBP (TATA Binding Protein) y las protenas TAFs (TBP
TFII-D
TFII-B
TFII-A
TATA
Inr
Complejo de
PREINICIACIN
F
ARN pol II
A
TATA
CTD
Inr
ARN pol II
E H
D
II
II
A
TATA
TATA
Elongacin
Inr P
P
P
Inr
TD
CTD
P ARN 30-50
nucletidos
D
E H
TATA
II
TF II E
TF II H
TD
P Inr
P
P
P
Complejo de
INICIACIN
Figura 4.2.
Mecanismo de accin de los factores generales en el inicio de la transcripcin.
47
Associated Factors). La TBP reconoce la secuencia de la caja TATA y se une a ella

orquestando todo el proceso de iniciacin. Al complejo caja TATA-TFII-D se unen
consecutivamente los factores TFII-A y TFII-B formando el complejo de preiniciacin. TFII-A estabiliza la unin de TFII-D al ADN y es necesario particularmente
in vivo donde hay numerosos elementos que se opondran a la unin de TFII-D a
TATA. El factor TFII-B tambin estabiliza este complejo de preiniciacin, pero
sobre todo sirve de puente para unir la ARN polimerasa a dicho complejo. A continuacin, se une la ARN polimerasa que lleva asociado el factor TFII-F, que acta de
puente entre la polimerasa y los factores TFIID y TFIIB unidos a la caja TATA. El
factor TFII-F es un dmero formado por las cadenas polipeptdica RAP30 y RAP74
(RNA polymerase Associated Protein) que son capaces de asociarse a la ARN polimerasa y a los factores TFII-D y TFII-B, labor realizada fundamentalmente por
RAP30. RAP74 induce un cambio conformacional que favorece los contactos entre
la RNA polimerasa y el ADN. Finalmente se unen TFII-E y TFII-H completndose
la formacin del complejo de iniciacin. TFII-H es un complejo multimrico que
tiene actividad helicasa y quinasa. Especficamente fosforila, en el complejo de iniciacin, el dominio CTD de la subunidad mayor de la ARN polimerasa, paso que es
imprescindible para que la enzima una vez iniciada la transcripcin pueda abandonar el promotor y elongar. Este factor, junto con los otros unidos a la polimerasa, se
separa de la misma una vez sintetizados los primeros 30-50 nucletidos de ARN.
Una vez terminada la iniciacin la ARN polimerasa se libera del complejo de
preiniciacin (Fig. 4.2) y es capaz de llevar a cabo la elongacin. El complejo
de preiniciacin podra quedar unido al ADN y reiniciar la transcripcin.
2. La informacin presente en el promotor ncleo, a diferencia de lo que ocurre in vitro, es muy poco eficaz para iniciar la transcripcin in vivo. Ello se debe a
que in vivo el ADN est asociado a las histonas, formando la cromatina, y el complejo de iniciacin tiene que competir con ellas para unirse al ADN. En consecuencia, para que la iniciacin sea eficaz se necesita el concurso de al menos la regin
promotora proximal. Esta secuencia de ADN tiene sitios de unin para otras protenas que se denominan factores de transcripcin especficos o simplemente factores de transcripcin y son capaces de unirse a secuencias especficas del ADN y
regular el inicio de la transcripcin. Estos factores de transcripcin tienen un dominio de unin al ADN, del que existen diversos tipos, y uno o varios dominios de
transactivacin, que son bsicamente dominios que les permiten a estas protenas
interaccionar con otras y estimular el inicio de la transcripcin. Tambin pueden
reprimir la transcripcin en cuyo caso, se denominan represores.
3. Los estimuladores, son elementos originalmente definidos en el estudio del
promotor del virus SV40. Son secuencias del ADN capaces de aumentar la transcripcin, cuando se unen a un promotor ncleo, de forma independiente de su orientacin, es decir, las podemos unir 5-3 o 3-5 con respecto al sitio de iniciacin, y
de su distancia, pudindose poner en situacin 5 o 3 con respecto al sitio de iniciacin. Son secuencias de 50 pb a 1.5 kbp que frecuentemente aparecen diseados
como para llevar a cabo una funcin especfica, como por ejemplo, activar un gen
en un determinado tipo celular o en un momento determinado del desarrollo. La
48
expresin de un gen puede estar regulada por muchos estimuladores diferentes.

Estos elementos, al igual que lo indicado para el promotor proximal, contienen
secuencias o sitios de unin de factores de transcripcin, a veces los mismos que se
unen al promotor proximal, que influyen en la iniciacin de la transcripcin. Se sitan a una distancia y orientacin muy variable con respecto al sitio de iniciacin,
pero siempre distal con respecto al promotor ncleo por lo que frecuentemente se
les llama elementos distales. Como ejemplo tenemos: un estimulador, importante
para el gen de la cadena del receptor de clulas T, se sita a 69kb en la direccin 5
del sitio de iniciacin y en contraste el estimulador ncleo de locus de ratn de la
inmunoglobulina H se localiza en el segundo intrn. Lo ms usual sin embargo, es
que estos elementos se siten en direccin 5 a pocas kb de distancia del sitio de iniciacin. Debemos recordar, que los elementos frontera impiden que el rango de
accin de los estimuladores, algunos de los cuales son enormemente potentes, se
extiendan ms alla de los lmites deseados.
Regulacin de la iniciacin
En este apartado introduciremos algunos de los conceptos bsicos de la regulacin de la iniciacin de la transcripcin en procariotas y eucariotas (9,10) a travs
de algunos ejemplos bien caracterizados.
Procariotas: Factores m. Opern lactosa
Dada la relativa simplicidad de la ARN polimerasa procariota y la funcin tan
claramente definida de su subunidad sigma, es obvio que una forma muy sencilla de
regulacin sera el disponer en el genoma de varios genes que codifiquen subunidades sigma capaces de unirse a promotores diferentes. De esta forma, se pueden
poner en marcha diversos programas genticos en funcin de las necesidades de la
clula, ya que las distintas subunidades sigma dirigiran la polimerasa ncleo a
diferentes grupos de genes. Esto es lo que ocurre en E. coli, su genoma codifica adems de m70 las subunidades m32 y m54, que son la subunidad de choque trmico y
de deficiencia en nitrgeno respectivamente. En condiciones normales el contenido
de estas protenas es muy bajo y no son capaces de competir con m70 por la unin
a la enzima ncleo por lo que los genes que estn bajo su control no se transcriben.
Sin embargo, en caso de un aumento de temperatura o falta de las fuentes usuales
de nitrgeno respectivamente la expresin de estos genes se induce y como consecuencia de ello, la expresin de otra serie de genes que le permitirn a la bacteria
combatir eficazmente estas situaciones. El promotor de m32 es muy diferente del de
m70, particularmente en lo que se refiere a la secuencia de la caja Pribnow. La
secuencia -10 para m32 es CCCATNT (N es cualquiera de los cuatro nucletidos del
ADN) en claro contraste con la caja Pribnow de m70: TATAAT.
El Opern lactosa esta formado por tres genes estructurales que se transcriben
juntos a partir de un nico promotor y que codifican para tres protenas que le per-
49
miten a la bacteria utilizar el disacrido lactosa como fuente de carbono. Tambin

forma parte de l el gen que codifica para el represor lac, protena fundamental en
la regulacin de este opern. El represor lac es una protena de 37kDa de tamao
que forma un tetrmero y es capaz de unirse a secuencias especficas de ADN. En
el promotor de los genes estructurales hay una secuencia de 28pb a la que se une el
represor lac y que se denomina operador, y que est situada entre -5 y +25. La unin
del represor lac impide que la ARN polimerasa pueda iniciar la transcripcin. Es
necesario quitar esta protena del operador para que los genes estructurales puedan
transcribirse, y esto es lo que ocurre cuando hay lactosa en el medio de cultivo, ya
que el represor lac se une a un derivado de la lactosa y pierde su afinidad por el
ADN. Esto es un paso necesario para que se puedan transcribir los genes estructurales, pero no es muy eficiente, ya que el promotor de los genes estructurales se
aleja del consenso y es poco activo. El aumento en la expresin de estos genes
estructurales slo por la presencia de lactosa no es por tanto muy grande. Sin embargo, cuando la presencia de lactosa se combina con una disminucin o ausencia de
glucosa en el medio, se produce un importante aumento de la expresin de los
genes estructurales. Ello se debe a que tambin interviene la protena CAP
(Catabolite gene Activator Protein), que se une al ADN en una secuencia muy cercana al promotor de los genes estructurales, situada entre -71 y -53, e induce la
transcripcin. El funcionamiento de la protena CAP depende de la eliminacin del
represor lac unido al opern y de la presencia del nucletido cclico adenosina 5,3
monofosfato cclico, AMPc. En presencia de concentraciones de glucosa adecuadas,
los niveles de AMPc son bajos en la clula, insuficientes para formar complejos
CAP-AMPc y en consecuencia CAP no se une al ADN y por tanto no tienen ningn
efecto sobre la transcripcin. Cuando disminuye la glucosa sube la concentracin de
AMPc que se une a CAP y el complejo AMPc-CAP se une a su sitio de unin del
ADN y favorece de forma muy eficiente la iniciacin de la transcripcin por el
holoenzima de la ARN polimerasa estndar. Con este modelo tan sencillo definimos
una parte de los elementos que intervienen en la regulacin de la transcripcin y que
tienen sus elementos paralelos en situaciones mucho ms complejas como es la
regulacin de la transcripcin en eucariotas. Hay, por tanto, seales que son secuencias especficas en el ADN (frecuentemente denominados elementos cis), y tenemos, aparte de la maquinaria basal de la transcripcin, otras protenas que reconocen estas seales y regulan el inicio de la transcripcin (elementos trans). De esta
forma, es perfectamente posible que dos clulas con la misma informacin gentica hagan cosas diferentes en funcin de la dotacin de protenas lectoras de estas
seales. Tal es el caso de clulas E. coli cultivadas en medios de diferente composicin, en nuestro caso uno con glucosa y otro sin glucosa y con lactosa.
Eucariotas: Regulacin de la expresin gnica por hormonas tiroideas
La situacin es mucho ms compleja en los eucariotas y particularmente en los
organismos pluricelulares complejos como es el caso del ser humano. Este apartado
lo limitaremos a describir el mecanismo de accin de la hormona tiroidea, que den-
50
tro de las limitaciones que ello supone nos permitir familiarizarnos con algunos
conceptos muy importantes como es el papel de la cromatina en la regulacin de la
expresin gnica. El receptor de hormona tiroidea (3,5,3-triiodotironina, T3) es un
factor de transcripcin dependiente de ligando y que est codificado por dos genes
en los vertebrados diploides: NR1A1 y NR1A2 segn la nomenclatura de la superfamilia de receptores nucleares (11) a la que pertenecen estos dos genes o genes _
(T3R_) y ` (T3R`) como nomenclatura ms familiar y ms frecuentemente en la
literatura cientfica. En el genoma humano T3R_ y T3R` estn situados respectivamente en el cromosoma 17 y 3. A partir del gen T3R_ se originan al menos dos protenas diferentes por corte y empalme alternativo que son la isoforma T3R_ 1 y
T3R_ 2, que se diferencian en el extremo carboxilo terminal (C-t). Como consecuencia de la sustitucin de los 40 aminocidos C-t, T3R_ 2 ha perdido su capacidad de unir T3 y por tanto no acta como un receptor de dicha hormona y su funcin
es desconocida. Del gen T3R` se originan dos protenas a partir de dos promotores
diferentes T3R` 1 y T3R` 2, que se diferencian en la regin amino terminal y unen
T3 actuando ambas como receptores. T3R` 2 se expresa de forma abundante slo en
la hipfisis y las restantes isoformas se expresan de forma ubiquista. Todas estas
protenas tienen un dominio central que es el de unin al ADN (DBD, DNA Binding
Domain), que es prcticamente igual para todas ellas y que se corresponde con el
dominio mejor conservado en la superfamilia de los receptores nucleares. Un dominio amino terminal en el que T3R` 1 difiere de T3R` 2 y ambas isoformas de las
isoformas _, no estando conservada esta regin en la superfamilia. Finalmente est
la regin o dominio carboxilo terminal que es el ms grande y complejo, en el se
incluyen entre otros el dominio de unin a la hormona (LBD, Ligand Binding
Domain) que se distribuye a lo largo de la mayor parte de esta regin y que est relativamente conservado en la superfamilia, el dominio de dimerizacin y el dominio
ms importante de transactivacin denominado AF2. A la superfamilia de los receptores nucleares tambin pertenecen los receptores de hormonas esteroideas, cido
retinoico, vitamina D3, el protooncogen v-erbA del virus de la eritroblastosis aviar
(que es una forma mutada del receptor T3R_ 1 de pollo) y otras protenas con o sin
ligando conocido. Los miembros de la superfamilia sin ligando conocido frecuentemente se denominan receptores hurfanos (12), que es una denominacin confusa
ya que implicara que han de tener un ligando y ser receptores. Sin embargo, muchas
de ellas son factores de transcripcin normales, pertenecientes a esta superfamilia
por homologa de secuencia, y que no actan como receptores. Los receptores de T3
se encuentran en el ncleo, muchos de ellos unidos a las secuencias de ADN que
reconocen y que se denominan TREs o T3REs (Thyroid receptors Responsive
Elements) ya que no requieren de la hormona para ello. Los TREs estn formados
por repeticiones de la secuencia hexamrica 5-AGGTCA-3, siendo la forma ms
frecuentemente encontrada en los genes regulados por hormona tiroidea aquel que
est formado por dos secuencias de este tipo separadas por cuatro nucletidos (DR4,
Direct Repeat 4). Se unen al ADN en forma de un heterodmero con otro factor de
transcripcin de la misma superfamilia, el RXR, que es un receptor de retinoides,
aunque tambin es capaz de unirse al ADN como homodmero o monmero, no
51
estando clara la importancia funcional de estos dos ltimos. En ausencia de T3 el

T3R unido al ADN est en una conformacin que le permite unirse a una serie de
protenas denominadas correpresores (13), que son capaces de unirse a otras protenas
para formar un complejo cuya funcin va a ser compactar la cromatina en el rea
donde estn concentrados y hacerla ms inaccesible a la maquinaria basal de la
transcripcin, complejo represor (Fig. 4.3). Tras la unin de T3, la conformacin del
receptor cambia de forma que se expone el dominio de transactivacin AF2, que se
corresponden con los ltimos aminocidos de la protena y que forman parte de una
hlice _ y se esconde el dominio de unin a los correpresores. Como consecuencia
de ello, el receptor pierde su capacidad de unin a los correpresores y se une a otras
protenas que se denominan coactivadores (14), que a su vez interaccionan con otras
protenas formando un complejo, complejo activador, que es capaz de modificar la
cromatina originando una forma de la misma ms abierta y accesible a la maquinaria basal de la transcripcin (Fig. 4.3). Finalmente el receptor unido al ADN y al
ligando es tambin capaz de unirse a otros grandes complejos multimricos de unas
16 cadenas polipeptdicas y que reciben nombres como TRAP (Thyroid hormone
receptor Associated Proteins), DRIP (vitamine D Receptor Interacting Proteins), o
ARC (Activator-Recruited Cofactor) cuya composicin y actividad est peor caracterizada, pero parece que actuara bsicamente como molculas puentes entre T3R
y la maquinaria basal de la transcripcin, ya que interaccionan con el complejo de
preiniciacin, facilitando el acceso de la ARN polimerasa II al promotor ncleo. En
resumen, el mecanismo de accin del receptor de hormona tiroidea se ajustara a un
modelo de dos pasos propuestos por Roeder et al. (15) en el que tras la unin de la hormona al receptor, ste se disociara del complejo represor y se asociara con un
complejo activador a travs de protenas coactivadoras o con los complejos puente.
En la (Fig. 4.3) hemos esquematizado este modelo y debemos aadir que la accin
de los dos tipos de complejos, el que denominamos activador y los complejos puente (TRAP/DRIP/) podran actuar de una forma secuencial, combinatoria, o paralela.
Una idea importante, es que el receptor sin ligando no es una protena inactiva, como
ocurre con muchos receptores de hormonas esteroideas, sino que tienen una actividad represora y tras la unin de la hormona cambia hacia una actividad fundamentalmente activadora de la transcripcin.
En la formacin del complejo represor juegan un papel destacado los correpresores, de los que se conocen y han clonado varios, entre ellos N-CoR (Nuclear
Receptor Corepressor) y SMRT (Silencing Mediator of Retinoic acid and Thyroid
hormone receptors). Estas dos protenas son protenas grandes y modulares, es
decir, que poseen diversos dominios. La actividad de estos dominios es la de reconocer otras protenas y unirse a ellas. Tienen dos dominios carboxi-terminal que reconocen a los receptores nucleares y al menos dos dominios amino-terminal que se
denominan dominios de represin y que les permiten reclutar otras protenas como
Sin 3, histonas deacetilasas y otras ensamblando finalmente un complejo represor.
Los dominios de interaccin con los receptores nucleares reconocen en el T3R la
regin Visagra (hinge o dominio D) que est expuesta cuando el receptor no est
unido a la hormona. El nombre de dominio Visagra es debido a que inicialmente
Figura 4.3.
TRE
RXR TR
Complejo
represor
HD
TATA
TRANSCRIPCIN
Desacetilacin CROMATINA
histonas
COMPACTA
T3
Complejo
activador
HAT
Complejo
represor
HD
TRE
RXR TR
TRE
TRAP/
DRIP/
ARC
RXR TR
TATA
II
TRANSCRIPCIN
TRANSCRIPCIN
Acetilacin CROMATINA
histonas
ABIERTA
TATA
Complejo
activador
HD
52
Esquema del mecanismo de regulacin de la transcripcin por hormona tiroidea.
53
esta regin del T3R era simplemente una regin flexible que una los dominios de
unin al ADN y de unin al Ligando.
El nmero de coactivadores conocidos y clonados es mayor y entre ellos estn:
SRC-1/NcoA-1 (Steroid Receptor Coactivator-1/Nuclear receptor Coactivator-1),
TFI-2/GRIP-1/NcoA2 (Transcriptional Intermediary Factor-2/Glucocorticoid
Receptor Interactin Protein-1/Nuclear receptor Coactivator-2) y pCIP/ACTR/AIB1(p300/CBP co-Intergator-Protein/Activator of the Thyroid and Retinoic acid
receptors/Amplified in Breast Cancer). Son tambin protenas modulares, que reconocen el dominio de transactivacin AF-2 en el complejo T3-T3R a travs de unas
secuencias cortas situadas en la regin central de dichas protenas y que se denominan cajas NR y cuya secuencia es Leu-XX-Leu-Leu (X es cualquiera de los 20
aminocidos). A su vez poseen otros dominios denominados de activacin que reconocen protenas como la CBP y p300 que adems de poseer actividad acetilasa de
histona (HAT) tienen dominios de unin a otras protenas como p/CAF (p300/CBP
Associated Factor) que tambin poseen HAT y son capaces de interaccionar con la
maquinaria basal de la transcripcin.
Finalmente la complejidad y el nmero tan grande de cadenas polipeptdica que
participan en la regulacin de la iniciacin de la transcripcin en los eucariortas, y
que a primera vista podra antojrsenos excesiva, constituye probablemente la
manera de lograr que la transcripcin funcione en estos organismos con la flexibilidad, gradacin y capacidad de integracin necesarias para lograr el grado de ajuste entre sus clulas en organismos multicelulares complejos.
Bibliografa
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5
Sntesis de protenas:
Traduccin y transporte
E. lvarez Garca
Introduccin
Las protenas son los productos finales de la mayora de las rutas de transmisin
de la informacin gentica. Las clulas las sintetizan en funcin de los requerimientos fisiolgicos y posteriormente se transportan al lugar donde van a desempear su funcin.
La sntesis de protenas es el mecanismo biosinttico ms complejo. En este proceso la informacin codificada en un ARN mensajero (ARNm) se traduce mediante la maquinaria de sntesis de protenas de las clulas que incluye los ribosomas
complejos de ARN y protenas, las enzimas necesarias para activar los aminocidos precursores unindolos a los ARN de transferencia (ARNt) y factores proteicos especficos que participan en las distintas fases de este proceso: inicio, elongacin y terminacin.
Esta ruta biosinttica es muy importante para las clulas, en ella se consume hasta
el 90 % de la energa qumica utilizada en procesos biosintticos. A pesar de su complejidad las protenas se sintetizan a gran velocidad. Una clula de E. coli a 37 C
puede sintetizar una cadena polipeptdica completa de 100 residuos en cinco segundos.
El cdigo gentico
Durante el proceso de sntesis de protenas, la maquinaria que lleva a cabo la traduccin se desplaza a lo largo de una molcula de ARNm en direccin 5 A 3 y
lee la secuencia de nucletidos de tres en tres. Cada triplete de nucletidos (codn)
en la molcula de ARNm especfica para un aminocido y durante la sntesis de protenas un codn se aparea con la secuencia del extremo anticodn de una molcula
de ARNt unida covalentemente a un aminocido, de esta forma el codn determina
qu aminocido ser aadido a la cadena polipeptdica en crecimiento.
56
El ARN contiene cuatro nucletidos diferentes que permiten 4 4 4 = 64 posibles tripletes del ARNm para codificar los 20 aminocidos. Tres de estos 64 tripletes (UAA, UAG y UGA) no codifican ningn aminocido sino que se utilizan como
seales que especifican la terminacin de la sntesis proteica y se denominan como
seales de terminacin. Los 61 codones restantes especifican para los 20 aminocidos que forman parte de las cadenas polipeptdicas. La mayora de los aminocidos
estn determinados por ms de un codn, por esta razn se dice que el cdigo gentico est degenerado.
La degeneracin del cdigo gentico indica que tiene que existir mas de un
ARNt para transportar cada aminocido o que la secuencia del anticodn de una
molcula de ARNt puede reconocer ms de un codn del ARNm. Ambas opciones
son ciertas, algunos aminocidos pueden ser transportados por diferentes molculas de ARNt y los anticodones de muchas molculas de ARNt pueden reconocer
ms de un codn. El apareamiento descrito por Watson y Crick tiene lugar slo en
las dos primeras posiciones de un codn y existe una mayor libertad de apareamiento en la tercera posicin, esta libertad en el emparejamiento de la 3.a base del
codn se conoce como balanceo. Algunas bases del anticodn estn modificadas.
La presencia del nucletido inosina (I), cuya base hipoxantina procede de la desaminacin de adenina, permite tambin apareamientos alternativos en la tercera posicin de un codn. Por ello, los apareamientos posibles entre la primera base del
anticodn y la 3.a del codn son los siguientes:
primera base del
anticodn
C
A
U
G
I
tercera base del

codn
G
U
AoG
UoC
U, C, o A
As, el anticodn del ARNt para la alanina cuya secuencia es 5-IGC-3 reconoce tres codones GCU, GCC y GCA.
anticodn 3CGI5
ARNm 5GCU3
anticodn 3CGI5
ARNm 5GCC3
anticodn 3CGI5
ARNm 5GCA3
Sin embargo, los codones UUA y CUA que codifican leucina son ledos por
diferentes ARNts.
De este modo, en general, los codones alternativos para un mismo aminocido
difieren slo en la tercera base (GCA, GCC, GCG y GCU especifican alanina,
GGA, GGC, GGG y GGU especifican glicina).
Slo dos aminocidos estn determinados por un solo codn: metionina (AUG)
y triptfano (UGG). El codn AUG funciona tambin como seal de iniciacin
para la sntesis proteica adems de codificar metionina en posiciones internas de la
cadena polipeptdica.
SNTESIS DE PROTENAS: TRADUCCIN Y TRANSPORTE
57
Activacin de los aminocidos

Uno de los requisitos previos a la incorporacin de un aminocido a una cadena polipeptdica es su activacin. Este proceso tiene lugar tras la unin de cada
uno de los 20 aminocidos a su ARNt especfico para formar el aminoacil-ARNt
(aa-ARNt). Las molculas de ARNt cuya estructura tridimensional tiene forma de
L, unen por uno de sus extremos el aminocido especfico y en el otro extremo, que
contiene los tres nucletidos del anticodn, reconoce y se aparea con un codn de
la molcula de ARNm. La formacin de estos complejos tiene dos funciones. Una
de ellas es unir el aminocido con el ARNt que posee el anticodn complementario
al codn del ARNm que especifica para este aminocido y que permite que durante la sntesis de protenas, las secuencias de nucletidos se conviertan en la secuencia de aminocidos de una protena. Otra de las funciones de estos complejos es la
activacin del extremo carboxlico del aminocido, es decir, la formacin de un
enlace rico en energa que permita la formacin de un enlace peptdico al reaccionar con el grupo amino del aminocido situado a continuacin en la cadena que se
est sintetizando.
El acoplamiento entre los aminocidos y ARNts est catalizado por enzimas
especficas denominadas aminoacil-ARNt sintetasas, cada una de las cuales reconoce un aminocido concreto y su ARNt adecuado. Esta reaccin tiene lugar en dos
etapas y la energa para la activacin proviene de la hidrlisis de ATP. En la primera etapa se forma un aminoacil-adenilato, que en el ejemplo elegido sera la activacin de glicina:
+
H3NCH2COO + ATP A +H3NCH2COAMP + PPi
En la segunda etapa el aminocido se transfiere al extremo 3 de una molcula

de tARN.
+
H3NCH2COAMP + ARNt A +H3NCH2COARNt + AMP
Las aminoacil-ARNt sintetasas, altamente especficas, son capaces de discriminar entre las distintas cadenas laterales de los aminocidos y entre varias molculas
de ARNt.
Etapas de la sntesis de protenas

Todos los dems acontecimientos de la sntesis de protenas estn catalizados
en los ribosomas y se pueden diferenciar tres etapas: iniciacin, elongacin y terminacin de la cadena, de acuerdo con lo representado esquemticamente en la
Figura 5.1. El proceso de traduccin es muy parecido en clulas eucariotas y procariotas. Por ello aqu lo describiremos a continuacin en clulas procariotas destacando al final de cada una de las etapas las diferencias con clulas eucariotas.
58
A) Iniciacin
sitio P
sitioA
sitio E
fMet-tARNi
Ribosoma
fMet
AUG GAU ACU CCA GGA GAG GUA CUA GCA UGA
3 ARNm
B) Elongacin
fMet
Asp
Thr
fMet
Asp
C) Terminacin
Factordeterminacin
Cadena polipeptdica
fMet
Asp
Thr
Pro
Gly
Glu
Val
Leu
Ala
Figura 5.1. Representacin esquemtica de las etapas de la sntesis de protenas:

(A) Iniciacin, (B) Elongacin y (C) Terminacin.
59
Iniciacin de la biosntesis de protenas

En esta etapa se forma un complejo de iniciacin formado por un ribosoma
unido al ARNm y al ARNt iniciador cargado (fMet-ARNti). La etapa de iniciacin
requiere adems la presencia de tres factores de iniciacin (IF1, IF2 e IF3). Los factores IF1 e IF3 facilitan la disociacin del ribosoma 70S. El ARNm se une a la subunidad ribosmica pequea 30S.
Ribosoma 70S + IF1 + IF3 A Subunidad 30S-IF1-IF3 + Subunidad 50S
Subunidad 30S-IF1-IF3 + ARNm + GTP-IF2-fMet-ARNti A Complejo
de iniciacin 30S + IF3
El factor de iniciacin IF2 tiene un sitio de unin para GTP y es capaz de reconocer el ARNt iniciador; este metionil-tARN es un sustrato de una transformilasa.
De este modo, todas las protenas procariotas empiezan con N-formilmetionina y
tambin las sintetizadas en las mitocondrias de clulas eucariotas.
El aminoacil-ARNt iniciador se aparea con el codn de iniciacin frecuentemente AUG o en algunos casos GUG que seala el principio de la cadena polipeptdica. La posicin correcta para comenzar la lectura depende tambin de una
secuencia situada en el extremo 5 del ARNm, secuencia de Shine-Dalgarno, que es
complementaria a un fragmento del ARNr 16S que forma parte de la subunidad
pequea 30S.
Una vez formado el complejo de iniciacin 30S, se libera el factor IF3 y se une
la subunidad 50S. Esta subunidad tiene tres lugares para la unin del ARNt denominados: sitio P (peptidilo) donde normalmente se une el ARNt unido a la cadena polipeptdica que se est sintetizando, sitio A (aminoacilo) donde se une el ARNt portador del nuevo aminocido que se va a incorporar a la cadena polipeptdica y el sitio
E (salida) donde se unen ARNts vacos antes de abandonar el ribosoma (Fig. 5.1). Al
unirse la subunidad 50S el codn AUG con su fMet-ARNti se sita en el sitio P. En
este momento el GTP unido al IF2 se hidroliza y el factor IF2-GDP se libera. El complejo de iniciacin 70S formado est preparado para aceptar un segundo ARNt cargado y pasar a la etapa de elongacin (Fig. 5.1 A).
Complejo de iniciacin 30S + Subunidad 50S A Complejo de iniciacin 70S +
IF1 + IF2 + GDP + Pi
El proceso de traduccin en clulas eucariotas es en general muy parecido al que
ocurre en procariotas. Las diferencias ms destacables ocurren a nivel de la iniciacin. En las clulas eucariotas existen al menos nueve factores de iniciacin y los
ARNms se unen al ribosoma formando un complejo con varias protenas. Algunos
factores facilitan la disociacin de las subunidades 60S y 40S del ribosoma.
Ribosoma 80S + eIF6 + eIF3 + eIF4C A Subunidad 60S +
Subunidad 40S-eIF3-eIF4C
60
El ARNm se asocia con varios factores de iniciacin uno de ellos se denomina

protena de unin al casquete (CBPI).
ARNm + CBPI + eIF4A + eIF4B + eIF4F A Complejo de ARNm
El complejo de mARN se une a la subunidad ribosmica 40S y al ARNt iniciador que va acompaado tambin por el factor eIF2, una protena que une GTP
(GTP-eIF2-Met-ARNti) y a continuacin se realiza un barrido del ARNm para localizar el primer codn AUG que indica el inicio de la lectura del ARNm. Este proceso es dependiente de la hidrlisis de ATP.
Complejo de ARNm + Subunidad 40S-eIF3-eIF4C + GTP-eIF2-Met-ARNti + nATP
A Complejo de iniciacin 40S + nADP + nPi

El factor de iniciacin eIF5 induce la liberacin de otros factores. Una vez que
ocurre el emparejamiento entre el Met-ARNti y el codn AUG tiene lugar la hidrlisis del GTP unido al factor eIF2 que se libera, y la subunidad 60S se une al complejo formado por el ARNt iniciador, el ARNm y la subunidad 40S.
Complejo de iniciacin 40S + eIF5 + Subunidad 60S A Complejo de iniciacin
80S + eIF2-GDP + Pi + eIF3 + eIF4C + eIF5
Elongacin de la biosntesis de protenas
La cadena polipeptdica se alarga mediante unin covalente de unidades de aminocidos transportados al ribosoma por los aminoacil-ARNts y posicionados
correctamente por apareamiento de bases del anticodn del ARNt con el correspondiente codn del ARNm. En esta etapa participan tambin factores de elongacin (EF-Tu, EF-TS y EF-G).
Al comienzo de cada ciclo la cadena polipeptdica est unida a un ARNt en el
lugar peptidilo y los otros lugares estn vacos.
El factor de elongacin Tu (EF-Tu), al igual que eIF2, est unido a un nucletido de guanina y acompaa al aminoacil-ARNt al sitio A del ribosoma; a continuacin el GTP se hidroliza y la forma EF-Tu-GDP se libera del ribosoma.
sitio P peptidil-ARNt
Ribosoma
+ GTP-EF-Tu-aa-ARNt
sitio A vaco
sitio P peptidil-ARNt
A Ribosoma
+ GDP-EF-Tu
sitio A aa-ARNt
La hidrlisis del GTP unido al factor de elongacin Tu desempea una funcin

importante en la fidelidad de la sntesis de protenas. Mientras el EF-Tu no se diso-
61
cie no se puede formar un nuevo enlace peptdico y la disociacin requiere la hidrlisis del GTP. El tiempo que transcurre hasta que se hidroliza el GTP permitira que
un aminoacil-ARNt incorrecto unido en el sitio A abandonara el ribosoma.
Una vez liberado el EF-Tu-GDP, ste tiene baja afinidad por un aminoacil-ARNt
pero posee alta afinidad por otro factor de elongacin Ts (EF-Ts) que facilita la liberacin del GDP y la asociacin con GTP dando lugar a la forma de alta afinidad para
todos los aminoacil-ARNts excepto el ARNt iniciador.
EF-Tu-GDP + EF-Ts A EF-Tu-EF-Ts + GDP
EF-Tu-EF-Ts + GTP A EF-Tu-GTP + EF-Ts
EF-Tu-GTP + aminoacil-tARN A EF-Tu-GTP-aminoacil-tARN
Una vez formado el complejo en el que el aminoacil-ARNt ocupa el sitio A y la
cadena polipeptdica unido al ltimo ARNt que se ha incorporado ocupa el sitio P
tiene lugar la formacin de un nuevo enlace peptdico. La actividad enzimtica que
cataliza la formacin del enlace peptdico (peptidiltransferasa) es parte de la subunidad grande del ribosoma y juega un papel importante el ARNr 23S que acta
como una ribozima. El grupo amino del aminoacil-ARNt en el sitio A ataca al enlace ster que une la cadena polipeptdica en crecimiento a la molcula de ARNt en
el sitio P y la cadena polipeptdica es transferida al grupo amino del aminoacilARNt situado en el sitio A (Fig. 5.1 B).
Sitio P
|
NH
|
R1CH
|
O=C
|
O
|
tARN
peptidil-ARNt
Sitio A
NH2
|
R2CH
|
O=C
|
O
|
tARN
aa-ARNt
Sitio P
OH
|
tARN
ARNt vaco
Sitio A
|
NH
|
R1CH
|
O=C
|
NH
|
R2CH
|
O=C
|
O
|
tARN
peptidil-ARNt
62
El paso siguiente del ciclo de elongacin se denomina translocacin. El ribosoma se desplaza la distancia de un codn hacia el extremo 3 del ARNm. Este desplazamiento traslada al peptidil-ARNt desde el sitio A al sitio P mientras que el
ARNt descargado pasa al sitio E y despus se libera. El movimiento del ribosoma
requiere tambin la presencia del factor de elongacin G (EF-G) tambin llamado
translocasa, que une GTP. La hidrlisis del GTP permite que EF-G-GDP se libere
del ribosoma. Despus de la translocacin, el sitio A est vaco y se puede iniciar un
nuevo ciclo de elongacin.
El ciclo de elongacin en eucariotas es parecido, con tres factores de elongacin
eEF1_, eEF1`a y eEF2 que tienen funciones anlogas a los factores EF-Tu, EF-Ts
y EF-G.
Terminacin de la biosntesis de protenas
Todo el proceso se repite hasta que en el sitio A del ribosoma est ocupado por
uno de los tres codones de terminacin; ningn aminoacil-ARNt se une al ribosoma cuando uno de los codones UAA, UGA o UAG ocupan este sitio. Estos codones son reconocidos por protenas denominadas factores de terminacin o liberacin. El factor RF1 reconoce los codones UAA o UAG y el factor RF2 reconoce
UAA o UGA. La unin de un factor de liberacin en el sitio A a un codn de terminacin cambia y activa la actividad peptidiltransferasa y se transfiere la cadena
polipeptdica a una molcula de agua (Fig. 5.1 C). El factor RF3 une GTP y tiene
actividad GTPasa que parece estimular el proceso mediante hidrlisis de GTP.
Finalmente se liberan tambin los factores de terminacin, el ARNm y el ribosoma
se disocia en las subunidades 30S y 50S.
sitio P peptidil-tARN
+ GTP-RF + H2O A cadena
Ribosoma
sitio A codn de terminacin
polipeptdica + GDP+ Pi + RF+ ARNm + Subunidad 50S + Subunidad 30S

En eucariotas un nico factor de terminacin, eRF, reconoce los tres codones de
terminacin.
Antibiticos que inhiben la sntesis proteica

La sntesis de protenas es una de las rutas fisiolgicas vitales para las clulas y
muchos antibiticos actan inhibiendo este proceso. Algunos de estos antibiticos
aprovechan diferencias estructurales y funcionales que existen entre los ribosomas
de procariotas y eucariotas, de esta forma, algunos resultan especficos para los
ribosomas bacterianos entre ellos: estreptomicina, eritromicina, cloranfenicol y
tetraciclina.
63
Estreptomicina: es un trisacrido muy bsico que interfiere con la unin del

fMet-ARNt iniciador y tambin provoca errores de lectura originando protenas
aberrantes.
Eritromicina: se une a un lugar especfico en el ARNr 23S de la subunidad
grande e inhibe la translocacin.
Cloranfenicol: impide la actividad peptidiltranferasa de la subunidad 50S.
Tetraciclina: se une a la subunidad pequea y bloquea la unin de las molculas de aminoacil-ARNt al ribososma. In vitro puede inhibir tambin sntesis de protenas en ribosomas eucariotas.
Puromicina: tiene una estructura parecida al extremo 3 de un aminoacil-ARNt
lo cual facilita que se pueda unir al sitio A y la cadena polipeptdica en crecimiento
se transfiere a la puromicina provocando la terminacin precoz de la misma. Este
antibitico inhibe la sntesis de protenas en clulas procariotas y eucariotas.
Destino y transporte de protenas

Las clulas eucariotas contienen diferentes orgnulos cada uno de los cuales
poseen sus propias protenas. La sntesis de la mayora de las protenas (excepto las
codificadas por el ADN mitocondrial) se inicia en los ribosomas libres en el citoplasma. Su destino final est determinado por seales de clasificacin presentes en
la estructura de la propia protena que dirigen su transporte hasta otros orgnulos.
En la Figura 5.2 aparecen las secuencias que dirigen las protenas hacia el ncleo,
las mitocondrias, los peroxisomas, o la seal que dirige los ribosomas hacia el retculo endoplsmico (ER) y desde el ER las protenas pasan al complejo de Golgi y
otros destinos como los lisosomas, membrana plasmtica y vesculas de secrecin.
Tambin aparecen diferenciados los tres mecanismos mediante los cuales las protenas se desplazan entre los diferentes compartimentos celulares: a) el transporte
entre el citoplasma y el ncleo (Fig. 5.2, flecha
) tiene lugar a travs de poros
nucleares que actan de forma selectiva permitiendo la difusin de molculas de
pequeo tamao y siendo necesario un mecanismo de transporte activo para molculas de mayor tamao, denominado tambin transporte regulado; b) el transporte
de protenas desde el citoplasma a otros orgnulos (mitocondrias, peroxisomas y
ER) implica en todos los casos que las protenas tienen que atravesar una bicapa
lipdica, se conoce como transporte de transmembrana (Fig. 5.2, flechas
)y
son necesarios translocadores proteicos y el mantenimiento de las protenas en una
conformacin desplegada. c) el transporte vesicular (Fig. 5.2, flechas
)
mediante el cual se mueven las protenas desde el ER al complejo de Golgi y desde
donde son clasificadas bien en vesculas de secrecin o destinadas a los lisosomas
y membrana plasmtica fundamentalmente. Estas vesculas se producen en un orgnulo por gemacin transportando tanto fragmentos de membrana como molculas
del lumen del compartimento. Las vesculas despus de ser transportadas a su destino descargarn su contenido mediante fusin con la membrana del otro compartimento.
ENDOSOMAS
LISOSOMAS
SUPERFICIE CELULAR
APARATO DE GOLGI
VESCULAS
SECRETORAS
Figura 5.2. Destino y transporte de protenas. Secuencias que dirigen su transporte a los diferentes compartimientos. Mecanismos de transporte:
transporte regulado (flecha
), transporte de transmembrana (flechas
), y transporte vesicular (flecha
).
Man 6-P
+H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-LeuVal-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-GluGln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln
-Ser-Lys-Leu-
PEROXISOMAS
-Lys-Asp-Glu-Leu-COO
RETCULO ENDOPLSMICO
+H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-ArgPhe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-CysSer-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu
MITOCONDRIAS
-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val
NCLEO
CITOPLASMA
64
65
Importacin al ncleo
Las protenas destinadas al ncleo tiene pptidos seal en el interior de la cadena polipeptdica que constan de cinco residuos aminoacdicos cargados positivamente (Fig. 5.2). Estas secuencias son reconocidas por protenas que se mueven
entre el citoplasma y el ncleo. Las importinas _ y ` actan como un dmero receptor para estas seales. El complejo formado es translocado a travs del poro con la
participacin de una GTPasa; en el ncleo este complejo se disocia y las protenas
transportadoras salen de nuevo al citoplasma.
Importacin a las mitocondrias
Las protenas destinadas a la mitocondria contienen en el extremo amino terminal un pptido seal de 20 a 35 aminocidos en el que se alternan residuos cargados
positivamente y residuos hidrofbicos (Fig. 5.2). Estos residuos se pliegan en forma
de hlice alfa anfiptica. La cadena polipeptdica se mantiene desplegada mediante
interaccin con protenas chaperonas (Hsp-70). En las membranas mitocondriales
existe complejos que reconoce la hlice alfa y facilita el transporte a travs de las
membranas. El transporte a travs de la membrana interna depende del gradiente
electroqumico y de la hidrlisis de ATP. Una vez en la matriz mitocondrial la
secuencia seal se elimina y tiene lugar el plegamiento de la protena.
Importacin al ER y distribucin desde el aparato de Golgi
Las protenas que contienen una secuencia seal hidrofbica (5-10 residuos) en
el extremo amino terminal (Fig. 5.2) dirigen estos ribosomas hacia el ER. Los ribosomas unidos a membranas sintetizan fundamentalmente tres tipos de protenas:
protenas lisosmicas, protenas de secrecin y protenas de membrana. Este pptido seal es reconocido por un complejo denominado partcula de reconocimiento de
la seal (SRP) que consta de un ARN de 300 nucletidos (7SL-ARN) y seis protenas diferentes una de estas subunidades une e hidroliza GTP. La unin de SRP
detiene la sntesis proteica y el complejo ribosoma-SRP se dirige hacia la membrana del ER donde existen receptores de SRP localizados en la cara citoplasmtica. La
cadena polipeptdica pasa a un complejo de translocacin, posteriormente se hidroliza GTP y la SRP se disocia del ribosoma permitiendo que se reanude la sntesis de
protenas. Si no existen ms seales el polipptido completo atraviesa la membrana pasando a la luz del ER donde una peptidasa elimina la secuencia seal. En el
caso de protenas transmembrana pueden existir varios tipos, uno de los ms simples son aquellas que adems de la secuencia seal ya descrita contienen otro segmento hidrofbico adicional (secuencia de anclaje). Esta secuencia de anclaje detiene el proceso de translocacin originando protenas con una nica regin de
transmembrana y el extremo amino terminal situado en la cara externa de la membrana plasmtica. Las protenas que contienen ms de una regin de transmembra-
66
na necesitan seales adicionales que inician y detienen de nuevo la translocacin de

la cadena polipeptdica.
En la luz del ER las protenas recin sintetizadas se pliegan y muchas son modificadas mediante N-glucosilacin (oligosacridos unidos al nitrgeno de los grupos
amida de residuos de asparagina). Despus las protenas correctamente plegadas
son transportadas mediante vesculas al aparato de Golgi donde los oligosacridos
previamente unidos pueden ser modificados y se pueden aadir nuevos. Los oligosacridos aadidos en el Golgi pueden estar unidos al oxgeno de los grupos hidroxilo de residuos de serina o treonina (O-glucosilacin).
Protenas que contienen la secuencia KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) en el extremo
C-terminal se unen a receptores especficos en la regin de cis Golgi y son devueltas al ER.
Importacin a los lisosomas
Las hidrolasas destinadas a los lisosomas durante su paso por las distintas cisternas del Golgi son modificadas. Estas protenas son reconocidas por una glucosiltransferasa que transfiere una N-acetilglucosamina fosfato a un residuo de manosa. Posteriormente una glucosidasa elimina el residuo de N-acetilglucosamina
originando un oligosacrido con grupos de manosa 6-fosfato. La presencia de residuos modificados de manosa-6-fosfato permite que estas hidrolasas sean reconocidas por protenas receptoras en membranas del complejo trans Golgi donde se forman vesculas que se dirigen a los lisosomas. Durante el transporte el receptor y las
hidrolasas se disocian, tanto por efecto de la disminucin del pH como por la presencia de fosfatasas que eliminan los grupos fosfato, facilitando el reciclaje de los
receptores al complejo de Golgi mientras que las vesculas con las hidrolasas finalizan fusionndose con lisosomas.
Las protenas que son destinadas a la membrana plasmtica no necesitan seales especficas cualquier protena que pase del ER al Golgi ser dirigida hacia la
superficie celular (va por defecto) a menos que contenga seales que la enven
hacia los lisosomas o a vesculas de secrecin.
No se conocen cules son las seales que determinan que las protenas sean dirigidas a vesculas de secrecin. Estas seales de clasificacin en algunos casos puede
estar en regiones de estas protenas que son procesadas proteolticamente durante su
transporte. Estas protenas forman agregados en la regin trans del complejo de
Golgi y posteriormente se forman vesculas de secrecin que permanecen cerca
de la membrana hasta que se produce una seal de liberacin.
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6
Fundamentos de regulacin de la
expresin gnica.
Diferenciacin celular
E. Velzquez Snchez y J. M. Ruz Albusac
Introduccin (1,2)
Los organismos pluricelulares contienen una gran cantidad de clulas que se
organizan de una forma precisa para conformar los diferentes tejidos y rganos. Los
distintos tipos presentan tantas diferencias, en la forma y en su actividad biolgica,
que cuesta trabajo pensar que los cromosomas de todas ellas contengan la misma
informacin gentica. Por esta razn, y dado que la diferenciacin celular suele ser
un proceso irreversible, se lleg a creer que este proceso se produca como consecuencia de la prdida selectiva de genes. En cambio, hoy se sabe que lo que diferencia a una clula de otra es la cantidad y calidad de las protenas que contiene, lo
cual viene condicionado por el patrn de expresin gnica que cada una de ellas
posee. Por este motivo, la diferenciacin celular se produce como consecuencia de
modificaciones en la expresin gnica y no como consecuencia de la prdida
secuencial de genes.
El genoma de una clula contiene, en la secuencia de su ADN, la informacin
necesaria para sintetizar millares de protenas diferentes. De todos los genes que
constituyen el genoma de los diversos organismos, slo se expresa una fraccin de
ellos, al menos durante un periodo de tiempo determinado. Atendiendo a la forma
de expresin de las distintas protenas en los diferentes tipos celulares, se pueden
distinguir los siguientes tipos:
a) Protenas sintetizadas por todos los tipos celulares de un organismo. stas,
a su vez, pueden estar presentes en altas concentraciones, como las protenas
del citoesqueleto, o las histonas, etc.; o en bajas concentraciones, como las
enzimas implicadas en la reparacin de ADN.
b) Protenas presentes en determinados tipos de clulas especializadas y ausentes en las dems. Quizs el ejemplo ms caracterstico sea la hemoglobina,
70
que se encuentra presente solo en los eritrocitos y, adems, a elevadas concentraciones.

c) Protenas sintetizadas en muchos tipos celulares por un periodo de tiempo
limitado. A este tipo pertenecen las protenas reguladoras implicadas en el
desarrollo embrionario y en la diferenciacin celular.
Niveles de control de la expresin gnica (1,2,3)

El coste energtico de la sntesis de protenas es muy elevado, tanto si una protena se expresa durante toda la vida de la clula, como si lo hace durante un periodo de tiempo limitado. Por ello, el control de la expresin gnica es un proceso
esencial que permite a las clulas aprovechar al mximo la energa metablica disponible. Este control se puede ejercer, en todas las etapas del proceso que, desde el
ADN, conduce a las protenas:
a) Control de la transcripcin. Regula el tiempo y el nmero de veces que un
gen, o un conjunto de genes, debe ser transcrito.
b) Control del procesamiento postranscripcional. Regula las reacciones que
producen la transformacin de los transcritos primarios del ARN, en los
correspondientes ARN mensajeros maduros.
c) Control del transporte de los ARN mensajeros. El ARN mensajero es sintetizado en el ncleo: sin embargo, sus lugares de actuacin se encuentran en
el citoplasma, por lo que previamente han de ser transportados a travs de los
poros nucleares.
d) Control traducional. Seleccin de los ARN mensajeros citoplasmticos que
deben ser traducidos por los ribosomas.
e) Control de la degradacin de los ARN mensajeros. Algunos ARN mensajeros presentes en el citoplasma son inactivados de forma selectiva.
f) Control de la actividad proteica. Las protenas sintetizadas son convertidas
de manera selectiva en las correspondientes formas activas o inactivas.
De todos los niveles posibles en los que puede ser regulada la expresin gnica,
la regulacin a nivel del inicio de la transcripcin es la ms importante y la mejor
caracterizada para la mayora de las clulas. Este nivel de control es el que tiene
lugar preferentemente en el proceso de la diferenciacin celular.
Visin general del control de la transcripcin:

regiones reguladoras (1,4)
La transcripcin gnica est regulada por una o varias regiones situadas a lo
largo de la molcula del ADN y que precisamente reciben el nombre de regiones
reguladoras. Las regiones reguladoras actan a la manera de interruptores mole-
FUNDAMENTOS DE REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA
71
culares, ms o menos complejos, cuya funcin es la activacin o la represin de la

expresin gnica. Estos interruptores moleculares que controlan la transcripcin
estn constituidos por dos elementos esenciales: Secuencias especficas en el ADN
y protenas reguladoras que se unen a l.
a) Secuencias especficas de ADN. El ADN posee un gran nmero de segmentos de pequeo tamao (menos de 20 pares de bases) cuya secuencia posee
una composicin definida, que son reconocidos por una protena reguladora
nica o por un conjunto de protenas relacionadas. La interaccin de una protena reguladora con su correspondiente secuencia diana en el ADN determina la activacin o la inactivacin (represin) de uno o de varios genes. El
fundamento de la regulacin de la expresin gnica viene representado por
la naturaleza de la interaccin entre las protenas reguladoras con sus respectivas secuencias diana en el ADN. Las protenas reguladoras contactan
con el surco mayor del ADN mediante interacciones no covalentes. Aunque
la energa de interaccin de cada uno de estos contactos es en s dbil, la
existencia simultnea de entre 18 y 22 contactos asegura una unin fuerte y
altamente especfica.
b) Protenas reguladoras. Una protena reguladora reconoce una secuencia de
ADN porque las superficies de contacto de ambas molculas son complementarias. Cada protena reguladora presenta una secuencia de aminocidos
caracterstica y, por tanto, los motivos de reconocimiento protena-ADN son
tpicos en sus detalles. Sin embargo, el estudio de los complejos protenaADN, mediante cristalografa de rayos X o por espectroscopia de resonancia
magntica nuclear, ha determinado, que la mayora de las protenas reguladoras conocidas, se puede agrupar en alguno de los tipos de motivos estructurales de unin al ADN que se describen a continuacin.
Principales motivos de unin al ADN

Motivo hlice-giro-hlice (6,7)
Este motivo, descrito originalmente en protenas bacterianas, se encuentra presente en un gran nmero de protenas reguladoras, tanto de procariotas como de
eucariotas. Est formado por dos hlices a unidas por una corta cadena de aminocidos que forman el giro. La hlice ms cercana al extremo carboxilo se denomina
hlice de reconocimiento y se adapta al surco mayor del ADN.
Protenas con homeodominio (8,9,10)
Este motivo est constituido por tres hlices a conectadas por dos bucles. Fue
primeramente descrito en las protenas reguladoras denominadas hometicas,
72
codificadas, a su vez, por los genes hometicos cuya expresin es esencial para el
desarrollo de la mosca del vinagre (Drosophila). Este motivo se halla tambin presente en las protenas reguladoras de los organismos superiores.
Dedos de zinc (11,12)
La caracterstica principal de este motivo, del que se han descrito varios tipos
diferentes, es que todos ellos contienen, al menos, un tomo de zinc. Hoy se conocen varios tipos distintos, en unos, el tomo de zinc conecta una hlice a con una
lmina `, en otros, como en la familia de receptores para hormonas tiroideas, el
tomo de zinc conecta dos estructuras a helicoidales. En ambos casos la interaccin
de la protena con el ADN tiene lugar por sus regiones _ hlice.
Cremallera de leucina 5,13,14
Es una hlice _ en donde se distinguen dos dominios funcionalmente diferentes:
a) Dominio de dimerizacin. Se forma a partir de una regin a helicoidal que
contiene un mnimo de cuatro leucinas, separadas cada una de ellas por seis
aminocidos. La estructura primaria es: Leu-X6-Leu-X6-Leu-X6-Leu, en
donde X puede ser cualquier aminocido. Puesto que hay 3,6 aminocidos
por vuelta de hlice, las leucinas se alinean en un margen de la hlice, lo que
les permite establecer interacciones hidrofbicas con otra protena que presente un motivo estructural similar.
Las protenas con cremallera de leucina pueden unirse a otra protena idntica para formar un homodmero, o a una protena diferente, pero que presente ese mismo motivo estructural, y formar as un heterodmero.
b) Dominio de unin al ADN. Se sita a continuacin de la cremallera de leucina, presenta estructura de _ hlice y contacta con el surco mayor del AND.
Motivo hlice-bucle-hlice (HBH) (4,15)
Este motivo est constituido por dos hlices _ anfipticas conectadas por un
bucle de longitud variable. A travs de una de las hlices se produce la interaccin
con el ADN, la segunda hlice permite la interaccin con un motivo semejante
perteneciente a una protena igual o diferente; las protenas que contienen este motivo pueden formar por tanto dmeros: homodmeros o heterodmeros. La capacidad
para formar dmeros depende de la naturaleza de la hlice _ y es comn a todas las
protenas que contienen el motivo HBH. La mayora de las protenas que contienen
el motivo HBH presentan adems una secuencia con alto contenido en aminocidos
bsicos. Esta regin bsica se sita en una posicin adyacente al motivo HBH y es
de capital importancia para la interaccin con el ADN. Este motivo se denomina
hlice bucle hlice bsico (HBHb).
73
Dimerizacin de protenas. Control combinatorio.

Importancia en la expresin gnica (1,3,4)
La dimerizacin de protenas es de gran importancia para el control de la expresin gnica durante la diferenciacin celular. Los heterodmeros se forman mediante interaccin de protenas con diferentes especificidades de unin al ADN; puesto
que hay varias protenas diferentes (con motivos estructurales complementarios)
stas pueden combinarse de varias maneras, en funcin de la combinacin establecida en un momento preciso el resultado sobre la expresin de un gen o de un
conjunto de genes puede ser muy diferente. Del control combinatorio se deducen
varios aspectos fundamentales (Fig. 6.1): en primer lugar, que el control de un solo
gen puede requerir la presencia de varias protenas reguladoras, en segundo lugar,
que una misma protena reguladora puede estar implicada en la expresin de varios
genes diferentes y en tercer lugar, que la misma protena reguladora puede formar
parte de un complejo regulador activador o represor, dependiendo del resto de las
protenas que formen parte del complejo.
Una consecuencia importante del control combinatorio es que unas cuantas protenas reguladoras, combinadas de forma adecuada, pueden formar varios tipos
celulares diferentes, a lo largo del desarrollo. En la Figura 6.2 puede verse como,
mediante la combinacin de cinco protenas, cuya expresin ha sido inducida de
PROTENAS REGULADORAS
COMPLEJOS ADN-PROTENA
A
Gen activo
B
Gen inactivo
Figura 6.1. Efecto de la combinacin de protenas reguladoras unidas a su ADN diana sobre la
transcripcin gnica. (A) Combinacin activadora de la transcripcin. (B) Combinacin inhibidora
de la transcripcin.
74
Clula embrionaria
1.a DIVISIN
2.a DIVISIN
3.a DIVISIN
Figura 6.2. Importancia del control combinatorio para la diferenciacin celular. La decisin de
sintetizar una protena (escogida de entre un par) se toma despus de cada divisin celular atendiendo a criterios posicionales (las clulas hijas situadas a la derecha del embrin expresan nicamente la protena representada a ese lado de la flecha, y las de la izquierda, las representadas a ese mismo lado). Cuando una generacin inicia la expresin de una protena, las
generaciones sucesivas la expresan tambin. En el ejemplo se representa la formacin de ocho
tipos celulares con cinco protenas reguladoras diferentes (tringulos y , crculo k, corazn
y media luna z).
forma secuencial a lo largo de tres divisiones celulares, y teniendo en cuenta la posicin ocupada por cada clula en el embrin, se han formado ocho tipos diferentes
de clulas.
Otra consecuencia del control combinatorio es que el efecto de aadir una nueva
protena a una clula depende de la historia anterior de la misma, puesto que esta
historia determina qu protenas reguladoras se encuentran ya en la clula. As,
durante el desarrollo, una clula acumula una serie de protenas que pueden no
modificar su expresin gnica, pero en un momento determinado, cuando se expresa el ltimo miembro de la combinacin requerida, se completa el mensaje regulador, y en consecuencia se producen grandes cambios en la expresin gnica. Esto
puede explicar por qu los fibroblastos pueden ser convertidos en clulas musculares por efecto de la expresin inducida de un gen denominado mioD, como veremos
despus.
75
El control combinatorio puede tambin explicar el proceso de la determinacin

celular por la cual una clula queda determinada a seguir una cierta ruta de diferenciacin y un destino, y el proceso de la diferenciacin celular, mediante el cual una
clula expresa su carcter diferenciado.
Regulacin de la actividad de las protenas reguladoras (1,3,4)

La combinacin de las protenas reguladoras para activar la expresin gnica
no se produce al azar, sino que est, a su vez, regulada por seales extracelulares
que combinan su mensaje mediante receptores situados en la membrana plasmtica o en el interior celular. La seal externa es transducida hasta el ncleo celular y
la consecuencia es la activacin/inactivacin de una o de varias protenas reguladoras.
Control de la expresin gnica en la diferenciacin celular.

Miognesis (1,3,4)
El proceso mediante el cual un huevo es transformado en un organismo multicelular requiere la ejecucin de un complejo programa de desarrollo. Para que este
programa pueda llevarse a cabo, es necesaria la activacin de una serie de genes.
Esta activacin debe producirse en el momento preciso, en una secuencia determinada y en una localizacin exacta.
Son varios los mecanismos y procesos implicados en la regulacin de la expresin gnica durante el desarrollo. Como resultado de esos controles, las clulas responden a los cambios producidos en su entorno y as los diferentes tipos celulares
pueden producir sus protenas caractersticas. La mayora de los mecanismos implicados en la regulacin de la expresin gnica durante la diferenciacin celular
requieren la participacin de una gran cantidad de protenas reguladoras que actan
de forma combinada. El resultado de su actuacin es la activacin/represin de la
transcripcin de uno o de varios genes. Uno de los ejemplos ms representativos y
mejor caracterizados sobre el control de la expresin gnica en la diferenciacin
celular lo constituye la miognesis, algunos de cuyos aspectos se describen a continuacin.
Etapas de la miognesis (3,15)

Las clulas musculares se forman en los organismos superiores a partir de los
somitos (bloques de clulas mesodrmicas localizadas a ambos lados del tubo neural)
mediante tres etapas: Determinacin, Proliferacin/Migracin y Diferenciacin
(Fig. 6.3).
76
Somito
Determinacin
Protenas
MioD/Myf5
Mioblastos
ProliferacinMigracin
Clulas musculares
indiferenciadas
Diferenciacin
Protenas
Miogenina
Mrf4
Miotubo
Figura 6.3. Esquema representativo de las tres etapas principales que intervienen en la miognesis. Influencia de las protenas miognicas. De acuerdo con el modelo representado, las protenas MioD y Myf5 actuaran fundamentalmente en la etapa de determinacin, mientras que,
Miogenina y Mrf4, lo haran en el transcurso de la diferenciacin.
a) Etapa de Determinacin
Una clula est determinada cuando ha tomado una decisin sobre su desarrollo; es decir, cuando ha experimentado un cambio que la diferencia, a ella y a sus
descendientes, de las otras clulas del embrin y que la obliga a tomar una va de
desarrollo determinada. En este caso, algunas clulas concretas de los somitos se
determinan, convirtindose as en mioblastos; precursores de las clulas musculares, que carecen todava de grandes cantidades de las protenas propias de la clula
madura.
77
b) Etapa de Proliferacin/Migracin
Despus de la determinacin, una subclase de mioblastos (los destinados a convertirse en msculo) migran desde los somitos hacia las regiones en donde se formarn las extremidades, aqu proliferan y se funden para formar un sincitio.
c) Etapa de Diferenciacin
En esta etapa los precursores se convierten en clulas musculares maduras (miotubos). Se emplea el trmino diferenciacin para designar la especializacin celular
manifiesta; es decir, la manifestacin de un carcter celular muy evidente (expresin de actina, miosina, troponina, receptor de acetilcolina, etc.).
Las seales extracelulares que inducen la determinacin de cada grupo de mioblastos proceden de las clulas vecinas, principalmente del tubo neural y del ectodermo lateral, y se expresan slo de forma transitoria. Estas seales disparan la
expresin de numerosos factores intracelulares que mantienen el programa miognico en ausencia de las seales inductoras.
Durante el proceso de la miognesis se produce un gran aumento de la expresin
de los genes necesarios para el desarrollo del msculo y para su funcin biolgica:
genes miognicos.
Protenas reguladoras de la miognesis

En la determinacin y diferenciacin del msculo intervienen varias protenas
reguladoras pertenecientes a dos familias diferentes de factores de transcripcin
denominadas FMR (Factores Musculares Reguladores o Protenas Miognicas), y
MEF-2 (Myocyte Enhancer Factor 2).
Factores Musculares Reguladores (FMR) (3,16,17,18,19)
En esta familia se incluyen cuatro protenas denominadas MioD (primera descubierta), Miogenina, Myf5 y Mrf4. Reciben el nombre colectivo de Protenas
Miognicas porque cuando su expresin es inducida experimentalmente en otras
clulas (fibroblastos) estas expresan las protenas propias de las clulas musculares.
Los miembros de esta familia se expresan nicamente en las clulas musculares
y se unen a secuencias especficas en el ADN denominadas cajas E.
La expresin de los FMR est sometida a regulacin espacial y temporal a lo
largo del desarrollo muscular. Por ejemplo, se detecta expresin de Myf5 en la
regin dorsomedial del somito en el da octavo del desarrollo, expresndose un da
y medio despus en la regin lateral. Con excepcin de la Mrf4, que se expresa de
forma transitoria durante los das diez y once del periodo embrionario y nuevamente, a partir del da diecisis, el resto de las protenas miognicas, una vez ini-
78
ciada su expresin, sta permanece, aunque en intensidad variable, hasta el estado

adulto.
Diversos estudios de mutagnesis dirigida, parecen indicar, que cada una de las
protenas miognicas poseen diferentes funciones in vivo. As, las protenas MioD
y Myf5 parecen estar principalmente implicadas en la determinacin de los somitos
y en su conversin en mioblastos (Fig. 6.3), mientras que Miogenina y Mrf4 intervendran ms bien en el proceso de la diferenciacin.
MEFs (Muscle Enhancer Binding Factors) (17,18,20)
Los MEFs, a diferencia de los FMR, son incapaces por s mismos de inducir la
miognesis, pero hacen posible que los FMR lo hagan. Los MEFs son expresados
por otros tipos celulares, adems de por las clulas musculares, durante el desarrollo. Las regiones del ADN a las cuales se unen especficamente se denominan cajas
MEF.
Estructura de los FMR y MEFS. Control combinatorio

en la miognesis (3,4,17)
Tanto los FMR como los MEFs contienen en su estructura molecular el motivo
HLH bsico. Esto les permite formar homodmeros y heterodmeros y por tanto,
combinarse de formas diversas, con las correspondientes implicaciones en la expresin gnica. Y as, aunque cada uno de estos factores puede unirse a sus ADNs
diana, la afinidad de unin es mucho mayor, cuando cualquiera de ellos lo hace asociado con l mismo o con otro. Por ejemplo, los MRFs forman heterodmeros con
la protena E2A (factor de transcripcin expresado en varios tipos celulares, que
posee tambin el motivo HLH bsico), y este heterodmero se une a la caja E del
ADN. Por su parte, la unin de los MEFs a su ADN diana (caja MEF), requiere la
dimerizacin de los mismos. Los dmeros MEF-MEF, pueden a su vez combinarse
con los heterodmeros MRF-E2A.
Teniendo en cuenta que los genes implicados en la diferenciacin terminal del
msculo (Fig. 6.4) poseen cajas E, cajas MEFs o ambas, y que los heterodmeros
MRF-E2A interaccionan con los dmeros MEF-MEF, dependiendo del tipo de interaccin, con las mismas protenas reguladoras pueden activarse hasta tres genes
diferentes.
En general, estas diferentes posibilidades de combinacin, producen altos niveles de expresin en los genes responsables de la formacin del msculo. En conclusin, la llave de la especificidad miognica se encuentra en la asociacin combinatoria de las diferentes protenas a sus correspondientes sitios de control.
E2A
FMR
MEF
MEF
79
Promotor
Caja MEF
MEF
MEF
FMR
E2A
Promotor
Caja E
Caja MEF
MEF
MEF
E2A
FMR
Promotor
Caja E
Figura 6.4. Modelos de combinacin de las protenas implicadas en la miognesis. Cada una
de las tres combinaciones de protenas (A, B y C) podra activar un gen diferente implicado en la
miognesis. FMR (Factores Musculares Reguladores). E2A (Factor de transcripcin E2A). MEF
(Muscle Enhancer Binding Factor). Caja E (secuencia de ADN especifica para la unin del dmero FMR-E2A). Caja MEF (secuencia de ADN especfica para la unin del dmero MEF-MEF).
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7
Genes para la presentacin
y el reconocimiento de antgenos
R. Milln Gonzlez y J. R. Regueiro
Introduccin
El sistema inmune surgi durante la evolucin de los vertebrados para combatir
las infecciones causadas por virus, bacterias, protozoos, hongos y helmintos. Estos
patgenos pueden ser responsables de infecciones intracelulares o extracelulares,
para las cuales la respuesta inmune debe ser diferente. De hecho, el sistema inmune ha desarrollado una variedad de respuestas apropiadas para combatir cada tipo de
patgeno, al mismo tiempo que mantiene la tolerancia a los componentes del propio organismo. Para eliminar un patgeno que haya establecido una infeccin (atravesando las barreras epiteliales del organismo) lo primero que debe de hacer el sistema inmune es reconocerlo como tal y a continuacin desarrollar una respuesta
adecuada para destruirlo. Para ello el sistema inmune ha desarrollado dos tipos de
mecanismos cuya diferencia principal reside en las estructuras de reconocimiento
de los patgenos, ya que los mecanismos efectores de destruccin son esencialmente similares. Estos dos mecanismos son la inmunidad innata y la inmunidad
adquirida.
La inmunidad y la autotolerancia innatas

Los mecanismos innatos, ms primitivos evolutivamente hablando, de accin
inmediata, son mecanismos inespecficos de reconocimiento del patgeno y carentes de memoria inmunolgica. Son los encargados de combatir la infeccin desde el
mismo momento de su inicio y durante sus primeras fases (aproximadamente de
0-5 das) con gran eficacia. Si stos no consiguen eliminar la infeccin, al menos la
mantienen bajo control mientras se desarrolla el otro tipo de mecanismo, la inmunidad adaptativa, que requiere ms tiempo (aproximadamente una semana) para
82
desarrollarse. Las respuestas innatas generadas influyen en el tipo de respuesta

adaptativa que se desarrollar ms tarde.
La inmunidad innata se basa en la activacin del complemento por la va alternativa y en los fagocitos (monocitos/macrfagos y neutrfilos) e inflamocitos (mastocitos), clulas que tienen receptores innatos para mltiples patgenos (1):
1. Receptores que reconocen estructuras caractersticas de los patgenos.
Lectinas de superficie que reconocen carbohidratos en la superficie de
bacterias, levaduras y clulas senescentes (como LPSR o CD14 y el
receptor de manosa, MR).
Receptores de detritos (scavenger) que reconocen polmeros aninicos
presentes en la superficie microbiana y de clulas muertas.
2. Receptores para el fragmento Fc (FcR) de las inmunoglobulinas. Se encuentran en la superficie celular y estn especficamente diseados para reconocer y unirse al fragmento constante de las inmunoglobulinas y mediar su funcin biolgica.
3. Receptores para protenas del complemento (CR).
Todos estos receptores son capaces de reconocer, de forma inespecfica, estructuras propias del patgeno y opsoninas. Una vez que el patgeno ha sido reconocido, se iniciar la fase efectora de la respuesta inmune innata. En el caso de un fagocito, tras el reconocimiento, se producir la activacin del fagocito, ingestin del
patgeno (formacin del fagosoma) y, por ltimo, la digestin (formacin del fagolisosoma y destruccin del patgeno).
Existen otros mecanismos innatos que no actan inmediatamente, sino que son
inducibles, como son la respuesta de fase aguda, los interferones (especialistas en
defendernos de los virus), las clulas citolticas naturales (NK, natural killer), las
citocinas y otros mediadores que producen inflamacin.
Como se indic anteriormente, la funcin principal del sistema inmune es la
defensa frente a las infecciones, pero adems, dicho sistema tiene que aprender a
tolerar las estructuras propias para no reaccionar contra ellas. En el caso de la inmunidad innata, debido a que es una inmunidad que ya est desarrollada desde el nacimiento (est determinada en la lnea germinal) y no necesita el contacto previo con
la sustancia ofensiva, los mecanismos de tolerancia se realizan por la accin de la
seleccin natural. Los individuos en los que las clulas o molculas que pertenecen
a la inmunidad innata no respeten los componentes propios del organismo sern
purgados por accin de la seleccin natural y no sern viables.
La inmunidad adaptativa
Los mecanismos adaptativos (ms recientes evolutivamente hablando) tardan
una semana en desarrollarse (por eso constituyen la inmunidad adquirida), tienen
unos mecanismos de reconocimiento del patgeno extremadamente especficos (los
GENES PARA LA REPRESENTACIN Y EL RECONOCIMIENTO
83
receptores para antgeno TCR y BCR) y presentan memoria. Los linfocitos T y B

son las nicas clulas capaces de reconocer especficamente los agentes patgenos,
cada linfocito est programado genticamente para reconocer de forma exclusiva un
nico antgeno. El sistema inmunitario en conjunto puede reconocer especficamente miles de antgenos, de tal forma que los linfocitos que reconozcan un antgeno determinado deben constituir una fraccin minscula del conjunto total de linfocitos (2). Cmo es posible entonces generar una respuesta inmunitaria adecuada
frente a un agente infeccioso? La respuesta es que cuando un agente se une a las
escasas clulas capaces de reconocerlo, dichas clulas inician un proceso de proliferacin masiva. Al cabo de pocos das, su nmero es suficiente para ejercer una
respuesta inmunitaria eficaz. Es decir, el antgeno selecciona los clones de clulas
que son capaces de unirse a l y promueve su proliferacin (vase Fig. 7.1).
FASES
RECONOCIMIENTO
(SELECCIN CLONAL)
LINFOCITOS
VRGENES
B
3
SELECCIN CLONAL
B
ACTIVACIN
(EXPANSIN CLONAL)
PROLIFERACIN
LINFOCITOS
ACTIVADOS
2 B
2
2
DIFERENCIACIN
LINFOCITOS
EFECTORES
2
2
CLULAS PLASMTICAS
FUNCIN
EFECTORA
CLULAS DE MEMORIA
ANTICUERPOS
Figura 7.1. La seleccin clonal. Cada linfocito y su progenie (el clon) tienen una nica especifidad generada por azar (de la 1 a la n). Cada antgeno seleciona por estimulacin al linfocito que
es capaz de reconocerlo, ignorando a los dems (el 2 en este ejemplo). ste entonces prolifera y
madura amplificando la respuesta especfica y generando memoria inmunolgica. Las fases de
reconocimiento, activacin y funcin efectora son aplicables.
84
Por tanto, el fenmeno primario y esencial de toda respuesta inmune es el reconocimiento del antgeno por los linfocitos T y B, que se consigue gracias a la presencia en su membrana de receptores especficos para l. En el caso de los linfocitos B, este receptor est constituido por inmunoglobulinas de membrana (mIg), que
se hallan asociadas de forma no covalente con el heterodmero CD79_-CD79`. En
el caso de los linfocitos T, lo constituye el TCR, que se halla asociado de forma no
covalente a las molculas CD3. Un sistema especial de reordenamiento de estos
genes, sistema que slo poseen los linfocitos T y B, garantiza que durante su desarrollo en los rganos linfoides primarios, cada clon linfocitario (clula y todas las
clulas derivadas de ella por divisin celular) adquiera un receptor antignico
(inmunoglobulina en el caso de los linfocitos B, TCR en el caso de los linfocitos T)
con un nico sitio de unin al antgeno, es decir, con una sola especificidad, que es
diferente de la de los receptores de los otros clones linfocitarios. El repertorio de
especificidades distribuidas clonalmente entre los distintos linfocitos T y B maduros es enorme, lo que permite que haya siempre linfocitos, aunque sea en muy bajo
nmero, con receptores especficos para eptopos de las mltiples (potencialmente
millones) sustancias extraas (antgenos) que pueden penetrar en el organismo de
un individuo. Una vez maduros, los linfocitos pasan a la periferia, circulando y
recirculando por los rganos linfoides secundarios, donde desarrollarn las respuestas cuando encuentren el antgeno para el que son especficos. Estas respuestas
obedecen al principio de seleccin clonal, de forma que el antgeno selecciona (es
decir, se une de forma selectiva) clones de linfocitos T y/o B con receptores especficos para l; esto determina la activacin y proliferacin de dichos clones y la
consiguiente amplificacin clonal del nmero de linfocitos especficos para ese
antgeno. Esta ampliacin del nmero de linfocitos especficos de antgeno garantiza que la respuesta secundaria frente al mismo antgeno se comporte como una
respuesta con memoria, es decir, sea mucho ms rpida, eficaz e intensa.
Linfocitos B y su receptor para el antgeno

Las clulas B son generadas por el organismo a lo largo de toda su vida, produccin que tiene lugar en la mdula sea. Las clulas precursoras residentes en
dicho rgano tienen que sufrir un proceso de diferenciacin, en el que se requiere
la participacin de las clulas del estroma a travs de contactos directos clula-clula y a travs de la produccin de factores solubles. En el proceso de maduracin del
linfocito B se va a producir la formacin del complejo BCR (receptor de la clula
B) maduro y funcional. El BCR est formado por dos tipos de cadenas, cadenas
variables (inmunoglobulina de membrana) y cadenas invariables (iguales en todos
los linfocitos, CD79). Cada complejo receptor est formado por la unin de la inmunoglobulina a dos heterodmeros CD79_/CD79`. Cmo se genera la diversidad en
estos receptores? (3) Las molculas de inmunoglobulina son codificadas por genes
que contienen mltiples versiones para cada regin de la cadena. De este modo un
linfocito B elige entre todas esas opciones posibles y expresa al final en su mem-
85
brana una molcula de inmunoglobulina concreta. Las regiones constantes de las

cadenas ligeras y pesadas se encuentran codificadas por los denominados segmentos C y las regiones variables por los segmentos V y J o V, D y J segn se trate de
cadenas ligeras o pesadas respectivamente. Los segmentos codificantes (V, J y C, y
tambin D en el caso de las cadenas pesadas) se encuentran separados en el genoma de todas las clulas del organismo, excepto en los linfocitos B, la aproximacin
de estos segmentos gnicos durante la maduracin de la clula B es necesaria para
su expresin. Dicha aproximacin tiene lugar por un proceso de recombinacin
somtica (vase Fig. 7.2). Slo los segmentos que codifican para la regin variable
de cada cadena recombinan y se aproximan. Los segmentos constantes permanecen
separados del resto y es a nivel del ARNm cuando se unen a la combinacin VDJ o
VJ ya recombinada. Por tanto, el mecanismo bsico para la generacin de la diver-
Figura 7.2. Ejemplo de reordenamiento, transcripcin y traduccin de una cadena ligera g en un

precursor de linfocitos B. Una de las versiones V () se yuxtapone a una J () por recombinacin
somtica, eliminndose grandes segmentos de ADN (*). Ahora ya es posible la sntesis de un RNA
con los segmentos necesarios (V, J, C) que se alinearn por excisin intrnica (se eliminan grandes segmentos de ARN). La regin variable de la cadena ligera est codificada por dos segmentos gnicos (V y J).
86
sidad de los anticuerpos es la recombinacin somtica al azar de las distintas versiones de los genes que codifican cada regin de sus cadenas, y la asociacin al azar
de las propias cadenas pesadas y ligeras, pero no es el nico. La imprecisin en la
unin de los segmentos gnicos a la hora de la recombinacin y la hipermutacin
somtica que tiene lugar durante el reordenamiento amplifican dicha diversidad.
Tenemos, por tanto, formado un amplio repertorio de linfocitos B capaces de reconocer especficamente un amplio espectro de antgenos a pesar de que cada linfocito B expresa y sintetiza una nica inmunoglobulina.
Linfocito T y su receptor para antgeno
Los linfocitos B reconocen antgenos libres o solubles mediante su receptor
antignico de superficie. En el caso de los linfocitos T, el antgeno es previamente
degradado y procesado en el interior de las clulas presentadoras de antgeno
(APC). Posteriormente, los fragmentos procesados son expuestos en la superficie de
la clula presentadora, en el seno de una molcula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC de clase I o de clase II). El TCR no reconoce al antgeno libre
de forma directa como ocurre con los anticuerpos, sino que reconoce slo fragmentos del antgeno en la membrana de esas clulas presentadoras, unidos o presentados por las regiones polimrficas de las molculas MHC de clase I o clase II
propias. Esto implica que el MHC heredado por un individuo determinado condiciona o restringe la especificidad del TCR de sus linfocitos T. En otras palabras, una
clula T no es especfica de un antgeno, X, como ocurre con los linfocitos B, sino
de X + MHC propio. La restriccin por el MHC de la especificidad de las clulas T
es una propiedad adquirida durante su desarrollo en el timo.
Adems del TCR, las clulas T expresan en su membrana determinadas protenas de superficie, denominadas colectivamente molculas accesorias, cuya funcin
principal es estabilizar la interaccin inicial entre la clula T y la clula presentadora
(como CD4, CD8, CD2). Esta interaccin inicial facilita el posterior reconocimiento del antgeno por el TCR. Adems, asociado a las dos cadenas polimrficas que
constituyen el TCR se encuentra un grupo de protenas monomrficas, denominado en conjunto CD3, formando as el complejo TCR-CD3. Las cadenas CD3 son
imprescindibles para la transmisin de la seal de reconocimiento antignico al
interior celular, estando probablemente implicadas en las interacciones del TCR con
las molculas accesorias antes citadas. A lo largo de su desarrollo en el timo los linfocitos T adquieren el receptor del antgeno de las clulas T (TCR), y al igual que
ocurre con los linfocitos B, cada linfocito T adquiere un nico TCR, cuya especificidad es distinta de la de los otros linfocitos T.
El TCR
Es un heterodmero con un peso total de 86 kD cuyas dos cadenas polipeptdicas, denominadas _ y `, estn unidas covalentemente por puentes disulfuro. Es la
87
porcin especfica del receptor, por lo tanto polimrfica, y en ella se da la variacin

clonotpica que permite el reconocimiento de los diferentes antgenos. Existe un
isotipo del TCR que se encuentra en una pequea subpoblacin (inferior al 5 %) de
clulas T y est formado por cadenas a y b en lugar de _ y `. Este heterodmero
tiene una estructura similar al TCR_`, y su funcin biolgica an no est claramente determinada. Los genes que codifican las cadenas del TCR estn formados
por la unin de elementos gnicos separados que codifican para las regiones V, D,
J y C. Las secuencias adyacentes a los segmentos V, D y J tienen, como los de las
inmunoglobulinas, determinadas secuencias (heptmero-espaciador-nonmero) que
estn implicadas, como seal de reconocimiento, en el reordenamiento somtico. El
mecanismo de reordenamiento sigue tres etapas: a) interaccin de las secuencias
complementarias de uno de los genes D y J, al azar; b) el gen V sigue un mecanismo anlogo, constituyndose segmentos V-D-J; los segmentos V podran asociarse
con los J cuando no existe la regin D, y c) por ltimo, se produce un reordenamiento de un gen de la regin C, dando lugar al ADN reordenado y completo que
habra as creado una especificidad al azar. La amplia diversidad de TCR posibles
se genera por los siguientes mecanismos: multiplicidad de genes V; unin aleatoria
de los mltiples segmentos de los genes V, D, J y C; diversidad de unin que resulta de una fusin imprecisa entre los ltimos segmentos, responsable de deleciones
y adiciones de nucletidos, lo que origina una diferencia en el nmero de aminocidos (este cierto grado de flexibilidad es una caracterstica que slo poseen los linfocitos T), y asociacin al azar de las dos cadenas (_-` y a-b) que constituyen el
receptor. En contraste con las inmunoglobulinas, los genes de TCR no parecen
diversificarse mediante mutaciones somticas de los genes reordenados, posiblemente debido a la necesidad de reconocimiento de las molculas MHC.
El sistema HLA
El sistema HLA constituye el sistema principal de histocompatibilidad (MHC)
humano. Est compuesto por una serie de protenas de membrana que se hallan
codificadas por genes situados en una regin, cercana al centrmero, en el brazo
corto del cromosoma 6. Su funcin en el sistema inmunitario consiste en combinarse con pptidos que han sido procesados por las clulas presentadoras de antgenos (APC), formando un complejo que puede ser reconocido por las clulas T.
Para este fin, las molculas de histocompatibilidad cuentan con una regin polimrfica, que se encarga de unir pptidos e interaccionar con el TCR, y una regin
monomrfica, que ancla la molcula a la membrana y se encarga de interaccionar
con los correceptores CD4 o CD8. Dos familias de molculas de histocompatibilidad se han especializado en presentar pptidos a los linfocitos T CD4+ y CD8+: las
de clase II y las de clase I respectivamente. Cada familia de molculas cuenta con
varias versiones o isotipos (HLA A, B, C de clase I y HLA-DR, DP, DQ de clase II),
cada uno de los cuales presenta un elevado polimorfismo en la poblacin. Cada una
de la variantes o alotipos de cada uno de los isotipos de las molculas de clase I y
88
de clase II presenta un grupo de pptidos ligeramente diferente, aunque la flexibilidad existente permite que siempre se produzca alguna presentacin.
Fases de la inmunidad adaptativa

Si un patgeno logra sortear las tremendamente eficaces barreras inmunes innatas y establecer una infeccin, se ponen en marcha los mecanismos de inmunidad
adaptativa. A menudo sta se pone en marcha de todos modos, simplemente para
reforzar la inmunidad innata en futuras infecciones. Las respuestas adaptativas
comienzan con el reconocimiento del antgeno, a continuacin se produce la activacin de los linfocitos y su posterior proliferacin para alcanzar un nmero de linfocitos mnimo tal que, al diferenciarse y adquirir su funcin efectora, sean capaces
de eliminar el antgeno (patgeno). A la vez que se generan linfocitos efectores tambin se producen linfocitos de memoria. La respuesta inmune adaptativa consta de
las siguientes fases:
1. Reconocimiento: Consiste en la unin del antgeno a los receptores especficos para antgeno de los linfocitos maduros. Los linfocitos B reconocen determinantes antignicos conformacionales (protenas, carbohidratos o lpidos) de los
patgenos extracelulares o sus productos (en forma soluble) por medio de su BCR.
Los linfocitos T reconocen el antgeno por medio de su TCR, pero a diferencia del
linfocito B no lo hacen en forma soluble, sino que reconocen pequeos pptidos (924 aminocidos) unidos a las molculas de histocompatibilidad HLA (de clase I y
II) propias presentados por clulas presentadoras de antgeno.
Las molculas MHC de clase II y de clase I muestran una diferente especializacin para presentar el antgeno segn la procedencia intracelular o extracelular de
ste. Las de clase II estn especializadas en la presentacin de antgenos extracelulares (cualquier antgeno proteico exgeno) que entren en la clula presentadora por
endocitosis o fagocitosis, mientras que las de clase I estn especializadas en la presentacin de antgenos procedentes de protenas citoslicas sintetizadas por la propia clula (como una protena vrica en una clula infectada). Esto est condicionado por las distintas vas biosintticas seguidas por las molculas MHC de clases II
y I. Las cadenas que forman las molculas de clase I se sintetizan en el retculo endoplsmico, donde se ensamblan, formando un heterodmero fsicamente inestable a
temperatura fisiolgica. La presencia de pptidos antignicos de 8-10 aminocidos
es esencial para la formacin de heterodmeros estables. Una vez formado el heterodmero estable unido al pptido, se sigue el proceso de exocitosis comn a las molculas de membrana, es decir, del retculo endoplsmico son transportadas al aparato de Golgi y, desde ste, pasan a la membrana plasmtica a travs de un sistema
vesicular. Los pptidos que se unen a las molculas MHC de clase I en el retculo
endoplsmico proceden generalmente de protenas citoslicas o nucleares que se
han degradado en el citosol. Los pptidos producidos como consecuencia de esta
degradacin son transportados a la luz del retculo endoplsmico mediante trans-
89
porte activo dependiente de ATP que es llevado a cabo por protenas transportadoras
de pptidos (TAP, del ingls transporters associated with antigen presentation),
consistentes en dos subunidades (TAP-1 y TAP-2) ancladas a la membrana formando un heterodmero. Se han descrito pptidos procedentes de las secuencias seales
que pueden unirse al MHC de forma independiente de TAP, probablemente tras
degradacin proteica dentro del retculo endoplsmico. Por otro lado existen otros
genes, LMP2 y LMP7, que codifican subunidades de un complejo de proteasas citoslico denominado proteasoma, que pueden estar involucrados en la produccin de
los pptidos citoslicos que van a ser transportados al retculo endoplsmico. En
cuanto a las molculas MHC de clase II, las cadenas _ y ` que forman el heterodmero tambin se sintetizan en el retculo endoplsmico. Dentro de ste se asocian a
una tercera cadena polipeptdica, la cadena invariante (hi), formando un trmero _`-hi. Dicha asociacin impide a la molcula de clase II unirse a un pptido dentro
del retculo endoplsmico. Adems, la cadena invariante dirige el transporte de las
molculas MHC de clase II a travs del aparato de Golgi a un compartimiento de la
va endolisosmica, an no totalmente definido, donde se separa por protelisis,
dejando dmeros _` libres para unir pptidos procedentes de la degradacin proteoltica de antgenos que han entrado en la va endoctica. Los pptidos antignicos
que se unen a las molculas MHC de clase II proceden, en su mayor parte, de protenas extracelulares que entran en la clula por endocitosis. La unin del pptido y
las molculas MHC de clase II en los endolisosomas es independiente de TAP. En
clulas en reposo se ha demostrado que los ligandos naturales de las molculas de
clase II proceden mayoritariamente de protenas citoslicas que pueden entrar en la
va endolisosomal.
2. Activacin: Para la completa activacin del linfocito se requieren simultneamente sobre l dos tipos de seales: la primera se la da el antgeno y la segunda
procede de una clula coestimuladora o accesoria (una clula presentadora de antgeno profesional para los linfocitos T y un linfocito Th para los B). Si se produce
un reconocimiento del antgeno sin seal coestimuladora no slo no se activa el linfocito, sino que se puede convertir en anrgico y ya no responder ms a dicho antgeno (mecanismo que previene de la autoinmunidad). Una vez activado correctamente el linfocito, comienzan los procesos de proliferacin que conducen a la
expansin de los clones de linfocitos especficos de antgeno para generar un nmero de linfocitos necesario para eliminar (una vez adquirida la funcin efectora en
una fase posterior) al patgeno (esta fase lleva una semana aproximadamente). Una
vez alcanzado un nmero de linfocitos suficiente se produce su diferenciacin
(mediada por citocinas distintas a las que mediaban la proliferacin) con lo que
adquieren su funcin efectora definitiva (una pequea parte de los linfocitos proliferantes permanecen como clulas de memoria). Por ejemplo, los linfocitos B se
diferencian a clulas plasmticas productoras de anticuerpos, que se unen al antgeno en el medio extracelular y activan los mecanismos de eliminacin del antgeno dependientes de anticuerpos. Los linfocitos T se diferencian a linfocitos T cooperadores que ayudan a los macrfagos a la lisis de patgenos fagocitados por stos,
90
o ayudan a los linfocitos B en la produccin de anticuerpos, o bien se diferencian a

linfocitos T citolticos con capacidad de lisis de clulas infectadas intracelularmente (por ejemplo, por virus). En esta fase, adems de generarse un elevado nmero de
linfocitos efectores, tambin se producen cambios en otras protenas de su superficie, las molculas de adhesin, las cuales les permiten llegar rpidamente a los
lugares del organismo donde se est produciendo la infeccin.
3. Funcin efectora: Son todos los mecanismos que emplea el linfocito diferenciado para eliminar el antgeno. Con la adquisicin de la funcin efectora se produce la transicin de unas pocas clulas con una nica funcin de reconocimiento
especfico de antgeno, a un elevado nmero de clulas con capacidad de mediar
(directa o indirectamente) la destruccin especfica de dicho antgeno. Lo que diferencia realmente a los linfocitos del resto de las clulas efectoras del sistema inmune (adems de la memoria inmunolgica) es su sutil capacidad para reconocer las
estructuras (por el BCR) o secuencias de aminocidos (por el TCR) de los patgenos que sean distintas a las propias (para las cuales es tolerante). Dichos antgenos
son imposibles de distinguir por los mecanismos de inmunidad innata. Por lo
dems, los mecanismos efectores destructivos son muy similares en las respuestas
innatas y en las respuestas adaptativas y la funcin biolgica de los linfocitos es
hacer de adaptadores (de ah la palabra adaptativa) para poner en contacto a los
esquivos patgenos con los diversos y universales mecanismos destructores, que
tambin funcionan en ausencia de linfocitos.
Tolerancia adaptativa
El sistema inmune es capaz de responder a una gran variedad de antgenos diferentes, debido al amplio repertorio de especificidades, generadas somticamente,
que poseen sus clulas B y T. Sin embargo, y como consecuencia de que la generacin de dicho repertorio es aleatoria, es posible que muchos de los linfocitos T o B
producidos por el organismo reconozcan componentes propios. Estas clulas se
encuentran normalmente controladas por distintos mecanismos que aseguran la
tolerancia a lo propio. Pero, ocasionalmente, alguna clula B o T especfica para un
antgeno propio puede escapar a estos mecanismos generadores de tolerancia y atacar a los tejidos propios donde se localice el antgeno para el que es especfica,
dando lugar a una patologa de tipo autoinmune: Los componentes de la inmunidad
innata son en general autotolerantes de manera igualmente innata, por lo que slo
participan en las reacciones autoinmunes si son invocados por los linfocitos T o las
Igs. El establecimiento de tolerancia frente a los componentes propios (autoantgenos) es un proceso fundamental para el normal funcionamiento del sistema. En el
caso de la inmunidad adaptativa, la tolerancia es especfica del antgeno y es un
fenmeno adquirido. La delecin, la anergia y la ignorancia clonales son los principales mecanismos de induccin y mantenimiento de la tolerancia. Cada uno de
ellos puede intervenir a nivel central (timo o mdula sea para las clulas T y B, res-
91
Figura 7.3. La seleccin de los timocitos _`. En el timo se rescatan (seleccin positiva de los
tiles), se eliminan (seleccin negativa de los dainos) o se pierden (no seleccin de los tiles) los
timocitos segn la afinidad de su TCR_` por las molculas de MHC/pptidos propias. Apenas un
5 % de los timocitos sobreviven.
pectivamente) o perifrico (rganos linfticos secundarios y tejidos) (vase Fig.

7.3).
Delecin clonal
El mecanismo fundamental, aunque no el nico, de tolerancia T a nivel central
es la delecin de los clones de timocitos autorreactivos en el timo. En el timo ocurren dos procesos aparentemente contradictorios: la seleccin positiva de aquellos
linfocitos cuyo receptor es capaz de reconocer las molculas HLA propias y la eliminacin (seleccin negativa) de las clulas T autorreactivas. Las clulas del estroma tmico son las encargadas de presentar pptidos propios a los linfocitos T para
realizar dicha seleccin (4). Existen dos umbrales de afinidad diferentes entre el TCR
y el complejo HLA-pptido propio: los linfocitos portadores de TCR con afinidades
92
bajas e intermedias por los complejos HLA-pptido propio seran seleccionados

positivamente (a efectos prcticos se habran seleccionado todos los linfocitos capaces de reconocer el HLA propio), mientras que aquellos cuyo TCR tuviera una afinidad alta seran seleccionados negativamente. Por tanto, en el timo morirn timocitos por tres razones distintas: a) fallo en la produccin de un TCR funcional a
travs de los procesos de recombinacin de los segmentos V, J y D de las cadenas
_ y ` del TCR; b) incapacidad de su TCR de reconocer algn complejo HLA-pptido incluso con una afinidad relativamente baja; y c) reconocimiento con muy alta
afinidad del TCR de complejos HLA-pptido propio. El mecanismo de muerte de
los timocitos en todas estas circunstancias es la apoptosis.
El proceso de delecin de los clones autorreactivos en el timo no puede ser
exhaustivo so pena de reducir drsticamente el repertorio de linfocitos T disponible
para responder a los antgenos ajenos, por lo que se mantienen en circulacin clones capaces de reconocer antgenos de los tejidos perifricos (por perifricos se
entienden todos los tejidos que no forman parte del sistema hematopoytico y el
timo) aunque normalmente, no responden a antgenos perifricos. Las razones de
esta ausencia de respuesta pueden ser de dos tipos: a) Ignorancia, indiferencia clonal o silencio inmunolgico. Estos tres trminos, prcticamente equivalentes, describen el siguiente mecanismo: la mayora de las clulas parenquimatosas de los
tejidos perifricos desde las clulas musculares hasta las neuronas no expresan
molculas de HLA de clase II, un requerimiento esencial para el reconocimiento de
los antgenos por parte de los linfocitos CD4+ de tipo colaborador. Normalmente,
estas clulas perifricas tampoco expresan molculas de adhesin (por ejemplo
ICAM-1) que faciliten el contacto con ellos, y las clulas endoteliales de los capilares que las rodean no expresan niveles suficientes de molculas de adhesin o
receptores de asentamiento linfocitario. La circulacin de linfocitos a travs de
estos tejidos perifricos es, en situacin normal, muy reducida y, por tanto, la probabilidad de encuentro con su autoantgeno en forma inmunognica, remota. El
resultado es que los linfocitos autorreactivos se mantendrn indiferentes frente a
clulas perifricas que, si bien contienen antgenos reconocibles por ellos, los mantienen inmunolgicamente silentes. b) Anergia clonal. Se ha demostrado que algunas clulas T circulantes autorreactivas no responden a la presentacin del autoantgeno en el contexto apropiado. Se cree que dichas clulas estn en una situacin
de anergia, este estado se produce probablemente por la presentacin incompleta
de los antgenos perifricos. Este concepto parte de la hiptesis de que la activacin
de todo linfocito requiere dos seales: una primera seal generada por el contacto
del TCR con el complejo HLA-pptido apropiado y una segunda seal normalmente
generada por el contacto con clulas presentadoras de antgeno profesionales (es
decir, macrfagos y clulas dendrticas) o por otras molculas, como citocinas e
incluso ciertas molculas de adhesin y los correceptores CD4 y CD8. Dado que en
la periferia las clulas parenquimatosas, incluso cuando expresan HLA de clase II,
no poseen que se sepa actividad coestimuladora, al interaccionar con los linfocitos autorreactivos los anergizaran.
93
Tolerancia B
Est bien establecido que una notable proporcin de linfocitos B del repertorio
normal primario (clulas B recin formadas que no han tenido contacto con el antgeno) expresan inmunoglobulina de membrana (mIg) con actividad contra autoantgenos. Hay que sealar, sin embargo, que no existen linfocitos B reactivos contra
autoantgenos ampliamente distribuidos e importancia biolgica decisiva como los
antgenos de los grupos sanguneos ABO o los antgenos de histocompatibilidad.
Adems, afortunadamente, estos linfocitos B autorreactivos, en condiciones normales, no desarrollan una respuesta, ya que para ser activados por un antgeno los
linfocitos B, requieren la colaboracin de linfocitos T CD4+ especficos de otros eptopos del mismo antgeno, y el repertorio de linfocitos T CD4 es poco autorreactivo. Esta limitacin no es absoluta y, de hecho, falla cuando el sistema se enfrenta a
un autoantgeno que contenga (en la misma molcula o en molculas fsicamente
asociadas) eptopos reconocidos por linfocitos B autorreactivos junto a eptopos
exgenos reconocibles por el repertorio de linfocitos T CD4. ste sera el caso de
una molcula microbiana con eptopos reconocidos por clulas B que tenga reactividad cruzada (mimetismo molecular) con un componente propio o bien un frmaco que se conjugue a una protena propia; la clula B autorreactiva puede entonces
activarse y secretar autoanticuerpos ya que recibe la ayuda de las clulas T CD4+ que
reconocen los eptopos extraos. Hay que tener en cuenta, adems, que durante su
respuesta frente a los antgenos exgenos, las clulas B diversifican su repertorio
de anticuerpos (repertorio secundario de clulas B) por los mecanismos de hipermutacin somtica de los genes de las regiones VH y VL, con lo que se pueden
generar autoanticuerpos de alta afinidad. La alta frecuencia de clulas B autorreactivas en el repertorio primario se explica porque stas no sufren un proceso de
seleccin negativa durante su desarrollo en la mdula sea, tan radical y riguroso
como ocurre con los linfocitos T en el timo. Al igual que en el caso de las clulas
T, la delecin clonal es el principal mecanismo de tolerancia central (en la mdula
sea), mientras que la anergia clonal lo sera en la periferia. Estudios con ratones
que expresan transgenes codificadores de autoanticuerpos contra distintos tipos de
autoantgenos indican que las clulas B fuertemente autorreactivas contra autoantgenos de membrana celular de amplia distribucin, como las molculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I, son delecionadas a nivel
central y no se hallan en la periferia. En cambio, cuando se trata de autoantgenos
proteicos solubles, los linfocitos B autorreactivos no son delecionados sino que
aparecen en la periferia; sin embargo son anrgicos, es decir, incapaces de activarse frente al antgeno. El hecho de que un autoantgeno favorezca la delecin en
lugar de la anergia, depende de su mayor capacidad para inducir un fuerte ligamiento cruzado de las mIg, lo que se da en el caso de los autoantgenos multivalentes de membrana. Dicho puenteo de las mIg de los linfocitos B en desarrollo
generara una fuerte seal activadora que, en ausencia de una segunda seal proporcionada por las clulas T (probablemente va CD40), conducira a la apoptosis
de la clula B; si este puenteo es menor, como ocurre con los antgenos solubles,
94
se favorecera la anergia. Por otro lado, las clulas B autorreactivas generadas en el

repertorio secundario, es decir, por el mecanismo de hipermutacin somtica del
centro germinal de los folculos linfoides durante una respuesta frente a un antgeno exgeno, seran igualmente eliminadas por delecin clonal o silenciadas por
anergia clonal, incluso si el antgeno se hallara bien representado en el microambiente del centro germinal, al faltarles la ayuda (va CD40) de clulas T CD4+
especficas del mismo autoantgeno.
Los mecanismos generadores de tolerancia que se han descrito, tienen una
eficiencia muy elevada. Por ello, se cree que la autoinmunidad podra reflejar la
activacin desafortunada de algunas clulas potencialmente autorreactivas en estado de anergia o ignorancia inmunolgica. Slo algunos autoantgenos inducen
autoinmunidad, y suelen ser aquellos para los que es difcil generar tolerancia central o perifrica por no ser ni muy abundantes ni extremadamente raros y para los
que existen linfocitos autorreactivos. La mayora de las veces, estos linfocitos no se
encuentran activados, y slo se activan en determinadas circunstancias, dando lugar
a la respuesta autoinmune. Debido a la depedencia de los linfocitos B y Tc respecto a los Th, se considera que la mayor parte de las respuestas autoinmunes comienzan por la activacin de linfocitos Th autorreactivos, que precisa de dos seales, la
generada por un autoantgeno asociado a MHC, y la seal coestimuladora de la propia clula presentadora. Esta ltima es necesaria, no slo para la activacin del linfocito efector, sino para el mantenimiento de la funcin efectora: si el coestmulo
cesa, entonces el linfocito autorreactivo deja de actuar y muere.
Enfermedades autoinmunes
Las enfermedades autoinmunes son la consecuencia patolgica de una respuesta inmune contra componentes del propio husped. Aunque no se conoce todava la
causa o causas concretas que desencadenan la autoinmunidad, parece necesaria la
existencia de clulas presentadoras con complejos MHC/autoantgeno en su superficie, de clulas T o B efectoras autorreactivas y de seales coestimuladoras capaces de activar a esos linfocitos. Se ha sugerido que las infecciones pueden ser un
factor desencadenante, y as parecen probarlo algunos datos experimentales. La
prdida de tolerancia podra deberse a que el agente infeccioso induce la expresin
de molculas MHC de clase II y/o seales coestimuladoras antes ausentes en
la clula presentadora o diana del ataque autoinmune o bien el patgeno obliga a
rescatar linfocitos anrgicos que finalmente consiguen eliminarlo, pero con el coste
autoinmune. Tambin se ha apuntado la posibilidad de que anticuerpos o clulas T
generadas frente al agente infeccioso puedan dar reacciones cruzadas con antgenos
propios. En este caso, los anticuerpos o linfocitos T reconocen, adems de los antgenos del agente infeccioso, otros propios del organismo de similar estructura
(mimetismo molecular). Otro modelo propone que las clulas B capaces de reconocer el antgeno propio interaccionan con l cuando ste se encuentra asociado a
la bacteria que acta como portadora y pueden recibir, entonces, ayuda de
95
las clulas Th. En el caso de tejidos inmunoprivilegiados, se ha sugerido que el trauma o la infeccin podran permitir el acceso de los linfocitos autorreactivos a los
autoantgenos antes secuestrados, disparando la autoinmunidad.
Por otro lado, parece claro que muchas, si no todas, las patologas autoinmunes
tienen un importante componente gentico, adems del ambiental. De hecho,
muchas enfermedades de este tipo parecen presentar una fuerte asociacin con ciertas molculas HLA, principalmente de clase II, aunque a veces con clase I. Esta idea
no es nada descabellada, puesto que la respuesta inmune (y autoinmune) implica la
participacin de clulas T que reconocen, precisamente, pptidos presentados por
molculas del MHC. Adems de las molculas HLA, otros factores genticos, como
el sexo, son importantes en el desarrollo de enfermedades autoinmunes.
Las enfermedades autoinmunes pueden estar mediadas por anticuerpos como
tales o formando parte de complejos inmunes o por linfocitos T, tanto Th como Tc.
Los sntomas que se asocian a cada enfermedad autoinmune dependen esencialmente del origen (ubicuo o localizado) y la naturaleza del autoantgeno (soluble, o
bien asociado a membranas celulares, o a la matriz extracelular...).
Diabetes mellitus tipo I
Es un trastorno en el cual la destruccin de las clulas ` productoras de insulina de los islotes pancreticos de Langerhans, origina deficiencia de insulina. Est
mediado por clulas Tc (que a diferencia de las Th reconocen autoantgenos citoplsmicos, esto es, producidos por las propias clulas blanco). En esta enfermedad
las clulas ` del pncreas son destruidas selectivamente. Adems, hay presencia de
anticuerpos contra diversos antgenos, algunos de ellos sin caracterizacin molecular hasta el momento; entre ellos, los ms representativos son (5):
Anticuerpos contra clulas de los islotes (ICA). El antgeno, quizs un glucolpido, an no ha sido caracterizado.
Anticuerpos antiinsulina. Se han descrito en el suero del 50 % de los pacientes
en estadios preclnicos y clnicos de inicio reciente.
Antidescarboxilasa del cido glutmico (GAD). El GAD existe en dos formas
derivadas de genes separados que codifican para las protenas GAD-65 y GAD-67
que tienen un 65 % de identidad de aminocidos. Ambas formas se encuentran en
altas concentraciones en neuronas y en clulas ` del pncreas. Aunque se han descrito anticuerpos contra ambas formas, los correspondientes a 65 kD se han detectado con mayor frecuencia (80 % de las formas preclnicas).
Autoanticuerpos contra otros antgenos. Entre ellos se incluyen el anti-37 kD/40
kD, que es un fragmento trptico de GAD-65, y el anti-38 kD una protena parcialmente purificada de la membrana de los grnulos secretores de insulina (anticuerpos contra este antgeno se encuentran en el 30 % de los pacientes con enfermedad
de inicio reciente).
Otros aspectos inmunolgicos de la diabetes tipo I son: a) infiltrado linfoide de
los islotes (insulitis), preferentemente a expensas de linfocitos T citotxicos (ver
Figura 7.4. Mecanismos de autotolerancia y autoinmunidad. Ntese el papel central de los lifoncitos Th en la respuesta autoinmune. Los lifoncitos anrgicos pueden ser rescatados por patgenos en ciertas circunstancias, causando quiz autoinmunidad.
96
97
Fig. 7.4); b) rechazo rpido con insulitis de pncreas trasplantados, y c) asociacin

con DR3, DR4, de modo que un alelo u otro se encuentra en el 90-95 % de los
pacientes diabticos, mientras que la frecuencia en la poblacin no diabtica es del
40-45 %. El posible papel de este hecho en la instauracin de la enfermedad an no
se ha aclarado. El HLA-DR2 se considera un alelo protector.
Enfermedad de Graves
Es una enfermedad autoinmune que se presenta como tirotoxicosis con bocio
difuso. El diagnstico inmunitario de la enfermedad se basa en la identificacin de
anticuerpos antitiroideos con propiedad de alterar la funcin normal tiroidea. Hay
anticuerpos estimulantes del tiroides [antirreceptor de hormona tirostimulante
(TSH)] en el 90 % de los casos, y anticuerpos antitiroglobulina y antiperoxidasa
tiroidea en el 25 y el 50 %, respectivamente, de los pacientes. Se observa infiltracin
linfocitaria difusa, a expensas de clulas T activadas, CD4+ y, en menor cantidad,
CD8+. Los anticuerpos antirreceptor de TSH con frecuencia pertenecen a un solo
tipo de cadena ligera, kappa o lambda, lo que sugiere que se desarrollan a partir de
una poblacin de clulas B restringida. Los autoanticuerpos promueven in vitro el
crecimiento de las clulas tiroideas, por lo que al parecer desempean un papel en
el aumento del tamao de la glndula. La responsabilidad de los anticuerpos antirreceptor de TSH en la patogenia del hipertiroidismo se demuestra convincentemente por el cuadro de hipertiroidismo que presentan los hijos recin nacidos de
madres con enfermedad de Graves, cuadro clnico que desaparece cuando catabolizan los anticuerpos transferidos de la madre. La oftalmopata de la enfermedad de
Graves se asocia a la presencia de anticuerpos contra una protena del msculo del
ojo de 64 kD (vase Fig. 7.4).
Resumen
Los principales aspectos que se han tratado en el presente artculo son:
Genes para la presentacin y el reconocimiento de antigenos BCR, TCR
Polimorfismo MHC.
La autoinmunidad innata (determinada en lnea germinal) se purga por la accin
de la seleccin natural.
La autoinmunidad adaptativa (determinada somticamente) se purga por la
accin de la seleccin negativa central y por anergia por falta de colaboracin con
linfocitos T colaboradores (a nivel perifrico).
Los mecanismos de tolerancia a veces fallan: enfermedades autoinmunes.
Ejemplo de enfermadad autoinmune mediada por anticuerpos: Enfermedad de
Graves.
Ejemplo de enfermedad autoinmune mediada por linfocitos T citotxicos:
IDDM.
98
Por qu existen estos fallos en la tolerancia? Papel central de los linfocitos Th.
Factores genticos (asociacin con MHC clase I y II) y factores ambientales (infecciones).
Bibliografa
1. Milln R, Pacheco A, Regueiro JR. Los monocitos. En: Ejido J., Gmez Reino, HerreroBeaumont, Rodriguez de la Serna.(eds.), Manual de inflamacin, Madrid Medical &
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medicina interna. Barcelona, Editorial Masson-Salvat, 1997.
3. Regueiro JR, Lpez-Larrea C. Inmunologa: biologa y patologa del sistema inmune. 2.a.
edic. Madrid, Editorial Mdica Panamericana, 1998.
4. Janeway Charles A, Jr., Travers. P. Immunobiology: The immune system in health and
disease. Oxford. Blackwell Scientific Publications, 1994.
5. Roitt I, Brostoff J, Male D. Inmunologa. 5.a Edicin Barcelona. Ediciones Harcourt,
S.A., 2000.
8
Oncogenes. Protenas tumorales.
Mecanismos de activacin de
proto-oncogenes. Genes supresores
de tumores. Genes mutadores
J. M. Ruz Albusac, y E. Velzquez Snchez
Introduccin
Etapas del desarrollo del cncer (2,3)
La investigacin llevada a cabo sobre las bases moleculares del cncer ha permitido conocer las fases del desarrollo del mismo:
Comienza cuando una clula de una poblacin normal sufre una mutacin
gentica que le permite continuar proliferando cuando, en condiciones normales, debera estar quiescente. Esta clula alterada y su progenie conserva su apariencia normal, pero se reproducen en exceso (hiperplasia).
Aos ms tarde, alguna de estas clulas sufre otra mutacin que altera, an
ms, el control del crecimiento celular, con lo que su progenie presentar un
aspecto anormal en su morfologa y orientacin (displasia).
Despus de cierto tiempo, una de estas clulas adquiere una mutacin que
altera su comportamiento. Sus descendientes tienen otro aspecto y presentan
nuevas anomalas en su desarrollo. Si no ha traspasado ninguna barrera, se
forma un tumor benigno, o cncer in situ, capaz de permanecer as indefinidamente y alcanzar grandes proporciones.
Algunas clulas pueden sufrir nuevas mutaciones. Si estos cambios genticos
permiten la ruptura de la lmina basal, la invasin del tejido circundante y la
entrada de las clulas en el torrente circulatorio (o en la linfa), se forma un
tumor maligno.
La accin inmediata de las clulas del sistema inmune acabar con la mayora de ellas. No obstante, si unas pocas clulas supervivientes se adhieren a la
pared vascular, de los capilares que baan otro tejido u rgano, podra producirse extravasacin.
100
Las clulas invasoras pueden proliferar hasta dar lugar a nuevos tumores en
otra parte del cuerpo, formando un tumor secundario o metstasis, que puede
resultar letal si afecta a un rgano vital.
En resumen, una neoplasia se define como un proceso complejo, que se desarrolla en mltiples etapas y que envuelve cambios secuenciales en los mecanismos
moleculares responsables del control del crecimiento celular; esto es:
a)
b)
c)
d)
Proliferacin o divisin celular.

Diferenciacin celular.
Muerte celular programada (apoptosis).
Reparacin del ADN.
Sistemas de sealizacin celular (2,5,13)

Cules son los eventos moleculares involucrados en el control de la divisin
celular? Qu mecanismos producen la prdida de este control y la formacin de
clulas cancerosas? Las clulas normales estn, permanentemente, recibiendo seales del exterior: por va endocrina, paracrina, autocrina o yuxtacrina. Todos los
mensajes son transmitidos hasta el ncleo e integrados por el reloj del ciclo celular
que, en definitiva, ser el encargado de decidir si las clulas deben o no proliferar:
Las seales estimuladoras son iniciadas por los factores de crecimiento (EGF,
PDGF, etc.), cuyo objetivo es la produccin de protenas que ponen en marcha la divisin celular.
Las seales inhibitorias, iniciadas por citoquinas (TGF-`, interfern, TNF,
etctera) producen, por el contrario, protenas que inhiben la divisin celular.
Una alteracin en las cascadas estimuladoras producir una seal continuada
de proliferacin celular. Una prdida de la seal de parada producir un error
en la inhibicin de la divisin celular.
En ambos casos, la consecuencia es la misma: la clula pierde el control de su
propio crecimiento, permitiendo que avance en el ciclo.
Los factores de crecimiento hacen que las clulas en reposo (G0, quiescentes)
entren y progresen a travs del ciclo celular. Durante la fase G1 temprana es necesaria la presencia sostenida (varias horas) de los denominados factores de competencia (EGF, PDGF, etc.). En el primer punto de control del ciclo (punto de
Restriccin), para que la clula no detenga su crecimiento, se necesita la presencia
simultnea de los denominados factores de progresin. Durante la fase G1 tarda, y
el comienzo de la fase S, slo es necesaria la presencia de factores de progresin
(IGF-I, etc.). En ciertas clulas, la ausencia de estimulacin por factores de crecimiento causa una rpida entrada en muerte celular programada. Algunas citoquinas
(TGF-`), pueden antagonizar los efectos proliferativos de los factores de crecimiento, e incluso revertir su efecto, si se aaden al final de la fase G1.
ONCOGENES. PROTENAS TUMORALES. MECANISMOS DE
101
Otros puntos de control del ciclo se encuentran en la fase G2 y en la propia fase

M, impidiendo, mediante su destruccin, que la clula llegue realmente a dividirse.
Genes y cncer (1,2,11,15,16,17,18,19,20,21,22)

El genoma es el portador de la informacin expresada en las protenas que regulan la divisin celular; por ello, slo se puede considerar el cncer como una enfermedad gentica, cuando las alteraciones tienen lugar al nivel de los genes. Cules
son estos genes? Se distinguen tres categoras:
Proto-oncogenes: Regulan los procesos de crecimiento celular.
Genes supresores de tumores: Responsables de inhibir la mitognesis.
Genes mutadores: responsables de la reparacin del ADN.
Oncogenes. Protenas tumorales (7)

Los oncogenes son las versiones patolgicamente alteradas de los proto-oncogenes que, de forma dominante, estn involucradas en la transformacin neoplsica de las clulas.
La mayora de los acontecimientos genticos que producen cncer ocurren en
las clulas somticas. stos se acumulan a lo largo de la vida del individuo, hasta
que se pierde un nmero crtico de elementos de control del crecimiento. De esta
forma se origina el clon que dar inicio a un tumor. La frecuencia con la que transcurren estos acontecimientos puede alterarse por la exposicin a mutgenos
ambientales. Como estas alteraciones genticas tienen lugar en las clulas somticas, no se transmiten a las generaciones futuras; es decir, no se heredan. Sin embargo, si el dao se produce en las clulas germinales, los descendientes recibirn una
forma alterada de estos genes, heredando la predisposicin o la susceptibilidad de
padecer cncer.
Retrovirus transformantes
Los oncogenes fueron inicialmente identificados como genes portados por un
tipo de virus cuyo material gentico estaba constituido por ARN, y que eran capaces de causar tumores en los organismos susceptibles a los pocos das de la infeccin. Por ello, recibieron el nombre de retrovirus de transformacin aguda. Por el
contrario, los retrovirus de transformacin crnica o dbil (no defectivos) no portan oncogenes. Estos virus causan tumores en tejidos especficos (tras un periodo
de latencia de muchos meses), pero por un mecanismo diferente al de los anteriores y, aunque pueden replicarse in vivo, no son capaces de transformar clulas en
cultivo. El virus del sarcoma de Rous es uno de los ms representativos del grupo
102
de retrovirus transformantes agudos. Su genoma, adems de los genes caractersticos (gag, pol y env), que porta la especie salvaje de referencia (virus de leucemia
murina), y que codifican las protenas necesarias para la proliferacin viral, contiene el oncogn v-src. Este oncogn codifica una protena tirosina quinasa responsable del sarcoma de los pollos. El oncogn v-src resulta ser la forma mutada
de un proto-oncogn homlogo, denominado c-src, presente en el genoma de la
clula husped.
Se conocen ms de 30 oncogenes responsables de causar tumores en animales
(incluido el hombre); algunos de ellos se mencionan en la Tabla 8.1. En general,
cada genoma viral porta un oncogn, aunque hay casos, como el del virus de la eritroblastosis aviar, que porta dos oncogenes: erb-A y erb-B.
Si los oncogenes proceden de la clula huesped, cmo han sido incorporados
al genoma de los retrovirus? La informacin gentica de los retrovirus est contenida en una molcula de ARN monocatenario, por lo que la replicacin del virus
pasa necesariamente por la sntesis, dentro de la clula husped, de su ADN complementario. La enzima responsable de esta sntesis se denomina transcriptasa
inversa y es una de las protenas cuya informacin est contenida en el genoma
viral. Este ADN complementario viral se integra seguidamente dentro del genoma
del husped, formando lo que se denomina un provirus.
Los retrovirus pueden transferir informacin gentica tanto horizontalmente
como verticalmente. La transferencia horizontal se lleva a cabo durante el proceso
de infeccin viral y que consiste en el aumento del nmero de clulas infectadas en
un mismo husped. La transferencia vertical tiene lugar cuando el provirus se ha
integrado en las clulas germinales de un organismo, pudiendo ser transmitido a la
generacin siguiente como si se tratara de un locus de herencia mendeliana.
Tabla 8.1.
Algunos retrovirus transformantes, tumor inducido y oncogn responsable.
Virus (nombre)
Sarcoma de Rous (RSV)
Sarcomas murinos:
de Harvey (Ha-MuSV)
de Kirsten (Ki-MuSV)
de Moloney (Mo-MuSV)
Osteosarcoma murino
de FBJ (FBJ-MuSV)
Sarcoma de simio (SSV)
Sarcomas felinos:
(PI-FeSV)
(SM-FeSV)
(ST-FeSV)
Sarcoma de ave (ASV-17)
Sarcoma de Fujinami (FuSV)
Mielocitomatosis de ave (MC29)
Leucemia de Abelson (MuLV)
Reticuloendoteliosis (REV-T)
Eritroblastosis de ave (AEV)
Mieloblastosis de ave (AMV)
Tumor inducido (especie)
Oncogn
sarcoma (pollo)
src
sarcoma/eritroleucemia (rata)
sarcoma /eritroleucemia (rata)
sarcoma (ratn)
H-ras
K-ras
mos
condriosarcoma (ratn)
sarcoma (mono)
fos
sis
sarcoma (gato)
fibrosarcoma (gato)
fibrosarcoma (gato)
fibrosarcoma (pollo)
sarcoma (pollo)
carcinoma/sarcoma/mielocitoma (pollo)
linfoma de clulas pre-B (ratn)
leucemia linfoblstica (pavo)
eritroleucemia/fibrosarcoma (pollo)
leucemia mieloblstica (pollo)
sis
fms
fes
jun
fps
myc
abl
rel
erb-B, erb-A
myb
103
A veces la integracin del provirus se produce en un lugar cercano a un protooncogn. Cuando se producen errores de transcripcin, el genoma retroviral puede
llevar parte de la secuencia del proto-oncogn. En sucesivas transmisiones verticales
esta secuencia puede ir completndose, hasta que una partcula viral porte la secuencia completa de exones codificados por el proto-oncogn. Si durante cualquiera de los
ciclos de reproduccin del retrovirus, el proto-oncogn sufre una mutacin, se formar un oncogn. Este oncogn tiene la capacidad de transformar la clula husped
dado que, expresa un producto proteico defectuoso: oncoprotena o protena tumoral,
que interviene activamente en la regulacin de la proliferacin celular. Para qu le
sirve al virus el oncogn? Una clula en continuo proceso de proliferacin debe tener
a punto su maquinaria de replicacin, transcripcin y traduccin. Obviamente, esta
maquinaria ser utilizada por el virus. Parece claro que alguna ventaja evolutiva
obtendr, mxime cuando la mayora de los retrovirus transformantes han perdido
parte del gen pol en esto el virus del sarcoma de Rous representa una excepcin,
que les impide replicarse por s mismos. En este caso la infeccin va acompaada de
la cepa salvaje del virus, que acta como ayudante de la replicacin.
Los retrovirus portadores de oncogenes son capaces de transformar clulas en
cultivo, produciendo cambios fcilmente apreciables a tres niveles:
Anomalas en la membrana plasmtica: Incremento de las necesidades metablicas; aumento del paso de los distintos metabolitos con prdida de especificidad de algunos transportadores; aparicin de burbujas.
Problemas de adherencia: Disminucin de la adherencia al sustrato; cambio
del aspecto normal poligonal-aplastado a la forma redondeada; nueva reorganizacin del citoesqueleto; incremento de la protelisis extracelular.
Anomalas en la proliferacin celular: Las clulas crecen formando focos;
baja dependencia de los factores de crecimiento y de anclaje; proliferan indefinidamente y pueden causar tumores si se inyectan a animales susceptibles.
Funciones de los proto-oncogenes
En general, los proto-oncogenes codifican protenas que estn implicadas en el
control del crecimiento celular. Segn sus propiedades bioqumicas y funcionales se
clasifican en los siguientes grupos:
I. Factores de crecimiento
Polipptidos que funcionan como seales extracelulares. Estimulan la proliferacin de las clulas que disponen en su membrana plasmtica de un receptor especfico para dicho factor.
II. Receptores de factores de crecimiento
Son las mquinas moleculares que transmiten informacin unidireccionalmente a travs de la membrana celular. En general, constan de tres dominios:
104
Extracelular de unin al ligando.

Transmembrana.
Intracelular con actividad tirosina quinasa.
La fosforilacin de protenas citoplasmticas especficas pone en marcha una
serie de eventos bioqumicos dirigidos hacia la divisin celular.
III. Transductores intracelulares de seal
Transmiten la seal desde la cara interna de la membrana plasmtica hasta el
ncleo, mediante protenas generalmente fosforiladas que interaccionan en
el citosol. Dos grupos principales:
Protena quinasas citoslicas (no receptores).
Tirosina quinasas.
Serina/Treonina quinasas.
Protenas de unin a GTP/con actividad GTPasa intrnsica.
Monomricas (ras).
Heterotrimricas (protenas G).
IV. Factores de transcripcin
Son protenas nucleares que regulan la expresin de los genes o familias de
genes diana. La regulacin transcripcional es mediada por protenas de unin a
secuencias de ADN especficas o motivos estructurales de ADN, usualmente localizados corriente arriba del gen diana. Los factores de transcripcin son el eslabn
final en la va de transduccin de seal que convierten seales extracelulares en
cambios modulados en la expresin gnica.
V. Reguladores de la muerte celular programada (protenas
antiapoptticas)
Los tejidos normales presentan un balance regulado entre la proliferacin celular y la muerte celular programada, un componente importante en el proceso de
embriognesis normal y desarrollo orgnico. En las clulas cancerosas falla tambin
la muerte celular programada, ltimo recurso que dispone una clula, que presenta
una regulacin descontrolada de su crecimiento, para evitar que se transforme al
fenotipo neoplsico.
VI. Protenas que controlan el ciclo celular
Para que el ciclo celular avance, determinadas protenas debern ejercer sus
acciones especficas en ciertos momentos del mismo. Modificaciones en la actividad de los complejos ciclina/quinasa dependiente de ciclina pueden dar lugar a un
exceso de seal de divisin.
Tabla 8.2.
105
Clasificacin funcional de oncogenes/proto-oncogenes.
c-sis
KS/HST
wnt1
int2
c-erb-B
erb-B2,3
c-ms
c-kit
ros
trk
ret
sea
met
mas
N-ras
Ha-ras
Ki-ras
gsp/gip
c-src
c-abl
yes
fgr
fes
syn
c-fps
mos
A-raf
B-raf
crk
vav
c-fos
c-jun
c-erbA
c-myb
c-myc
N-myc
L-myc
c-rel
Bcl-2
PRAD1
MDM2
cdk4
A. Factores de crecimiento; B. Receptores de Factores de crecimiento; C. Protenas de unin a GTP; D. Tirosina

quinasas post-receptor; E. Serina/Treonina quinasas; F. Reguladores SH2/SH3; G. Factores de transcripcin;
H. Reguladores de la apoptosis; I. Reguladores del ciclo celular.
Se conocen ms de 100 proto-oncogenes, algunos de los cuales se presentan en

la Tabla 8.2. Mediante tcnicas bioqumicas y de citogentica, la localizacin cromosmica de muchos de ellos ya se conoce.
Activacin de proto-oncogenes
Se denomina activacin de proto-oncogenes al conjunto de circunstancias que
causan alteraciones en la estructura/funcin, o en la expresin, del producto proteico de un proto-oncogn. Se dice entonces que el proto-oncogn se ha convertido en
un oncogn, y por ello capaz de transformar clulas al fenotipo neoplsico. Puesto
que la neoplasia es un proceso en varias etapas, ms de uno de estos mecanismos
debern coincidir en una clula para que sta contribuya en la gnesis de un tumor.
Por otra parte, en la expresin completa del fenotipo neoplsico incluyendo la
capacidad para formar metstasis, normalmente estarn involucrados una combinacin de proto-oncogenes activados y la prdida o inactivacin de genes supresores de tumores.
Los mecanismos de activacin de proto-oncogenes siguen dos modelos:
A) Modelo cualitativo. El producto proteico presenta cambios estructurales,
responsables de la alteracin de su actividad biolgica, sin que haya modificacin
en la cantidad de protena expresada. Tres tipos:
1. Delecin.
2. Mutacin puntual.
3. Translocaciones que producen protenas de fusin.
B) Modelo cuantitativo. El producto proteico presenta una actividad biolgica
normal, pero se expresa una cantidad mucho ms elevada de lo normal, o bien se
expresa en un tejido inadecuado. Tres tipos:
106
1. Insercin mutacional.
2. Amplificacin gnica.
3. Translocaciones que producen activacin gnica.
Estas alteraciones se producen en las clulas somticas (excepcionalmente, alteraciones en los oncogenes RET, CDK4 y NET tambin pueden producirse en las
clulas germinales), y se transmiten a las clulas hijas en forma autosmica dominante, mediante un mecanismo de ganancia de funcin.
Un ejemplo de delecin lo constituye el oncogen v-erb B, que codifica para un
receptor de EGF cuyo dominio de unin al ligando est ausente y el extremo carboxlico, que regula la actividad tirosina quinasa del receptor, truncado. En consecuencia, el oncogn v-erb B est permanentemente activado, aun en ausencia del
factor de crecimiento.
El proto-oncogn src codifica una protena tirosina quinasa unida a la membrana plasmtica, cuya activacin depende de la unin de un factor de crecimiento a su
receptor. La quinasa, en su forma inactiva, tiene en la posicin 527 un resto de tirosina fosforilada, unido a un dominio SH2 del extremo N-terminal, y otro residuo de
tirosina desfoforilado, en la posicin 416, dentro del dominio cataltico. La unin
del ligando produce: la dimerizacin del receptor y la consiguiente autofosforilacin en residuos especficos de tirosina. Estas nuevas fosfotirosinas compiten por el
dominio SH2 de src, liberando la fosfotirosina 527, que inmediatamente es desfosforilada, a la vez que el resto de tirosina 416 es fosforilado. De este modo la quinasa se convierte en la forma activa.
El producto del oncogn v-src tiene sustituidos los 19 aminocidos finales
(incluida la tyr-527) por otros 12 aminocidos diferentes como consecuencia de
una mutacin puntual que origina un error en la lectura de los tripletes del ARN
durante la sntesis proteica, a la vez que anticipa el codn de terminacin, y la tyr416 est fosforilada. Esta alteracin permite que la protena src se encuentre activa
de forma constitutiva.
En la mayora de los tumores en los que se ha aislado el oncogn ras, la alteracin consiste en una mutacin puntual que da lugar a la sustitucin de un solo aminocido. La familia de proto-oncogenes ras codifican protenas de 188-189 aminocidos (en general, conocidas como p21ras). Las mutaciones normalmente se han
detectado en las posiciones 12, 13 y 61. Por ejemplo, la sustitucin de la glicina-12
por cualquier otro aminocido excepto prolina, o de la glutamina-61 por un
aminocido distinto de la prolina o el cido glutmico, da lugar a una protena
mutante, que tiene alterada su actividad biolgica.
Las protenas ras ocupan un papel central en la transduccin de seales generadas por factores de crecimiento, interviniendo en la cascada de activacin de la
familia de protena serina/treonina quinasas activadas por mitgenos (MAP quinasas) que inducen, a su vez, la fosforilacin activacin de determinados factores de transcripcin. Se trata de una protena monomrica de unin a nucletidos de
guanina con actividad GTPasa intrnsica. La protena ras unida a GDP es inactiva,
mientras que la unida a GTP es activa. Pues bien, las protenas ras mutantes, cuya
107
forma unida a GDP fuera activa o que la forma unida a GTP no pudiera desfosforilarse, estaran enviando al ncleo una seal continuada de proliferacin y seran responsables de su accin oncognica.
Las clulas tumorales suelen expresar resistencia a algunos agentes quimioterapeticos mediante el mecanismo de amplificacin gnica. Consiste en la produccin de centenares o millares de copias de un gen que codifica para una protena que
interviene en el proceso degradativo del agente. Los cromosomas son notablemente ms largos, y mediante las tcnicas de bandeo se aprecian segmentos cromosmicos que han perdido el patrn normal de alternancia de bandas claras y oscuras,
denominadas regiones homogneamente teidas (HSR), y cuya ruptura da lugar a
los llamados cromosomas diminutos. Uno de los genes ms comnmente afectados
por este mecanismo de amplificacin es el de la dihidrofolato reductasa (DHFR). A
veces, cuando uno de estos genes se encuentra prximo a un proto-oncogn (por
ejemplo, c-myc), ste tambin se amplifica. En consecuencia, se produce una sobreexpresin de la protena Myc y un incremento en la seal de proliferacin.
El mecanismo de insercin mutacional se produce cuando un retrovirus no defectivo, de transformacin lenta o crnica que no porta un oncogn integra su ADN
complementario en las proximidades de un proto-oncogn (por ejemplo, myc). Los
elementos reguladores del provirus (LTR), y no el promotor de myc, son los que dirigen la transcripcin del mismo. De este modo, el proto-oncogn escapa a los mecanismos de control celular, producindose una sobreexpresin de la protena Myc.
El gen myc consta de tres exones: el exn 1, no se traduce, y los exones 2 y 3
forman la protena c-Myc. Se han descrito distintos sitios de insercin de retrovirus
en los dominios del proto-oncogn myc: 1) dentro del primer intrn; 2) dentro de
este primer intrn, pero orientado a la inversa; 3) pasado el tercer exn. En todos los
casos, la secuencia codificada por c-myc es correcta, por lo que la oncogenicidad es
atribuida a la prdida de control normal y a la sobreexpresin del gen.
La baja probabilidad de las inserciones retrovirales en las proximidades de un
proto-oncogn, y los diferentes modos de insercin, justifican que los retrovirus no
defectivos tengan periodos de latencia muy largos, y que sus efectos transformantes sean menos intensos que el de los retrovirus portadores de oncogenes.
En ocasiones, una recombinacin anormal entre cromosomas puede situar a un
proto-oncogn bajo la influencia de las secuencias reguladoras de otros genes, que
tienen la propiedad de ser muy expresados en un tipo celular determinado. En estas
circunstancias se produce tambin una sobreexpresin del proto-oncogn, y como
consecuencia de ello, una elevacin de los niveles de la protena oncognica que da
lugar a la aparicin del fenotipo neoplsico. Este fenmeno recibe el nombre de
activacin gnica. Un ejemplo caracterstico lo representa el linfoma de Burkitt, en
donde se produce una translocacin entre el cromosoma que contiene al protooncogn c-myc (cromosoma 8) y uno de los cromosomas que contienen los genes
que codifican para la cadena pesada y las cadenas kappa y lambda ligeras de las
inmunoglobulinas (cromosomas 14, 2 y 22); o bien otra translocacin entre los cromosomas 8 y 14, que sita al proto-oncogn c-myc prximo al gen del receptor _
de las clulas T (TCR_). En cualquiera de las circunstancias descritas se produce
108
una desregulacin de la expresin del proto-oncogn c-myc, que puede dirigir hacia
la transformacin neoplsica de la clula. La sobreexpresin de c-Myc impide a los
linfocitos inmaduros diferenciarse en clulas B y T, maduras.
Existe otro tipo de reordenamiento cromosmico en donde el punto de ruptura
se sita dentro del loci de dos genes. Se produce un nuevo gen, que contiene en su
extremo inicial parte de uno, y en su extremo final parte del otro. Los genes hbridos de fusin codifican protenas quimricas de fusin con actividad transformante, en la que los dos genes implicados en la fusin contribuyen al potencial transformante de la oncoprotena quimrica. En consecuencia, la cantidad de protena
expresada es normal, pero tiene la funcin biolgica alterada. El ejemplo mejor
conocido se corresponde con la leucemia mieloide crnica (LMC), una enfermedad
que se caracteriza por la presencia en todos los pacientes del denominado cromosoma Filadelfia. Durante algn tiempo, se pens que este pequeo cromosoma se
formaba como consecuencia de la transformacin neoplsica de las clulas; hoy se
conoce bien que este cromosoma representa la causa misma de la enfermedad. La
leucemia mieloide crnica (y la leucemia linfoblstica aguda, LLA) se caracteriza
por una translocacin entre los cromosomas 9 y 22, dentro de los loci del protooncogn de Abelson (c-abl) y del gen bcr, respectivamente. El gen bcr codifica para
una protena adaptadora que regula la actividad de protena tirosina quinasas; el
proto-oncogn abl codifica para una protena tirosina quinasa citoslica. La translocacin produce un gen hbrido que tiene secuencias del gen bcr, al principio, y la
secuencia que expresa el dominio cataltico del c-abl, en el extremo del gen. Este
gen hbrido se transcribe y el mensaje se traduce en una protena de fusin (BcrAbl), en la que los aminocidos codificados por bcr activan a los aminocidos de la
regin codificada por el gen c-abl. Esta protena hbrida tiene propiedades oncognicas, ya que pone en marcha la divisin celular al mantener constitutivamente activa la va de transduccin de seales a travs de Ras.
En general, las translocaciones cromosmicas asociadas a cnceres del ser
humano afectan mayoritariamente a las clulas sanguneas. No obstante, tambin se
han descrito translocaciones responsables de algunos tumores slidos.
Genes supresores de tumores (4,12,14)

Los genes cuya actividad esencial consista en inhibir una proliferacin celular
descontrolada fueron primeramente conocidos con el nombre de antioncogenes.
No obstante, esta denominacin se consider inapropiada, ya que su mecanismo de
accin molecular no consista en oponerse a la de los oncogenes. Pronto se descubri que la fusin de clulas malignas con clulas normales en cultivo produca la
supresin del fenotipo maligno en las clulas hbridas; por ello recibieron el nombre de genes supresores de tumores. Las mutaciones en estos genes impiden que
ejerzan su funcin normal de control de la divisin celular. Por analoga con los
oncogenes, se dice entonces que han adquirido capacidad oncognica, dada su
implicacin en el desarrollo de tumores; por ello se les conoce tambin con el nom-
109
bre de oncogenes supresores. Estas mutaciones pueden producirse tanto en las clulas somticas cncer espontneo, como en las clulas germinales cncer
hereditario. Tambin se les denomina oncogenes recesivos, dado que las mutaciones se transmiten en forma autosmica recesiva, mediante un mecanismo de
prdida de funcin; esto es, desde el punto de vista celular, las mutaciones son
recesivas y las clulas heterocigticas no desarrollan tumores. Sin embargo, estas
mutaciones son dominantes desde el punto de vista del individuo, dado que los heterocigticos suelen desarrollar la enfermedad en realidad, lo que se hereda como
rasgo autosmico dominante es la gran predisposicin a la formacin de tumores.
Esta aparente contradiccin se resuelve teniendo en cuenta que slo se necesita una
nica clula tumoral, en una poblacin de millones de clulas, para iniciar un tumor.
Se conocen algo ms de una docena de genes supresores de tumores. Codifican
protenas que intervienen en la transduccin de seales, en la transcripcin, en las
interacciones clula-clula y, sobre todo, en alguna de las etapas directamente
implicadas del ciclo celular (Tabla 8.3).
Tabla 8.3.
Gen
Algunos ejemplos de genes supresores de tumores y su papel en el cncer

Funcin del producto gnico
Cncer hereditario
RB1
Interrumpe el ciclo celular al

formar un complejo con E2F
Retinoblastoma/osteosarcoma
APC
Interacciona con la catenina `

en la va de sealizacin de Wnt
Cncer de colon familiar con

poliposis adenomatosa
NF1
Inhibe la protena ras
Neurofibromatosis tipo 1
NF2
Enlace entre protenas de

membrana y el citoesqueleto
Neurofibromatosis tipo 2
p53
Induce parada del ciclo celular

o apoptosis. Factor de transcripcin
Sndrome de Li-Fraumeni
VHL
Regula la elongacin transcripcional
Enfermedad de von-Hippel-Lindau
WT1
Factor de transcripcin
Tumor de Wilms
p16
Inhibidor de CDK
Melanoma familiar
BRCA1
Interacciona con RAD 51

(protena reparadora de ADN)
Cncer de mama y ovario familiar
BRCA2
Interacciona con RAD 51
Cncer de mama familiar
PTEN
Fosfatasa
Enfermedad de Cowden
AT
Regula el ciclo celular en respuesta

al dao en el ADN
Ataxia telangiectasia
ARF
Antagoniza a mdm2 para activar p53
DPC4
Inhibe la divisin celular
Cncer de pncreas
Cd95
Responde al dao en el ADN

por rayos a
Linfoma de timo
110
El gen Rb 9
Uno de los ejemplos ms caractersticos que ilustran la diferencia entre genes del
cncer hereditario y genes alterados somticamente es el responsable del retinoblastoma (Rb) en humanos. Una persona que hereda una copia de un gen mutado del retinoblastoma ha de experimentar una segunda mutacin somtica, en uno o ms retinoblastos, para desarrollar uno o ms retinoblastomas. Igualmente, pueden
producirse dos mutaciones somticas en un nico retinoblasto de un feto no predispuesto, lo que dar lugar a un retinoblastoma espordico. Por esta razn, todos los
pacientes con retinoblastoma hereditario presentan tumores bilaterales, mientras que
los retinoblastomas espordicos aparecen normalmente en un solo ojo.
La eliminacin de la copia normal del gen Rb, en una clula retiniana (heterocigtica) que ha heredado una copia defectuosa, puede llevarse a cabo mediante
alguna de las siguientes vas: prdida del cromosoma completo portador del gen
normal (monosoma) durante la mitosis; segregacin cromosmica errnea y
duplicacin del nico cromosoma portador del gen anormal; recombinacin mittica; conversin gnica; delecin y mutacin puntual del gen normal. Todas estas
situaciones llevan a la prdida de heterocigosidad para el gen del retinoblastoma en
una clula determinada, la cual comenzar a proliferar de forma descontrolada y
constituir el cln que posteriormente dar origen a un tumor. Adems del retinoblastoma, otros cnceres humanos tambin manifiestan la prdida de heterocigosidad.
El gen Rb, situado en el cromosoma 13 (13q14), codifica una protena nuclear
(pRB, de 928 aminocidos) que se encuentra en todos los tipos celulares, incluyendo tanto las clulas en reposo como las que se dividen muy activamente. Adems,
se encuentra presente durante todas las etapas del ciclo celular, en donde funciona
sincrnicamente como un conmutador molecular, regulando el avance a travs del
mismo. Si pRB est desfosforilada activa, durante la fase G1, forma un complejo con el factor de transcripcin E2F, que queda inactivo. De esta forma pRB
acta como el freno principal del paso a la fase S, deteniendo la divisin celular. Por
el contrario, si pRB est fosforilada inactiva, el factor E2F queda libre y por
tanto activo, permitiendo la transcripcin de los genes que codifican para protenas
necesarias para que la clula avance en el ciclo celular. La fosforilacin es catalizada por protenas quinasas dependientes de ciclinas (concretamente las CDK4 y
CDK6), que son activas cuando forman un complejo con las ciclinas D o E.
Si las dos copias del gen Rb desaparecen o sufren una mutacin en una clula
retiniana, la protena pRB estar ausente o defectuosa, no pudiendo, por tanto, regular la divisin celular. En este caso, la clula se divide continuamente, formando un
tumor. Si esta alteracin se produce, por ejemplo, en hueso dar lugar a un osteosarcoma.
Como pRB juega un papel esencial en la regulacin del ciclo celular, cualquier
situacin que la mantenga inactiva producir los mismos efectos sobre la divisin
celular. As, por ejemplo, la activacin del proto-oncogn cdk4, producir una oncoprotena activa constitutivamente; es decir, que mantiene permanentemente fosfo-
111
rilada a la pRB, aun en ausencia de ciclinas, permitiendo que el ciclo celular avance. Igualmente, la inactivacin de pRB por interaccin con oncoprotenas virales
(antgeno T del SV 40, o la protena E7 del virus del papiloma), permitir que el factor de transcripcin E2F est siempre activo, enviando una seal continuada de
proliferacin celular.
El gen APC
En ocasiones, la aparicin de un cncer puede deberse a la alteracin de un solo
gen caso del retinoblastoma; sin embargo, en otras muchas, el cncer surge
como consecuencia de mltiples eventos moleculares que producen la activacin
de proto-oncogenes y la inactivacin de genes supresores de tumores. Un buen
ejemplo lo representa el cncer de colon familiar con poliposis adenomatosa, en
donde, al menos, tres oncogenes (K-ras, neu, myc) y cuatro genes supresores (APC,
DCC, p53, HNPCC) han sido caracterizados en algn momento del desarrollo del
tumor. Aunque para el desarrollo de tumores malignos, a partir de la mayora de los
adenomas, sea decisiva la suma de los cambios acumulados, en este caso los fenmenos mutacionales suelen producirse en una determinada secuencia. As, los adenomas ms precoces muestran un slo cambio gentico (APC), los intermedios llevan dos o tres y los ms tardos cuatro o cinco. Para la formacin del carcinoma y
las posteriores metstasis, los dems cambios adicionales tambin tienen que producirse.
Una alteracin en el gen APC predispone significativamente al cncer de colon,
y tambin est implicado en la mayora de las manifestaciones espordicas del
mismo. Este gen supresor de tumores, situado en el brazo largo del cromosoma 5,
funciona como principal regulador de la va Wnt, un sistema de sealizacin bien
caracterizado desde el punto de vista bioqumico, que interviene en las fases del
desarrollo y embriognesis. Codifica para una protena que puede modular los niveles de `-catenina, una protena implicada en la adhesin celular y en la formacin
de complejos de transcripcin. Existen cnceres de colon que presentan el gen APC
normal, pero tienen mutado el gen de la `-catenina.
El gen p53 (8)
Aproximadamente el 50 % de los cnceres humanos se caracteriza por tener formas mutadas del gen supresor de tumores p53. Este gen codifica una fosfoprotena
nuclear de 390 aminocidos, que presenta varios dominios:
De activacin de la transcripcin (aminocidos: 1-50).

De sealizacin (60-90).
De unin al ADN (100-290).
De oligomerizacin (320-350).
De unin al ADN daado (370-390).
112
La forma activa de la protena es tetramrica. Cuando se asocian determinadas

formas mutantes con la forma nativa de la protena, el tetrmero adopta la conformacin mutante y es incapaz de funcionar. Por ello, aunque se considera a p53
como un gen supresor de tumores, estas mutaciones ejercen un efecto dominante
sobre la transformacin celular: Mutantes dominantes negativos. Otras formas
mutantes de p53 tienen propensin a amplificar el ADN. No obstante, el 80-90 % de
las mutaciones del gen p53 son de sentido errneo y se concentran en la regin del
gen que codifica para el dominio de unin al ADN.
El gen p53 se activa en respuesta a seales de dao por irradiacin en el
ADN. La protena P53 acta como un factor de transcripcin que interacciona, al
menos, con otros seis genes. Si la clula se encuentra en la fase G1 del ciclo celular, P53 se une al promotor del gen p21, que codifica una protena inhibidora de
CDK4 (p15, p16 y p27 tambin bloquean la activacin de la protena del retinoblastoma PRB). Se detiene el ciclo celular antes de pasar a la fase S, proporcionando tiempo a la clula para la reparacin del ADN daado. Alternativamente,
si la clula se encuentra en la fase G2, p53 pone en marcha un programa de muerte
celular (apoptosis); esta respuesta se elige tambin cuando no es posible detener el
ciclo celular para reparar el ADN por estar afectada la va del PRB. No obstante, los
mecanismos moleculares que pone en marcha p53 para optar por una va u otra an
no se conocen. Cuando existen mutaciones en p53, las clulas con el ADN daado
no detienen el ciclo para su reparacin y eluden los programas de autodestruccin,
por lo que la proliferacin continuada de clulas con el ADN daado puede dar
lugar a la aparicin de tumores
El dominio central de unin al ADN capacita a P53 para unirse un palndromo
de 10 pares de bases. Este dominio tambin es reconocido por determinadas oncoprotenas virales. Los virus que contienen ADN se reproducen infectan en
clulas permisivas; por el contrario, cuando un virus entra en clulas no permisivas,
no se produce infeccin, sino la integracin de parte o todo el ADN viral en regiones al azar dentro del genoma del husped. Por ejemplo, la transcripcin y posterior
traduccin de la regin temprana del virus SV40, integrado en una clula husped
da lugar a la aparicin de los antgenos T/t. Estos antgenos pueden bloquear el
dominio de unin al ADN de la protena P53, ocasionando la transformacin de la
clula husped.
Genes mutadores (6)

Se denominan genes mutadores a aquellos que codifican para un sistema de
enzimas correctores de pruebas. Estos genes fueron primeramente estudiados en
E. coli y en levaduras, constituyendo los genes Mut HLS. Tambin se les conoce
con el nombre de genes reparadores de los errores en el ADN. Detectan los defectos
en el apareamiento de bases causados por errores de la transcripcin o por agentes
mutagnicos exgenos. Los individuos que heredan una mutacin en estos genes son
constitutivamente heterocigotos, transmitindose mediante un mecanismo de prdi-
113
da de funcin. La ausencia o un defecto en la actividad de los enzimas reparadores,

incrementa la tasa de mutacin espontnea, lo que aumenta el riesgo de desarrollar
tumores. Los homlogos humanos de los genes mutadores fueron localizados en las
mismas regiones cromosmicas responsables del cncer de colon hereditario sin
poliposis (HNPCC). Este sndrome de predisposicin al cncer se hereda como un
desorden autosmico dominante y constituye un ejemplo de cncer producido por
inestabilidad genmica. La inestabilidad genmica se caracteriza por la presencia en
el genoma de microsatlites: Breves secuencias de los nucletidos CA o CG, repetidas decenas o cientos de veces en un solo sitio, que se encuentran distribuidas por
millares de sitios diferentes del genoma. Se han identificado cuatro genes mutadores
implicados en este cncer: hMSH2, hMLH1, hPMS1 y hPMS2.
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9
Apoptosis
E. Vara
Muerte celular
La muerte celular es un fenmeno fundamental de los organismos biolgicos. Es
un proceso que ocurre de forma fisiolgica durante la organognesis y embriognesis y tambin en el turnover celular en el adulto, y como proceso patolgico en
respuesta a distintos tipos de dao.
Hay dos tipos fundamentales de muerte celular que se conocen como necrosis y
apoptosis (1) (Fig. 9.1). El trmino necrosis se refiere a la muerte de la clula por un
dao severo y repentino como el debido a un trauma fsico o qumico y se suele
referir a un tipo de muerte accidental en el que la clula pierde rpidamente la capacidad para mantener la homeostasis. En la necrosis, la membrana plasmtica suele
ser el lugar principal que sufre el dao perdiendo su capacidad para regular la presin osmtica por lo que tanto la clula como los orgnulos subcelulares se rompen
esparciendo su contenido al espacio tisular adyacente, provocando as una respuesta inflamatoria. Los leucocitos intentan eliminar los restos de clulas necrticas para
tratar de reparar el dao, pero al mismo tiempo liberan mediadores proinflamatorios
que pueden lesionar el tejido normal vecino, amplificando as el dao (1).
La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso normal que contribuye a la renovacin tisular tanto en el desarrollo como en el estado adulto (1,2).
Durante el desarrollo, la apoptosis est implicada en diversos procesos tales
como la seleccin clonal negativa, remodelacin de tejidos y diferenciacin celular,
y se ha sugerido que este fenmeno podra jugar un papel complementario a la vez
que opuesto, a la mitosis en el mantenimiento de la homeostasis celular (3). La apoptosis est tambin implicada en procesos patolgicos, tales como la muerte de clulas tumorales, enfermedad de injerto contra husped, respuesta al estrs celular,
exposicin a compuestos citotxicos y puede funcionar tambin en la patognesis
de algunas enfermedades degenerativas. Podramos decir que la apoptosis es un
116
NECROSIS
APOPTOSIS
Fagocitosis
Figura 9.1.
Muerte celular por necrosis y apoptosis.
proceso fisiolgico y sutil mediante el cual la clula activa una serie de mecanismos
que desencadenan en ltima instancia su propia autodestruccin de una forma discreta y programada. As, la apoptosis es equivalente a un suicidio celular.
Cambios bioqumicos y estructurales

Los cambios mas caractersticos observados en una clula que sufre apoptosis (1-4) incluyen alteraciones de la membrana plasmtica, condensacin de la cromatina, reduccin del tamao celular, formacin de poros en la membrana nuclear
y finalmente fragmentacin de la clula en los llamados cuerpos apoptticos, en los
que distintos componentes celulares estn rodeados y sellados por una membrana
plasmtica que no permite que salga nada al exterior por lo que no se provoca reaccin inflamatoria, a diferencia de lo que ocurra en la necrosis. Estos cuerpos apoptticos son reconocidos por clulas fagocticas adyacentes que se encargan de su eliminacin (Fig. 9.1). Este proceso de eliminacin por fagocitosis puede efectuarse
en etapas ms tempranas del proceso apopttico y muy frecuentemente no se llega
al ltimo paso de fragmentacin total de la clula.
Tambin la membrana celular sufre alteraciones durante la apoptosis. Las clulas pierden el contacto con las clulas vecinas y comienzan a aparecer ampollas
hasta que la clula adquiere una forma caracterstica blebbing previa a la formacin de los cuerpos apoptticos. Adems en los primeros estadios de la apoptosis la
APOPTOSIS
117
clula pierde la asimetra de los fosfolpidos de membrana y los residuos de fosfatidil serina (PS), que en una clula normal se encuentran en la cara interna de la
membrana, se reorientan hacia la superficie externa de la membrana celular.
En cuanto a la mitocondria, aunque su estructura permanece intacta, durante la
apoptosis hay una alteracin del potencial de membrana debido a cambios en la distribucin de H+ y otros iones a travs de la membrana mitocondrial. Estos cambios
en el potencial de membrana ocurren muy tempranamente, antes de la fragmentacin del ADN e incluso antes de la reorientacin de los residuos de PS y parecen
estar mediados por canales transmembrana que regulan el potencial inico de la
clula (4).
En cualquier caso, el hecho ms caracterstico de la apoptosis es la fragmentacin del ADN por lo que cuando se examina por electroforesis se observa una escalera de bandas mltiplos de 180-200 pares de bases. Cada cromosoma eucaritico
contiene una molcula de ADN que debido a su gran tamao debe plegarse y compactarse de forma ordenada dentro del ncleo de la clula formando complejos
compactos con protenas, preferentemente histonas, constituyendo lo que se denomina la cromatina. Las histonas son protenas relativamente pequeas, enriquecidas
con residuos de arginina y lisina cargados positivamente, que se agregan para formar una especie de bolsas alrededor de las cuales el ADN se enrolla dando lugar a
los llamados nucleosomas que se conectan entre s por fibras delgadas de ADN. La
longitud del ADN asociada con cada uno de los nucleosomas es de aproximadamente 180-200 pares de bases. Cuando se produce una respuesta apopttica se activa una endonucleasa endgena que degrada al azar al ADN que une nucleosomas
adyacentes en la fibra de cromatina ya que este ADN internucleosomal es ms accesible al ataque enzimtico que la regin nucleosomal protegida por las histonas. La
accin de la endonucleasa genera de esta forma varios fragmentos de ADN mltiplos de 180-200 pares de bases. La separacin ulterior del ADN y la posterior electroforesis en geles de agarosa del ADN aislado permite visualizar, tras tincin con
bromuro de etidio, la escalera tpica de fragmentos de ADN caracterstica de la
apoptosis (Fig. 9.2).
Genes implicados en la apoptosis

Para que el procero apopttico se desencadene, es necesario que se activen en la
clula una serie de mecanismos que en muchos casos van a estar controlados a nivel
gentico (4). Los mejores ejemplos de genes implicados en la apoptosis han sido
definidos en invertebrados, sobre todo en Caenorhabditis elegans, un nematodo en
el que se han realizado una gran parte de los estudios sobre este proceso y en el que
se identificaron genes implicados en el inicio de la apoptosis (eg-1, ces-1, ces-2), en
el proceso mismo de la apoptosis (ced-3, ced-4, ced-9), en la fagocitosis de las clulas apoptticas (ced-1, ced-2, ced-5, ced-6, ced-7, ced-8, ced-10) y en la digestin
y degradacin de la clula muerta (nuc-1); de todos ellos han resultado ser especialmente interesantes el ced-9 que es un supresor de la apoptosis y el ced-3 que es
118
Nucleosoma
Cromatina
Digestin por
endonucleasa
Electroforesis
Direccin de migracin
180-200 bp
180-200 bp
+
Figura 9.2.
Fragmentacin del ADN en fragmentos mltiplos de 180-200 bp.
necesario para que se produzca la apoptosis. Estos genes se haban identificado en

invertebrados, pero la apoptosis es un proceso conservado a lo largo de la evolucin. Esta sugerencia de conservacin evolutiva fue sugerida por la confluencia de
estudios genticos realizados en nematodos y en clulas tumorales.
Tres tipos de protenas (Tabla 9.1) parecen ser crticos en esta va tan conservada:
a) Protenas reguladoras. Pueden promover o reprimir la apoptosis.
b) Adaptadores. Interaccionan tanto con los reguladores como con los efectores. En ausencia de factores trficos promueven la activacin de los factores.
Tabla 9.1.
Tipos de protenas implicadas en la apoptosis
Reguladores
C. Elegans
Vertebrados
Adaptadores
Ced-9
Bcl-2
Ced-4
Apaf-1
Efectores
Ced-3
Casp9
A Muerte celular
A Casp3 A Muerte celular
APOPTOSIS
Tabla 9.2.
119
Inductores de apoptosis
Activadores
fisiolgicos
Protenas de la familia
del TNF (TNF, Fas L)
Ausencia de factores
de crecimiento
Glucocorticoides
Inductores
de dao
Clulas T citotxicas
p53
Radicales libres
de oxgeno
Agentes asociados
a terapias
Quimioterapia
Radiacin Y
Radiacin UV
Toxinas
Etanol
c) Efectores. Son una familia de cistein proteasas cuya activacin conduce a la

degradacin de varios sustratos celulares y finalmente a la muerte celular.
El control de la apoptosis implica diferentes mecanismos y/o factores que inducen o reprimen la apoptosis. El balance entre inductores (Tabla 9.2) e inhibidores
(Tabla 9.3) va a determinar si la clula vive o muere.
En muchos casos la apoptosis es iniciada por la unin de un ligando a un receptor especfico y han sido descrita una familia de receptores que puede disparar especficamente la apoptosis. Estos receptores, death receptors (4,5), se caracterizan por
poseer dominios extracelulares ricos en cistena, y un dominio intracelular que acopla los receptores a la maquinaria inductora de apoptosis. Miembros de esta familia incluyen el CD95 (Apo 1 o Fas), TNF-R1, FADD (Fas activating death domain),
TRADD (TNF-R1 asociated death domain) y RIP (receptor interacting protein). De
todos ellos el mejor caracterizado es el Fas. Todos ellos poseen una regin homloga de 70 aminocidos (death domain) necesaria para la transmisin de la seal de
muerte y que est muy conservada filogenticamente. Los ligandos que se unen a
estos receptores (oncogene related products) tambin presentan estructuras homlogas, lo que se refleja en mecanismos similares de reconocimiento del receptor e
iniciacin de la respuesta. Estos ligandos (excepto el Lt_) son sintetizados como
protenas transmembrana, a partir de las cuales se puede generar una forma soluble
por accin de metaloproteasas. El papel de estas formas solubles no est claro y
aunque en algunos casos se ha reportado actividad para estas formas solubles, otros
autores piensan que solo es capaz de inducir apoptosis la forma unida a membrana.
In vivo, la activacin de los death receptor es controlada en muchos casos por la
expresin de novo de sus respectivos ligandos.
Tabla 9.3.
Inhibidores de apoptosis
Inhibidores fisiolgicos
Factores de crecimiento
Protenas reguladoras
Andrgenos
Estrgenos
bcl-2
Agentes virales
Otros
Adenovirus
Ciertos agentes farmacolgicos
120
Acoplamiento entre estmulo y apoptosis

Aunque en el acoplamiento entre estmulo y el proceso final de apoptosis van a
estar implicadas diferentes seales, en la mayor parte de los sistemas apoptticos
est implicada una actividad proteoltica. Se puede considerar la protelisis como
un fenmeno comn en todos los procesos apoptticos, con diferentes proteasas
implicadas y distintas protenas como diana de esta actividad proteoltica.
Los candidatos mas importantes como mediadores finales de la apoptosis son las
caspasas (4,6). Las caspasas son una familia de cistein proteasas de las que se conocen al menos 14 homlogos aunque no todos han sido asociados a la apoptosis.
Los genes codificantes de caspasas codifican proenzimas que requieren una ruptura proteoltica para su activacin. Las caspasas pueden propagar la seal apopttica rompiendo/activando otras caspasas o pueden intervenir en el proceso final
rompiendo sustratos (6). Por ejemplo, la caspasa 8 activa a la caspasa 3, mientras que
sta acta sobre protenas diana especficas como poly-ADP polimerasa, laminina,
actina, quinasa dependiente de ADN, etc.
En mamferos (7), la va ms importante de iniciacin de la apoptosis es va Fas
(Fig. 9.3), que es un receptor de superficie relacionado con el receptor de TNF (su
ligando el Fas L est relacionado con el TNF).
La unin de un ligando al receptor inicia la activacin de una proteasa lo que
conduce a la liberacin de citocromo c de la mitocondria lo que a su vez activa a
otras proteasas, siendo el resultado final la destruccin de las estructuras celulares.
El TNF-R est unido a una protena llamada TRADD (TNF-R asociated death
domain) que a su vez se encuentra unido a FADD (Fas activating death domain)
mientras que el receptor Fas se encuentra unido a FADD. En ambos casos FADD se
une a la caspasa 8 (FLICE), la cual tiene un dominio de muerte, death domain y
una actividad cataltica proteasa que inicia un camino comn. La caspasa 8 hidroliza a la protena Bid liberando el extremo C-terminal que se transloca a la membrana mitocondrial e induce la liberacin del citocromo c. El citocromo c induce la
interaccin de una protena, Apaf 1, con la procaspasa 9; esto causa una autohidrlisis que activa a la caspasa 9 que a su vez hidroliza a la procaspasa 3 para dar lugar
a la caspasa 3 activa (7) (Fig. 9.4).
La caspasa 3 puede ser considerada el efector de la va y es la que va a actuar
sobre los sustratos diana, lo que implica hidrlisis de protenas y ADN. La fragmentacin del ADN implica la hidrlisis por parte de la caspasa 3 de una subunidad
del dmero DFF (ADN fragmentation factor). La otra subunidad activa a una nucleasa que degrada ADN (6).
El camino descrito es la va que podramos llamar prototpica, pero el Fas tambin puede activar la apoptosis por un camino que implica una quinasa, la JNK quinasa, cuyo sustrato predominante es el factor de transcripcin c-jun. Esto conduce,
por mecanismos no bien conocidos, a la activacin de proteasas (Fig. 9.4). En este
camino juega un papel importante como mediador la protena Daxx que reconoce en
FADD un sitio diferente a Fas por lo que ambos caminos pueden funcionar independientemente. Es probable que la activacin de Fas active ambas vas de apopto-
APOPTOSIS
121
TNF-R1
Fas/TNF-R1
FADD
Caspasa-8
Bid
Anti-apoptosis
Bcl-2
Mitocondria
Caspasa-9
Apaf-1
Caspasa-3
DFF
Degradacin de
protenas
Dao de
membranas
Ruptura del ADN
Figura 9.3.
Camino clsico de iniciacin de la apoptosis mediada por Fas.
sis y la importancia relativa de ambos caminos puede variar dependiendo del tipo
de clula y/o la seal que reciba.
La liberacin de citocromo c es un punto importante de control de la apoptosis (7,8). A este nivel parecen jugar un papel regulador importante una serie de protenas de la familia bcl 2, entre las que se incluyen bcl 2, que tiene un papel regulador antiapopttico y bid que ya hemos visto que favoreca la apoptosis. Otros
miembros de la familia bcl 2 pueden jugar un papel importante en la regulacin
de la apoptosis favorecindola (bclxs, bax) o inhibindola (bclxL). Estas protenas
de la familia bcl 2 pueden estar en forma de homodmeros o heterodmeros y parece necesaria la formacin del homodmero bcl2/bcl2 para que pueda ejercer su
papel protector, mientras que los heterodmeros bcl2/bax o bcl2/bclxs no protegen.
Se puede concluir que las diferentes asociaciones entre miembros de la familia
pueden producir dmeros con diferentes efectos en la apoptosis y que la expresin
relativa entre los diferentes miembros de la familia puede ser importante. La sus-
122
Fas/TNF-R1
Daxx
JNK
C-Jun
C-Jun
Caspasas
APOPTOSIS
Figura 9.4.
Apoptosis, va Fas, mediada por JNK quinasa.
ceptibilidad de una clula a la apoptosis parece ser proporcional a la relacin entre

ellos.
Un hecho importante es que todas las protenas de esta familia parecen actuar a
nivel de la membrana mitocondrial, as por ejemplo, Bid favorece la liberacin de
citocromo c y bcl2 la inhibe; bax probablemente est implicado en los cambios de
potencial de membrana.
Se ha sugerido (8) que el papel inhibidor de los factores de crecimiento sobre la
apoptosis se deba a la inhibicin de estos reguladores proapoptticos. En presencia
de factores trficos (por ejemplo NGF que protege a las neuronas de la muerte celular) se estimula la PI3 quinasa que a su vez activa la AKT-quinasa que fosforila a
Bad. Bad cuando est fosforilado forma un complejo con la protena 14-3-3 y permanece en el citosol formando un complejo antiapopttico que puede inhibir a Bax
previniendo la liberacin de citocromo c y la activacin de la cascada de caspasas.
En ausencia de factores trficos, no se activan las quinasas, Bad no se fosforila
y se une a las protenas antiapoptticas impidiendo que inhiban a Bax. Bax forma
APOPTOSIS
123
canales que permite el flujo de iones lo que implica la liberacin de citocromo c y

activacin de las caspasas.
Otro posible camino (9) apopttico es el disparado por los linfocitos T citotxicos, los cuales matan a las clulas diana por un proceso que implica la liberacin de
grnulos conteniendo serin proteasas y otros componentes lticos como perforina y
granzimas. La granzima B puede iniciar algunos de los hechos caractersticos de la
apoptosis incluyendo la activacin de caspasas y fragmentacin del ADN.
Papel del p53 en la apoptosis

El p53 (10) es una protena que se une al ADN y que normalmente se encuentra
en forma de tetrmero. Puede actuar como activador transcripcional de una serie de
genes diana, pero tambin puede tener un papel como represor transcripcional, probablemente por interaccin con factores de la transcripcin. Adems puede interaccionar con otras protenas celulares y l mismo es molcula diana para ciertas protenas virales.
Su papel esencial es la prevencin de la proliferacin de clulas portadoras de
mutaciones. En una clula normal los niveles de p53 son bajos; en respuesta al
estrs genotxico el p53 se activa (y esto implica tambin un aumento de sus niveles) y dos tipos de acontecimientos son iniciados como consecuencia de esta activacin: Parada del crecimiento celular y apoptosis.
El p53 bloquea el ciclo celular tempranamente (fase G1) lo que permite la reparacin del ADN daado antes de entrar en la fase S; en este aspecto, parece que el
p53 podra intervenir directamente en la reparacin del ADN y/o probablemente
activar enzimas reparadoras. Si una clula est en fase de divisin, entonces el p53
inicia un programa de muerte celular.
En resumen, cuando una clula normal sufre una lesin en su ADN tiene la posibilidad de dos respuestas, detener el ciclo celular o bien seguir la apoptosis. La decisin de seguir una respuesta u otra depender en primer lugar del ciclo en el que se
encuentre la clula, pero tambin depende del tipo de clula y de factores extrnsecos medioambientales (2,11-13).
Los desencadenantes de la apoptosis dependiente de p53 incluyen, adems de
las lesiones del ADN, la activacin inapropiada de oncogenes, citoquinas, hipoxia
o el shock trmico.
Los mecanismos moleculares por los que acta el p53 no son totalmente conocidos, pero parece que es necesaria la transcripcin de Bax, que cuando supera los
niveles de bcl2 induce la apoptosis (10).
La apoptosis dependiente de p53, inducida por lesiones en el ADN, es crtica en
el embrin para evitar la teratognesis radio-inducida y en la supresin de carcinognesis en especial en los tejidos hematopoytico y linftico. La apoptosis dependiente de p53 que se produce en respuesta a una proliferacin inadecuada inhibe la
carcinognesis en un estadio precoz al destruir clulas potencialmente neoplsicas (10).
124
Papel de la apoptosis en los procesos fisiopatolgicos

El hecho de encontrar que el p53 y otros protooncogenes estn implicados en la
regulacin de la apoptosis de las clulas neoplsicas ha sido un hallazgo importante en el campo de la oncologa, ya que el proceso apopttico parece estar relacionado con la progresin tumoral y con la respuesta de las clulas tumorales a los
diferentes tratamientos. Se puede destacar el caso de los adenocarcinomas gstricos
y sobre todo colorectales en los que la progresin tumoral est directamente relacionada con la apoptosis, cuya determinacin en el laboratorio podra incluso servir para la clasificacin y seguimiento post-quirrgico de estos tumores (14).
Pero adems del cncer cada vez es ms evidente que la apoptosis puede jugar
un papel importante en la patognesis de un gran nmero de enfermedades. En este
aspecto hay que considerar dos tipos de alteraciones, las asociadas al incremento de
apoptosis (14,15) o sea, con un aumento de muerte celular, y aquellas asociadas a una
disminucin de la apoptosis (15-18), lo que resulta en una supervivencia prolongada.
Entre las enfermedades asociadas a la inhibicin de la apoptosis se encuentran
varios tipos de neoplasia, como los tumores dependientes de hormonas, cncer de
prstata, de ovario o de mama; carcinomas que expresan mutaciones en el p53, linfomas foliculares, algunas enfermedades autoinmunes y algunas enfermedades virales.
Otras enfermedades o situaciones se asocian con un incremento de la apoptosis,
entre ellas el SIDA, algunas enfermedades degenerativas (Alzheimer, Parkinson),
sndromes mielodisplsicos (anemia aplsica), lesiones isqumicas (infarto de miocardio o sndrome de isquemia-reperfusin), enfermedades hepatotxicas (alcoholismo) y enfermedades autoinmunes (diabetes).
Modulacin de la apoptosis por xido ntrico

Se acepta generalmente que el xido ntrico (NO), y sus productos de reaccin,
pueden tanto prevenir como inducir apoptosis. El NO podra ser uno de los factores
responsables del dao celular en respuesta a diferentes situaciones patolgica y
recientemente, ha sido sugerido para el NO un papel como modulador de la apoptosis (19), aunque sin embargo su papel no ha sido completamente aclarado y se han
descrito tanto efectos proapoptticos como antiapoptticos para esta molcula.
El NO es una molcula de vida media corta sintetizada a partir de L-arginina por
accin de las NO sintasas. Estos enzimas son expresados en microorganismos, plantas y mamferos y participan en diferentes funciones fisiolgicas incluyendo la neurotransmisin, regulacin del tono vascular, comunicacin celular, inflamacin y
respuesta inmune. En mamferos se expresan tres isoformas distintas de nitrato sintasa, la nNOS (neuronal tipo 1) y eNOS (endotelial tipo 3) que son constitutivas y
se regulan predominantemente a nivel postranscripcional, y una isoforma inducible
iNOS (tipo 2) que puede ser inducida en respuesta a varios estmulos. Las formas
constitutivas son importantes en los procesos fisiolgicos, mientras que el NO gene-
APOPTOSIS
125
rado por la iNOS funciona tanto como regulador como efector en los procesos de
infeccin e inflamacin. Dentro de las funciones efectoras se incluira la citotoxicidad frente a clulas tumorales, microorganismos y clulas husped. La capacidad
citotxica del NO resulta de la capacidad de interaccin del NO con el in superxido para formar peroxinitrito que es un potente antioxidante.
Efectos proapoptticos del NO

La capacidad del NO para inducir apoptosis fue descrita por Albina et al. en
1993 (20), que observ que el NO inducia apoptosis en macrfagos; posteriormente
se describieron efectos proapoptticos para el NO en otros tipos celulares. La sensibilidad al NO depende del tipo de clula. Entre las clulas que muestran mayor
sensibilidad se incluyen, adems de los macrfagos (20), las clulas ` de los islotes
pancreticos (21), timocitos (22) y ciertas neuronas (23).
Los efectos proapoptticos del NO parecen ser independientes de la acumulacin de cGMP, aunque tambin han sido descritos efectos apoptticos para el NO
va activacin de la guanilato ciclasa soluble (24), probablemente mediados por una
protein quinasa dependiente de cGMP.
Aunque los factores que determinan la sensibilidad de los distintos tipos celulares al NO no estn totalmente dilucidados, la induccin de apoptosis por NO puede
ser el resultado del dao al DNA lo que resultara en un aumento de los niveles
de p53 que, ya se ha dicho, es un indicador primario y esencial de la induccin de
apoptosis (25). En cualquier caso, la induccin de apoptosis por NO requiere la exposicin a niveles altos de NO. Tales niveles txicos de NO podran ser poco importantes en condiciones fisiolgicas, pero se pueden encontrar en ciertas alteraciones
patolgicas como la spsis. Es posible adems que esta accin del NO rompiendo
el DNA pueda estar mediada por la formacin del radical peroxinitrito (25).
Efectos antiapoptticos del NO

Han sido descritas tambin la inhibicin de la apoptosis por NO en otros tipos
celulares. El NO puede suprimir la apoptosis por dos mecanismos diferentes. A travs de la activacin de la guanilato ciclasa soluble con el consiguiente aumento de
los niveles de cGMP que interrumpe las seales apoptticas en algunos tipos celulares, incluyendo hepatocitos (26) y esplecnocitos (27). El aumento de los niveles
intracelulares de cGMP disminuye la concentracin de Ca2+ que es una de las llaves sealizadoras de la apoptosis. En este caso, el mecanismo propuesto tambin
(como en las acciones proapoptticas) implica la activacin de una protena quinasa dependiente de cGMP. Esta protena quinasa podra participar en la inhibicin
de las caspasas lo que a su vez podra limitar la degradacin de bcl2. El NO tambin puede inhibir las caspasas directamente. A travs de estos mecanismos, el NO
126
puede prevenir la degradacin de bcl2 y la liberacin de citocromo c de la mitocondrias (27).

La decisin de que una clula sufra o no apoptosis depende del balance entre las
fuerzas proapoptticas y antiapoptticas. El NO parece contribuir de forma importante a este balance suprimiendo el camino apopttico a diferentes niveles; la inhibicin de las caspasas por nitrosilacin es el mejor conocido. Sin embargo, niveles
muy altos de NO podran inclinar la balanza en el sentido de la apoptosis. Adems,
la presencia del in superxido podra dirigir el papel del NO en el sentido apopttico debido a la formacin de peroxinitrito.
Resumen
La apoptosis es una forma fisiolgica de muerte celular. Sus causas y mecanismos de ejecucin todava no son totalmente conocidos y diferentes mediadores,
entre ellos NO, estrs oxidativo, Ca2+, proteasas, nucleasas y alteraciones en la
mitocondria, han sido implicados. Por otra parte, dado que la apoptosis es un proceso altamente regulado e implica la actividad de enzimas hidrolticos, condensacin de la cromatina y formacin de vesculas apoptticas, es probable que sea un
proceso altamente dependiente de energa (28). Alteraciones en los niveles energticos de la clula (ATP) podran ser un factor determinante en la decisin de muerte
celular por apoptosis o necrosis.
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10
Terapia gnica en clulas somticas
J. P. Garca-Ruz
Introduccin
La terapia gnica tiene como objetivo corregir enfermedades mediante la insercin de un gen funcional en clulas somticas. En teora todas las enfermedades
hereditarias como la inmunodeficiencia severa combinada (SCID), la fibrosis qustica, la enfermedad de Huntington, la anemia falciforme o enfermedades adquiridas
durante la vida de un individuo, como el cncer o el SIDA, podran ser tratadas
mediante terapia gnica. Este sueo, que naci hace 25 aos, no es una ilusin sino
algo muy complejo que requiere la cooperacin y los avances cientficos de las distintas reas de las Ciencias de la Salud, tales como Biologa Molecular, Gentica,
Virologa, Endocrinologa Molecular, Inmunologa, etc. La terapia gnica ha resultado ser mucho ms compleja de lo que se poda prever por ignorar aspectos bsicos y tan importantes como la toxicidad que representa la expresin de un transgn
en un sitio inadecuado, o la respuesta inmunolgica de algunos de los vectores usados para insertar el transgn. En este sentido, Alain Fisher comenta en un artculo
reciente sobre lo nave que resultan hoy los primeros intentos de terapia gnica sin
tener presente el bagaje de los conocimientos actuales (1).
El anlisis gentico y el uso de tcnicas de ADN recombinante han permitido el
aislamiento y caracterizacin de gran nmero de genes, as como la caracterizacin
de aquellos cuyo defecto es causa de enfermedades hereditarias en humanos. Tanto
las enfermedades causadas por una alteracin en un nico gen, o monognicas,
como las debidas a fallos en varios genes, o multignicas, tienen inters en terapia
gnica. Sin embargo, las enfermedades monognicas son los objetivos prioritarios
y en ellas es donde se han obtenido los primeros logros teraputicos.
La terapia gnica requiere de la insercin de un gen correcto en una clula somtica especfica y que ste se exprese adecuadamente durante toda la vida del individuo. Con objeto de entender la complejidad del abordaje de este tipo de terapia y los
130
logros conseguidos, resulta necesario recordar algunos conceptos, como qu es un

gen y cmo se transcribe, los vectores virales que ofrecen ms ventajas en la transferencia gnica y cmo se obtienen y cultivan las clulas somticas objetivo de la
transferencia gnica.
Elementos de los genes eucariticos

Un gen puede ser definido como la secuencia de nucletidos necesaria para la
sntesis de una protena funcional y est compuesto por la secuencia de nucletidos
que codifica para la protena (secuencia codificante) y por secuencias de nucletidos no codificantes de protena pero absolutamente necesarias para la correcta
transcripcin del gen. Los genes humanos son monocistrnicos y contienen la
secuencia nucleotdica que los codifica distribuida en un nmero variable de exones. Las secuencias no codificantes de protena se encuentran localizadas entre los
exones, intrones, y en ambos extremos del gen. En el extremo 5 del inicio de la
transcripcin de los genes, se encuentran las regiones reguladoras de la transcripcin, conocidas como enhancers o potenciadores distribuidas a una distancia variable que puede llegar a ser de 50 Kb o mayor. Las otras secuencias no codificantes
de protenas, que igualmente son crticas en la transcripcin correcta de un gen, son
las seales de corte y poliadenilacin localizadas en el extremo 3 del gen y las
secuencias que intervienen en el splicing o ayuste de los transcritos primarios.
La complejidad de los genes es variable. Los hay que producen un solo tipo de
transcrito que codifica para una protena (unidades de transcripcin simple), y otros
cuya transcripcin es compleja. Estos ltimos son genes que tienen varios sitios de
iniciacin de la transcripcin regulados por distintos elementos y/o que cuyos transcritos primarios pueden ser procesados mediante diferentes pasos. A modo de ejemplo sirve la transcripcin del gen del receptor de la hormona prolactina. La transcripcin del nico gen del receptor puede ser regulada desde tres regiones diferentes
localizadas en el extremo 5 del gen y, adems, presenta una transcripcin alternativa de exones que da lugar a varias molculas de ARNm, cuya composicin es parcialmente distinta, y que son traducidas en las conocidas isoformas del receptor de
prolactina (2). Cualquier mutacin en la secuencia nucleotdica de los exones, intrones o regiones reguladoras de un gen puede ocasionar alteraciones en la expresin
de una protena. Con este concepto de gen es fcil darse cuenta de la cantidad de trabajo pendiente de realizar para conocer todos los genes humanos.
Inicio de la transcripcin de un gen codificante

para una protena
Los factores que determinan que los genes codificantes de protenas en los organismos pluricelulares tengan una velocidad de transcripcin especfica de tejido son
muchos, incluyendo las decisiones tomadas por las clulas durante el desarrollo
TERAPIA GNICA EN CLULAS SOMTICAS
Estado celular
y desarrollo
Conformacin y
accesibilidad
del DNA
131
Ligandos
neuroendocrinos/receptores
Segundos mensajeros
ARN polimerasa II
Factores de transcripcin
Activadores e inhibidores
TATA
Promotor distal
Figura 10.1.
Promotor proximal
Iniciacin
Elongacin
Terminacin
Esquema de los factores implicados en la transcripcin de un gen.
(Fig. 10.1). La enzima que cataliza esta reaccin es la ARN polimerasa II (3). Esta
protena reconoce una secuencia o caja TATA presente en el extremo 5 no codificante del gen y hace que la ARN polimerasa II se asocie a la secuencia existente
entre 35 y 10 del codn de iniciacin. La regin, que ocupa aproximadamente
200 pb anteriores al sitio de iniciacin de la transcripcin, constituye la regin promotora donde existen secuencias consenso para la unin de distintos factores de
transcripcin. Hay genes que tienen otra regin promotora ms alejada del inicio de
la transcripcin llamada promotor distal. La transcripcin de un gen, as como la
activacin como la represin, es consecuencia de la unin de los factores de transcripcin a sus sitios consenso, la adecuada activacin de stos y de la cooperacin
de interacciones entre los factores de transcripcin y el complejo de iniciacin de la
transcripcin (4). Este proceso es ms complejo en algunos genes ya que pueden utilizar promotores alternativos. Los factores neuro-endocrinos y citoquinas regulan la
expresin gnica mediante la unin a sus respectivos receptores y la activacin de
las cascadas de reacciones celulares que modulan la expresin de los factores de
transcripcin y/o el estado de activacin de stos.
Los genes que codifican protenas suponen nicamente el 5 % del genoma
humano. La accesibilidad de un gen dentro de la estructura de la cromatina a los factores proteicos implicados en la regulacin del inicio de la transcripcin es crtica
en la expresin de ste. La estructura de la cromatina es muy compacta. La doble
cadena de ADN se dispone alrededor de un octmero de protenas, denominadas
histonas, constituyendo la unidad estructural de la cromatina: el nucleosoma. Una
secuencia de seis nucleosomas espaciados por regiones que asocian a la Histona
tipo 1, His1, forma un selenoide donde las His1 quedan en el interior de una estructura muy compacta. El grado de condensacin de la cromatina se regula por la acetilacin de la regin amino-terminal de la His1. Cuando la cromatina est conden-
132
sada, los factores de transcripcin no pueden acceder a las regiones reguladoras de

muchos genes (5). Este hecho, entre otros factores, supone que la expresin de algunos genes sea especfica de tejido.
Transferencia de un gen a una clula somtica

La transferencia de un gen a una clula es un proceso que tiene lugar normalmente ex vivo, es decir, en clulas explantadas de un paciente, las cuales, una vez
modificadas genticamente, seleccionadas y expandidas in vitro son reimplantadas
en el mismo paciente (6,7). Existen muchos mtodos para la introduccin de material
gentico en clulas en cultivo, cuya eficacia es variable en funcin del tipo de clula. La manera ms eficaz de transferir un gen a clulas somticas es con la ayuda de
vectores derivados de virus. Existen vectores virales derivados de los Retrovirus,
Adenovirus, Herpesvirus y Parvovirus, tales como el virus asociado a Adenovirus
(AAV) entre otros. Todos los vectores conservan la capacidad de infectar clulas y
son manipulados genticamente para que transporten el gen objeto de la terapia. De
todos los posibles vectores virales, los ms idneos son aquellos cuyo ciclo biolgico comprende una fase de integracin en el ADN genmico teniendo menor inters aquellos que se mantienen como elementos episomales o aquellos que activan
una respuesta inmunolgica del husped.
Vectores derivados de oncorretrovirus

Los vectores ms utilizados en terapia gnica son los derivados de los
Oncorretrovirus, concretamente los derivados del virus de la leucemia murina
(MoMLV) (8). Las partculas del MoMLV estn formadas por dos molculas idnticas de ARN, y las enzimas que requiere el virus para su replicacin rodeadas por la
nucleocpsida y por la envoltura viral. Esta ltima se compone de una glicoprotena viral y fraccin de membrana perteneciente a la clula husped donde se replic
el virus. La molcula del ARN viral presenta en la mitad dos fases abiertas de lectura (ORF) (Fig. 10.2). La primera ORF corresponde a dos genes en tndem: gagpol, que codifican para una poliprotena precursora de la protena de la nucleocpsida (GAG), la transcriptasa inversa (RT) y de la integrasa (IN). La segunda ORF
constituye el gen env que codifica las protenas de la envuelta viral (ENV) y es responsable del reconocimiento de los receptores de la clula en el proceso de infeccin, denominado tropismo viral. En el extremo 5 contiene varias regiones no
codificantes: R, que se repite en sentido directo en el extremo 3; U5, que contiene
la seal de poliadenilacin del ARN; PBS, lugar donde hibrida un ARNt cebador
usado en la actividad RT; SD, secuencia donadora de splicing, y s, necesaria para
la encapsidacin del ARN en las partculas virales. En el extremo 3 tiene secuencias no codificantes, como PPT (Poly Purina Track) necesarias para la sntesis de la
segunda cadena de ADN viral, y la U3, que corresponde al promotor viral.
133
A
gag-pol
R
U5
PBS ^
PPT U3
env
SD
SA
B
gag
pol
LTR
LTR
env
Figura 10.2. Esquema de la molcula ARN del virus de la leucemia murina (A). Esquema del
ADN viral correspondiente al virus citado (B).
El ciclo de replicacin de un retrovirus se muestra en el esquema de la Figura 10.3. La infeccin viral empieza cuando la glicoprotena de la envoltura viral
interacciona con los receptores presentes en las clulas suceptibles de la infeccin,
fusionndose los componentes de membrana de la envoltura viral y de la clula. El
ARN es transcrito por las molculas de RT dando lugar sucesivamente a una cadena de ADNc y al ADN viral de doble cadena. El ADN es transportado al ncleo en
forma de un complejo con las protenas, ING, GAG y otras, llamado complejo de
pre-integracin (PIC). El PIC es de gran tamao molecular por lo que la entrada al
ncleo se logra cuando la clula est en mitosis. El provirus es integrado en el ADN
cromosmico en sitios no predeterminados de ste y es catalizado por la actividad
integrasa viral que elimina dos nucletidos de ambas LTR (Long Terminal Repeat)
y corta el ADN cromosmico.
Los vectores derivados de MoMLV, y en general de los retrovirus, son virus
que han sido modificados para que pierdan su capacidad de propagacin (8).
Mediante ingeniera gentica se retiran los genes virales gag-pol y env y se introduce el gen de inters teraputico (Fig. 10.4). La propagacin de los vectores en
clulas se puede conseguir suministrando los productos de los genes gag-pol y env
de diversas maneras: mediante el uso de virus auxiliares; cotransfectando con vectores de expresin que codifican para los genes gag-pol y env; o usando clulas
empaquetadoras. Las clulas empaquetadoras son clulas modificadas para expresar constitutivamente los genes correspondientes a las protenas virales antes mencionadas y as obtener las denominadas partculas transferentes de los genes teraputicos (Fig. 10.5). Se dispone de muchos tipos de clulas empaquetadoras, ya
que el gen env, responsable del tropismo, puede ser modificado. Por ejemplo, sus-
134
Virus infectivo
Transcripcin
reversa
Produccin de
protenas virales
ADN viral
Integracin
ARN viral
ADN
celular
Provirus
ADN
celular
Encapsidacin
del ARN viral
ncleo
citoplasma
Liberacin de
partculas virales
Figura 10.3.
Esquema mostrando el ciclo de replicacin de un retrovirus.
tituyendo parte del gen env por el gen de la hormona eritropoyetina, se obtienen
partculas transferentes que reconocen las clulas que expresan el receptor de esta
hormona.
Vectores derivados de los lentivirus

Otros vectores retrovirales con gran futuro son los generados a partir de los lentivirus. stos tienen, tanto el genoma, como el ciclo de replicacin, ms complejo
Sitio de
integracin
Sitio de
integracin
PPT
PBS
Inicio de la
transcripcin
Figura 10.4.
SD
^
TRANSGN
LTR
LTR
Trmino de la
transcripcin
Esquema de una partcula transferente de un transgn derivada de un retrovirus.
135
Vector con el
transgn
Produccin de
protenas virales
Encapsidacin
del vector
transgn
gag-pol
env
ncleo
citoplasma
Liberacin de
partculas transferentes
del transgn
Figura 10.5.
quetadora.
Esquema mostrando la produccin de partculas transferentes en una clula empa-
que los oncorretrovirus. Sin embargo, los lentivirus, en trmino de aplicabilidad

clnica, adems de incorporarse al genoma, infectan clulas que no estn en divisin (9,10). Los vectores ms estudiados son los derivados del virus de la inmunodeficiencia humana HIV-1 (Fig. 10.6). En el genoma del HIV-1 hay genes accesorios
que juegan un papel importante en el ciclo de replicacin, como tat, rev y vpr. La
protena TAT activa el promotor HIVLTR, y la REV junto a la VPR intervienen en
el transporte del ADN viral al ncleo. El complejo de preintegracin (PIC) de los
lentivirus tiene asociadas varias protenas, entre ellas la protena VPR capaz de
unirse al poro nuclear, mientras que la integrasa y la protena de la matriz (GAG)
tienen dominios que actan de chaperonas del complejo facilitando su transporte al
tat
rev
pol
LTR
gag
rev
LTR
vif
vpr
Figura 10.6.
Esquema del genoma de de HIV-1.
vpr
nev
136
ncleo. Recientemente se ha demostrado que la secuencia PPT juega un papel

importante en el transporte del PIC al ncleo (11). Esta secuencia interviene en la
generacin de una triple hlice de ADN importante en la estructura del complejo
PIC. La generacin de la triple hlice se produce mediante el siguiente proceso
(Fig. 10.7). La transcripcin inversa que sufren las dos copias del ARN presentes en
la partcula viral, empieza con la sntesis de la hebra (-). La sntesis de la hebra (+)
es discontinua y los segmentos a la derecha e izquierda se sintetizan independientemente. Desde el PPT se inicia uno de estos segmentos (+) que cuando se une
al segmento generado en direccin contraria, da lugar a un segmento solapante de
99 nucletidos conocido como flap. La triple cadena as generada es importante en
la estructura del complejo PIC para que sea transportado al ncleo, como ha sido
demostrado con mutantes de la regin PPT.
Transcriptasa inversa
ADNc viral
PPT
Hebra
Hebras +
Complejo de pre-integracin
Poro nuclear
Figura 10.7. Esquema que muestra la formacin del complejo de preintegracin de un lentivirus y su entrada por el poro nuclear de la clula infectada.
137
La mayora de los vectores lentivirales derivan del HIV-1 (9,10). Tambin hay vectores derivados del HIV-2 (12), del virus de la inmunodeficiencia de simios, SIV (13) y
equinos (14). Las estrategias seguidas han sido realizadas para cambiar el tropismo
natural del virus por el receptor CD4 de macrfagos y linfocitos T, manipulando el
gen env y la generacin de clulas empaquetadoras. Mediante estos vectores se ha
conseguido introducir genes en hgado, retina, msculo y neuronas.
Clulas diana de la terapia gnica

Los tejidos de los animales adultos tienen un nmero variable de clulas embrionarias que sirven para los procesos de regeneracin. Estas clulas pueden ser aisladas, expandidas in vitro e implantadas en un mismo individuo sin disparar la respuesta del sistema inmmune. La mdula sea del hombre adulto es una fuente
asequible y excelente de clulas pluripotenciales del sistema inmuno-hematopoytico y mesenquimales. Las correspondientes al sistema inmuno-hematopoytico se
aslan del resto porque expresan el antgeno de superficie CD34 y, por esto, estn
siendo ampliamente utilizadas en todos los proyectos de terapia gnica del sistema
inmune con gran xito, como veremos en el siguiente apartado.
Las clulas pluripotenciales mesenquimales (MSCs) aisladas de la mdula sea
tienen la potencialidad de diferenciarse en cartlago, hueso, tejido adiposo, tendn, etc. (Fig. 10.8) (15). Las clulas implantadas adquieren el fenotipo del lugar de
la implantacin como hueso, cartlago, tejido adiposo, msculo, etc. (16,17), y se estn
empezando a establecer las condiciones y factores necesarios para la diferenciacin
in vitro (18). Resultan muy interesantes los estudios que muestran la diferenciacin de
la MSCs en neuronas.
El potencial teraputico de las MSCs es grande. stas se aslan del resto de clulas de la mdula sea por su capacidad de adherencia. El nmero de MSCs presentes en la mdula sea vara en relacin inversa a la edad de los individuos. Sin
embargo, la potencialidad de diferenciacin de las MSCs obtenidas de adultos se
mantiene inalterada. Estas clulas pluripotentes amplificadas in vitro son unas dianas excelentes para ser modificadas genticamente mediante el uso de los vectores
antes mencionados, ya que al ser implantadas adquieren el fenotipo adecuado para
la expresin del transgn. En estas clulas descansa el futuro de la terapia gnica sin
alterar la clulas germinales de los individuos.
Logro de la terapia gnica en la inmunodeficiencia severa

combinada (SCID)-X1
La enfermedad hereditaria SCID-X1 se caracteriza por un bloqueo temprano en
el proceso de diferenciacin de los linfocitos. La causa de esta enfermedad es un
defecto en el receptor de citoquinas ac (19). Dos nios franceses con edades de 11
Figura 10.8.
Hueso
Osteocito
Cartlago
Condrocito
Hipertrfico
Condrocito
Condrocito
Transitorio
Osteoblasto
Transitorio
Osteoblasto
Condrognesis
Osteognesis
Tendn/
ligamento
Fibroblasto
Fibroblasto
Transitorio
Tendognesis/
Ligamentognesis
Msculo
Miotbulo
Fusin Mioblstica
Mioblasto
Miognesis
Mdula
Clula
Estromal
Clula Estromal
Transitoria
Estroma
Celular
Esquema de la diferenciacin de las clulas pluripotenciales mesenquimales aisladas de la mdula sea.
Maduracin
Diferenciacin
Expansin
clonal
Destino
Proliferacin
Clula Mesenquimal Progenitora
Proceso Mesengnico
Tejido
conjuntivo
Adipocito
Clula Dermal
Otros
Otros
138
139
y 8 meses que padecan dicha enfermedad han sido pioneros en experimentar con
xito la terapia gnica (20). A ambos pacientes se les extrajo mdula sea y se aislaron las clulas progenitoras del sistema inmunitario mediante bolitas magnticas
tapizadas con el anticuerpo anti-CD34. Las clulas progenitoras CD34+ se amplificaron en placas tapizadas con fibronectina y en medio de cultivo definido. El
medio contena IL-3, factor de diferenciacin de megacarioticitos y el tiempo de
incubacin empleado fue de 24 horas. El gen humano completo codificante para el
receptor ac fue introducido en un vector oncorretroviral llamado MFG-ac y empaquetado en una lnea de clulas disponibles en el mercado. El sobrenadante de las
clulas conteniendo 500.000 partculas transferentes por ml fue utilizado para infectar durante tres das las clulas progenitoras CD34+ aisladas de ambos pacientes.
Transcurrido este tiempo, las clulas se lavaron y fueron retornadas a la mdula de
los respectivos pacientes. Los resultados del seguimiento efectuado durante 10
meses a los dos pacientes, muestran que la expresin del transgn comienza a las
dos semanas de la infusin de las clulas en la mdula y consecuentemente se llega
a alcanzar unos niveles de linfocitos T, B y NK, similares a los controles sin enfermedad. Adems los pacientes muestran una funcionalidad del sistema inmunitario
totalmente normal cuando fueron vacunados de la polio, el ttano y la difteria.
Gracias a la terapia gnica, estos nios destinados a vivir en una burbuja o recibir
un transplante alognico llevan casi dos aos haciendo vida normal con la nica
molestia de dos inyecciones en la mdula.
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11
Introduccin a la Biotecnologa
y generalidades sobre cultivos
celulares
A. Martnez Mogarra
Definicin
En lneas generales podemos definir la Biotecnologa como la utilizacin industrial de seres vivos para la obtencin de sustancias de inters. Como vemos se trata
de una definicin muy amplia por lo que no debe sorprendernos el hecho de que la
Biotecnologa sea casi tan antigua como la civilizacin. Los procesos biotecnolgicos ms antiguos de los que se tiene conocimiento son las fermentaciones para
obtener bebidas alcohlicas o la aplicacin de pan mohoso a las heridas que los
antiguos egipcios practicaban como profilaxis de las infecciones. En la actualidad
existe una larga lista de productos obtenidos por la Biotecnologa que afecta a
todos los rdenes de la vida: tejidos, alimentacin, caucho, farmacia, medio
ambiente. As pues, atendiendo a la amplitud del campo en el que nos movemos,
centraremos nuestra atencin en la aplicacin de la Biotecnologa a las Ciencias de
la Salud.
La palabra Biotecnologa deriva de vocablos griegos cuyo significado es utilizacin industrial de formas vivas o el uso integrado de la ingeniera, la bioqumica y la microbiologa para conseguir la aplicacin tecnolgica de las capacidades
de microorganismos, clulas de tejido cultivado y sus partes. En el campo de la
salud, existe una multitud de productos de origen natural debido en general a que su
elevada complejidad estructural hace muy difcil su sntesis. Incluso algunos productos como las vacunas, son organismos vivos o partes de ellos. Hace 20 o 30 aos
habramos podido decir que la Biotecnologa farmacutica era la obtencin de frmacos a partir de substratos naturales. El conocimiento actual de la Biologa es lo
que nos ha permitido alcanzar el nivel molecular de la vida, abriendo con ello nuevos horizontes de posibilidades en la obtencin de sustancias curativas. De hecho y
como ms adelante volveremos a mencionar, el desarrollo de la tecnologa del ADN
recombinate y su aplicacin industrial ha abierto las puertas de un mundo de posi-
142
bilidades tanto en la fabricacin de drogas como en la directa terapia sobre enfermos de dolencias hasta la fecha consideradas incurables. No debemos olvidar que
el trmino droga que se utiliza habitualmente referido a personas es sin embargo
utilizable en la salud animal y que la farmacia veterinaria tiene tambin un peso
econmico importante.
Muchas sustancias teraputicas han sido descubiertas accidentalmente en animales y plantas. Slo en pocas muy recientes la ciencia ha explorado en el nivel
bsico y ha sido capaz de convertir en drogas el producto de esa investigacin. ste
hecho es lo que comnmente venamos denominando Biotecnologa Farmacutica. Sin embargo, el trmino Biotecnologa Farmacutica se ha desvirtuado y se ha transformado en un cajn de sastre en el que se incluye una amplia
variedad de avances cientficos dirigidos al cuidado de la salud. Dentro de ellos pueden destacarse siete campos:
1. Reconocimiento y caracterizacin de factores endgenos que median los
efectos producidos por las drogas tradicionales.
2. Utilizacin de la tecnologa del ADN recombinante.
3. Produccin industrial de anticuerpos monoclonales para terapia, diagnstico
y purificacin de otras sustancias.
4. Diseo de frmacos por ordenador.
5. Sistemas de administracin de drogas (DDS)
6. Organismos transgnicos.
7. Aplicaciones del cultivo de tejidos.
Inevitablemente se genera una nueva industria sobre estas tecnologas con un
elevado desarrollo potencial y real. Existen miles de empresas en EE UU y Europa
relacionadas con estos campos. Actualmente hay diversos frmacos en el mercado
producidos mediante tecnologa del ADN recombinante y muchos ms en fase de
ensayos clnicos o esperando su aprobacin por las autoridades sanitarias (r-hGH,
r-FSH, Insulina, Factor VIII, Factor IX...). Estas producciones dan lugar al desarrollo de una gran industria auxiliar dedicada a la fabricacin de plsticos, reactivos,
etctera, formando todo ello un tejido industrial que mueve actualmente miles de
millones de dlares. La evidencia de que la Biotecnologa es una industria y que
como tal tiene un peso econmico (creciente) nos conduce a definiciones si bien un
tanto prosaicas del trmino, no por ello desacertadas. De este modo se dice que la
Biotecnologa es hacer dinero con la Biologa o en una concepcin menos econmica pero tambin llena de pragmatismo la Biotecnologa se define como la aplicacin industrial de la Biologa.
La Biotecnologa Farmacutica persigue la obtencin de cantidades industriales de productos que existen en la naturaleza en cantidades muy pequeas con
objeto de tratar enfermedades. Uno de los ms antiguos productos obtenidos por la
Biotecnologa Farmacutica es la insulina, que en los aos veinte comenz a purificarse en grandes cantidades a partir de los pncreas porcinos y bovinos.
La extraccin de sustancias a partir de tejidos animales, no digamos ya humanos, lleva aparejados problemas relacionados con la presencia de agentes adventi-
INTRODUCCIN A LA BIOTECNOLOGA Y GENERALIDADES
143
cios difcilmente detectables. Ejemplos muy sobresalientes de este hecho es el

lamentable contagio de SIDA de personas tratadas con factor VIII o la aparicin
prematura de demencia senil como manifestacin de la enfermedad de CreutfeldtJakobs en personas tratadas con hormona de crecimiento extrada de tejidos humanos. Por otra parte, determinadas sustancias que son muy escasas en la naturaleza
pueden obtenerse en cantidades relativamente abundantes mediante la manipulacin gentica de organismos. Estos hechos favorecen que la tecnologa del ADN
recombinante irrumpa con fuerza en la Biotecnologa Farmacutica y que sea en la
actualidad la ms sobresaliente aplicacin de tecnologa con una realidad teraputica y comercial. Hoy en da disponemos de molculas humanas en grandes cantidades que, sin embargo, jams han estado relacionadas con seres humanos. Tal es
el caso de la hGH , insulina o factores de coagulacin.
Tambin en el campo de la inmunologa tiene una gran importancia la tecnologa del ADN recombinante puesto que diversas vacunas incluyen nicamente partes del patgeno incapaces de desarrollar enfermedad alguna, sino tan slo la respuesta inmune.
Las fronteras actuales de la Biotecnologa Farmacutica se encuentran en la
bsqueda de nuevos productos capaces de acabar con enfermedades como el cncer
y en el tratamiento a nivel gentico de las enfermedades para poder corregirlos en
origen. Es la terapia gnica que comienza a mostrar sus primeros xitos.
Con todo lo dicho podemos redefinir el trmino Biotecnologa Farmacutica
como el uso de sistemas biolgicos para producir drogas o sustancias o tambin
como la utilizacin de tecnologas modernas para producir sustancias teraputicas
a partir de sistemas biolgicos.
Resea histrica
Ya se ha indicado que la Biotecnologa tiene una edad no inferior a los 5.000
aos pero entre las primeras fermentaciones en la antigua Mesopotamia y las
modernas terapias gnicas se producen una serie de hechos destacados que van
marcando la pauta de desarrollo y crecimiento de esta tecnologa. A continuacin
trataremos de sintetizar la historia de la aplicacin industrial de organismos vivos en
varias etapas.
1. Anterior a Pasteur. Se limita a la produccin de alimentos y bebidas fermentadas, destilacin, utilizacin de levaduras y fabricacin de yoghurt y
vinagre, todos ellos procesos tradicionales cuyas causas son, evidentemente
desconocidas para quienes las realizan.
2. Era Pasteur. Los trabajos de Louis Pasteur demostraron la participacin de
los microorganismos como agentes activos en la produccin de cerveza y
vino y en la descomposicin de alimentos. Los hitos principales de este
periodo son fundamentalmente dos:
144
Produccin microbiolgica de butanol, glicerol y cido ctrico.

Produccin de acetona y butanol con Clostridium acetobutylicum
(Weizmann 1913-1915, Manchester).
3. Era de los antibiticos. Fleming descubri en 1928 la penicilina pero hasta
1940 no se inici su produccin en masa gracias a la aplicacin de la tecnologa de la industria alimentaria, que permiti la fermentacin a gran
escala del Penicillium notatum, que hasta entonces se haba crecido en
botellas.
Al desarrollo de la penicilina, le siguieron otros muchos antibiticos,
como la eritromicina y la estreptomicina.
4. Era Post-antibiticos. El desarrollo de la bioqumica y la microbiologa
impuls la utilizacin de microorganismos en la produccin de diversas sustancias; es el caso de las vitaminas B2 y B12, de aminocidos (licina y glucosa) o la transformacin masiva de glucosa en fructosa.
Otros productos de inters industrial generados por Biotecnologa son el
gasohol, etanol obtenido por fermentacin y utilizado como combustible y la
goma de xantano, que reemplaza el caucho.
Un uso muy llamativo aunque fallido de los microorganismos fue la
produccin de SCP (Single Cell Proteins) que durante un tiempo persigui
la obtencin de protenas tiles para el consumo animal e incluso humano
a partir de la transformacin de residuos agrcolas y petroleros, partiendo
de la premisa de que el mundo tendra en el futuro escasez de protenas.
Tras varios aos de inversin y esfuerzo investigador, el cultivo de la soja
termin con esta iniciativa.
Tambin corresponde a este periodo la utilizacin de microorganismos
para la limpieza de efluentes y como auxiliares de lixiviacin.
5. Incorporacin de la Biologa Molecular. La combinacin de las tcnicas de
la Biologa Molecular con el cultivo masivo de microorganismos ha supuesto una revolucin en el campo de Biotecnologa. La tecnologa del ADN
recombinante en combinacin con las tcnicas de cultivo masivo de bacterias
y, desde 1962, tambin de clulas eucariotas se convierte en la va para producir cantidades importantes de protenas de inters teraputico, como anticuerpos monoclonales de gran especificidad, hormonas, mediadores biolgicos, etctera.
La frontera actual de la biotecnologa se encuentra en la creacin de seres transgnicos capaces de expresar genes ajenos e incorporar el producto o efecto de los
mismos como parte de su propia naturaleza, en la clonacin de organismos superiores y en las terapias gnicas que permiten la correccin de defectos genticos en
organismos ya desarrollados.
Fuera del campo de la salud, los sensores biolgicos y las enzimas inmovilizadas ocupan la vanguardia de la Biotecnologa.
145
Produccin de frmacos por Biotecnologa

Una vez detectado el inters teraputico de una sustancia, hay que seguir una
secuencia de pasos hasta llegar el producto final. Con matices, todos los frmacos
obtenidos por un proceso biotecnolgico siguen una secuencia similar. Nos centraremos pues en la produccin de protenas recombinantes.
Una vez detectada, aislada y caracterizada la sustancia de inters teraputico se
procede a la localizacin del ADN que la codifica en el organismo de origen, habitualmente el hombre. Existen diversos mtodos para aislar la secuencia de ADN,
como la creacin de sondas y genotecas, que en otro captulo se describirn en detalle.
Cuando se posee el ADN de inters, se transfiere al organismo elegido para la
produccin industrial. En este paso temprano se aplican por primera vez criterios
econmicos al proceso. As, si bioqumicamente, es viable la produccin de la
protena, en diversos organismos, ser necesario pensar en las posibilidades de
sacar adelante el cultivo, productividad, costes de purificacin del producto, problemas de impurezas y caracterizacin final. Como ejemplo, siempre que una
protena requiera modificaciones estructurales post-traduccionales para ser funcional, las bacterias quedarn automticamente descartadas como organismo productor.
Una vez realizada la construccin gnica y seleccionado y creado el organismo
hospedador, se ha de proceder a la elaboracin del banco de clulas. ste no es sino
un reservorio de clulas productoras, todas iguales entre s, que se mantienen en
condiciones de conservacin durante aos. La homogeneidad y buena conservacin de las clulas resulta esencial para garantizar el desarrollo del proceso productivo.
Una vez creado el banco de clulas, comienza el diseo del proceso de produccin. La naturaleza del hospedador seleccionado, bacteria o eucariota es muy determinante en este desarrollo. Las bacterias admiten condiciones de crecimiento
mucho menos depuradas que las clulas. Las reas de trabajo en la optimizacin del
proceso son tambin diferentes dependiendo de que se trabaje en clulas o bacterias
y de si aquellas viven en suspensin o son dependientes de anclaje. Parmetros
como la concentracin de gases en solucin, la distribucin de temperaturas en el
tiempo o el control de pH, por ejemplo, son algunos de los factores a tratar a la hora
de poner en marcha un proceso. En estos desarrollos son habituales los ensayos
multifactoriales para determinar los parmetros realmente importantes y la manera
en que inciden sobre el mismo.
Un aspecto de capital importancia a la hora de seleccionar el organismo productor es el mtodo de purificacin del producto final. Un ejemplo muy ilustrativo
lo encontramos en la fabricacin del tPA. Esta protena fue clonada en Escherichia
coli y en clulas CHO (Chinese Hamster Ovary). En ambos casos y pese a tratarse
de una protena con estructura terciaria, el producto resultaba funcional tanto in
vitro como in vivo. Adems, el producto generado por E. Coli (ECOtPA) resultaba
ms estable una vez inyectado que el procedente de clulas CHO con lo que reque-
146
ra dosis menores para actuar. Sin embargo, la ECOtPA se produca en forma de grnulos insolubles intracelulares lo que requera un complejo proceso de recuperacin
y purificacin en el que se consuman grandes cantidades de urea y guanidina y
haca necesario el trabajo con grandes volmenes. Adems, el rendimiento final del
proceso era de un 2,8 %. Consecuentemente se adopt la CHO como organismo
productor de tPA a pesar de que la productividad en el crudo era de tan slo 33,5
mg/L frente a los 460 mg/L generados por las bacterias.
Junto con la eleccin de las condiciones de cultivo y de los pasos a dar para la
purificacin del producto, se definen los controles en proceso necesarios. El control
en proceso es fundamental para la elaboracin de un producto de estas caractersticas puesto que un conocimiento preciso de la evolucin de la produccin resulta
imprescindible para detectar y atajar los posibles problemas que vayan surgiendo y
garantizar la ausencia de sorpresas desagradables en el producto final.
El diseo general del proceso de fabricacin junto con las caractersticas del
organismo hospedador, dar la pauta a seguir en el diseo de las instalaciones y la
eleccin de los mtodos de trabajo.
La forma final del procedimiento de fabricacin se obtiene con el rodaje de la
produccin, ya que slo la prctica diaria pone de manifiesto los problemas existentes.
El tiempo requerido por un frmaco para llegar al mercado se divide en tres
periodos:
Preclnico: Es toda la etapa de desarrollo del producto que ya hemos comentado. La fase en que se produce la deteccin de la sustancia, su implantacin
en un organismo hospedador y el desarrollo del modelo de produccin.
Clnico: Es el momento en que comienzan los ensayos clnicos. Las observaciones realizadas en esta fase pueden modificar partes o incluso la totalidad
del proceso de produccin.
De revisin: Terminadas las dos fases anteriores, la propuesta de productos es
enviada a las autoridades sanitarias para su estudio y aprobacin. Las preguntas y demostraciones solicitadas por dichas autoridades pueden tambin afectar al proceso de fabricacin.
El tiempo medio de salida al mercado de productos obtenidos por biotecnologa viene siendo de siete aos desde su concepcin hasta su venta al pblico.
Este tiempo es comparable al requerido para la salida al mercado de drogas para
el tratamiento del SIDA y sensiblemente menor que el requerido a los frmacos
tradicionales o los extractivos, estos ltimos permanentemente bajo sospecha y
frecuentemente inspeccionados.
Un punto que ayuda a la rapidez en la salida al mercado de productos biotecnolgicos es el hecho de que algunos de ellos, como la insulina y la hGH, son sustancias que ya existan como frmacos y en los que nicamente cambia el sistema de
fabricacin. No obstante, y en el caso de los NBE (New Biological Entities), los productos biotecnolgicos tambin vienen requiriendo menores tiempos de revisin
por parte de las autoridades.
147
Cultivo in-vitro de clulas

Una poblacin bacteriana depositada en el seno de un medio nutritivo y no renovado, produce un perfil de crecimiento de tipo sigmoide. En la curva de crecimiento se identifican tres fases fundamentales que son de importancia a la hora de desarrollar una produccin biotecnolgica. Dichas fases son:
De latencia o lag. Durante este periodo las bacterias se adaptan al medio.
De crecimiento exponencial o log. Es el periodo de crecimiento neto, caracterizado por una intensa duplicacin del cultivo. Las bacterias se multiplican
en una progresin geomtrica de razn 2 durante esta fase, es decir, siendo N
el nmero inicial de individuos, la poblacin crecer de la siguiente manera:
N A 2N A 4N A 8N A 16N
Entre cada multiplicacin transcurre un tiempo especfico, constante y caracterstico de cada especie que es conocido como tiempo de duplicacin. Es posible
determinar este tiempo, el nmero de duplicaciones producidas o prever la cantidad
de bacterias al cabo de cierto tiempo mediante ecuaciones sencillas.
Xt = X0 2n
Donde Xt : microorganismos en tiempo t
X0: microorganismos en t0
n: nmero de duplicaciones
Puesto que n = t / td, siendo td el tiempo de duplicacin, entonces:
Xt = X0 2n = X0 2t/td c X/X0 = 2t/td c n(X-X0) = ln 2t/td
Por tanto:
0,693
(logX logX0)
2,303 =
t
td
Es decir, que una grfica de crecimiento frente al tiempo produce una recta cuya
pendiente es 0,693/td.
Estos clculos slo son aplicables a la fase de crecimiento exponencial, lgicamente.
Medida de crecimiento bacteriano

Existen diversos mtodos para medir el crecimiento. Podemos clasificarlos en
directos e indirectos.
148
Directos: Son los diversos sistemas de recuento, ya sean la cmara cuentaglbulos o los contadores de clulas.
Indirectos: Evalan diversos parmetros que dan una idea aproximada del
nmero de clulas presente.
Peso seco: Recuperacin mediante filtracin o centrifugacin de las clulas contenidas en un volumen conocido de cultivo, desecacin en estufa de
las clulas retiradas y pesada de las mismas.
Peso hmedo: Se recuperan las clulas mediante la filtracin de un volumen conocido de cultivo y se pesa la biomasa recogida.
Disolucin seriada de una muestra del cultivo y siembra en medio slido.
Se considera que cada una de las colonias formadas sobre la placa corresponde a una sola bacteria en suspensin. Multiplicando el nmero de colonias obtenidas por el factor de dilucin se puede estimar la concentracin
bacteriana en el cultivo original.
Absorcin de luz visible. Las suspensiones de bacterias absorben luz visible. La absorcin es tanto mayor cuanto ms elevada es la concentracin de
bacterias. La combinacin de esta medicin con la realizacin de diluciones
seriadas de los cultivos permite establecer una relacin entre la concentracin de microorganismos y la absorbancia de un cultivo bacteriano.
Cultivo de clulas eucariotas

Gran parte de los principios aplicados al cultivo de bacterias son extrapolables
a los cultivos de clulas. De hecho, bastantes tcnicas de trabajo con bacterias han
sido aplicadas al cultivo de eucariotas. Sin embargo, es frecuente que las clulas
eucariotas pierdan parte de sus propiedades cuando son extradas de los rganos que
se encuentran y que su proliferacin requiera la utilizacin de condiciones especiales, incluyendo los cultivos histotpicos.
En esencia, la clula inmortalizada en cultivo sigue un ciclo similar al que
hemos visto en bacterias. Tras una fase inicial de latencia se produce un crecimiento exponencial con una fuerte predominancia de clulas en divisin que conduce a una fase estacionaria cuando los elementos crticos para el desarrollo
comienzan a escasear, culminada por una fase de muerte si los nutrientes llegan a
desaparecer por completo.
La cintica de este crecimiento puede expresarse en forma de ecuaciones matemticas idnticas a las que hemos visto para el caso del crecimiento bacteriano.
Entre los diversos parmetros que definen la dinmica de una poblacin celular destacaremos por su utilizacin frecuente la estimacin del nmero de duplicaciones n.
X
n = 3,32 log
X0
Donde X es el nmero de clulas a tiempo t y X0 el nmero inicial de clulas.
149
Clulas inmortalizadas
A diferencia de las bacterias, la clula eucariota carece de sistemas de proteccin
frente al entorno quedando esta funcin supeditada a la organizacin tisular y orgnica. As pues, una clula eucariota extrada de su entorno muere con facilidad, aun
mantenindola en un ambiente muy controlado.
En ocasiones se realiza cultivo de rganos que, tras una necrosis traumtica inicial, adquieren un estado estacionario en el que pueden vivir durante das e incluso
semanas en condiciones de laboratorio. Esta modalidad de cultivo, utilizada tan slo
con fines cientficos, tiene la ventaja de mantener las condiciones fisiolgicas y bioqumicas propias del tejido original. Sin embargo plantea problemas de reproducibilidad de los experimentos.
Como alternativa al cultivo de rganos se encuentra el cultivo de clulas que
consiste, como ya indica su nombre, en el mantenimiento de las condiciones vitales de clulas que se han independizado de la estructura tisular.
El paso del rgano a las clulas independientes tiene lugar por simple y espontnea migracin de las clulas o bien mediante la disgregacin mecnica o enzimtica del rgano y tejido originales.
Las clulas diferenciadas son incapaces de dividirse en la mayora de los casos.
Por otra parte, un cultivo de clulas especficas puede presentar diversos estadios,
as por ejemplo, el cultivo de queratinocitos puede contener clulas madre que se
multiplican, clulas precursoras y escamas queratinizadas. En otros casos, las clulas pueden mantener un aspecto homogneo y dar lugar a cultivos cuya proliferacin depende de la densidad, como es el caso de los fibroblastos, capaces de dividirse a baja densidad (104 cell/cm2) pero incapaces de multiplicarse a altas
densidades (106 cell/cm2).
Finalmente, una poblacin celular puede tener un aspecto homogneo y mantener sin embargo diferencias genticas distribuidas en distintos clones.
La multiplicacin de las clulas en cultivo requiere la utilizacin de densidades
de crecimiento adecuadas, bajas concentraciones de Ca++ (entre 100 y 600 mM) y
la utilizacin de factores de crecimiento tales como el EGF, IGF, PDGF, retinoides,
etctera, todos ellos presentes en el suero sanguneo.
Con todo, las clulas normales en cultivo se dividen un nmero limitado de
veces y despus mueren. Sin embargo las clulas de origen tumoral son capaces
de dividirse ilimitadamente con tal de que se mantengan las condiciones adecuadas para ello. Algunas, como las clulas B16 procedentes de un melanoma de
ratn son capaces de sufrir una diferenciacin parcial y seguir no obstante dividindose.
Las clulas de tipo no neoplsico pueden generar lneas inmortales. La aparicin
de estas clulas inmortales se registra al cabo de una serie de divisiones, cuando la
mayora de las clulas en cultivo empiezan a morir. La inmortalizacin de las clulas se considera producto de mutaciones relacionadas con delecciones en algunos
genes pero no se puede descartar la pre-existencia de clones inmortales en un tejido normal.
150
Las clulas inmortalizadas presentan diferencias morfolgicas con respecto a

aquellas clulas de las que proceden. En general suelen ser de menor tamao, menos
adherentes, ms redondeadas y presentan una relacin ncleo/citoplasma mayor.
Son tambin frecuentes alteraciones de tipo cromosmico siendo muy habituales las
aneuploidas y la heterocariosis.
Las clulas inmortalizadas en cultivo son las ms utilizadas en la biotecnologa
farmacutica actual para producir protenas de inters teraputico.
Las clulas en cultivo pueden vivir en suspensin, como es el caso de los hibridomas, clulas procedentes de la fusin entre linfocitos y clulas procedentes de un
tumor asctico.
La otra forma de crecimiento de clulas en cultivo son las clulas dependientes de anclaje (ADC), que deben mantenerse unidas a una superficie para su desarrollo.
La seleccin del tipo de clulas ms adecuado durante el proceso de desarrollo
de un frmaco biotecnolgico debe tener en cuenta las posibilidades de realizar con
xito un cultivo a gran escala y tratar de compatibilizarlo con las posibilidades de
transformacin de la clula.
Las clulas capaces de crecer en suspensin ofrecen algunas ventajas sobre las
dependientes de anclaje.
Fcil escalado.
Menor manipulacin.
Fcil induccin del estado estacionario.
El cultivo de clulas es una tcnica de gran complejidad y precisin con un fuerte predominio de las respuestas empricas. Los mtodos, materiales y medios de cultivo deben ser previamente ensayados en el laboratorio para realizar la eleccin de
los mismos. Con todo, hay algunos valores de referencia que pueden darse como
norma general:
pH. El valor ptimo suele encontrarse en torno a 7,2 y 7,4. Valores inferiores
a 6,8 suelen resultar inhibitorios del crecimiento. El mantenimiento del pH se
consigue tamponando los medios de cultivo habitualmente con CO3H que se
mantiene en equilibrio con el CO2 atmosfrico.
Temperatura. Frecuentemente se considera que la temperatura ptima de crecimiento es de 37 C pero esto no ha de ser necesariamente as. Determinadas
lneas celulares murinas muestran su crecimiento ptimo a 35 C y hay lneas
celulares de aves que encuentran su temperatura ptima a 40 C.
Aporte de oxgeno. La solubilidad del oxgeno es de 7,6 g/ 106 cell/mL. El
ritmo de consumo de O2 alcanza los 6 g/ 106 cell/mL lo que significa que un
cultivo estndar con 2106 clulas /mL acaba con todo el oxgeno en solucin
en menos de una hora. Existen diversos sistemas de aporte de O2 que van
desde variaciones en la superficie de aireacin hasta sofisticados sistemas de
burbujeo y perfusin y cuya eleccin depende del tipo de cultivo.
151
El medio de cultivo. No existe un medio de cultivo universal. Cada clula,

cada proceso, y cada produccin debe llevar su medio de cultivo especfico.
Los medios de cultivo contienen una fuente de carbono, habitualmente glucosa y/o glutamina, diversas sales minerales y un amplio abanico de nutrientes fundamentalmente aminocidos esenciales y vitaminas.
Suero. Es frecuente que el medio de cultivo se complemente con suero animal.
Existen varias fuentes de suero comnmente utilizadas y comercializadas:
humano, equino, etc., pero la ms habitual es el suero fetal bovino. El aporte
del suero es fundamental para el desarrollo de los cultivos puesto que proporcionan a las clulas una multitud de factores de crecimiento y elementos mitognicos adems de un ambiente muy estable y adecuado para el crecimiento.
Es habitual la utilizacin de concentracin de suero entre el 2 % y el 20 %. El
suero presenta, no obstante, importantes inconvenientes tales como la posible
aparicin de agentes adventicios, la no garanta de abastecimiento y la falta de
homogeneidad del producto. De ah que se est desarrollando un intenso trabajo en la obtencin de medios de cultivo libres de suero en los cuales ste se
sustituye por una variedad de componentes estimulantes de crecimiento conocidos y en cantidades controladas.
Contaminacin y prevencin
No podemos terminar este apartado de generalidades sobre el cultivo celular sin
mencionar la principal amenaza que sobre ellos pesa: La contaminacin. Por su crecimiento lento y la riqueza en nutrientes y condiciones altamente fisiolgicas que se
requieren, los cultivos celulares son un blanco ideal para la contaminacin por bacterias, levaduras y hongos. Es por ello frecuente la adicin de antibiticos a la formulacin del medio, pero esto no siempre puede ser as: la produccin de protenas
para consumo humano debe hacerse necesariamente sin antibiticos que de otro
modo podran generar resistencias o reacciones alrgicas en los pacientes.
Aparte de estos contaminantes comunes, merecen especial atencin los micoplasmas, diversos virus animales y, ltimamente, los priones, como es el caso de la
BSE. Existen diversos mtodos para detectar la presencia de agentes adventicios
que, en muchos casos, pueden no presentar efectos citopticos visibles. La mejor
manera de evitar la aparicin de estos elementos indeseables en los cultivos es el
anlisis de las materias primas, el trabajo asptico y la utilizacin de salas y equipos controlados y diseados para prevenir la contaminacin.
Tipos de cultivos
Trabajemos con procariotas o eucariotas, los cultivos se dividen en dos categoras: batch o discontinuo y continuo.
152
Cultivo discontinuo
Consiste en la inoculacin de una cantidad conocida de clulas en un cierto
volumen de medio, bajo las condiciones adecuadas para el crecimiento. Las clulas
se multiplican y van cambiando su ambiente debido al consumo de nutrientes y a la
acumulacin de metabolitos txicos. Esta variacin en el entorno se traduce en alteraciones de carcter fisiolgico en las clulas que finalmente terminarn por morir
o mantener una poblacin residual.
Existen diversas variaciones del cultivo discontinuo destinadas a prolongar la
duracin del mismo. stas son:
Batch alimentado (fed batch). Consiste en la adicin peridica de cantidades
de medio de cultivo sin retirada del consumido, con el consecuente incremento de volumen.
Batch semi-continuo. Consiste en la peridica retirada de cantidades fijas de
medio de cultivo y su sustitucin por medio nuevo. Estos sistemas retienen
siempre en mayor o menor medida una cierta cantidad de desechos y mantienen por ello un ambiente fluctuante.
Sistemas de perfusin. Consisten en la continua entrada de medio con salida
de cantidad igual, manteniendo las clulas retenidas en el reactor. Es el tpico
sistema de los cultivos histotpcios como el biorreactor de fibra hueca. La
renovacin del medio se puede realizar con medio fresco o bien procediendo
a la regeneracin del medio consumido.
Cultivo continuo
Es en el que se consiguen autnticas condiciones homeostticas evitando fluctuaciones en el ambiente. Consiste en la salida continua de medio de cultivo con
clulas que es reemplazado por medio fresco.
El fundamento del quimiostato reside en el hecho de que el crecimiento celular
est determinado por la concentracin de nutrientes especficos limitantes del crecimiento. En un cultivo, las clulas crecen hasta alcanzar un equilibrio que est relacionado con la dilucin de un factor limitante. Entonces las clulas entran en lo que
se denomina estado estacionario.
En el estado estacionario, el ratio de crecimiento, , es igual al ratio de dilucin,
D que a su vez es la relacin entre el flujo de medio entrante (f) por unidad de tiempo y volumen de cultivo V es decir:
= D = f/V das 1
Puesto que el ratio de crecimiento es dependiente del ratio de flujo entrante, el
tiempo medio de generacin puede expresarse como:
td = ln(2/D)
153
Un sistema automatizado para conseguir un cultivo continuo es el turbidostato,

que valora la densidad celular por turbidimetra.
El inters del cultivo continuo reside en el mantenimiento de las condiciones
fisiolgicas ptimas, requisito en muchos casos para mantener una buena produccin.
Bibliografa
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12
La ingeniera gentica I.
Herramientas y Metodologa
Introduccin
En el inicio de la dcada de los sesenta los genetistas tenan una clara visin de
la gentica clsica. Sin embargo, carecan por completo de metodologa para estudiar y obtener los genes excepto a travs de laboriosos experimentos de apareamientos y anlisis de los mutantes resultantes. No existan procedimientos para
examinar los genes a nivel molecular. No fue hasta 1974 cuando las operaciones de
ingeniera gentica, tambin llamadas tcnicas de ADN recombinante se hicieron
realidad.
La ingeniera gentica es un trmino que, por un lado, hace referencia a aspectos tcnicos: ingeniera, herramientas y a ensamblaje, mientras que el otro trmino,
gentica, remite a los genes, el soporte material de la herencia, a la transmisin a los
descendientes de la informacin inscrita en el patrimonio hereditario de un organismo.
La ingeniera gentica no es una ciencia sino un compendio de tcnicas capaces
de intervenir sobre el patrimonio gentico de los organismos; de esta forma, las tcnicas de ingeniera gentica permiten modificar selectivamente (reprogramar) los
genes de un organismo mediante la incorporacin de nueva informacin gentica,
de forma que sta se exprese y se perpete en la progenie.
Desde su aparicin hacia 1974, la ingeniera gentica ha evolucionado muy
deprisa hacia un grado muy alto de perfeccin tcnica, en la actualidad es posible
aislar fragmentos discretos de ADN procedentes de un gran genoma, mantenerlos y
expresarlos en sistemas sencillos que faciliten su estudio a nivel molecular. Es posible tambin, secuenciar y mutar el gen clonado, ponerlo bajo ptimas condiciones
de expresin, en distintos hospedadores, observar su comportamiento, determinar la
estructura tridimensional y determinar interacciones con otras macromolculas.
Todos estos estudios han supuesto un avance espectacular en el campo de la
156
Biologa Molecular, ejemplo de ello son los descubrimientos de la organizacin de

los genes eucariticos en intrones (o regiones no codificantes) y exones (o regiones
codificantes), la caracterizacin de innumerables nuevos genes y sus elementos de
control.
Adems del avance en conocimientos e investigacin bsica, las tcnicas de
ingeniera gentica han llevado al campo biomdico a cambios revolucionarios
como son la produccin masiva de protenas con alto valor teraputico, (escasas o
difciles de extraer del organismo humano u otras fuentes naturales) o sentar las
bases para la terapia gnica.
A pesar de todo lo anterior, la puesta en prctica de la ingeniera gentica se ha
enfrentado y enfrenta a dificultades. Es muy frecuente que estas dificultades sean
tanto tcnicas como econmicas; las tcnicas de ingeniera gentica conllevan elevados gastos econmicos y la mayora de los trabajos sobre expresin gnica se llevan a cabo en los laboratorios de empresas de ingeniera gentica que se encuentran
en una carrera vital de supervivencia para comercializar producciones lucrativas. La
informacin esencial y til no deriva a la comunidad cientfica y se conserva como
secreto industrial. A veces, es posible tcnica y econmicamente la obtencin de un
determinado producto mediante ingeniera gentica y son otros factores, no cientficos (presiones polticas o ecolgicas) los que evitan que la produccin se lleve a
cabo.
Tcnicas de ADN recombinante

Las tcnicas de Ingeniera Gentica han permitido romper las barreras naturales
entre especies y se ha cambiado el concepto clsico de herencia: genes eucariticos se expresan en sistemas procariticos con gran eficiencia; genes procariticos
se insertan en genomas de mamferos y tambin se expresan, los genes humanos se
pueden aislar, mutar y sustituir; la manipulacin gentica de plantas permite obtener plantas resistentes a plagas o herbicidas. En conjunto, estas tcnicas han abierto
un inmenso abanico de posibilidades y aplicaciones prcticas en campos tan dispares como la biomedicina, agricultura, ganadera o industria.
Todos estos avances han sido y son en la actualidad posibles en base a los dos
pilares de la ingeniera gentica:
1. El empleo de protenas (enzimas) con capacidad de intervenir sobre los cidos nucleicos (AN) macromolculas de la herencia. Estas protenas constituyen las herramientas de la ingeniera gentica.
2. La universalidad del cdigo gentico que nos permite cruzar las barreras
naturales entre especies, introduciendo y expresando genes de cualquier
organismo en un organismo hospedador no relacionado, en el que pueden
perpetuarse indefinidamente.
LA INGENIERA GENTICA I
157
Herramientas de la ingeniera gentica

Nucleasas de cidos nucleicos
Las nucleasas son enzimas que degradan los AN. En funcin de si actan degradando desde los extremos o desde el interior de la cadena se denominan exonucleasas o endonucleasas respectivamente. Las ms empleadas se describen a continuacin:
ADNasa I
Caractersticas: Endonucleasa inespecfica de ADN de cadena sencilla (ADNcs)
o doble (ADNdc). En presencia de Mg++ produce cortes al azar en ambas cadenas originando mellas o nicks, si se utiliza Mn++ los cortes se producen enfrentados en
ambas cadenas provocando una degradacin del ADN tratado. El corte se realiza en
3 del esqueleto azcar-fosfato dejando extremos 3-OH y 5-fosfato (5-P).
Uso en ingeniera gentica: Esta enzima se emplea para realizar digestiones
totales o parciales de ADN para generar genotecas de genomas completos. Tambin
es muy utilizada para marcaje de fragmentos de ADN junto con la ADN polimerasa en la tcnica de desplazamiento del corte (nick translation).
Exonucleasa III
Caractersticas: Exonucleasa inespecfica de ADNdc que corta en direccin
3 A 5 hasta dinucletido dejando extremos 5P protuberantes. Requiere que el
extremo 3 est sin fosforilar.
Uso en ingeniera gentica: Se utiliza para el marcaje de los extremos 3 de
fragmentos de ADN en combinacin con la ADN polimerasa I que rellena los extremos protuberantes generados por la Exonucleasa III. Tambin se emplea para generar delecciones unidireccionales progresivas de fragmentos de ADNdc.
h Exonucleasa
Caractersticas: Aislada de E. coli infectada por el fago h. Es una exonucleasa
inespecfica de ADNdc que corta en direccin 5 A 3 hasta dinucletido a partir
de extremos 5P generando extremos 3 protuberantes.
Uso en ingeniera gentica: Se utiliza para el marcaje de los extremos 3 de fragmentos de ADN en combinacin con la Transferasa terminal que alarga los extremos protuberantes 3 generados por la h Exonucleasa.
Nucleasa S1
Caractersticas: Es una exonucleasa y Endonucleasa de ADN y ARN de cadena simple en direccin 5 A 3 cortando en 3 dejando extremos 3-OH y 5P.
158
Uso en ingeniera gentica: Se utiliza para eliminar los extremos 5 protuberantes generados por las enzimas de restriccin o fragmentos de ADN o ARN de
cadena simple libres que no estn hibridados a un molde.
Nucleasa Bal31
Caractersticas: Es una exonucleasa sobre ADNdc y endonucleasa sobre
ADNcs. Posee las actividades de la Exo III (3 A 5) y la h Exonucleasa (5 A 3)
pero degrada de forma progresiva.
Uso en ingeniera gentica: Se utiliza para eliminar los extremos 3 o 5 protuberantes generados por las enzimas de restriccin. Puesto que la degradacin del
ADN es estrictamente dependiente de Ca++ es posible controlar la reaccin a diferentes tiempos mediante la adicin de agentes quelantes de Ca++ como EGTA lo cual
hizo de esta enzima la de eleccin cuando se necesitaban generar delecciones progresivas de fragmentos para su posterior secuenciacin, previo relleno de los extremos con el fragmento Klenow de la ADNpol I.
Ribonucleasa A (ARNasa A)
Caractersticas: Es una endonucleasa sobre ARN de cadena sencilla con especificidad de corte en pirimidinas (U y C).
Uso en ingeniera gentica: Se utiliza para eliminar ARN en purificaciones de
ADN y/o protenas, eliminacin de ribosondas no hibridadas y dada su especificidad de corte en U+C, se emplea en la secuenciacin de ARN.
Ribonucleasa H (ARNasa H)
Caractersticas: Es una endonucleasa sobre ARN siempre que se encuentre en
forma de cadena mixta (heterodplex) ADN/ARN. Presenta especificidad de corte
en restos de riboadenina (A).
Uso en ingeniera gentica: El hecho de no degradar ARN de cadenas dobles
o sencillas hace que su empleo fundamental sea la eliminacin del ARN del hbrido ADN/ARN tras la transcripcin reversa previa a la sntesis de la segunda cadena de ADNcopia (ADNc) en la construccin de genotecas.
Enzimas de restriccin
El ADN de las clulas se presenta en forma de molculas inmensas que hay que
fragmentar de manera precisa y reproducible para aislar los pequeos fragmentos
que contienen los genes. Fue a partir del ao 1974, momento en el que se descubrieron las endonucleasas de restriccin, cuando se pudo dividir el ADN de los
organismos en fragmentos discretos relativamente fciles de manejar.
159
Las enzimas de restriccin son protenas, que se encuentran de forma natural en

las bacterias. Suponen un sistema inmunitario rudimentario frente a la infeccin de
las bacterias por fagos (virus bacterianos). El trmino restriccin refiere a que las
enzimas de restriccin degradan el ADN intruso a la vez que protegen el suyo
modificndolo.
Las enzimas de restriccin son endonucleasas capaces de cortar en el interior de
la doble cadena de la molcula de ADN cuando reconocen una secuencia diana de
nucletidos especfica siempre y cuando la diana no tenga modificados por metilacin algunos de los nucletidos que la componen. El corte se puede producir sobre
la diana de reconocimiento o a una cierta distancia de ella.
Hay varios tipos de enzimas de restriccin, denominados Sistemas I, II y III
por sus diferentes caractersticas. Los sistemas I y III no se emplean en ingeniera gentica, se caracterizan porque la secuencia de reconocimiento y la
secuencia de corte estn separadas una distancia variable (entre 24-26 pb en el
caso del sistema III o 1.000 pb en el sistema II) y las secuencias de corte aunque no son al azar no son totalmente especficas. En cualquier caso las enzimas
de restriccin de tipo II son las verdaderas tijeras moleculares de la ingeniera
gentica.
Enzimas de restriccin Tipo II
Las enzimas de restriccin de tipo II se caracterizan porque cortan la molcula de ADN en la misma secuencia diana de reconocimiento. Las secuencias de
reconocimiento son especficas para cada enzima de restriccin y constan de una
corta secuencia de 4 a 10 nucletidos que sirven de referencia para realizar el
corte. Las secuencias reconocidas por estas enzimas son capicas o palindrmicas, es decir, la lectura un sentido (5 A 3) de los nucletidos de la diana en una
cadena idntica a la de la cadena complementaria del ADN leda en ese mismo
sentido (5 A 3).
El corte dentro del ADN se realiza en el extremo 3 del esqueleto azcar-fosfato, liberando fragmentos 5-fosfato y 3-OH. Este dato es muy importante, pues se
trata de extremos que luego podrn ser reparados con ligasas de ADN. En general
la secuencia de reconocimiento es especfica, pero cambiando las condiciones de sal
y sustituyendo Mg++ por Mn++, es posible modificar la actividad de algunas enzimas, obtenindose una especificidad de corte relajada que se denomina actividad
estrella.
Existen enzimas que producen cortes enfrentados en ambas cadenas dentro de la
secuencia de reconocimiento y generan fragmentos con los extremos lisos o romos;
otras sin embargo, realizan cortes quebrados en la secuencia de reconocimiento y
generan extremos protuberantes. Los extremos protuberantes son tambin denominados como cohesivos o adhesivos dado que la complementariedad de bases permite que sean ms fcilmente soldados por accin de ligasas ya que los puentes de
hidrgeno que se forman entre ambos extremos estabilizan el ADN y las ligasas
actan ms eficientemente.
160
La nomenclatura de las enzimas de restriccin hace referencia al gnero y la

especie bacteriana de la que se aislaron inicialmente; as la primera letra indica el
gnero y las siguientes la especie y cepa. Si existen ms enzimas de restriccin en
la especie se numeran con nmeros romanos:
PstI: Providentia stuartii I.
Sau3AI: Staphilococus aureus cepa 3AI
Cuando dos enzimas de restriccin diferentes reconocen, total o parcialmente, la

misma secuencia y cortan en la misma posicin se denominan isosquizmeros.
En principio es posible calcular la frecuencia de corte de una enzima de restriccin en funcin del nmero de nucletidos que constituyen la diana de corte. Para
enzimas que reconocen un tetranucletido la frecuencia de corte sera 44, una vez
cada 256 nucletidos, para un hexanucletido 46, una vez cada 4.096 nucletidos.
Sin embargo estos datos no son reales debido a que el contenido real de GC en relacin a AT no es del 50 % en los ADN y por tanto, la distribucin de las dianas no es
homognea en los genomas.
Actualmente se han identificado unas 150 enzimas de restriccin, la mayora de
ellas disponibles comercialmente como herramienta de biologa molecular. La gran
importancia de estas enzimas radica, como se indic inicialmente, en la capacidad
de cortar de forma precisa, especfica y reproducible molculas de ADN para su
posterior manipulacin.
Polimerasas de cidos nucleicos

Las polimerasas son enzimas que catalizan la formacin de las molculas de AN
a partir de sus unidades correspondientes y un molde para copiar. Hay muchos
pasos en los experimentos de ingeniera gentica que requieren de la participacin
de las polimerasas de los AN: polimerasas de ADN (ADNpol) y de ARN (ARNpol).
El empleo de estas enzimas es vital para la sntesis de ADN o ARN in vitro o crear
sondas con las que localizar luego genes o secuencias de inters.
Todas las polimerasas requieren:
Presencia de Mg++ y nucletidos trifosfato (deoxi- o ribo-) en el medio para su
actividad.
Un molde de cido nucleico (con la nica excepcin de la enzima denominada transferasa terminal) para copiar.
Un cebador, corta secuencia de oligonucletidos hibridado al molde que proporciona el punto de partida de la polimerizacin.
Todas la polimerasas presentan polaridad de sntesis, siempre en la direccin
5 A 3 del ADN a partir de un extremo 3-OH libre.
Las polimerasas ms empleadas en ingeniera gentica se describen brevemente a continuacin:
161
ADN polimerasa I (ADNpol I)

Caractersticas: La enzima funciona con actividad polimerasa y exonucleasa en
direccin 5 A 3 y tiene una actividad exonucleasa correctora de errores 3 A 5.
Uso en ingeniera gentica: La principal utilidad de esta enzima es el marcaje
radiactivo o fluorescente de molculas de ADN por el procedimiento de traslado de
corte (nick translation). El procedimiento se basa en el tratamiento de ADN con una
pequea cantidad de una endonucleasa (ADNasa I) para que se generen pequeos
cortes al azar en la molcula de ADN, estos pequeos cortes proporcionan el extremo de inicio a la ADNpol I. En presencia de Mg++ y deoxinucletidos trifosfatos la
ADNpol I va digiriendo los nucletidos de la cadena por delante del corte en direccin 5 A 3 a la vez que los sustituye por los deoxinucletidos trifosfato del medio.
Uno o varios de estos deoxinucletidos puede ser radiactivo o llevar algn agente
fluorescente, de forma que la molcula de ADN estara marcada para emplearla
como sonda.
Fragmento Klenow de la ADNpol I
Caractersticas: Es una modificacin de la ADNpol I que ha perdido la actividad exonucleasa 5 A 3 y por tanto no puede alargar los cortes en una molcula de
ADN.
Uso en ingeniera gentica: Se utiliza principalmente para el relleno de huecos
internos en molculas de ADN o el relleno extremos cohesivos generados por enzimas de restriccin para hacerlos romos. Es muy utilizada para la sntesis de la
segunda cadena de ADN a partir de un molde de cadena sencilla. Inicialmente se
emple en las reacciones de secuenciacin por el mtodo de los di-deoxinucletidos, en la actualidad se emplea frecuentemente para el marcaje isotpico de fragmentos de ADN con alta actividad especfica empleando cebadores de secuencia
aleatoria de 4-6 nucletidos que hibridan aleatoriamente con ambas cadenas del
ADN a marcar (ramdom priming).
ADN polimerasa de T7 (ADNpol T7) y Secuenasa
Caractersticas: La ADNpol T7 es una polimerasa que se aisla de E. coli infectada por el fago T7. Es la polimerasa de ADN ms eficiente que se conoce y la que sintetiza cadenas ms largas. Posee las actividades exonucleasa y polimerasa 5 A 3 y
la exonucleasa 3 A 5. Sin embargo esta actividad correctora de errores es tan
potente que a veces destruye los fragmentos cebadores si no estn fuertemente apareados con el molde.
Uso en ingeniera gentica: La enzima modificada sin la actividad exonucleasa
3 A 5 se denomina Secuenasa , su elevada procesividad (numero de nucletidos
incorporados cada vez que una molcula de enzima se une al ADN molde) la hacen
la enzima de eleccin en la secuenciacin del ADN.
162
Polimerasas termorresistentes
Caractersticas: Son un conjunto de polimerasas de AN caracterizadas por ser
termoestables y presentar temperaturas ptimas de actividad entre 75-80 C. La
ms conocida es la Taq polimerasa, aislada originalmente de Thermus aquaticus
y en la actualidad obtenida por ingeniera gentica. Otras polimerasas termoestables son la Pfu polimerasa o la Vent polimerasa que polimerizan ADN con menores errores de copia que la Taq. Otra enzima termoestable importante es la Tth
polimerasa que adems de su actividad ADN polimerasa, posee capacidad de
transcripcin reversa: utilizando un molde de ARN y un cebador, es capaz de sintetizar ADN.
Uso en ingeniera gentica: Estas enzimas se emplean en reacciones de secuenciacin y de amplificacin de ADN mediante PCR (-Polymerase Chain Reactionreaccin en cadena de la polimerasa).
Transcriptasas reversas
Caractersticas: Las transcriptasas reversas son enzimas de retrovirus que
sintetizan ADN utilizando ARN como molde siempre y cuando exista un corto
cebador hibridado que proporcione un 3-OH como punto de inicio de polimerizacin.
Las transcriptasas reversas carecen de la actividad exonucleasa 3 A 5 y por lo
tanto cometen bastantes errores de copia (1 nucletido errneo cada 500 incorporados) y poseen una actividad enzimtica ARNasa H que degrada hbridos ADNARN. Las transcriptasas ms empleadas son la AMV polimerasa (del Virus de la
mieloblastosis aviar) y la MMLV polimerasa (del virus de la leucemia murina) en
las versiones comerciales modificadas por ingeniera gentica que han perdido la
actividad ARNasa H.
Uso en ingeniera gentica: Se emplean en la obtencin de ADN copia (ADNc),
a partir de ARN molde. Estas enzimas son fundamentales para la generacin de
genotecas de ADNc.
Transferasa terminal
Caractersticas: Es una polimerasa que cataliza la adicin de deoxinucletidos
a extremos 3-OH libres de molculas de ADN. Prefiere extremos protuberantes
3-OH de cadenas simples o dobles de ADN, pero tambin es capaz de actuar con
extremos romos.
Uso en ingeniera gentica: La enzima se emplea comnmente para aadir colas
de homopolmeros a molculas de vector e inserto que se quieren unir posteriormente usando ADN ligasa.
163
ARNpolimerasas
Caractersticas: Son enzimas que reconocen secuencias especficas en el ADN
llamadas promotores y en presencia de ribonucletidos trifosfatos y Mg++ catalizan
la sntesis de ARN complementario a una de las hebras del ADN molde. Requieren
de ADN de doble cadena (ADNdc) como molde y no necesitan ningn cebador,
siendo el ribonucletido 5 de inicio un ribonucletido trifosfato. Las ARN polimerasas ms empleadas son las ARN polimerasas de los fagos SP6 y T7 debido a que
sus secuencias promotoras son muy potentes y la transcripcin a ARN desde estos
promotores es muy eficiente.
Usos en ingeniera gentica: Estas enzimas se emplean junto con vectores que
poseen sus secuencias promotoras para realizar transcripcin in vitro (obtencin de
ARN a partir de un ADN incluido en un vector de expresin. La transcripcin in
vitro se puede emplear para marcaje homogneo, isotpico o no isotpico, de un
fragmento de ARN (ribosonda) o para realizar una traduccin in vitro a protenas de
los ARN sintetizados u obtener cortos ribonucleticos que sirvan como ARN antisentido para bloquear transcripcin de un fragmento de ADN.
Poli-A polimerasas
Caractersticas: Son enzimas que aaden colas de AMP a los extremos 3-OH
de los ARNs a partir de ATP y en presencia de Mg++ y Mn++. No necesitan molde ni
cebador.
Usos en ingeniera gentica: Tanto las eucariticas como las procariticas se
emplean para aadir colas de poli-A a los extremos 3 de ARN para obtener ARN
poliA+ y retrotranscribirlos a ADNc. Se pueden obtener de esta forma genotecas de
ADNc a partir de ARN total. El empleo de ATP marcado isotpicamente o con fluorocromos permite obtener ribosondas marcadas en el extremo 3.
Enzimas de modificacin de cidos nucleicos

Ligasas de ADN
Caractersticas: Las ligasas de ADN catalizan, la formacin de un enlace fosfodister entre el extremo 3-OH y el extremo 5-P de molculas de ADN mediante la hidrlisis de rATP a rAMP y pirosfofato. La ms empleada comercialmente es
la ligasa del fago T4 (T4 ligasa) que tambin puede ligar ARN. La reaccin de ligacin es ms eficiente en la unin de molculas de ADN con extremos cohesivos
pero tambin es factible entre molculas de extremos romos.
Usos en ingeniera gentica: La ligasa se emplea en la reparacin de cortes o
mellas en la molculas de ADN de doble cadena, ya sean lineales o circulares. Sin
embargo el principal uso de las ligasas ha sido su empleo como pegamentos mole-
164
culares en la unin de fragmentos de ADN generados por las enzimas de restriccin

para experimentos de clonaje.
Quinasas de cidos nucleicos
Caractersticas: Las quinasas catalizan la transferencia del grupo fosfato en a
del rATP a extremos 5-OH libre de mltiples sustratos, ADN y ARN de cadenas
simples y dobles o oligonucletidos sintticos. La enzima comercialmente usada es
la quinasa del fago T4 (T4 quinasa). Esta enzima es capaz tambin de provocar el
recambio del grupo fosfato de un extremo 5-P.
Usos en ingeniera gentica: La quinasa posee mltiples usos, se emplea en el
marcaje isotpico de extremos 5-P de ADN o ARN empleando [a-32P] rATP estos
fragmentos marcados en 5 se emplean como sondas o para secuenciacin de ADN
o ARN o simplemente como marcadores radiactivos de peso molecular para electroforesis. Otro importante uso es la fosforilacin de extremos 5-OH de fragmentos de ADN (normalmente generados por las enzimas de restriccin) para poder ser
unidos por las ligasas.
Fosfatasas de cidos nucleicos
Caractersticas: Las fosfatasas catalizan la eliminacin del grupo fosfato terminal de los extremos 5-P de mltiples sustratos, ADN y ARN de cadenas simples
y dobles o oligonucletidos sintticos. La enzima comercialmente usada es la fosfatasa alcalina.
Usos en ingeniera gentica: Las fosfatasas se emplean en la preparacin de
fragmentos de ADN que se desea que no sean sustratos de las ligasas o en el marcaje isotpico de extremos 5-P de ADN o ARN empleando [a-32P] rATP, primero
se tratan con fosfatasas para eliminar el fosfato terminal fro y luego se marcan empleando la quinasa.
Procedimientos de ingeniera gentica

A continuacin se describen una serie de procedimientos y tcnicas bsicas que
se emplean habitualmente en los laboratorios de biologa molecular para la obtencin, caracterizacin y modificacin de los AN.
Mtodos de obtencin purificacin de AN

El primer paso para la caracterizacin y aislamiento de un gen de inters lleva
asociado el aislamiento y purificacin fsica del ADN o el ARN que codifica por l.
No existe un mtodo general y perfecto para el aislamiento y purificacin de los
165
AN, sino que los mtodos se emplean en funcin de diversos factores condicionantes:
Fuente de obtencin, (organismos procariticos y/o eucariticos).
Tipo de cido nucleico: ARN o ADN.
Propsitos preparativos o analticos del cido nucleico purificado.
En cualquier caso, en el aislamiento y purificacin de los AN se siguen una serie
de pasos secuenciales:
1. Ruptura celular. En funcin de la fuente biolgica de los AN podemos
seguir distintos procedimientos:
Cultivos bacterianos: El paso inicial suele ser la concentracin del cultivo
bacteriano, normalmente por centrifugacin. Una vez obtenidas las clulas
bacterianas los mtodos de ruptura empleados pueden ser mecnicos
(mediante homogeneizacin con abrasivos como almina o procesos sucesivos congelacin/descongelacin) qumicos (mediante el empleo de detergentes inicos como el SDS o neutros como el Tritn X-100 o Nonidet P-40)
o enzimticos (mediante el empleo de una solucin isotnica de lisozima
que degrada las paredes bacterianas).
Virus en suspensin: Tras un paso inicial de concentracin por centrifugacin el mtodo ms empleado es el de la degradacin de las envueltas de
los virus con detergentes y tratamiento con proteasas de baja especificidad
como la proteinasa K.
Cultivos celulares y tejidos: En el caso de tejidos el paso previo es la disgregacin celular mediante tratamiento enzimtico (con colagenasa) o
mecnico (ruptura en mortero con nitrgeno lquido) seguido de una
homogeneizacin en un homogenizador. El tratamiento de eleccin depende de la consistencia del tejido de partida (tejido animal o vegetal) y la cantidad de partida. En el caso de cultivos celulares, el paso previo es la obtencin de la suspensin celular, bien mediante raspado directo de las clulas
sobre las placas de cultivo, bien por tratamiento enzimtico con tripsina.
Una vez obtenidas las suspensiones celulares la rotura de las clulas se realiza por tratamiento con detergentes inicos o no inicos o directamente
por la adicin de solventes orgnicos.
2. Fraccionamiento celular. Una vez obtenido el homogeneizado se procede a
la separacin y eliminacin de los lpidos, azcares y protenas de los AN. El
fraccionamiento utilizado de forma habitual implica una digestin previa
con proteinasa K seguida de extracciones empleando solventes orgnicos en
los cuales no son solubles ni protenas ni AN La extraccin en fenol de los
homogeneizados seguida de centrifugaciones ha sido el mtodo tradicional
de obtencin de los AN, fundamentalmente ADN.
La eleccin del procedimiento de fraccionamiento depender del propsito final al cual se destine el cido nucleico y el tipo del mismo; por lo gene-
166
ral si es ADN de alto peso molecular se suelen emplear tratamiento suaves

(sin agitar o pipetear) que evitan la rotura de las molculas de ADN, este
ADN es susceptible de ser empleado en la construccin de genotecas a partir de ADN genmico. En el caso de ARN se han empleado soluciones que
llevan agentes caotrpicos como el isotiocianato de Guanidina o cloruro de
guanidina que desnaturalizan y destruyen las ARNasas que pudieran daar al
ARN a purificar.
Al final de esta etapa de fraccionamiento se suele obtener una fraccin
acuosa con los AN y algunas protenas contaminantes. Es posible ya el aislamiento directo de ambos AN mediante precipitacin llevando la fase acuosa a una determinada concentracin de sal y aadiendo un alcohol (etanol o
isopropanol). La concentracin de sal, los volmenes de alcohol y la temperatura determinan una precipitacin selectiva de uno o ambos AN, que se
recogen posteriormente por sedimentacin tras una etapa de centrifugacin.
Normalmente el ADN precipita en forma de hebras mientras que el ARN lo
hace como copos.
A la etapa de sedimentacin le sucede una etapa de secado y resuspensin
en una solucin adecuada, a ser posible estril y libre de nucleasas. El ADN
as obtenido es susceptible de ser digerido por enzimas de restriccin o modificado por otras enzimas de cidos nucleicos.
3. Purificacin. Si el propsito del ADN es analtico (secuenciacin) o si se va
a utilizar para introducirlo en clulas (tranfeccin) o se van a aislar distintos
tipos de molculas (mARN de ARN totales) se suelen llevar a cabo procesos
de purificacin adicionales. Estos procesos de purificacin se basan en dos
tipos de tcnicas:
Centrifugacin: Se emplea la sedimentacin en gradientes de sedimentacin alcalinos de sacarosa (que informan acerca de la conformacin de las
molculas de ADN) o en gradientes de densidad de cloruro de cesio (CsCl).
Este ltimo mtodo es un mtodo de purificacin basado en la gran diferencia de densidad de las protenas y el ADN en un gradiente de CsCl. El ADN
obtenido por este mtodo es de gran pureza, adems, si el gradiente de densidad generado con el CsCl se realiza en presencia de bromuro de etidio, es
posible separar molculas de ADN circulares intactas de molculas de ADN
circulares con cortes en alguna de las cadenas. Esta tediosa tcnica se ha
empleado muy frecuentemente en el pasado para la obtencin de plsmidos
(vectores transmisin de informacin gentica)
Cromatografa: Actualmente se emplean microcolumnas de cromatografa, disponibles comercialmente, preempaquetadas con distintas matrices
capaces de retener y eluir selectivamente los distintos AN de banda simple o
doble. En otros casos el tratamiento de las soluciones de AN con pequeas
bolitas modificadas qumicamente permite la purificacin de subpoblaciones
de molculas de ADN o ARN.
167
Hoy en da en los laboratorios de biologa molecular se dispone de un catlogo

muy amplio de productos especficamente diseados para el objetivo perseguido
por el investigador y en funcin de sus necesidades. La mayora de estos productos
no emplean los disolventes orgnicos anteriormente tratados y se basan en el
empleo de columnas desechables que suelen ahorrar tiempo de procesamiento y rinden el producto especfico buscado: ARN poliadenilado, ADN circular o lineal, de
doble cadena o cadena sencilla.
Mtodos de deteccin de cidos nucleicos:

Mtodos de deteccin-cuantificacin directos
Una vez obtenidos los AN el siguiente paso lgico es la cuantificacin de los
mismos; para ello se han empleado tres tipos bsicos de valoracin de los AN:
Mtodos biolgicos: Son mtodos que implican que los AN obtenidos sean biolgicamente activos para poder someterlos a reacciones enzimticas. Estos mtodos
no suelen ser muy utilizados para cuantificacin, por citar algn ejemplo: la valoracin de la eficiencia de transformacin (en un determinado rango de concentracin de ADN existe una relacin lineal entre colonias de transformantes que toman
el ADN y la concentracin del ADN empleado). En el caso de ARN mensajero, la
eficiencia de sntesis in vitro de una protena es, en determinadas condiciones, una
relacin directa de la cantidad de ARN mensajero del ensayo.
Mtodos fsicos: Los mtodos fsicos se basan fundamentalmente en la medida
espectrofotomtrica de la cantidad de radiacin ultravioleta (UV) absorbida por las
bases nitrogenadas de los AN. Este mtodo es el ms empleado si la muestra es relativamente pura (sin cantidades significativas de contaminantes tales como protenas, fenol o agarosa). Las determinaciones se realizan midiendo la absorcin de la
muestra a dos longitudes de onda UV a 260 y 280 nm. La relacin entre la absorcin a ambas longitudes de onda indica (DO260/DO280) determina la pureza de la
muestra: Muestras puras de ADN o ARN presentan valores de DO260/DO280 de 1,8
y 2,0 respectivamente, valores inferiores indican una contaminacin de la muestra
con protena o fenol. La lectura de absorcin a 260 nm indica la concentracin de
AN en la muestra, un valor de DO260 = 1 corresponde a 50 g/mL de ADNdc, 40
g/mL de ADNcs o ARN y 20 g/mL de oligonucletidos de cadena simple.
El principal inconveniente de esta tcnica radica el bajo grado de sensibilidad y
que no es posible cuantificar por separado ADN, ARN y oligonucletidos.
Mtodos qumicos: Se basan en reacciones de los AN con reactivos adecuados
que originan complejos coloreados o fluorescentes. Tradicionalmente se emplearon
mtodos especficos de baja sensibilidad como el del orcinol para el ARN (el orcinol en presencia de FeCl2 reacciona con la ribosa del ARN y origina un complejo de
color verdoso) o la difenilamina para el ADN (la difenilamina reacciona con las 2deoxipentosas del ADN y genera, en medio cido, un color azulado); sin embargo
168
los mtodos ms empleados actualmente emplean agentes que permiten cuantificar

cantidades del orden de pg (10-12 g) y ng (10-9 g). Los agentes ms empleados son
el bromuro de etidio, Sybr Green, azul de metileno y naranja de acridina:
Bromuro de etidio: La determinacin se basa en valorar la fluorescencia emitida
por el bromuro de etidio intercalado entre las bases nitrogenadas del ADN o ARN al
irradiar la muestra con luz UV de 300 nm de longitud de onda. Puesto que la cantidad de fluorescencia emitida es proporcional a la masa total del ADN, la cantidad de
ADN en una muestra puede ser estimada comparando el rendimiento de fluorescencia de la muestra con una serie de estndares de ADN de concentracin conocida.
Mediante este mtodo es posible detectar visualmente concentraciones entre 1-5 ng
totales de ADNdc. Dado que la afinidad del bromuro de etidio por AN de cadena sencilla, es relativamente baja comparada con la afinidad por AN de cadena doble, la
sensibilidad para la cuantificacin de ADNcs y ARN es tambin menor.
Sybr Green: El mecanismo de actuacin del fluorocromo Sybr Green es similar al del bromuro de etidio pero es menos carcinognico que l y el nivel de sensibilidad es mucho mayor (25-100 veces ms sensible). El fluorocromo es capaz de
unirse a ADNdc, ADNcs y ARN y slo manifiesta fluorescencia cuando est unido
al AN y se irradia la muestra con luz UV. La sensibilidad de este mtodo alcanza
entre 20 y 60 pg de ADNdc y 1-2 ng para ARN, ADNcs y oligonucletidos.
Azul de metileno y naranja de acridina: Los niveles de sensibilidad de estos dos
reactivos estn muy lejos de los dos anteriores (40-200 ng de ADNdc para el azul
de metileno 50-100 ng de ADNdc y ADNcs respectivamente, para el naranja de
acridina), sin embargo, el hecho de tratarlos se debe a que el azul de metileno no es
txico y el naranja de acridina permite distinguir entre molculas de cadena sencilla (presentan fluorescencia en color rojo) y cadena doble (que presentan fluorescencia en color verde.).
La mayora de estos colorantes qumicos no solo se emplean para cuantificar los
AN en solucin, sino que son ampliamente utilizados para visualizar las molculas
de los mismos cuando se separaran por electroforesis en gel como veremos ms
adelante.
Mtodos de deteccin por hibridacin: Southern y Northern
Las principales tcnicas de deteccin/identificacin de AN se basan en la complementariedad de bases, propiedad qumica que hace que dos cadenas simples de
cidos nucleicos se unan o apareen entre s al establecerse puentes de hidrgeno
entre las bases nitrogenadas complementarias de cada cadena. Esta propiedad hace
que dos cadenas complementarias de un AN (ADNdc o ARNdc o hbrido
ADN/ARN) puedan ser separadas individualmente (desnaturalizadas) mediante
distintos tratamientos y luego vuelvan a unirse de forma espontnea al cesar el proceso de desnaturalizacin.
Las tcnicas que aprovechan esta propiedad se denominan tcnicas de hibridacin, las principales son el Southern y el Northern. La idea es obtener un fragmen-
169
to de ADN (denominado sonda) o ARN (ribosonda) de cadena sencilla marcado de

alguna forma (isotpica, fluorescente o enzimticamente), que, en presencia de una
poblacin de molculas de ADN o ARN, sea capaz hibridar o aparearse con secuencias complementarias presentes en esa poblacin de AN. La marca de la sonda
hibridada nos identificar la molcula de inters de la poblacin total.
Las tcnicas de hibridacin normalmente requieren de un paso de separacin e
inmovilizacin de las poblaciones o fragmentos de cidos nucleicos previo a la
identificacin con sondas. Normalmente el paso suele ser la electroforesis.
Electroforesis de AN. Los cidos nucleicos sometidos a electroforesis van a
migrar en el campo elctrico generado hacia el ctodo (b+) debido a su carga neta
negativa. Su velocidad vendr determinada por su tamao molecular y el tamao de
poro determinado por la composicin de la matriz. La electroforesis a travs de
geles de agarosa o poliacrilamida es un mtodo estndar de separacin, identificacin y purificacin de fragmentos de AN principalmente ADN. La localizacin de
fragmentos de ADN o poblaciones de ARN dentro del gel puede ser determinada
por tincin del gel con un agente intercalante de los AN como son el bromuro de etidio o Sybr Green; as, bandas discretas de ADN o ARN pueden ser identificadas
mediante visualizacin del gel teido expuesto a la luz ultravioleta. Si fuera necesario, es posible aislar las molculas de AN que componen una banda discreta y
recuperarlas del gel para su empleo en variedad de aplicaciones.
Los geles de agarosa y poliacrilamida se pueden emplear en multitud de tamaos, grosores y porosidades y desarrollar la electroforesis en diferentes configuraciones. La eleccin depende principalmente del tamao de los fragmentos a separar:
Los geles de poliacrilamida en vertical son el mtodo de eleccin ms efectivo en la separacin de pequeos fragmentos de ADN (5 A 500 pb pares de
bases). El poder de resolucin es tan alto, que es posible separar fragmentos de ADN que difieren en tamao en 1 pb, como ocurre en el caso de la
secuenciacin de ADN. Los principales inconvenientes de los geles de poliacrilamida son: la neurotoxicidad de la acrilamida y la dificultad de preparacin y manejo.
Los geles de agarosa poseen un poder de resolucin mucho menor pero presentan a su favor una amplio rango de separacin para fragmentos de alto peso
molecular (100 pb A 50 Kpb). Normalmente los geles de agarosa se desarrollan en horizontal y sumergidos en el tampn de electroforesis.
Existen una serie de factores que afectan la migracin de los AN sometidos a
electroforesis, entre todos ellos destacaremos:
Tamao o peso molecular: Molculas lineales de AN de cadena doble migran
a travs de la matriz del gel a velocidades inversamente proporcionales al
logaritmo decimal de su peso molecular en pb. La molculas de alto peso
molecular migran ms lentamente que las de bajo peso molecular debido al
efecto de filtrado ejercido por el tamao de poro de la matriz del gel.
170
Porosidad de la matriz del gel: Un fragmento lineal de AN migra a diferente velocidad en funcin del tamao de poro del gel. Usando geles de diferentes concentraciones de agarosa o poliacrilamida es posible resolver distintos rangos de tamaos de AN.
Conformacin del AN: La conformacin de las molculas tambin influye
sobre la velocidad de migracin, en presencia de bromuro de etidio las molculas lineales son las ms lentas, a continuacin las molculas circulares con
cortes y las ms rpidas son las molculas circulares cerradas.
Tcnicas de Southern y Northern. En realidad se trata de una nica tcnica de
hibridacin con sondas con dos variaciones: El Southern trata de identificar unas
molculas de ADN concretas en una poblacin general de molculas de ADN separadas por electroforesis e inmovilizadas en un filtro mediante el empleo de una
sonda especfica (ya sea sonda o ribosonda). La tcnica del Northern trata de realizar el mismo objetivo pero sobre una poblacin de molculas de ARN.
En resumen, la tcnica de Southern identifica por hibridacin molculas especficas de ADN mientras que la tcnica de Northern identifica por hibridacin molculas especficas de ARN.
Ambas tcnicas se basan en la capacidad de adsorcin selectiva que tienen
las membranas de nitrocelulosa para retener especficamente ADN o ARN de
cadena sencilla. Si bien en un principio fue la nitrocelulosa el soporte empleado, en la actualidad existe una amplia oferta comercial de membranas adaptadas a la fijacin especfica de AN de cadena sencilla o doble, diseadas para
ADN y/o ARN que, mediante la unin covalente de las molculas inicialmente adsorbidas, permiten su empleo sucesivas veces. Las ms utilizadas en
la actualidad son las membranas de nailon cargadas positivamente. Aunque
cada fabricante refiere las condiciones para una retencin ptima del AN con
su membrana, el procedimiento general se describe a continuacin:
1. En un primer paso la poblacin de molculas se separa por electroforesis,
esta poblacin puede variar desde un ADN genmico de alto peso molecular
digerido con enzimas de restriccin hasta el ARN total de un tejido o cultivo
celular. En el caso de electroforesis de ARN, sta se realiza en condiciones
desnaturalizantes (en presencia de formaldehdo o glioxal) de forma que el
ARN migre en el gel como molculas lineales en funcin slo de su peso
molecular.
2. Tras la electroforesis, el gel, conteniendo las distintas poblaciones de AN
separadas por peso molecular, se somete a un tratamiento desnaturalizante de
forma que todas las molculas sean de cadena sencilla. Este tratamiento se
suele realizar con una solucin de alta sal y con hidrxido sdico, despus
se neutraliza el gel en condiciones de alta sal para evitar que las cadenas desnaturalizadas por accin del hidrxido sdico vuelvan a hibridar entre s. En
el caso del ARN no es necesario este tratamiento desnaturalizante.
3. El siguiente paso es la transferencia de las molculas de AN desnaturalizadas
desde el gel de electroforesis hasta la membrana de nitrocelulosa o nailon.
171
Existen tres mtodos de transferencia bsicos, a eleccin en funcin de las

caractersticas de las membranas a emplear, tipo de gel y AN a transferir:
Capilaridad: Fue el mtodo empleado originalmente. En este mtodo los
fragmentos de AN son transportados desde el gel hasta el filtro mediante
un flujo de lquido que es mantenido por la accin capilar ejercida por un
bloque de papel absorbente. Obviamente, la velocidad de transferencia es
funcin del tamao de poro del gel y del tamao molecular de los AN: a
menor tamao molecular mayor movilidad. Normalmente las transferencias por capilaridad se realizan durante una noche (12-15 horas).
Electrotransferencia: Es un mtodo ms rpido que la capilaridad que se
basa en transferir las molculas de AN desde el gel hasta la membrana a
travs de un campo elctrico empleando un tampn de transferencia. Este
sistema requiere habitualmente de un sistema de enfriamiento del tampn
ya que se genera bastante calor en la transferencia. Este mtodo es el de
eleccin para transferencias desde geles de poliacrilamida y se lleva a
cabo normalmente entre 2-3 horas.
Vaco: La transferencia por vaco es extremadamente ms rpida y eficiente que la capilaridad. En este mtodo, el gel es puesto en contacto
directo con el filtro y ambos depositados sobre una base porosa conectada a una cmara de vaco. Un contenedor con tampn de transferencia que
es situado encima del gel, proporciona la solucin que arrastra los AN
desde el gel hasta el filtro al ser absorbido por el vaco de la cmara inferior. La transferencia se realiza entre 30 minutos y una hora.
4. Una vez obtenido el filtro o membrana con la poblacin de molculas de AN
separadas y adheridas, el siguiente paso consiste en identificar aquellas molculas que tienen algn inters, para ello es necesario disear una sonda que
sirva como anzuelo molecular para pescar, mediante hibridacin, esa
poblacin de molculas. La dificultad tcnica reside en cmo disear la
sonda y prepararla para nuestros propsitos. Existen diferentes abordajes:
Si lo que se persigue es identificar un gen de secuencia no conocida an,
es posible emplear como sonda un fragmento del gen homlogo de una
especie relacionada.
Si se conoce la secuencia de aminocidos de la protena que codifica es
posible deducir mediante la equivalencia entre codn (triplete de nucletidos que codifica por un aminocido) y aminocido, la secuencia de
nucletidos que posee el gen en su parte codificante y poder disear y sintetizar sondas ARN que tengan la secuencia complementaria para capturar el fragmento que contenga el gen.
En el caso de disponer de informacin de la secuencia de nucletidos del
gen el procedimiento es igual al anterior: diseo y sntesis de fragmentos
de cadena simple de ADN o ARN que tengan la secuencia complementaria del gen para emplearlos como sonda.
172
En lo referente a la preparacin de la sonda, la eleccin de la naturaleza

(sonda de ADN o ARN), la longitud de la misma y el tipo de marcaje (isotpico, fluorescente o enzimtico, etc.) depende de cada caso, pero en general
la preparacin de la sonda se realiza por marcaje in vitro utilizando las enzimas anteriormente descritas y los procedimientos de relleno de extremos,
nick translation, marcajes terminales, etc.
5. Para finalizar, una vez se dispone de la sonda marcada y las poblaciones de AN
inmovilizadas en el filtro, los pasos finales se destinan a lograr que las molculas de sonda busquen e hibriden con las molculas de AN que poseen la
secuencia complementaria. La hibridacin se lleva a cabo en recipientes hermticos, (bolsas selladas o tubos cerrados), a elevada temperatura que ponen en
contacto el filtro con el AN y una solucin de hibridacin que contiene las
molculas de sonda y una serie de aditivos que optimizan y favorecen la hibridacin. La temperatura a la cual se realiza el proceso de hibridacin es un parmetro crtico ya que va a determinar la formacin del hbrido especfico entre
la sonda y las molculas de AN diana. Una temperatura demasiado baja producir hibridaciones inespecficas por apareamientos parciales de la sonda con
fragmentos que slo sean complementarios con alguna regin de la sonda.
Una temperatura demasiado alta evitar la hibridacin entre la sonda y el AN.
6. Pasado el tiempo de hibridacin se procede a la identificacin del AN que ha
hibridado con las molculas de sonda, para ello se lava el filtro para eliminar
las molculas de sonda que no estn completamente hibridadas a su AN complementario y se procede a revelar la seal portada por la sonda:
Si el marcaje de la sonda es isotpico o fluorescente, la energa de la
radiacin o fluorescencia se utiliza para impresionar pelculas autorradiogrficas, de forma que una vez expuesto el filtro con la pelcula y revelada sta es posible identificar las bandas hibridadas al aparecer stas como
bandas de color gris o negro sobre un fondo claro.
Si el marcaje de la sonda es enzimtico, el revelado puede ser directo
sobre el mismo filtro, utilizando algn sustrato colorante que reacciona
con la enzima de la sonda y permite la visualizacin o emite quimioluminiscencia que es detectada, de forma indirecta, mediante una pelcula
autorradiogrfica.
Mtodos de secuenciacin de cidos nucleicos

La variabilidad de las molculas de los AN no radica en su estructura ni en la
diversidad de sus componentes, sino en el orden secuencial de los cuatro nucletidos constituyentes de sus molculas (A, G, C y T para el ADN y A, G, C y U para
el ARN). Dado que diferencias de un solo nucletido en una secuencia pueden
representar un enorme cambio en la protena codificada, el ltimo paso en el conocimiento de los AN reside en la determinacin de su secuencia constituyente.
173
Secuenciacin del ADN

Existen dos tcnicas bsicas rpidas para obtener la secuencia correcta de un
ADN: secuenciacin por el mtodo de degradacin qumica y secuenciacin por el
mtodo enzimtico. Aunque diferentes en el abordaje ambos mtodos comparten
algunos puntos:
Es necesario el marcaje (isotpico o fluorescente) de las molculas a
secuenciar.
Es necesario generar una poblacin de molculas de ADNcs marcadas en un
extremo cuyo tamao molecular difiera nicamente en un solo nucletido.
Esta poblacin de molculas puede ser separada en sus elementos constituyentes, que difieren en una sola base, mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida. El orden de los nucletidos en el ADN
puede ser ledo directamente de la imagen del gel obtenida por autorradiografa o por un sistema automtico de lectura asistida por computador.
Mtodo de secuenciacin por degradacin qumica: Fue descrito inicialmente
por Maxam y Gilber en 1977 y modificado en 1980. El mtodo implica un marcaje de la molcula a secuenciar en uno de sus extremos. Este marcaje terminal se
lleva a cabo en los extremos 5 P mediante la accin de la enzima T4 polinucletido
quinasa que incorpora un grupo radiactivo 5[a32P o a35S]. Como el marcaje terminal se verifica en ambas cadenas del ADNdc es necesario separarlas para la secuenciacin de cada una individualmente (mediante el corte con una enzima de restriccin por ejemplo). El marcaje terminal genera de esta forma una poblacin de
molculas idnticas marcadas en su extremo 5. El siguiente paso es separar la
poblacin en cuatro muestras que se sometern, por separado, a una degradacin
qumica especfica para una base o tipo de base (pricas: A+G o pirimidnicas
T+C). Las condiciones de reaccin con los reactivos especficos son tales que slo
se permita una modificacin de una(s) base(s) por molcula. De esta forma distintas molculas, para un mismo tratamiento, sern modificadas en diferentes puntos
susceptibles de degradacin. Se emplean cuatro tipos de reactivos especficos, el
primero modifica los residuos de guanina (G), el segundo modifica las purinas: adenina (A) y guanina (G) (A+G), el tercer reactivo modifica los residuos de timina (T)
y el ltimo ataca las citosinas (C). El tratamiento final de estas molculas con otro
reactivo (piperidina) rompe la cadena por la base modificada. Cada tratamiento
individual ha generado una poblacin de molculas que poseen un extremo 5 terminal comn marcado y se alargan hasta el punto en donde la base especfica fue
modificada. Las molculas obtenidas por los cuatro tratamientos se separan mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida cargando cada reaccin en pocillos contiguos. La exposicin del gel seco a una pelcula de autorradiografa hace que se obtenga una escalera decreciente de fragmentos radiactivos que
permiten la lectura secuencial de los nucletidos modificados desde el extremo
inferior del gel (representado por el nucletido ms prximo al extremo 5 marcado) hasta la parte superior del gel (que representa los extremos ms alejado del mar-
174
caje terminal). Este mtodo de secuenciacin cuando est optimizado permite la

lectura directa de fragmentos de unos 250 nucletidos como mximo, pero presenta una gran ventaja: la secuenciacin es directa sobre molculas de ADN originales,
a diferencia del mtodo enzimtico que la secuencia se determina a partir una copia
generada del fragmento molde a secuenciar.
Mtodo de secuenciacin enzimtica: Fue descrito inicialmente por Sanger en
1977. Es conocido como mtodo de terminacin de cadena por dideoxinucletidos
trifosfatos (ddNTPs). El mtodo se basa en obtener una poblacin de molculas
marcadas sintetizadas a partir del ADN molde del cual queremos obtener la secuencia, para ello se necesita un cebador que proporcione el extremo 3-OH libre para
la sntesis del ADN por la accin de una polimerasa. Este oligonucletido cebador
suele ser especfico y complementario de una secuencia de localizacin concreta en
el fragmento del ADN molde a secuenciar o prxima a l en el vector de secuenciacin. Las enzimas empleadas para la sntesis del ADN que vamos a marcar
radiactivamente (normalmente usando _ 35S dATP) son el fragmento Klenow de la
ADNpol I o ms frecuentemente la Secuenasa. Al igual que con el mtodo de
secuenciacin qumica, el ADN a secuenciar se divide en cuatro muestras y en cada
una individualmente se llevarn a cabo reacciones especficas para cada base (A, T,
G, C). Las reacciones de secuenciacin individuales se llevan a cabo en dos pasos:
En el primer paso el cebador se hibrida con el ADN molde y se inicia la sntesis
del ADN complementario hasta una distancia determinada del punto de hibridacin,
esta sntesis se lleva a cabo en presencia de los cuatro, dNTPs incluyendo el _ 35S
dATP marcado isotpicamente.
En el segundo paso se incorpora a cada reaccin una pequea cantidad de un
dideoxirribonucletido anlogo de la base especfica que queremos identificar, as
en la muestra de identificacin de la adenina (A) se aade dideoxirriboadenosina trifosfato (ddATP), a la muestra de la citosina se le aade dideoxirribocitosina trifosfato (ddCTP) y lo mismo en las muestras restantes, ddTTP y ddGTP. La adicin de
los ddNTPs provoca la terminacin de las cadenas que estaban siendo elongadas
cuando incorporan el ddNMP. Los dideoxirribonucletidos, al carecer de grupos
-OH tanto en el carbono 2 como en el 3 de la ribosa, imposibilitan el crecimiento
de la cadena en la que se han incorporado y se paraliza su sntesis.
El resultado final en cada muestra es una poblacin de fragmentos, de tantos
tamaos como unidades de la base en concreto existan en la secuencia. Los fragmentos generados se cargan y separan por electroforesis, como en el caso anterior,
y la secuencia se lee directamente por autorradiografia del gel de igual forma. Este
mtodo permite leer por encima de 300 nucletidos.
Mtodos de secuenciacin automtica del ADN

La incorporacin de la informtica y la microelectrnica al campo de la secuenciacin y la carrera por la obtencin de la secuencia completa del genoma humano
175
han llevado al desarrollo de sistemas automatizados para obtener y analizar la

secuencia de bases de cualquier ADN. Existen dos sistemas bsicos de secuenciacin automtica:
Secuenciacin por hibridacin: Microchips de ADN. Es un mtodo, actualmente en desarrollo, basado en utilizar oligonucletidos sintticos de secuencia
conocida inmovilizados en un soporte de vidrio modificado o polipropileno que permiten la hibridacin y deteccin de fragmentos de ADN marcados (con fluorocromos o isotpicamente) de secuencia desconocida. Un ordenador, con el software
apropiado se encarga de la lectura del microchip de ADN y determina la secuencia
del ADN.
Secuenciacin automtica con fluorocromos: Es una adaptacin del mtodo de
secuenciacin enzimtica que permite eliminar el marcaje radiactivo y automatizar
las fases de manipulacin del gel y lectura de la secuencia. Las reacciones de
secuenciacin se realizan mediante la tcnica de PCR. El marcaje de la poblacin
de molculas generada por elongacin del ADN molde se realiza de dos formas:
1) Marcaje terminal de las cadenas terminadas, cada uno de los cuatro dideoxirribonucletidos de terminacin de cadena lleva conjugado un fluorocromo diferente. Esta estrategia ha sido utilizada por la empresa Celera en la secuenciacin del
genoma humano.
2) Marcaje de cebadores. Las molculas de cebadores de cada reaccin se marcan con un nico fluorocromo o bien con diferentes tipos de fluorocromo. En la primera opcin, cuando las cadenas han sido terminadas por los dideoxirribonucletidos cada reaccin se lee mediante un rayo lser en pocillos separados de un gel de
electroforesis. El rayo lser manda la informacin del tamao del fragmento detectado en cada pocillo a un ordenador, que se encarga de ordenar los fragmentos y
proporcionar la secuencia. En la segunda opcin, como los cebadores estn marcados de forma diferencial con diferentes fluorocromos, las cuatro reacciones se cargan en un nico pocillo y son ledas directamente por el rayo lser. Como los espectros de emisin de cada fluorocromo son distintos el lser enva directamente al
ordenador informacin de la secuencia a medida que los fragmentos, con diferentes
pesos moleculares, pasan por el detector. Con estos mtodos de secuenciacin rpida es posible determinar un total de unas 600 bases con fiabilidad.
Es posible utilizar tambin el mtodo de marcaje con fluorocromos para realizar de una forma automatizada la secuenciacin por degradacin qumica. La nica
diferencia es que son las molculas originales de ADN las que resultan marcadas
con el/los fluorocromo/s.
Secuenciacin del ARN
Al igual que en la secuenciacin del ADN existen las mismas tcnicas rpidas
para obtener la secuencia correcta de un ARN: secuenciacin por el mtodo de
degradacin qumica y secuenciacin por el mtodo enzimtico. Las consideraciones establecidas para la secuenciacin del ADN son tambin vlidas aqu: el mar-
176
caje (isotpico o fluorescente) de las molculas a secuenciar y la generacin una

poblacin de molculas de ARN marcadas en un extremo cuyo tamao molecular
difiera nicamente en un solo nucletido que se resuelve posteriormente en sus elementos constituyentes mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida. El orden de los nucletidos en el ARN es establecido de la lectura directa de una autorradiografa del gel.
Mtodo de secuenciacin por degradacin qumica: Se procede al marcaje 5
terminal de la molculas de ARN mediante la accin de la enzima T4 polinucletido
quinasa que incorpora un grupo radiactivo 5[a32P o a35S]. El siguiente paso es separar la poblacin en cuatro muestras que se sometern, por separado a una degradacin qumica especfica para una base o tipo de base (puricas: A+G o pirimidinicas
U+C). Las condiciones de reaccin y los reactivos empleados son diferentes a los
empleados en la secuenciacin del ADN pero los pasos de separacin de las molculas por electroforesis y lectura de la secuencia son equivalentes.
Mtodo de secuenciacin por degradacin enzimtica: Este mtodo no es equivalente al mtodo enzimtico de secuenciacin del ADN, en realidad es una variacin del mtodo anterior de degradacin qumica pero utilizando la especificidad de
corte de ribonucleasas para degradar especficamente una base o grupo de bases.
As la ribonucleasa T1, ARNasa T1 corta en guaninas (G), la ARNasa P corta en pirimidinas (C+U), la ARNasa U2 corta en adeninas (A) y la ARNasa I corta en adeninas, guaninas y uracilos (-C).
Una estrategia alternativa es secuenciar el ARN a travs de su copia a ADNc y
secuenciar el ADNc de cadena sencilla mediante los mtodos de secuenciacin del
ADN. Si el ARN a secuenciar es un ARN mensajero eucaritico, la cola de poli-A
del extremo 3 puede servir de molde para un corto cebador poliT. La hibridacin
del cebador e incubacin de ambos con una transcriptasa reversa en presencia de
dNTPs provoca la sntesis de la cadena de ADNc sobre el molde de ARN. La eliminacin posterior del ARN molde mediante la adicin de ARNasa H, libera las
molculas de ADNc de cadena simple que puede ser secuenciado directamente por
cualquier mtodo de secuenciacin de ADN. En el caso de que los ARN a secuenciar carezcan de cola de poli-A, la estrategia es la misma pero utilizando la actividad de la enzimas poli-A polimerasa para aadir una cola de poli-A que sirva de
secuencia de enganche al cebador poli-T para la sntesis de la cadena complementaria de ADNc.
Aplicaciones de la secuenciacin de cidos nucleicos

Los mtodos de secuenciacin automatizada han supuesto una revolucin biotecnolgica, si en principio se procedi a la determinacin de la secuencia de bases
de genes codificantes de protenas conocidas como la insulina, citocromo c, hemoglobina, interferones, etc., y se procedi al estudio de las mutaciones que generaban
diferentes enfermedades genticas como la hemofilia A y talasemias, en la actualidad se est abordando el proceso inverso, el denominado clonaje posicional, la idea
177
es proceder a secuenciar grandes regiones del genoma y localizar posteriormente

enfermedades cuyos marcadores citogenticos estn relacionados con los genes
descubiertos en dichas regiones y de los cuales se desconoce la funcin de la protena o protenas que provocan la enfermedad.
Los intereses cientficos y econmicos implicados han desencadenado una verdadera carrera para obtener la secuencia completa del genoma humano (3 10 9
pares de bases). La secuencia completa identificar unos 35.000 nuevos genes que
constituirn un verdadero diccionario del ser humano y cuya informacin ser
empleada (bajo patente) para generar nuevos agentes teraputicos en cuatro reas
principales:
Terapia Gnica: Cada nuevo gen descubierto posee el potencial de uso en
terapia gnica humana. La terapia gnica se emplear para el tratamiento del
cncer, enfermedades genticas y enfermedades inducidas por virus (SIDA
hepatitis, etc.).
Terapia Proteica: Cada nuevo gen puede emplearse para generar su correspondiente protena recombinante que pueda usarse como agente teraputico
en distintas enfermedades. Ejemplos actuales son la eritropoyetina, interferones, hormona de crecimiento o la insulina.
Estudios farmacogenmicos: Puesto que el genoma humano contiene numerosas variaciones denominadas polimorfismos no existen dos individuos iguales. Cuando estas variaciones afectan a regiones codificantes de genes, las
protenas de distintos individuos pueden manifestar diferentes comportamientos en trminos de eficacia o efectos secundarios, frente a una droga
determinada. La correlacin entre cambios en el genoma y el estudio de los
efectos farmacolgicos de una droga se conoce como farmacogenmica. Un
ejemplo de un gen con diferentes variantes polimorficas que afectan al metabolismo de drogas teraputicas es el gen del citocromo P450.
Diseo Qumico: Cada nuevo producto gnico es una nueva diana para desarrollar, mediante ingeniera qumica, nuevas molculas capaces de interaccionar
con l aumentando o bloqueando su actividad. (Generacin de molculas bloqueantes de receptores celulares, bloqueo de molculas de anticuerpos, etc.).
Otras aplicaciones de la secuenciacin de los AN se encuentran en el campo
de la medicina forense o en estudios epidemiolgicos.
Reaccin en cadena de la polimerasa

La reaccin en cadena de la polimerasa o PCR puede definirse como un mtodo enzimtico in vitro que permite la amplificacin selectiva de una secuencia de
ADN dada. Este mecanismo de amplificacin selectivo in vitro mimetiza el proceso de replicacin del ADN in vivo.
Para entender la reaccin de PCR es necesario recordar varios puntos principales:
Las dos cadenas de ADN forman una doble hlice.
178
La secuencia de bases en ambas cadenas de la molcula de ADN es complementaria.

La orientacin de ambas cadenas es opuesta:
La cadena sentido posee orientacin. 5 A 3
La cadena antisentido posee orientacin 3 A 5.
Todas las polimerasas conocidas sintetizan ADN en el sentido 5 A 3.
La PCR consiste en la amplificacin de copias de ADN por medio de la repeticin de unas reacciones cclicas, que constan de tres pasos que se realizan a diferentes temperaturas: 1) desnaturalizacin 2) hibridacin y 3) extensin.
En el primer paso, desnaturalizacin, las molculas de ADN de doble cadena se
desnaturalizan por calor; la temperatura, entre 92-95 C, rompe los puentes de hidrgeno que mantienen unidas las dos cadenas complementarias y se separan entre s
como cadenas sencillas de ADN que servirn de moldes para la amplificacin.
En el segundo paso, hibridacin, dos tipos de molculas cebadoras (primers)
cuyas secuencias son complementarias a los extremos de la secuencia a amplificar
en el ADN, hibridan especficamente con las secuencias presentes en las molculas
de ADN molde desnaturalizadas anteriormente. La temperatura de hibridacin vara
entre 60-40 C en funcin de la longitud y secuencia de los cebadores. Una vez
hibridadas las molculas de los cebadores al ADN molde se generan cortos fragmentos de ADN de doble banda que sirven como puntos de partida para la posterior
polimerizacin.
En el tercer paso, extensin, una ADN polimerasa termorresistente sintetiza una
cadena complementaria a cada una de las cadenas molde, adicionando nucletidos
al extremo 3 del cebador hibridado. La reaccin de elongacin se realiza a una temperatura prxima a los 72 C y se realiza en ambas cadenas en direccin de la
secuencia que se quiere amplificar. Al final del proceso de extensin se generan dos
nuevas molculas de ADN de cadena doble idnticas a la original en la secuencia
amplificada.
Las nuevas cadenas sintetizadas sirven a su vez, adems del ADN original,
como moldes en el siguiente ciclo de reaccin. Los ciclos se repiten un nmero
variable de veces entre 20-45, resultando una acumulacin exponencial del fragmento de ADN amplificado delimitado por cebadores: en teora, despus de 20
ciclos de amplificacin se obtendra un milln de copias de la secuencia amplificada, despus de 30 ciclos 1.000 millones de copias. A medida que aumenta el nmero de ciclos se incrementa la cantidad de molculas en las cuales slo se amplifica
la regin de inters comprendida entre ambos cebadores. Esta cantidad de ADN
amplificado es ms que suficiente para ser visualizado y cuantificado por los mtodos espectofotomtricos o directamente en geles de electroforesis con colorantes
como el BrEt o Sybr-green.
El ARN puede tambin servir de molde para la PCR (RT-PCR), pero se necesita un paso previo de sntesis a ADNc catalizada por una transcriptasa reversa.
Actualmente se encuentran disponibles comercialmente ADN polimerasas termo-
179
rresistentes con actividad transcriptasa reversa que permiten la realizacin de que

ambas reacciones de forma secuencial con una sola enzima y en el mismo tubo de
reaccin.
Las reacciones de PCR se encuentran totalmente automatizadas por el uso de
aparatos llamados termocicladores que realizan de forma autnoma los ciclos de
subidas y bajadas de temperatura. Cada ciclo de reaccin (desnaturalizacin-hibridacin-extensin) se repite una y otra vez en menos de 3-4 minutos, por lo que en
menos de dos horas se pueden generar ms de 1.000 millones de copias de la
secuencia deseada.
Desde la publicacin en 1985 del mtodo de la amplificacin especfica de fragmentos de ADN por Mullis, Saki y colaboradores, la reaccin en cadena de la
Polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction) ha producido un cambio revolucionario en las tecnologas aplicadas al diagnstico y la investigacin. La PCR se ha
convertido en un procedimiento rutinario, imprescindible en cualquier laboratorio
de biologa molecular debido a su capacidad para amplificar fragmentos de ADN (o
ARN) de forma especfica. La posibilidad de automatizacin de esta tcnica abre un
potencial ilimitado de aplicaciones, entre las cuales podemos destacar:
Diagnstico gentico pre y postnatal de enfermedades genticas.
Estudio y anlisis de mutaciones en enfermedades genticas.
Diagnostico general (sanidad, agricultura y ganadera) de enfermedades infecciosas causadas por diferentes organismos (virus, bacterias o parsitos unicelulares).
Aislamiento de genes a partir de genotecas.
Estudios epidemiolgicos.
Estudios de evolucin molecular entre especies.
Obtencin de huellas genticas aplicables a medicina forense (estudios de
paternidad y anlisis de muestras de ADN en casos forenses de crmenes o
violaciones).
La extraordinaria y rpida contribucin de esta metodologa en proyectos mdicos, industriales y de investigacin fue reconocida por la concesin del Premio
Nobel de Medicina a su autor, K. Mullis, slo ocho aos despus de su descubrimiento.
13
La ingeniera gentica II.
Protenas recombinantes
Introduccin
Como se indic en la introduccin con la tecnologa del ADN recombinante,
adems del avance en conocimientos e investigacin bsica, uno de los principales
objetivos de la ingeniera gentica persigue la produccin masiva de protenas con
alto valor teraputico en diferentes organismos. Este objetivo implica la reprogramacin gentica de los organismos para adquirir los genes que les capacitan para la
sntesis de las protenas de inters. La estrategia a seguir para lograr esta reprogramacin conlleva una serie de pasos sucesivos: 1) aislamiento del gen que codifica
para la protena de inters; 2) insercin del gen en un vector adecuado; 3) transferencia del vector recombinante al organismo hospedador; 4) seleccin de los organismos modificados genticamente que expresan el gen de inters; 5) caracterizacin del producto clonado; y 6) crecimiento a gran escala de los organismos
genticamente modificados para la produccin industrial de la protena de inters.
Con la excepcin del punto 6) que ser objeto de otro captulo, pasaremos a analizar los elementos clave implicados en este proceso.
Aislamiento del gen. (Clonaje y subclonaje)

En el caso de protenas constituidas por un pequeo nmero de aminocidos de
los cuales se conoce su secuencia (entre 15-20 aminocidos), es posible un abordaje directo y sintetizar artificialmente el gen teniendo en cuenta el cdigo gentico:
tres bases sucesivas en el ADN (codn) codifican por un aminocido. Conociendo
los codones que codifican de los aminocidos identificados se procede a la sntesis
qumica de un oligonucletido que sera la cadena sencilla codificante de la protena (cadena con sentido). Una vez sintetizada la cadena con sentido se sintetiza la
182
cadena complementaria para disponer del fragmento de ADNdc que se incluira en

el vector adecuado.
Este abordaje tan sencillo, no es posible llevarlo a cabo con protenas de alto
peso molecular. Puesto que el gen a aislar se encuentra dentro del genoma completo del individuo, el aislamiento del gen del resto de las secuencias implica necesariamente un primer paso de fragmentacin del ADN completo del organismo en
fragmentos de un tamao adecuado de manera que en alguno/s de los fragmentos
generados se encuentre nuestro gen.
El mayor problema de la ruptura del genoma completo es la obtencin de fragmentos de ADNdc de tamaos adecuados y a la vez que homogneos. Las tcnicas
de ruptura del ADN genmico para la obtencin de fragmentos (insertos) son de dos
tipos:
Roturas inespecficas: El ADN se rompe por mecanismos fsicos como agitacin o ultrasonicacin. La fragmentacin se produce al azar y los fragmentos
generados oscilan entra 300 pb y 40 Kpbs segn el mtodo empleado. En
general, las condiciones se eligen para generar fragmentos de tamao medio
entre 20 y 40 Kpbs, suficientemente grandes para incluir la mayora de los
genes tpicos.
Roturas especficas: El ADN genmico se digiere mediante enzimas de restriccin de tipo II que reconocen y cortan en secuencias especficas. Se suelen
elegir enzimas con dianas de corte de cuatro nucletidos y las condiciones de
digestin son parciales de forma que no se corten todas las dianas para la enzima en todas las molculas de ADN genmico. La enzima de restriccin ms
empleada es Sau3A.
Con cualquiera de los dos mtodos se obtienen poblaciones de insertos de ADN
genmicos en los que se encuentra representada la totalidad del genoma del organismo que sintetiza la protena de inters. Estos fragmentos, incluidos en vectores
adecuados, constituirn las llamadas genotecas o libreras genmicas (tambin llamadas bancos de genes).
Un abordaje ms adecuado y sencillo siempre que se trate del clonaje de genes
eucariticos es conseguir fragmentos de ADN que incluyan slo las secuencias que
codifican para protenas y buscar el fragmento que codifica nuestra protena. Para
obtener este tipo de fragmentos se parte del ARN mensajero (ARNm) maduro del
tipo celular donde se expresa la protena de inters o del organismo completo. Todas
las molculas de ARNm se copian en ADN complementario o copia (ADNc)
mediante la accin de la enzima transcriptasa reversa. Se obtiene as una poblacin
de fragmentos de ADNc que son representativas de los genes que se expresan en un
momento dado en una poblacin celular. La insercin de estos fragmentos en vectores adecuados da lugar a las genotecas de ADNc o libreras de expresin.
Por lo general, el aislamiento y clonaje de un gen de secuencia conocida no
implicar necesariamente la construccin de una genoteca, en la actualidad se dispone comercialmente de un amplio catlogo de genotecas, tanto genmicas de ml-
LA INGENIERA GENTICA II
183
tiples organismos, como genotecas de expresin de distintos organismos, tejidos o

fases de desarrollo, para proceder a la bsqueda del gen de inters mediante la tcnica de PCR. La secuencia del gen ser amplificada del ADN de la genoteca e
incluida en el vector adecuado a travs las dianas de restriccin presentes en las
molculas de los primers cebadores. Por si ello no fuera suficiente, existen empresas comerciales capaces de generar genotecas a medida a partir del ADN genmico
proporcionado el investigador o, incluso, proceder al aislamiento directo del clon
que contenga el gen de inters para el investigador.
Insercin del gen en un vector adecuado: Vectores de ADN

Una vez obtenidos los insertos representativos de todo el genoma o slo de
aquellos genes que se expresan en protena, se insertan en molculas genticas portadoras (vectores).
Los vectores son molculas especiales de ADN que sirven como vehculos para
la transferencia de ADN a distintos organismos hospedadores. A grandes rasgos es
posible distinguir dos tipos principales de vectores:
Vectores de clonaje: Son aquellos utilizados para servir nicamente como
vehculos replicativos del ADN que llevan insertado.
Vectores de expresin: Son aquellos que llevan todos los elementos para la
expresin del gen que va incluido en el inserto una vez introducido en el hospedador adecuado.
Si bien esta diferenciacin es vlida a nivel conceptual, la gama actual de vectores disponibles hace que las barreras de definicin de uno y otro tipo queden a
menudo eliminadas y es posible obtener vectores con ambas caractersticas.
Por lo general, se tiende a emplear los vectores de clonaje para la insercin de
grandes fragmentos de ADN (construccin de genotecas de ADN genmico) en los
cuales proceder, posteriormente, a la identificacin del fragmento que posee el gen
de inters. Una vez identificado el inserto, se procede a su manipulacin (subclonaje) para eliminar las secuencias adyacentes hasta obtener un fragmento que slo
incluya el gen de inters.
Los vectores de expresin se emplean, bien cuando el gen de inters est ya
caracterizado (subclonado), bien para insertar fragmentos de ADNc cuya expresin
es directa (genotecas de ADNc).
La eleccin del tndem vector-hospedador es crtica a la hora de lograr el fin
experimental de obtener la expresin de una protena de inters. La eleccin exige
slidos conocimientos sobre los mecanismos de replicacin/expresin del vector y
sobre los mecanismos de expresin del gen en la clula hospedadora en donde se va
a introducir. Los vectores actuales, tanto para clulas hospedadoras procariticas
como para clulas eucariticas, son construcciones artificiales muy complejas, elaboradas mediante tcnicas de ingeniera gentica en base a una serie de cualidades:
184
Estabilidad, una vez incluido el fragmento de ADN exgeno no debe perderlo ni modificarlo.
Genticamente heredables a la progenie.
Fenotipo seleccionable, el vector debe conferir unas caractersticas que nos
permitan identificarlo en la poblacin de clulas hospedadoras (resistencia a
antibiticos, actividad enzimtica marcadora, expresin de una protena fluorescente).
Nmero de copias constante y alto para que se incremente el nmero de
copias del gen mantenidas dentro del hospedador o ser susceptibles de ser traducidas a protena.
Capacidad de replicacin en varios tipos de hospedadores (vectores lanzaderas).
Existencia de regiones de control de replicacin, expresin compatibles con
la biologa molecular de las clulas hospedadoras. La presencia de estas
regiones de control en el entorno del hospedador adecuado servirn para
lograr tanto una adecuada replicacin del gen incluido en el vector como una
potente expresin del gen. De particular importancia son las seales de excrecin que permiten la excrecin de la protena al exterior celular para facilitar
la purificacin de la misma.
Los vectores ms utilizados en ingeniera gentica son de cuatro tipos principales: 1) Plsmidos; 2) Csmidos; 3) Bacterifagos; y 4) vectores virales eucariticos.
1) Plsmidos: Son molculas de ADNdc circulares de pequeo tamao (53-4
Kpbs) con replicacin autnoma aislados inicialmente en bacterias a la cuales confieren resistencia a antibiticos. Los plsmidos actuales son todos
artificiales y tienen su tamao reducido al mnimo para as aumentar su capacidad de aceptar insertos. El tamao mximo de inserto aceptado suele ser de
10-13 Kpbs, ya que plsmidos recombinantes (plsmido+inserto) de ms de
15 Kpbs son muy inestables.
Todos los plsmidos artificiales poseen:
Adaptadores de policlonaje, secuencias nicas para 10 o ms enzimas de restriccin, estos adaptadores de policlonaje se emplean para incluir el inserto
dentro del vector.
Marcadores fenotpicos de seleccin. Normalmente son de dos tipos, genes
de resistencia a antibiticos (ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol o neomicina) y genes de marcadores enzimaticos (`-galactosidasa) o fluorescentes
(luciferasa o GFP). En el caso de plsmidos bacterianos normalmente el
adaptador de policlonaje se encuentra incluido en medio del gen de la `galactosidasa. La secuencia de policlonaje no afecta a la expresin de la
enzima de manera que las clulas hospedadoras bacterianas que reciben el
vector sin inserto poseen `-galactosidasa, estas colonias en presencia de un
colorante llamado X-gal presentan un color azulado en placas de agar. Si el
185
vector lleva un inserto, la interrupcin de la secuencia del gen de `-galactosidasa por el inserto, inactiva la expresin del gen de la `-galactosidasa y las
colonias de bacterias presentan un color blanco al no poder degradar el colorante X-gal.
Regiones de control de replicacin y expresin compatibles con las clulas
hospedadoras.
2) Csmidos: Los csmidos son plsmidos modificados con la regin Cos del
fago h para aceptar insertos de gran tamao. Estos vectores se introducen
(empaquetan) en fagos (virus de bacterias) como ADNdc lineales, estos
fagos al infectar las bacterias inyectan el ADN del csmido que se vuelve circular cerrado y se comporta como un plsmido dentro de las bacterias. Las
bacterias infectadas se seleccionan por resistencia a antibiticos. Los csmidos son los vectores de clonaje de eleccin para las insercin de fragmentos
de ADN genmicos grandes, entre 40 y 50 Kpbs.
3) Bacterifagos: Los vectores derivados de bacterifagos ms empleados derivan del fago M13 y del fago h.
Los vectores derivados del fago M13 son molculas de ADN circulares de
cadena sencilla cuando estn empaquetados dentro de la partcula viral o de
cadena doble cuando el ADN ha sido inyectado en bacterias. Estos vectores,
que poseen seleccin por color (`-galactosidasa) y resistencia a antibiticos,
se emplean como vectores de clonaje para secuenciacin del ADN insertado
por el mtodo enzimtico y para realizar mutagnesis dirigida de los insertos,
aprovechando la caracterstica de ser molculas de cadena sencilla.
Los vectores derivados del fago h son de dos tipos, vectores de sustitucin en
los cuales un fragmento de ADN no esencial para la viabilidad del fago h es
reemplazado por el inserto y vectores de insercin en los que el inserto se
integra dentro del genoma del fago por una diana de restriccin determinada.
Los vectores de sustitucin, son vectores de mixtos clonaje-expresin ideales para incluir fragmentos de ADN genmicos o de ADNc grandes, hasta 24
Kpbs. Los vectores de insercin son vectores de expresin ideales para
ADNc pequeos (hasta 8 Kpbs), su principal ventaja reside en que producen
protenas de fusin con el extremo amino del gen de la `-galactosidasa, lo
cual permite utilizar mtodos inmunolgicos (anticuerpos) para la deteccin
de la expresin del inserto.
4) Vectores virales para clulas eucariticas. No profundizaremos demasiado
en su descripcin, en general son de dos tipos:
Plsmidos modificados artificialmente con secuencias reguladoras de control
de replicacin expresin y excrecin derivadas de genes eucariticos o virus
de clulas eucariticas.
Virus eucariticos modificados con regiones de control virales o de genes
eucariticos, equivalentes a los vectores de reemplazamiento e insercin derivados del fago h. Los principales vectores de origen viral derivan de baculovirus, retrovirus, SV40, virus de la vacuna, herpesvirus y virus del papiloma.
186
Una vez obtenidos los fragmentos de ADN y las molculas de vector, el paso
final es la incorporacin de las molculas de inserto en las molculas de vector. Para
realizar este paso de unin se incuban ambas poblaciones de molculas en presencia de la enzima ADN ligasa. Existen distintas estrategias para asegurar que los
fragmentos de ADN se inserten en los vectores con orientaciones determinadas o
para evitar que las molculas de inserto o de vector se unan as mismas.
Transferencia del vector de recombinante al hospedador

Mtodos de Transferencia del ADN a clulas hospedadoras
Una vez obtenidos los vectores recombinantes, el siguiente paso a seguir es la
introduccin de los mismos en una clula hospedadora adecuada, los mtodos de
transferencia de ADN son mltiples y dependientes tanto de la clula hospedadora
receptora como del tipo de vector en el cual se encuentre nuestro ADN. La transferencia de ADN exgeno a bacterias y levaduras se denomina transformacin, la
transferencia de ADN exgeno a clulas en cultivo se denomina: transfeccin si el
vector es un plsmido o derivado plasmdico o transduccin si es un vector viral,
incluido en una partcula de virus, el que transfiere el ADN.
Los mtodos ms empleados se explican a continuacin:
Transformacin con CaCl2. La transferencia se realiza empleando bacterias
competentes, es decir, capaces de aceptar ADN extracelular. Las bacterias se
vuelven competentes en una determinada fase de su crecimiento al tratarlas con
una solucin de CaCl2 en fro (4 C). En condiciones ptimas es posible obtener eficiencias de transformacin mayores de 108 colonias por g de ADN de
plsmido. En la actualidad existen cepas bacterianas competentes, disponibles
comercialmente capaces de generar rendimientos * 5 109 colonias/g de ADN.
Transformacin con bacterifagos: Cuando los vectores son csmidos o bacterifagos la transformacin es normalmente directa. Los vectores recombinantes son partculas virales infecciosas capaces de infectar bacterias sensibles y transferirles el ADN incluido en el vector.
Transfeccin con fosfato clcico: Se desconoce el mecanismo por el cual las
clulas de mamfero son capaces de ingerir el ADN por endocitosis al ser
tratadas con fosfato de calcio. El procedimiento es conseguir la formacin
de microprecipitados de ADN con el fosfato de calcio mediante la mezcla de
ADN con cloruro de calcio y un tampn fosfato. Es el mtodo ms comn
para la transferencia de plsmidos a clulas de mamfero.
Electroporacin: Este mtodo se encuentra desarrollado tanto para transferir
ADN a clulas eucariticas como a procariticas. Las eficiencias de transformacin son las ms elevadas, del orden de 109-1010 colonias/g de ADN para
bacterias y 20-30 transformantes por cada 105 clulas eucariticas. El procedimiento es relativamente sencillo, se realiza en pequeas cmaras en las cua-
187
les se encuentra un microelectrodo, se mezclan el ADN y las bacterias o clulas eucariticas en una solucin conductora. La cmara se coloca en fro y se
da un pulso elctrico de alto voltaje (entre 2 y 4 Kv). Los poros inducidos
momentneamente en las clulas permiten la entrada del ADN.
Liposomas: La transfeccin se realiza empleando de soluciones de lpidos,
disponibles comercialmente, que envuelven (liposomas catinicos) o introducen en su interior (liposomas aninicos) las molculas de ADN para ayudarlas a atravesar la membrana plasmtica de las clulas de mamfero.
Transduccin: Cuando se trata de vectores virales de clulas de mamfero, los
vectores se encuentran incluidos en partculas virales infectivas, de forma que
los mecanismos de infeccin viral se encargan de introducir el vector recombinante en las clulas en cultivo.
Existen, en otros contextos, otros mtodos para la transferencia de ADN a clulas de mamfero como son la microinyeccin directa y el bombardeo gentico. La
microinyeccin nos permite la introduccin de ADN (o cualquier otro compuesto)
de forma directa e individual en el interior del ncleo de una clula. Este proceso se
realiza ayudado por un micromanipulador y visualizando la operacin en un microscopio o una pantalla de vdeo. El bombardeo gentico se utiliza para la transferencia de ADN a clulas vegetales o clulas con paredes celulares consistentes. El
mtodo usa una pistola especial que proyecta una nube de partculas de un metal
pesado, como oro o tungsteno, recubiertas de ADN sobre las clulas.
Eleccin de las clulas hospedadoras
Bacterias, levaduras, clulas de insectos y mamferos son los organismos hospedadores comnmente empleados a la hora de expresar protenas de inters. La
eleccin particular del hospedador, incluso del tipo celular o cepa bacteriana
depender de mltiples factores tanto biolgicos (biologa del hospedador, el tipo de
vector elegido, el tamao de la protena, facilidad de purificacin, inmunogenicidad, etc.) como de otros factores polticos o econmicos (impacto ambiental, costo
de produccin, mercado potencial de aplicacin, etc.).
Los principales factores a considerar a la hora de elegir la clula hospedadora
incluyen: 1) velocidad de crecimiento (rpido o lento); 2) coste econmico de la
produccin y purificacin (necesidad de medios especiales o suplementos nutritivos, necesidad de manipulaciones especiales y el diseo de las reas de produccin,
(upstream) y purificacin, (downstream); 3) nivel de expresin y excrecin de la
protena en la clula hospedadora; 4) capacidad del hospedador para rendir un producto biolgicamente activo, no inmunognico, mediante una adecuada sntesis y
modificacin post-traduccional de la protena; y 5) la posibilidad de obtener vectores de expresin adecuados para el hospedador elegido.
En base a la variedad de estos factores, la mayora de las veces la eleccin del
hospedador viene determinada por un compromiso entre los mismos. Analizaremos
a continuacin cada uno de los candidatos a clula hospedadora:
188
Hospedadores procariticos
Las bacterias han sido los primeros hospedadores para el clonaje y expresin de
genes, tanto eucariticos como procariticos y en la actualidad an juegan un decisivo papel en la expresin de productos de inters biotecnolgico.
Tradicionalmente se han empleado cepas de Escherichia coli, debido principalmente a su bien conocida gentica y biologa. Otras bacterias utilizadas han sido
Bacillus subtilis y algunas cepas de Salmonella.
Las bacterias se han empleado como hospedadores cuando se trataba de obtener
protenas de pequeo peso molecular que no requieren de modificaciones posteriores a la traduccin para su actividad biolgica. Estos microorganismos presentan
numerosas ventajas para la produccin en masa:
Cultivo celular fcil y barato.
Facilidad de escalado desde la fase piloto a la etapa industrial.
Rpida velocidad de crecimiento (divisiones cada 20-90 minutos).
Con el vector apropiado, generan altos rendimientos de produccin.
Son bastante resistentes a cambios bruscos del medio.
Sin embargo, tambin presentan graves inconvenientes:
Incapacidad de procesar los ARN transcritos directamente de genes eucariticos que contienen secuencias no codificantes (intrones). Este problema es
evitable clonando en los vectores solamente los ADNc obtenidos a partir de
los ARNm maduros.
Incapacidad de segregar al medio de cultivo las protenas recombinantes de
alto peso molecular. Este hecho determina una posterior lisis de las clulas
para obtener la protena de inters. Esta lisis provoca la contaminacin del
producto recombinante con protenas bacterianas que pueden arrastrarse
hasta el producto final y provocar reacciones inmunognicas en los individuos que han sido tratados con protenas recombinantes. En algunos casos, es
posible introducir una seal de secrecin en el vector (secuencia lder) junto
con el gen que permita la exportacin al espacio periplsmico. En cualquier
caso, es necesaria una lisis controlada de la pared celular para liberar la protena al medio. Este proceso conlleva de nuevo, el riesgo de contaminacin
con los restos de la pared bacteriana.
Tendencia a concentrar las protenas expresadas en forma de grnulos insolubles en los que la protena, en muchos casos, pierde su actividad biolgica
de forma irreversible o incluso puede resultar txica para el propio hospedador. Esta toxicidad puede llevar a la lisis de la bacteria.
Carencia de un sistema postraduccional de maduracin de protenas, que incapacita a estos organismos para la sntesis de protenas eucariticas las cuales requieren de estas modificaciones post-traduccionales. Si estas modificaciones son requeridas para la funcionalidad biolgica de la protena puede
darse la paradoja de obtener grandes cantidades de una protena correctamente expresada sin ninguna actividad biolgica.
189
Hospedadores eucariticos
Normalmente las protenas eucariticas despus de su sntesis requieren de una
serie de modificaciones postraduccionales que permiten que la protena adquiera
una conformacin espacial adecuada, responsable de su completa actividad biolgica. Las modificaciones ms comunes son: establecimiento de puentes disulfuro,
modificaciones de algunos aminocidos (hidroxilacin, metilacin, acetilacin y
fosforilacin) y la incorporacin de molculas de azcares (glicosilacin) y de cidos grasos (acilacin).
Estas modificaciones son muy importantes no slo por conferir la actividad biolgica a la protena, sino porque adems determinan las propiedades antignicas y
de estabilidad de la misma.
Se entiende ahora el por qu de la necesidad de hospedadores eucariticos que
puedan proporcionar estos mecanismos para la expresin de protenas eucariticas
funcionales, estables y totalmente inocuas cuya actividad biolgica sea estrictamente idntica a la natural. Otra ventaja adicional de los hospedadores eucariticos,
respecto a los procariotas, es la secrecin directa de las protenas sintetizadas al
medio de cultivo, con la consiguiente facilidad de purificacin.
Tradicionalmente se han empleado las levaduras y las clulas de mamfero
como sistemas husped, sin embargo las clulas eucariticas de insecto comienzan
a dar resultados prometedores.
Levaduras. Las levaduras comparten muchas ventajas con las bacterias (rpida
velocidad de crecimiento, bajo costo de produccin entre otras) pero la expresin de
genes en clulas de levadura plantea tambin graves inconvenientes:
El nivel de expresin es considerablemente inferior al obtenido en bacterias.
Un uso un poco especial del cdigo gentico.
Una tendencia a la inestabilidad de los vectores de expresin.
Cierta especificidad por los genes propios (preferencia en la expresin).
Aunque el sistema de eliminacin de los intrones de los ARN transcritos funciona correctamente, el sistema de modificacin post-traduccional, fundamentalmente la glicosilacin, es diferente (inducen hiperglicosilacin) al de
clulas eucariticas de mamfero.
A pesar de estas limitaciones, se ha logrado producir y excretar un nmero aceptable de protenas heterlogas con eficiencias variables (entre 1-10 mg/L) como la
lisozima humana o el antgeno vacunal del virus de la hepatitis B.
Clulas de insecto: La expresin de protenas recombinantes en clulas eucariticas de insectos puede ser comparable o superior al sistema de las levaduras, con
produccin de 1 a 100 mg por litro de cultivo. Cultivos de clulas de insecto han
logrado producciones a gran escala de productos de alto valor econmico como el
interfern _ humano, el factor de crecimiento epidrmico (EGF) o polimerasas de
cidos nucleicos para uso comercial.
Las vectores de expresin son virus de invertebrados en los cuales un gen
estructural del virus (gen de la poliedrina) es sustituido por el gen de inters.
190
La principal desventaja de estos hospedadores radica en la incapacidad de generar un patrn correcto de glicosilacin muy parecido al de clulas de mamfero.
Otros inconvenientes adicionales son de carcter bsicamente econmico y comunes a los de la clulas de mamferos.
Clulas de mamfero. Slo las clulas de mamfero en cultivo son satisfactorias
para la produccin de protenas humanas normales, correctamente plegadas y provistas de todas las modificaciones que puedan generar la totalidad de la funcionalidad biolgica, estabilidad e inocuidad.
El uso de clulas de mamfero plantea fundamentalmente inconvenientes de
ndole econmica (altos costos) como de ndole sanitario (capacidad de contaminacin con agentes infecciosos).
El cultivo de clulas de mamfero no es siempre sencillo:
Poseen unos complejos requerimientos nutricionales que hace que los
medios de cultivo y sus suplementos provoquen altos costos de produccin.
Las clulas poseen un crecimiento lento (duplicaciones cada 16-24 horas).
Los rendimientos de produccin no son muy elevados (100 mg/L de cultivo).
El empleo de clulas de mamfero conlleva la necesidad de evaluar los posibles contaminantes, normalmente virus o ADN viral de los vectores, que,
procedentes de la clulas o de los suplementos de origen animal, puedan
contaminar el producto.
As, la produccin industrial en clulas de mamfero resulta relativamente cara y
est solamente reservada a protenas complejas de alto valor biolgico y econmico.
Seleccin de los organismos que expresan el gen de inters

Una vez transferidas las molculas de ADN recombinante la clula hospedadora elegida, el paso final es el de seleccionar aquellas clulas hospedadoras que han
tomado el gen codificante para la protena de inters para su aislamiento y posterior
escalado. Normalmente este proceso de seleccin se lleva a cabo en dos etapas: 1)
una etapa inicial de cribado (screening) de toda la poblacin de clulas hospedadoras resultantes de la transferencia para seleccionar slo aquellas que han tomado los
vectores con los insertos ADN recombinante (clones recombinantes); y 2) una etapa
final de seleccin de los clones recombinantes para identificar cul o cules poseen
y/o expresan el gen de inters. Estos abordajes son tanto vlidos para clulas procariticas como eucariticas.
Los mtodos de screening o cribado se basan, normalmente en las caractersticas
fenotpicas aportadas por las molculas del vector (resistencia a antibiticos, la
expresin de actividades enzimticas o expresin de protenas fluorescentes). Es
relativamente sencillo de detectar la presencia de los clones recombinantes sin ms
que seleccionar aquellos que presentan estos fenotipos en la poblacin; ms complicado es el proceso de seleccin del clon o clones de inters. Existen tres enfoques
principales:
191
1. Deteccin de la actividad biolgica de la protena de inters. En este mtodo se ensayan los clones recombinantes a la bsqueda del que presenta la
actividad biolgica buscada. Este abordaje es perfecto siempre y cuando se
disponga de un mtodo lo suficientemente sensible de deteccin de la actividad biolgica y que las clulas hospedadoras no posean una actividad biolgica similar. La seleccin del hospedador en este caso es crtica.
2. Mtodos de deteccin inmunolgicos. Si se poseen anticuerpos especficos
para la protena existen numerosos protocolos para determinar qu clones
recombinantes de la poblacin estn secretando la protena reconocida por el
anticuerpo.
3. Mtodos de hibridacin de los AN. Estos mtodos se apoyan en ensayos de
hibridacin similares a los explicados en la tcnica de Southern. Los mtodos de hibridacin se basan en encontrar o disear sondas especficas (los
mtodos de diseo de las sondas ya fueron explicados en la tcnica de
Southern) del gen de inters. Estas sondas marcadas (isotpica, enzimticamente, o con fluorocromos) sirven de anzuelos moleculares para buscar,
sobre el ADN de los clones recombinantes transferido a membranas de hibridacin, aquellos clones que poseen el gen de inters que lleva la secuencia
complementaria a la de la sonda. En el caso de cultivos de clulas de mamferos, es posible aplicar una variacin de esta tcnica de hibridacin con sondas especficas sin necesidad de transferir el ADN de los clones a membranas de hibridacin simplemente realizando la hibridacin sobre los clones
directamente mediante la tcnica de hibridacin in situ.
Caracterizacin del producto y clulas productoras

Caracterizacin del producto clonado
La caracterizacin del producto recombinante obtenido puede ser tan importante como el proceso de clonaje y obtencin del mismo, sobre todo en aquellos casos
en los que la fidelidad entre la protena original y la producida por ingeniera gentica haya de ser mxima. En el entorno farmacutico las protenas recombinantes
estn sometidas a rigurosos controles peridicos por agencias gubernamentales. En
estos controles adems del verificar la estabilidad del proceso de produccin bajo
normativa GMP (Good Manufacture Procedures), se analiza exhaustivamente la
similitud entre el producto obtenido in vitro y el natural.
La caracterizacin primaria (o de identidad) incluye la determinacin del peso
molecular, carga elctrica, punto isoelctrico, secuencia y composicin de aminocidos e hidrofobicidad. Adicionalmente se analiza la conformacin estructural y la
actividad biolgica o enzimtica. Especial atencin se dedica a los extremos amino
y carboxilo para detectar la posible degradacin por proteasas, as como al correcto patrn de glicosilaciones, puentes disulfuro, fosforilaciones y cualquier otra
192
modificacin postraduccional que requiera la protena para su actividad biolgica y

estabilidad.
La caracterizacin secundaria (pureza y estabilidad) es otro factor crtico para
descartar la posible contaminacin del producto con pptidos inmunognicos. Es
necesario asegurar, mediante diferentes mtodos fsico-qumicos e inmunolgicos,
que la protena est libre de virus o cidos nucleicos que, procedentes del medio o
de las clulas hospedadoras pudieran suponer un factor de riesgo para el hombre.
Caracterizacin de las clulas productoras (bancos celulares)
El otro punto de control para asegurar una correcta obtencin de las protenas
recombinantes se encuentra en la caracterizacin de la clula hospedadora. De
acuerdo a la produccin bajo normas GMP, la estabilidad gentica de las clulas
productores es un factor crtico. Es necesario establecer y caracterizar un determinado clon celular de produccin a partir del cual generar un banco celular maestro
origen de la produccin (Master cell bank). Este banco celular se expande en cultivo para obtener bancos celulares de trabajo (Working cell bank) con los cuales llevar a cabo los lotes individuales de produccin. Ambos tipos de bancos, almacenados en N2 lquido a 196 C, deben ser amplia y cuidadosamente caracterizados para
asegurar:
1) La estabilidad gentica e identidad de las clulas productoras. (Caracterizacin morfolgica, anlisis de isoenzimas y anlisis citogenticos.)
2) La estabilidad de la construccin gentica que origina la protena recombinante. (Secuenciacin de la contruccin gnica, patrn de restriccin, estimacin del nmero de copias del gen.)
3) La ausencia de agentes adventicios como virus y micoplasmas. (Anlisis de
carga viral y anlisis de actividad transcriptasa reversa; test de deteccin de
micoplasmas.)
4) La consistencia de crecimiento y productividad de las clulas. (Determinacin de la productividad y nmero de duplicaciones de la poblacin en
los diferentes lotes de produccin.)
Estos procedimientos de control aseguran la consistencia y reproducibilidad de
cada lote de produccin.
Bibliografa
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Sambrook J. Fritsch EF. Maniatis T. Molecular Cloning (I, II and III). New York, Cold
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Walker JM. and Gingold EB. Biologa molecular y biotecnologa. Zaragoza, Editorial
Acribia 1997.
Thilly WG. Mammaliam Cell Technology. London, Butterworths Publishers. 1988.
Nota del Autor: Ambos captulos (12 y 13) de Ingenieria Gentica fueron desarrollados
sobre la base de una presentacin de Microsoft Power Point. Las figuras complementarias
al texto de ambos captulos estan disponibles, con fines educativos, solicitndolas a la
siguiente direccin electrnica. jose.casatorres@serono.com
14
Produccin industrial de frmacos
recombinantes
A. Martnez Mogarra
Introduccin
Toda persona con experiencia en un laboratorio de investigacin est familiarizada con cierto equipo de cultivo: placas, matraces, frascos T, placas multipocillo,
estufas de cultivo, incubadores orbitales y con unas determinadas condiciones de
trabajo relativas a las salas, aislamiento, material de proteccin. Muchos de estos
sistemas son tambin utilizados a nivel industrial, unas veces tal cual los conocemos
en el laboratorio y otras modificados y adaptados al manejo de grandes volmenes.
Los equipos utilizados en la produccin de grandes cantidades de clulas son muy
diversos ya que en muchos casos han sido desarrollados pensando en satisfacer las
necesidades creadas por un organismo concreto. Haremos una primera mencin al
cultivo a gran escala de bacterias y hongos para entrar con alguna extensin en los
sistemas de produccin masiva desarrollados para el cultivo de clulas, siempre ms
complejos y sofisticados. Tambin haremos referencia a las necesidades de construccin y diseo que plantea un proceso de produccin en la industria biotecnolgica sin dejar de lado las condiciones ambientales y de bioseguridad que debe cumplir una industria con tantos problemas potenciales. A continuacin repasaremos
algunas nociones de purificacin de protenas, para terminar con una mirada a las
condiciones de calidad requeridas en la industria.
Cultivos procariotas
Tanto bacterias como hongos presentan muchas ventajas y facilidades en su cultivo a gran escala si se comparan con las clulas eucariotas. Estas ventajas residen
fundamentalmente en dos cualidades de este tipo de clulas, su activo metabolismo
que les facilita el uso de una amplia gama de nutrientes y el rpido incremento de
196
biomasa, y su natural resistencia mecnica y qumica que facilita enormemente el

control de las condiciones de cultivo en trminos de aparataje. Los cultivos masivos de bacterias se llevan a cabo en fermentadores. Los fermentadores son equipos
que consisten en un vaso que puede ocupar volmenes muy diversos, desde unos
pocos litros hasta decenas de miles, en el que se carga el medio de cultivo y se inocula el organismo adecuado, acompaado por sistemas de control de las condiciones de cultivo. Veamos a continuacin los principales elementos del cultivo de procariotas.
El medio de cultivo
Los medios de cultivo definidos, es decir, aquellos en que se conoce la naturaleza y cantidad de todos y cada uno de sus componentes, tan utilizados en el laboratorio, resultan inviables en la produccin a gran escala debido a su coste y/o baja
capacidad para generar biomasa y produccin. Es frecuente pues, que se utilicen
medios de cultivo total o parcialmente indefinidos en los que se incluyen componentes de naturaleza compleja que aportan cierta variabilidad al proceso. En algunas fermentaciones se intenta utilizar como elemento nutritivo determinados desechos agrcolas.
En general, el medio de cultivo para bacterias debe incluir una fuente de carbono, y una fuente de aminocidos y/o protenas siendo tambin deseable el aporte de
cidos grasos esenciales en algunos casos. Para evitar el desarrollo de revertientes
es frecuente la adicin de algn antibitico cuyo gen de resistencia va incorporado
a la construccin que contiene el DNA de la protena recombinante.
Parmetros de cultivo
Control de temperatura
Los requisitos de temperatura para garantizar la supervivencia de las bacterias
no son demasiado estrictos aunque saliendo de determinados mrgenes se pueden
ocasionar cadas de productividad o mutaciones indeseables. Salvo que el microorganismo presente un requerimiento especfico de temperatura, se trabaja dentro de
rangos fisiolgicos, entre 35 y 37 C. Algunos equipos permiten disear un perfil de
temperatura cambiante a lo largo del proceso. Este sistema resulta muy til cuando
las temperaturas ptimas de crecimiento y produccin no coinciden o cuando es
necesario un pulso de temperatura para estimular la produccin de la protena de
inters.
La cuba del fermentador est equipada con una camisa de refrigeracin por la
que circulan a conveniencia vapor, agua caliente y lquido refrigerante. El refrigerante habitual es el agua aunque es posible la utilizacin de otras mezclas refrigerantes como agua glicolada.
PRODUCCIN INDUSTRIAL DE FRMACOS RECOMBINANTES
197
Las fases iniciales del cultivo, cuando la biomasa es escasa, requieren la calefaccin del mismo. A medida que el cultivo se desarrolla y la actividad metablica
se intensifica se genera calor y el cultivo puede llegar a requerir refrigeracin lo que
se consigue haciendo circular lquido refrigerante por la camisa.
Control del pH
La cuba del fermentador est dotada con sondas de pH a partir de cuya seal se
adicionan pulsos de soluciones concentradas de cido o base directamente sobre el
cultivo.
Aporte de oxgeno
La solubilidad del oxgeno en medio acuoso es muy baja. De ah que los cultivos lquidos a pequea escala requieran grandes cmaras de aire para evitar la aparicin de procesos anaerobios. Estas cmaras de aire no son posibles en los cultivos
masivos, con lo que es necesario recurrir al burbujeo bien sea de aire o de mezclas
conocidas y controladas de gases.
Agitacin
Dentro del fermentador son deseables unas condiciones lo ms homogneas
posibles. Para conseguir un ptimo de productividad y minimizar el riesgo de mutaciones es deseable eliminar los microambientes. Adems, una adecuada correccin
del pH y la temperatura y una aireacin apropiada exigen la continua mezcla de los
elementos del cultivo. Esto se consigue con la introduccin de un sistema de agitacin, consistente en un eje con unas palas impulsado por un motor elctrico, gobernado por un variador de velocidad. Es habitual que el variador est conectado al sistema de control de aireacin y qu parmetros como la presin parcial de oxgeno
sean los que regulen el incremento o disminucin de la velocidad de agitacin.
Volumen de los cultivos
La agitacin en combinacin con la presencia de concentraciones elevadas de
protenas y otras sustancias tensoactivas, provocan la formacin de grandes cantidades de espuma que es preciso evitar. Los fermentadores estn dotados de sondas
de nivel que regulan la adicin de productos antiespumantes.
Cultivo de clulas eucariotas

La extremada sensibilidad tanto frente a agentes qumicos como fsicos que presentan las clulas eucariotas y la posibilidad de que sea necesario su anclaje a super-
198
ficies para posibilitar su crecimiento, hacen que el cultivo de este tipo de organismos, partiendo de unos elementos comunes con respecto al crecimiento bacteriano
se sofistique enormemente tanto en los mtodos empleados como en las medidas de
calidad necesarias.
Como se ha mencionado anteriormente, el medio de cultivo adecuado para las
clulas eucariotas no responde a una frmula universal. Cada tipo de clula, cada
produccin especfica, requiere su propia formulacin. Los medios de cultivo utilizados a gran escala son los mismos empleados en el laboratorio y habitualmente
contienen concentraciones de suero entre el 2 y el 10 %. Adems de los componentes nutricionales del medio es frecuente que la formulacin incluya agentes antiespumantes y viscosizantes como el poliglicol o la carboximetilcelulosa, con objeto
de minimizar el efecto de cizalladura y prevenir la formacin de espuma.
Biorreactores
Este trmino se aplica a los sistemas de cultivo a gran escala para clulas eucariotas. Sus fundamentos proceden de los fermentadores pero los equipos de control
utilizados y la forma de trabajar son diferentes de la de aqullos, especialmente
cuando se trata de sistemas perfundidos. Como norma general, los biorreactores
deben cumplir con lo siguiente:
Estar construidos en materiales de calidad farmacutica (acero 316 L o hastelloid, plstico clase VI USP).
Tener sistemas de impulsin que no provoquen turbulencias ni cizalladuras,
siendo el caso extremo los fermentadores de tipo airlift.
No presentar en su interior piezas de gran tamao que dificulten la circulacin del lquido.
Tener una geometra interior suave, con fondos cncavos y el mnimo posible
de ngulos y esquinas para facilitar la homogeneizacin del cultivo y facilitar
la limpieza y esterilizacin del equipo.
Interiores electropulidos o pulidos a espejo.
El medio de cultivo que entra en un cultivo de clulas debe incorporarse en perfectas condiciones de pH, temperatura y gases en solucin, con lo que los recipientes de cultivo van frecuentemente acompaados de recipientes de acondicionamiento en los que se rectifican los parmetros mencionados.
Control de pH y aireacin
El tampn ms frecuentemente utilizado en los cultivos de clulas es el CO2CO3H, que basa su capacidad tamponante en la relacin entre el CO2 atmosfrico
y el CO2 en disolucin. De este modo, la generacin metablica de CO2, la difusin
199
de gases en el medio y la eliminacin de gases de desecho se mantienen en ntima

relacin.
El aporte de gases al medio se realiza por difusin a travs de membranas semipermeables o por simple burbujeo de aire comprimido o mezclas controladas de
gases. En este ltimo caso, es posible la regulacin del pH variando la concentracin relativa de los gases de la mezcla.
La difusin de gases mediante el sistema de agitacin que tena lugar en los fermentadores est sin embargo limitada en el cultivo de eucariotas que rara vez admiten velocidades de agitacin superiores a las 350 RPM.
Biorreactores airlift
Este tipo de biorreactores hace referencia a equipos que no utilizan sistemas de
agitacin y que para homogeneizar el cultivo mantienen un burbujeo desde la base
con la mezcla de gases adecuada. Las burbujas de gas arrastran las clulas hacia la
parte superior del reactor al mismo tiempo que oxigenan el medio de cultivo.
Adems, el medio oxigenado es ligeramente menos denso con lo que, junto a la
aireacin, se generan corrientes de conveccin que arrastran a las clulas a lo largo
de todo el vaso.
Los reactores airlift son muy adecuados para clulas especialmente frgiles o
que no admiten sustancias viscosizantes pero tienen el inconveniente de requerir
una relacin dimetro-altura muy baja, es decir, son altos y estrechos, lo cual plantea serios problemas en el escalado.
Clulas en suspensin y clulas dependientes de anclaje

Estos trminos hacen referencia al hecho de que una clula pueda vivir en una
fase lquida, tal y como ocurre con las clulas sanguneas o con muchas clulas
tumorales y transformadas o si por el contrario requieren una superficie a la que
mantenerse adheridas, como es el caso de los fibroblastos, por ejemplo. Las clulas
dependientes de anclaje incluyen un nuevo factor limitante a tener en cuenta a la
hora de disear el cultivo: la superficie disponible. Las clulas que deben crecer
asociadas a un sustrato lo hacen hasta alcanzar un cierta densidad ms all de la cual
no les es posible la divisin. Es el estado conocido como confluencia. Cuando el
cultivo llega a la mxima confluencia entra en fase estacionaria. Si en un cultivo de
estas caractersticas se desea obtener un mayor nmero de clulas que el alcanzado
es necesario separar las clulas del sustrato, diluirlas y resembrarlas sobre nuevas
superficies en el proceso que se conoce como subcultivo.
La necesidad de una superficie para el crecimiento de las clulas introduce nuevos factores de incertidumbre en el cultivo, relacionados con la influencia que el
material de soporte puede ejercer sobre el crecimiento celular y an sobre la expresin de los genes insertados. Existen diversos materiales susceptibles de soportar el
200
crecimiento celular entre los que el vidrio y el plstico ocupan lugares destacados.
Se dispone adems de diversos tratamientos para modificar plstico y vidrio aumentando su afinidad hacia las clulas.
El cultivo a gran escala de clulas dependientes de anclaje se puede asociar a
varios sistemas en los que se juega con la relacin superficie/volumen.
Un primer paso en el cultivo a gran escala de clulas dependientes de anclaje
son las botellas rodantes. Estas botellas son recipientes cilndricos en cuya pared se
adhieren y multiplican las clulas. El medio de cultivo no llena completamente la
botella, antes al contrario, deja una gran cmara de aire para facilitar el intercambio
de gases. Las botellas se emplazan en dispositivos que las mantienen rodando sobre
s mismas a velocidad constante para permitir el intercambio de gases y nutrientes.
Las botellas rodantes pueden ser de superficie lisa o presentar diversas morfologas
que aumenten su superficie.
Diversos fabricantes han presentado mltiples opciones para incrementar la
relacin superficie-volumen. De este modo se pueden encontrar productos como el
Spiracel de Sterilin, consistente en una botella rodante que incluye una lmina
espiral de plstico en su interior o el sistema de tubos de vidrio de Belco.
Ms all de las botellas rodantes existe toda una gama de mtodos para crecer
clulas dependientes de anclaje que buscan reproducir unas condiciones lo ms
fisiolgicas posibles. Se trata por lo general de sistemas perfundidos (con continua
renovacin de medio). Algunos de ellos son:
Multitray. Consiste en una coleccin de superficies paralelas para permitir el
anclaje de las clulas, encerradas en un contenedor. El ejemplo ms sofisticado es el Cell-Cube de Corning, que permite realizar cultivos entre 8.500 y
340.000 cm2 de forma perfundida.
Biorreactores de fibra hueca. Ofrecen una matriz fibrosa y repleta de canales
en los que introducen y multiplican las clulas y por el que perfunde medio de
cultivo. Este sistema permite muy elevadas densidades de clulas.
Cultivo en microcarriers
Los microcarriers o microportadores son partculas destinadas a servir como
soporte a las ADC (clulas dependientes de anclaje). Tales microcarriers (MC)
estn constituidos por materiales en principio inertes, que resultan adecuados para
la unin de las clulas. Las clulas se anclan a la superficie del MC y proliferan
sobre ella hasta alcanzar el grado mximo de confluencia. La utilizacin de MC
para el cultivo de ADC presenta una ventaja crucial sobre todos los otros mtodos
de cultivo en masa existentes para este tipo de clulas: los MC se introducen en un
biorreactor convencional y permiten tratar a las ADC como clulas en suspensin.
Consecuencias derivadas de ello son una mayor homogeneidad de las condiciones
de cultivo, la posibilidad de sacar muestras e incluso de observar las clulas al
microscopio, la posibilidad de recuperar fcilmente las clulas, y fundamentalmen-
201
te de poder disponer de un sistema de cultivo sencillo y fcil de controlar, que genera unas densidades de clulas y unas productividades superiores a otros mtodos de
cultivo existentes para ADC.
El uso de MC fue inicialmente publicado en los aos sesenta por van Wezel, que
utiliz partculas de una resina de intercambio inico, la dietil-aminoetil-sephadex
(DEAE) de Pharmacia . Posteriormente se utilizaron otras resinas de intercambio
inico; la constatacin de cierta toxicidad en estos materiales as como la aparicin
de nuevos sustratos y tratamientos fsico-qumicos para los mismos han dado lugar
a la aparicin de una amplsima gama de MC disponibles en el mercado. No existe
un MC universal que garantice el crecimiento y la produccin de cualquier tipo de
clula o material. Como de costumbre, cuando se habla de cultivos celulares, es
necesario probar hasta encontrar el sustrato ms adecuado para nuestra lnea celular e incluso para nuestra produccin.
Biorreactores de lecho fluido
Son sistemas de cultivo en los que no existe agitacin. Las clulas se crecen en
el interior de MC especiales, porosos y de gran tamao, generalmente fabricados en
colgeno, que reposan en la base del reactor y reciben una corriente de medio de
cultivo fresco y acondicionado. Las clulas disfrutan de un ambiente muy estable y
alcanzan altas densidades de crecimiento al desarrollarse en el seno de una matriz
porosa.
Monitorizacin de procesos
La biotecnologa farmacutica se ha incorporado en la industria como el nuevo
mtodo de produccin de principios activos. Es un procedimiento muy diferente de
los tradicionales de la industria, como la sntesis qumica o la extraccin, debido a
que utiliza un elemento completamente nuevo: organismos vivos. El uso industrial
de organismos vivos tiene una caracterstica que es a la vez un inconveniente, slo
son relativamente predecibles, lo que es especialmente notorio en el caso de las clulas eucariotas. Las clulas pueden ser extremadamente sensibles a factores ambientales, en ocasiones a elementos que no pueden ser controlados por los propios mtodos analticos. As pues, para garantizar la mxima reproducibilidad posible en los
mtodos de produccin, es necesaria una exhaustiva monitorizacin de los cultivos.
Qu controlar?
En un cultivo de clulas hay que asegurar que el ambiente que rodea a las mismas es el ptimo y que la variacin es la menor posible. Para ello hay que vigilar
muchos puntos:
202
El medio de cultivo
Normalmente se utilizan formulaciones especficas realizadas por fabricantes
industriales. Es normal que al fabricante se le exijan certificados de composicin del
medio, de origen de los componentes, especialmente de aquellos de origen animal
y garantas sobre la ausencia de determinados agentes adventicios. No es inusual
que en una produccin industrial se especifique por parte del cliente el tamao de
lote que se requiere para evitar la variabilidad debida a esta causa.
Mencin especial requiere el suero. Los sueros utilizados en la produccin farmacutica deben ser de origen conocido y garantizar su trazabilidad hasta los mataderos en que se recolecta la sangre. Naturalmente deben estar acompaados de anlisis que certifiquen la ausencia de micoplasmas. No es inusual que los propios
consumidores testen la capacidad del suero para facilitar el crecimiento de sus lneas celulares.
Una vez fabricado el medio de cultivo y antes de su utilizacin es imprescindible comprobar temperatura, pH y osmolalidad.
El agua
El agua utilizada en cultivos celulares debe ser bidestilada, apta para la administracin de inyectables conforme a normas USP.
Los materiales
Para evitar sorpresas desagradables, hay que asegurarse de que todos los materiales utilizados en el cultivo de clulas son inertes. Dentro de que se manejen calidades farmacuticas, siempre respetando las normas USP y equivalentes, es importante la realizacin de ensayos de toxicidad sobre cuantos materiales nuevos entren
en la produccin.
Tampoco hay que olvidar todos los sistemas de lavado, secado, acondicionamiento y esterilizacin de materiales directa o indirectamente relacionados con los
cultivos.
Las clulas
Las clulas utilizadas deben pertenecer a bancos controlados y analizados. Su
historia ha de ser trazable desde origen.
El cultivo
A lo largo del desarrollo del cultivo es necesario chequear el nmero de clulas
ya que la densidad de las mismas es un parmetro de vital importancia. Cuando se
203
producen protenas recombinantes es preciso monitorizar el nivel de excrecin.

Adems es frecuente la monitorizacin de parmetros metablicos, como el consumo de glucosa o la generacin de lactato y el control de la presin parcial de diversos gases.
El estudio de estos parmetros nos da una visin general de lo que ocurre en el
cultivo que nos puede permitir actuar sobre algunos elementos para garantizar las
condiciones ptimas de produccin.
Equipos de control
Los aparatos de control se basan en la utilizacin de transductores. Los transductores son aparatos capaces de transformar un tipo de energa en otro, habitualmente una seal elctrica. As nos encontramos con transductores de presin,
de temperatura (termmetros), qumicos (electrodos). Todos o la mayora de
ellos tienen cabida en un sistema de cultivo de clulas. La preparacin de medios
y soluciones requiere el empleo de pH-metros, termmetros, etc. Fermentadores
y biorreactores, as como sistemas perfundidos incorporan electrodos que monitorizan diversos parmetros a controlar en la produccin: pH, pCO 2, temperatura, densidad celular. Es habitual que estos equipos enven su seal a aparatos de
integracin y registro que representan la evolucin de los valores a lo largo del
tiempo.
Adems de indicar el valor que estn midiendo, los sistemas de control son susceptibles de ser programados con valores de referencia que generen acciones
correctoras sobre el sistema y que tiendan a mantener la condicin estable. Los
mecanismos de control pueden ser de dos tipos:
Regulacin de todo o nada. El controlador acciona el mecanismo efector
correspondiente hasta alcanzar el valor de consigna prefijado. Una vez alcanzado dicho valor, el efector se desactiva, volvindose a activar si se pierde
dicho valor.
Regulacin PID. El controlador recoge la lectura del valor y estima la segunda derivada de la funcin resultante en ese punto. En base a este dato y comparndolo con los valores ptimo y de histresis consignados, estima la oportunidad o no de activar o desactivar el efector. Este tipo de control es mucho
ms sofisticado que el sistema de todo o nada y permite un control mucho
ms ajustado.
Utilities y Layout
Identificamos como Utilities los servicios necesarios para llevar a cabo un proceso de produccin mediante Biotecnologa, y como Layout a las edificaciones destinadas a albergar el proceso.
204
A la hora de disear una planta de produccin hay que tener en cuenta tres elementos principales: las autoridades reguladoras, el tipo de proceso y las consideraciones ambientales.
Autoridades reguladoras
La venta en el mercado de un producto est condicionada por la necesidad ineludible de contar con el permiso de las autoridades sanitarias locales. Habitualmente
se viene tomando como referencia la Food and Drug Adminstration (FDA), autoridad reguladora de los Estados Unidos. Normalmente las autoridades reguladoras
exigirn distintos niveles de realizacin y de seguridad en la construccin y los servicios dependiendo de que nuestro producto est destinado a consumo humano, animal o agrcola. Tampoco el nivel de exigencia es el mismo si nos disponemos a
fabricar materia prima o producto terminado ni si ste tiene como forma final un
encapsulado o un inyectable.
Frecuentemente facilita las cosas la existencia de plantas que produzcan un producto de caractersticas similares cuya venta est autorizada y que su proceso haya
sido auditado.
Tipo de proceso
El sistema de fabricacin de la protena resulta esencial a la hora de establecer
la forma final de las instalaciones. Existen como hemos visto diversos sistemas de
cultivo de clulas a gran escala y todos ellos tienen sus ventajas y desventajas que
tambin alcanzan el terreno del diseo de salas y la eleccin de equipos. As por
ejemplo, un proceso de produccin en botellas rodantes requiere la construccin de
cmaras calientes de grandes dimensiones y la presencia de autoclaves y zonas de
flujo laminar habitualmente en mayor cantidad que un proceso realizado en fermentadores. Estos, por su parte, suelen requerir una gran variedad de servicios disponibles en el propio punto de fabricacin.
En el caso en que se utilicen biorreactores, no es lo mismo si se trata de un
proceso discontinuo que si se pretende realizar un proceso perfundido.
Normalmente, los cultivos de tipo batch se realizan en reactores de grandes
dimensiones que requieren salas amplias y techos altos. Los sistemas perfundidos
utilizan biorreactores de menor tamao que se ubican en salas de dimensiones
ms reducidas.
Es habitual que los biorreactores, especialmente si son grandes, lleven incorporados sistemas de limpieza y esterilizacin in situ. Tambin es frecuente que el
mximo posible de conexiones a servicios sea permanente.
En el siguiente cuadro se muestra la influencia que el mtodo empleado para el
cultivo ejerce sobre la construccin:
Cultivo discontinuo
205
Cultivo perfundido
Tamao de salas
Gran tamao. Techos elevados
Pequeo tamao. Techos bajos
Instalacin
Difcil
Sencilla
Integracin del reactor

y la sala
Muy integrados
Baja o moderada
Preparacin de medios
No son necesarias instalaciones

adicionales
Instalaciones especiales para

este fin
Purificacin/concentracin
Poco frecuente
Frecuente
Grandes volmenes
Volmenes pequeos
Dirigida por el cultivo

de clulas
No dirigidas por el cultivo

de clulas
Consideraciones ambientales
Cada proceso tiene sus requerimientos ambientales. Estos vienen dados generalmente por el riesgo de contaminacin de los cultivos y del producto. As pues, las
medidas para prevenir la contaminacin no son las mismas en una zona en que se
realiza un cultivo de clulas que en una sala en la que se concentra un eludo de una
cromatografa. Dentro de los cultivos, el riesgo de contaminacin es menor si se
trata de un cultivo tipo batch que si se trata de un cultivo perfundido que se debe
mantener varios meses. Por otra parte, el riesgo de contaminacin es mucho ms
alto en los cultivos de clulas que en los bacterianos.
Principales agentes causantes de contaminaciones
Trataremos de enumerar los agentes que pueden causar la contaminacin de un
cultivo de clulas y la forma de detectarlos. Ms adelante nos referiremos a medidas preventivas y correctivas.
Bacterias, hongos y levaduras. Son los ms habituales. En general resultan
sencillos de detectar puesto que suelen producir turbidez e incluso colonias
apreciables a simple vista o cuando menos al microscopio.
Micoplasmas. Los micoplasmas son bacterias de pequeo tamao y desprovistas de pared bacteriana, lo que les permite atravesar los filtros que retienen
bacterias, de 0,2 m, considerados habitualmente como esterilizantes. La presencia de micoplasmas es frecuentemente difcil de detectar debido a sus
requisitos para cultivo in vitro. Los sistemas habituales de deteccin de micoplasmas son el cultivo en condiciones especiales, la tincin diferencial
(Hoescht), mtodos inmunolgicos y ltimamente la deteccin de su ADN
mediante tcnicas de PCR. Algunas veces los micoplasmas pueden tener efectos citopticos y producir alteraciones visibles en los cultivos, tales como lisis
206
celular y turbidez y disminucin de la productividad en protenas recombinantes, pero es frecuente que los micoplasmas convivan con las clulas sin
manifestar ningn efecto.
Virus y retrovirus. Al igual que los micoplasmas, es frecuente que las infecciones por este tipo de agentes no provoquen cambios apreciables. Es pues
necesaria su identificacin mediante mtodos inmunolgicos o bioqumicos.
Prevencin de la contaminacin
El riesgo de contaminacin y los efectos econmicos de la misma sobre el proceso, marcan el nivel de inversin a realizar a la hora de prevenir las contaminaciones. Entre los elementos disponibles, algunos de los ms destacados son:
Tratamiento de aire. Consiste en la filtracin de aire por filtros de profundidad de distintas categoras. El aire filtrado se clasifica en funcin del nmero
de partculas por m3 y hora de muestreo. La clase 100 es considerada como
ambiente estril. Por encima de ella tenemos las clases 1.000, 10.000 y 100.000.
Cascadas de presin atmosfrica. Es posible regular el nmero de renovaciones de aire en una sala mediante la velocidad de impulsin y de salida del aire
de la misma. Merced a este sistema, se puede regular la presin atmosfrica en
una zona de trabajo. Las presiones de las distintas salas de una instalacin de
produccin se pueden regular para establecer el sentido de circulacin del
aire.
Esclusas de acceso. Un mtodo de aislamiento de una sala consiste en la creacin de un espacio intermedio en el que es posible regular la presin del aire
para evitar la mezcla de ambientes de dos salas contiguas.
Zonas de descontaminacin. reas en las que se realiza la desinfeccin de
materiales o personas que entran o salen de las zonas de produccin.
reas de cambio. Frecuentemente se requiere la utilizacin de vestuario especial para acceder a las zonas de produccin. Es importante construir dependencias en las que se realice el cambio de equipamiento de forma ordenada y
racionalizada.
En todo caso, no se debe olvidar que el principal vehculo de acceso de las contaminaciones son los propios operadores y que ninguna prevencin en el diseo de
instalaciones puede sustituir las normas de correcta fabricacin y la adecuada formacin del personal.
Impacto ambiental y bioseguridad

Todas las actividades fabriles suponen un riesgo para los trabajadores y para el
entorno. La industria farmacutica y ms concretamente la Biotecnologa, junto
207
con la investigacin cientfica en el campo de la Biologa no son una excepcin. Es

frecuente el uso de reactivos de gran peligrosidad (cidos, bases, neurotxicos) y se
trabaja sobre organismos vivos frecuentemente modificados genticamente cuando
no patgenos para el hombre o los animales domsticos. La ms incipiente actualidad en este terreno se centra sobre el esparcimiento en la naturaleza de seres que
han sufrido modificaciones genticas en el laboratorio, es decir, de cultivos transgnicos
La peligrosidad generada por la industria biotecnolgica y la investigacin cientfica en este campo se encuentra regulada por diversas directivas de la CEE, as
como la Ley de Prevencin de Riesgos Laborales y los diversos Reales Decretos
que la complementan. El marco jurdico que regula los riesgos de la Biotecnologa
es el siguiente:
Directiva 90/219/CEE. Referente a la utilizacin de organismos modificados
genticamente para usos comerciales o de investigacin.
Directiva 90/220/CEE. Sobre la liberacin internacional en el Medio
Ambiente de organismos modificados.
Directiva 98/81/CEE Por la que se modifica la directiva 90/219/CEE relativa
a la utilizacin confinada de organismos modificados.
Ley 15/1994 de 3 de junio. Por la que se establece el rgimen jurdico de la
utilizacin confinada, liberacin voluntaria y comercializacin de organismos
modificados genticamente a fin de prevenir los riesgos para la salud humana
y el medio ambiente.
Real Decreto 915/1997 de 20 de junio. Por el que se aprueba el reglamento
general para el desarrollo y ejecucin de la Ley 15/1994 de 3 de junio.
Ley de Prevencin de Riesgos Laborales (1995).
Real Decreto 664/1997 de 12 de mayo. Sobre la proteccin de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposicin a agentes biolgicos.
Directiva 98/24/CEE de 7 de abril. Relativa a la proteccin de la salud y la
seguridad de los trabajadores contra los riesgos relacionados con los agentes
qumicos durante el trabajo.
Real Decreto 833/1998 de 20 de julio. Por el que se aprueba el reglamento
para la ejecucin de la Ley 20/1988 bsica de residuos txicos y peligrosos.
Real Decreto 1078/1993 de 2 de julio. Por el que se aprueba el reglamento
sobre clasificacin, envasado y etiquetado de preparados peligrosos.
Al amparo de este conjunto de directivas, leyes y decretos, las agencias estatales o comunitarias correspondientes crean su propia documentacin en forma de
reglamentos, ordenanzas sugerencias o los conocidos guidelines que regulan a nivel
prctico las actuaciones y medidas pertinentes para proteger al medio ambiente y a
los trabajadores de los peligros que acarrea su actividad.
208
Clasificacin y prevencin de riesgos en las industrias biotecnolgicas

Los riesgos generados por la industria biotecnolgica son de tres tipos, biolgicos, qumicos y radiactivos.
Riesgos biolgicos
Se deben al tipo de organismo utilizado. Existe una completa clasificacin de
microorganismos en funcin del riesgo que entraa su manipulacin y su cultivo a
gran escala en el que se valora su capacidad de supervivencia en condiciones naturales, su capacidad infectiva y el tipo de dolencias que genera. La lucha contra el
riesgo biolgico se lleva a cabo mediante los sistemas de biocontencin.
Existen diversos mecanismos y sistemas para proteger a operadores y entorno de
los potenciales riesgos biolgicos. Estos mecanismos se agrupan en equipos de
seguridad o barreras primarias, instalaciones o barreras secundarias y las prcticas
de trabajo.
Entre las barreras primarias nos encontramos con las cabinas de trabajo, sistemas que aslan al operador del material biolgico, vestuario especfico y quipos de
respiracin.
Las barreras secundarias, o de construccin, hacen referencia a sistemas de esterilizacin, como los autoclaves, los pasillos especiales de acceso, duchas qumicas,
etctera.
Por ltimo, la buena prctica dentro del laboratorio se convierte en el elemento
esencial de todo sistema de seguridad. Una correcta metodologa de acceso a las
zonas y el respeto y escrupuloso cumplimiento de la normativa son la garanta para
alcanzar el nivel de bioseguridad requerido de una manera efectiva.
Riesgos qumicos
La Biotecnologa utiliza frecuentemente productos intermedios con caractersticas qumicas especiales que impiden su eliminacin por los cauces habituales.
Valores extremos de pH, componentes orgnicos o presencia de sustancias altamente txicas exigen protocolos especiales para su destruccin. Los trabajadores
ms afectados por estas sustancias son sobre todo analistas e investigadores que
deben utilizar las medidas de proteccin adecuadas para cada caso.
Al igual que con el riesgo biolgico, el factor fundamental de la seguridad es el
adecuado entrenamiento de los operadores y la existencia y cumplimiento de una
serie de normas de seguridad en las que se debe indicar el tipo de vestimenta a utilizar, la necesidad de guantes y mscaras protectoras, las condiciones de almacenamiento (humedad y temperatura), etc.
Como norma general, el almacenamiento de productos qumicos debe realizarse en lugares de acceso restringido, no expuestos a la luz directa ni a humedad excesiva o temperaturas extremas salvo para productos que lo requieran especficamen-
209
te. Los productos voltiles, tales como los solventes orgnicos, deben guardarse en
lugares ventilados para evitar la acumulacin de gases.
Exposicin a la radiacin
A escala industrial este riesgo se suele restringir a los analistas. Por lo general
es recomendable evitar la realizacin de pruebas radiactivas en las industrias. Si no
hay posibilidades alternativas, existen una serie de barreras fsicas basadas en la utilizacin de materiales como el plomo y el wolframio que son opacos a las radiaciones. En la construccin de instalaciones, dado el elevado coste de estos materiales, se utiliza el hormign. El personal que trabaja con radiactividad debe estar
sometido a un estricto control mdico y respetar escrupulosamente todas las normas
de seguridad relativas al manejo de fuentes radiactivas.
Gestin de residuos
Tras la proteccin de las personas, procede hacerse cargo de la proteccin del
ambiente, es decir, de la gestin de los residuos generados por el trabajo con productos biolgicos, qumicos o radiactivos.
Residuos biolgicos
En el nivel de bioseguridad 1, se considera que los residuos biolgicos generados no son peligrosos y pueden por lo tanto ser eliminados por las vas normales sin
ningn tipo de tratamiento adicional. En niveles de bioseguridad superiores se prevn diversas vas de eliminacin de slidos, lquidos y gases, todas ellas relacionadas con lneas de desage especiales, sistemas de esterilizacin y filtros. Los laboratorios de mayor seguridad filtran el aire que vierten al exterior.
Residuos qumicos
Las administraciones locales especifican la forma en que se deben eliminar los
diversos vertidos. En el caso de la Comunidad de Madrid, las vas de eliminacin
son las siguientes:
Medicamentos caducados y vertidos de alta toxicidad. Se debe contratar a una
empresa autorizada por la Comunidad que se encargue de la destruccin especfica
para cada sustancia. Existe normativa muy precisa sobre las condiciones de embalaje y almacenamiento de estos residuos.
Vertidos de baja toxicidad. Se eliminan a la red de alcantarillado despus de un
tratamiento que garantice que los valores de pH, conductividad, DBO y DQO se
encuentran dentro de ciertos lmites. Para que los vertidos alcancen esta situacin,
210
es necesaria la construccin de fosas de neutralizacin, depsitos en los que el vertido es tratado antes de su eliminacin.
Residuos radiactivos
La peligrosidad de los residuos radiactivos y por lo tanto su eliminacin vara
con la actividad, tipo de emisin y vida media de la fuente emisora. En general, las
instalaciones radiactivas deben proceder a una clasificacin de los residuos que
generan basndose en los parmetros mencionados. Las administraciones pblicas
se hacen cargo de estos residuos que deben cumplir condiciones muy precisas de
embalaje.
Las condiciones habituales de almacenamiento para residuos de alta actividad
dependen de su vida media. Se considera que por encima de 300 aos de vida media,
las administraciones no pueden garantizar el almacenamiento seguro de residuos
radiactivos en superficie por lo que las prcticas habituales consisten en el enterramiento a gran profundidad o adecuadamente embaladas en los fondos marinos.
Purificacin de protenas recombinantes

Una vez generada la protena de inters, la encontramos en situacin de
crudo, es decir, en un medio de cultivo modificado por el microorganismo o la
clula productora. A veces incluso, la protena puede encontrarse en el interior de
la clula que es incapaz de excretarla al entorno, siendo necesario un proceso de lisis
que libere el producto del interior de las clulas sin daarlo.
El proceso de purificacin debe asegurar la recuperacin del producto libre de
contaminantes. Dichos contaminantes son, adems de otras protenas, el DNA y los
pirgenos. En cada etapa de una purificacin se pierde parte del producto a purificar, lo que da a esta fase de la produccin un gran peso econmico dentro del proceso global.
El primer paso en la purificacin de la protena ser necesariamente la clarificacin del crudo que consiste en la filtracin del mismo a travs de filtros inertes de
las dimensiones adecuadas. Una vez realizada la clarificacin se suceden procesos
de cromatografa y concentracin.
Cromatografia
Es el proceso ms universalmente utilizado para purificar protenas. Se basa en
las interrelaciones de stas con matrices polimricas que exhiben diversas propiedades fsico-qumicas. Segn sean dichas propiedades se establecen las interacciones con las protenas y los distintos tipos de cromatografas. Los tipos de cromatografa posibles son los siguientes:
211
Filtracin molecular (Size Exclusion)

Separan las protenas en funcin de su tamao. Los geles utilizados en este tipo
de cromatografa son porosos y permiten el paso a su travs de protenas hasta un
cierto tamao. El tiempo que tardan las protenas en recorrer la columna es tanto
ms largo cuanto mayores son.
La relacin longitud-dimetro requerido en esta cromatografa debe ser entre
20:1 y 100:1, lo que hace difcil su utilizacin a escala industrial, al menos en fases
tempranas en que el producto suele suponer grandes volmenes.
Cromatografa de adsorcin
En este modelo se establecen uniones transitorias entre la protena a purificar y
el gel de cromatografa. Este tipo de unin puede ser producida por cargas elctricas (cromatografa de intercambio inico), por hidrofobicidad (cromatografa de
interaccin hidrofbica), por afinidad funcional tipo enzima-sustrato (cromatografa de afinidad) o por relaciones inmunolgicas (cromatografa de inmunoafinidad).
Garanta de calidad
A lo largo de este captulo hemos mencionado varias veces la importancia de los
mtodos y las buenas prcticas a la hora de garantizar la seguridad del producto, las
personas y el entorno. Existe un rea de las industrias farmacuticas, presente tambin en las biotecnolgicas como no poda ser de otra manera, que se ocupa de que
los productos fabricados sean aceptables y cumplan plenamente su funcin; estamos
refirindonos a los departamentos de Garanta de Calidad. La Garanta de Calidad
se ocupa de que todos los procesos se hagan de manera controlada, conforme a
mtodos descritos, plenamente documentados y respetando las GMP.
GMP
Es la abreviatura que designa los Good Manufacturing Practices (normas de
buena manufactura). Las GMP son un conjunto de normas que regulan el correcto
proceder a la hora de llevar a cabo un proceso industrial. Las GMP cubren un amplsimo espectro de temas, desde el tipo de materiales y acabados a utilizar hasta la
secuencia de documentos necesaria para la correcta realizacin de un proceso.
Las GMP no aparecen como tales en un solo documento ni constituyen una
doctrina esttica e inamovible. Antes bien, existen normas escritas, lneas de actuacin y recomendaciones de las autoridades sanitarias. Existe una continua renovacin de las GMP que procede de los registros de nuevos frmacos, de las inspecciones de las autoridades y del desarrollo de nuevas tecnologas.
212
Documentacin de procesos
Cuando se desea fabricar una sustancia para su venta como producto teraputico es preciso contar con la correspondiente autorizacin para su venta. Dicha autorizacin debe estar avalada, adems de por una serie de ensayos clnicos, por una
descripcin detallada del producto, de sus caractersticas qumicas y biolgicas y
del proceso seguido en su fabricacin. Es el registro del medicamento.
En el registro de un producto fabricado por biotecnologa figuran una descripcin del mtodo, de los equipos y de los controles analticos que se realizan as
como de los criterios que debe cumplir la sustancia en cada paso de la fabricacin
para acceder al siguiente. Este registro se entrega a las autoridades sanitarias y
constituye la documentacin de referencia a la que debe supeditarse toda documentacin de procesos.
En el punto de fabricacin debe contarse con una descripcin detallada y aplicable de todas y cada una de las operaciones que el personal debe realizar. Son los
llamados SOP (Standard Operating Procedures) o PNT (Procedimiento Normalizado de Trabajo). Los SOP hacen referencia a todo tipo de normas, desde la forma
de inocular un reactor hasta el orden en que debe vestirse una persona para acceder
al rea de trabajo o cmo debe procederse en la limpieza de un equipo.
A lo largo de la realizacin de un proceso se generan una serie de datos correspondientes a medidas, cantidades administradas, confirmacin de operaciones realizadas. Todos estos datos primarios se deben ir recogiendo en el momento y lugar
en que se producen. Los datos recogidos deben estar autentificados y comprobados.
El documento oficial que recoge los datos primarios del proceso es la gua de fabricacin o batch record.
Por ltimo, es esencial garantizar que las personas que trabajan en el proceso
conozcan el mismo perfectamente. Deben existir planes de formacin que cubran
este objetivo. La formacin de cada persona debe estar adecuadamente registrada.
A lo largo de la vida de un proceso de fabricacin es normal que ste vaya cambiando para incorporar nuevos materiales y avances tecnolgicos. Cuando la incorporacin de tales avances es contraria o se sale de lo indicado en el registro, es preciso comunicarlo a las autoridades sanitarias. stas valoran la importancia del
cambio propuesto por el fabricante y requieren la documentacin y las pruebas que
consideren procedentes para dar por vlido el mtodo de fabricacin modificado.
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Zaragoza Ed. Acribia 1989.
15
Presente y futuro de la Biotecnologa
en las ciencias de la salud: productos
obtenidos mediante biotecnologa
A. Campos de Olmo
Introduccin
Los rpidos y constantes cambios que se han vivido en las ciencias en general
nos han llevado a cambiar el modo de entender la investigacin, la medicina y la
tcnica.
Al hablar de biotecnologa, a la mayora de nosotros se nos agolpan en la mente
pelculas tremendistas con un mucho de ficcin cientfica y un algo de base cientfica o noticias no siempre bien tratadas sobre clonaciones, monstruos y eugenesia.
En la actualidad las caractersticas de las nuevas biotecnologas tienen tal potencial que han pasado de ser la cenicienta de los laboratorios a una disciplina con un
peso especfico tan grande que est modificando y obligando a revisar conceptos y
fronteras entre los diferentes campos implicados. As pues, hablamos de una disciplina multidisciplinar y multicultural en la que colaboran especialistas de campos
que tradicionalmente no tenan nada en comn.
Productos obtenidos mediante biotecnologa

en ciencias de la salud
La biotecnologa que debemos desarrollar en el presente siglo se fundamenta en
el proyecto Genoma Humano, farmacoqumica-macrocclica, diseo de frmacos,
diagnstico gnico ingeniera proteica y biomimtica, terapia gnica xenotrasplantes, etc.
La aplicacin prctica de todas estas especialidades ha llevado a obtener productos de difcil catalogacin en las rgidas estructuras de clasificacin tradicionales, as nos encontramos con vacunas que son anticuerpos y que a la vez son recom-
216
binantes y que se han diseado por ingeniera molecular y lo producen organismos

transgnicos.
Pero lo realmente importante de todo esto es que ya se tienen vacunas mucho
ms efectivas y sobre todo seguras y que proporcionan una inmunidad bastante larga. Por tcnicas de ADNr se han desarrollado cepas vivas atenuadas de V.
Cholerae que se usan como vacunas orales, tambin se ha dado un importante desarrollo en la generacin de vacunas de subunidades, sobre todo con el virus de la
hepatitis, las denominadas vacunas peptdicas y anticuerpos anti-idiotipos.
Otro punto a mencionar es el desarrollo de anticuerpos monoclonales partiendo
de los cultivos de hibridomas (clulas tetraploides resultantes de la fusin somtica de linfocitos B con clulas de mieloma). Su campo de aplicacin es muy amplio
y se pueden utilizar para eliminar selectivamente clulas que expresan un determinado antgeno (como ciertos antgenos asociados a clulas tumorales), se han desarrollado anticuerpos especficos de marcadores de diferenciacin celular para seleccionar poblaciones celulares (como en trasplantes de mdula sea) o frente a
mediadores solubles. Tambin son capaces de modificar el efecto de ciertas molculas antignicas o funcionar como reactivos para estudiar distribuciones tisulares
de protenas.
A continuacin haremos un breve repaso sobre el proceso de produccin industrial de hormonas recombinantes.
Produccin industrial de hormona de crecimiento

recombinante (r-hGH)
En la actualidad se comercializa hormona de crecimiento humana por parte de
varios laboratorios farmacuticos. Durante los ltimos treinta aos del siglo pasado
la obtencin de hormona de crecimiento se consegua por sistemas extractivos de
hipfisis de cadveres y a principio de la dcada de los ochenta se aplican tcnicas
microbiolgicas junto con la tcnica del ADN recombinante para obtener bacterias
productoras de somatropina.
No es hasta los primeros noventa con la aplicacin de la ingeniera gentica
junto con las tcnicas de cultivos celulares de eucariotas cuando se comienza a
obtener una hormona de crecimiento recombinante totalmente humana y en las cantidades y calidades necesarias para abastecer el mercado mundial.
Una primera fase fue la obtencin de una lnea celular apropiada. En nuestro
caso se trata de clulas de cncer de mama de ratn, clulas C127 que son dependientes de anclaje e inhiben su crecimiento por contacto. Se les introduce el gen de
la hGH humana y se obtiene un producto de altsima calidad al realizar estas clulas una modificaciones postranscripcionales (splicing de ARNm) y postransduccionales idnticas que en humanos (sobre todo la ltima glicosilacin, que en bacterias
no era completa e incorporaba distintos residuos con un ligero potencial antignico.
En estas clulas todas las modificaciones de maduracin de Prot, se realizan por
parte del retculo endoplasmtico y Golgi).
PRESENTE Y FUTURO DE LA BIOTECNOLOGA
217
Una vez conseguido este importante logro cientfico en laboratorios de investigacin comienza la fase de escalado para conseguir un proceso industrial. Siendo
ste un paso complicado es factible y alcanzable.
El ciclo de produccin tipo se compone de dos fases diferenciadas (Fig. 15.1).
1. Upstream
a) Subcultivos.
b) Produccin.
2. Downstream
a) Cromatografa de interaccin hidrofbica.
b) Cromatografa de intercambio inico.
c) Cromatografa de filtracin molecular.
CICLO DE PRODUCCIN DE r-hGH
Da de
trabajo
0
S1
S2
S3
54
H1H2H3
H14
Cultivo celular
70
84
Final de
Fin de la
produccin purificacin
Comienzo
produccin
Descongelar
ampollas
Figura 15.1.
S4
26
Produccin
(14 Cosechas)
90%
Purif.
Control de
calidad
Anlisis
Ciclo completo de un lote de produccin de r-hGH.
Upstream
Primeramente se genera un banco de clulas patrn (master cell bank = M CB) a
partir del cual se crean los bancos de clulas de trabajo (working cell bank = WCB).
Se mantienen las clulas congeladas en N2 lquido y almacenadas en viales o ampollas. Los envos de viales entre el MCB y el WCB se realizan en equipos especiales
que aseguran el mantenimiento de las condiciones ptimas durante todo el trayecto,
estando constantemente monitorizados por registradores de temperatura. La produccin de r-hGH comienza con la descongelacin de los viales del WCB. El nmero a
descongelar est directamente relacionado con el tamao final del lote de produccin.
Una vez descongelados los viales ser realiza un pool celular sobre DMEM
suplementado con suero fetal bovino (SFB) sembrndose todo sobre botellas rodantes (roller bottles = Rb) de 850 cm2 de superficie.
A estas botellas, por lo general entre 6 y 11, se les realizan varios cambios de
medio para producir el crecimiento del cultivo y fomentar la divisin celular.
Cuando el cultivo ha alcanzado la fase de confluencia se realiza el primer subculti-
218
vo. El objetivo de stos es ir aumentado el nmero de clulas productoras en el lote

lo que se acompaa, por tanto, de un incremento en el nmero de botellas rodantes.
La fase de escalado se completa con un cuarto subcultivo que fija el tamao de lote
en unas 3.000 botellas rodantes de 2.125 cm2 o 1.700 cm2 de superficie (la eleccin de
una u otra superficie viene condicionada por las necesidades de hormona. Actualmente tenemos capacidad para trabajar con un mximo de 3.600 Rbs de 2.125 cm2).
A partir del subcultivo 4 se comienza un paulatino proceso de aclarado y eliminacin de SFB del DMEM para dirigir el metabolismo celular a la produccin de la
hormona y no a la duplicacin celular.
La fase de produccin propiamente dicha se compone de 14 cosechas o harvest
durante los cuales se recoge entre 900 y 1.125 litros de medio de cultivo por da y
que contiene entre un 30-40 % de hormona en el total de protena. Las botellas, lgicamente, se rellenan con DMEM fresco.
Todos los procesos enumerados anteriormente se realizan de forma automatizada por robots ubicados dentro de cabinas de flujo laminar. El sistema est gestionado por un complejo sistema informtico que transmite rdenes precisas para que el
brazo robtico realice las tpicas fases en tcnicas de cultivos celulares (aclarado,
harvest, cambio de medio, tripsinizaciones, etc.). Destacar lo complicado de todas
estas operaciones, pues las instrucciones deben asegurar que el robot se mueva en
las tres direcciones del espacio, con movimientos suaves para que no afecten al cultivo y todo ello en tiempos compatibles con un proceso industrial (preferiblemente
dentro de una jornada laboral) (Fig. 15.2).
Figura 15.2. Robot trabajando con cultivos celulares. El brazo articulado se encuentra en el interior de un flujo laminar y es capaz de realizar todas las tareas propias de un laboratorio de cultivos celulares.
219
Todas estas manipulaciones se llevan a cabo en un laboratorio de cultivos celulares con tcnicos muy cualificados que deben trabajar en condiciones de sala blanca. Todo el laboratorio cuenta con un ambiente controlado en temperatura, humedad, calidad y renovacin del aire durante todos los das del ao.
La totalidad de las Rb del cultivo se mantienen constantemente en movimiento
rotatorio en unos armarios denominados comercialmente como roller cell y que
cuentan con una capacidad de 100 botellas cada uno. De esta forma nos aseguramos
que la monocapa celular se encuentre siempre baada por el medio que le aporta los
nutrientes necesarios. Los roller cell se introducen en cmaras calientes que mantienen temperaturas de 36.5 C y slo se permiten variaciones de + 0,2 C.
UPSTREAM
Da 0
Da 28
Da 54
Crecimiento
Cosecha
Descongelacin
Lote 1
Lote 2
Lote 3
18 Lotes al ao
Subcultivos
(8) X
Ampollas
WCB
Botellas rodantes
850 cm2
Botellas rodantes
1.700 cm2
(3.000)
30
Figura 15.3.
Esquema de la fase de produccin de la hormona de crecimiento.
220
Una parte importante de todo el proceso es la logstica de materiales y soluciones. El ingente volumen de DMEM y tampones necesario por operacin requiere de
sofisticados sistemas de esterilizacin. Los materiales de vidrio, plstico o acero
resistentes al autoclave se lavan previamente en mquinas especiales que utilizan
agua purificada para minimizar los contaminantes qumicos en los materiales que
vayan a estar en contacto con las clulas. Los equipos que no caben en los autoclaves pasan por sistemas de esterilizacin CIP-SIP. Todos los lquidos que se preparan para su uso en los cultivo de clulas o determinados pasos del proceso de purificacin se esterilizan por filtracin en carcasas de 20 pulgadas.
Los ciclos de los autoclaves y las mquinas lavadoras son especficos para
cada tipo de material y volumen de carga. Estn validados en las condiciones de
uso conforme a los requisitos que marcan las reglamentaciones vigentes y toda la
documentacin generada durante la fabricacin de un lote de produccin se almacena en registro escrito durante 10 aos despus de la caducidad del producto en
el mercado (en realidad estamos hablado de periodos de tiempo cercanos a los 30
aos.)
El abastecimiento de agua para inyeccin (WFI) es crucial para la preparacin
del medio de cultivo y las distintas soluciones de la fase de purificacin. En la planta contamos con un lazo de agua WFI que la mantiene constantemente a 80 C y en
circulacin para evitar el crecimiento de microorganismos. El sistema se completa
con unas clulas de luz UV que esteriliza el agua por radiacin. Todo el complejo
productor de agua se controla exhaustivamente incluyndose caracterizacin orgnica e inorgnica (conductividad y TOC) y monitorizacin continua, lo que asegura una calidad constante y, lo que es muy importante, estable (Fig. 15.3).
Downstream
El proceso de purificacin de hormona aprovecha tres caractersticas de la hormona de crecimiento:
1. Interaccin hidrofbica: en esta primera etapa se utiliza una columna de
phenyl-shepharosa que se carga con el harvest salado. Se recoge un pico
caracterstico del cromatograma (Abs a 280 nm).
2. Cromatografa de intercambio inico: Se aprovechan las regiones polares
de la hormona para retenerla en el gel. En esta etapa se usa una columna de
DEAE sepharosa que se carga con los eluidos obtenidos en la fase PS. El
pico del cromatograma se recoge en seis fracciones que incluyen los coleos de la curva del cromatograma. En este paso la pureza de la hormona es
ya de un 85 %.
3. Cromatografa de filtracin molecular: En este paso los contaminantes
son en realidad agregados (tetrmeros) y dmeros de la hormona. El pool
DEAE se ultracentrifuga y se carga una columna de ultragel ACA54. Esta
columna est compuesta de varios discos interconectados entre s, pues de
221
lo contrario tendra una altura cercana a los 6 metros. El cromatograma nos

separa tres picos que se corresponden con los diferentes agregados y se
recoge el monmero. Todo el eluido se dosifica y se obtiene una hormona
purificada al 90 %. En un sencillo ltimo paso se obtiene r-hGH al 99 %.
Algunas de estas columnas tienen dimetros de lecho de 60 cm e incluso de 1
metro! El lector acostumbrado a trabajar en condiciones de laboratorio sabr valorar el dato en toda su magnitud (Fig. 15.4).
Las especificaciones durante el control en proceso (IPC) se basan en la identificacin y pureza del producto final (SDS-PAGE, RP-HPLC y SE-HPLC), valoracin
(SE-HPLC y OD a 276 nm) y microbiologa (carga bacteriana, endotoxina, micoplasma y transcriptasa inversa).
Todo el proceso de produccin se encuentra estrechamente vigilado por un
estricto control de calidad que se basa en especificaciones generados a partir de
leyes y organismos reguladores nacionales e internacionales (NDA, FDA, y distintas farmacopeas como USP, PhEUR).
COSECHA
(1 cada 2 Das)
(14 por lote)
PURIFICACIN r-hGH
PS
Cromatografa de interaccin hidrofbica
40 C (+/5)
FROZEN
r-hGH
PS1
PS2
PS13
PS14
r-hGH
LOTE
DEAE
AC
54
Cromatografa de interaccin inica
Filtracin molecular
Filtracin y dosificacin
r hG
LOTE
90%
Figura 15.4. Proceso de purificacin de r-hGH. (Esquema cortesa Dpt. Purificacin SERONO.
Tres Cantos.)
222
Produccin industrial de r-hFSH

Utilizando los ltimos avances en cultivos celulares, la produccin industrial de
r-hFSH se basa en la tecnologa de microportadores en biorreactores de clulas
eucariotas. En este caso la clula vector es de ovario de hmster chino (clula
CHO). La ventaja de estas clulas es que presentan patrones de glicosilacin postrancripcional idnticos a humanos, incorporando correctamente los restos de cido
silico, galactosa, manosa y fucosa con lo que la hormona obtenida es totalmente
humana. De estas clulas se conoce perfectamente su biologa celular, son fcilmente cultivables en laboratorio y secretan el producto al exterior.
Igual que en el caso anterior el proceso industrial se divide en dos fases.
1. Upstream:
a) Proceso de cultivo celular o escalado (36 das).
1. Descongelacin de viales de WCB.
2. Expansin celular en frascos T o botellas rodantes.
3. Tripsinizacin y mezcla con el lecho de microportadores y transferencia al biorreactor.
b) Produccin de r-hFSH (34 das).
1. Fomentar el anclaje y el crecimiento celular.
2. Dirigir el metabolismo celular para la produccin de hormona.
3. Recoleccin (16 harvest).
2. Downstream:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Ultrafiltracin.
Cromatografa.
Inmunoextraccin de r-hFSH.
Cromatografa y RP-HPLC.
Ultrafiltracin.
r-hFSH purificada al 99 %.
La aplicacin de biorreactores a la produccin de hormona es una tcnica muy

novedosa a escala industrial. En nuestro caso utilizamos equipos de flujo continuo
de ms de 50 litros lo que permite una recogida de tres harvest cada 24 horas.
Modificacin gentica en animales. Transgnicos.

Introduccin
A finales del siglo XX los bilogos moleculares y celulares, en sus laboratorios,
han sido capaces de identificar, aislar y modificar genes en multitud de especies
incluida la humana.
223
El segundo paso fue desarrollar tcnicas que permitiesen introducir esos genes
en clulas y organismos vivos para poder estudiar sus funciones y efectos.
En 1982 los doctores. Brinster y Palmiter fueron los primeros en fabricar ratones gigantes obtenidos por la modificacin del gen de la hormona del crecimiento. Demostraron as la posibilidad de alterar de modo permanente caractersticas en
animales y durante todo su ciclo vital.
Desde entonces han producido varios miles de lneas de animales transgnicos
y no slo ratones. Algunas de estas modificaciones buscan obtener modelos vlidos
de enfermedades humanas en animales para disear y ensayar nuevas terapias.
El concepto de transgn
Estructuralmente, un transgn es idntico a un gen que se expresa in vivo, por
tanto debe contar con secuencias reguladoras y el gen estructural:
1. Gen estructural: secuencia de bases que codifica la informacin gentica
necesaria para la sntesis del producto de inters. Actualmente se dispone de
varios miles de genes clonados y ya se ha anunciado la secuenciacin completa del genoma humano.
2. Elementos reguladores: secuencias responsables de la expresin y regulacin
del gen determinan los tipos celulares y tejidos en los que el transgn ser
funcional.
Tcnicas de generacin de animales transgnicos

Microinyeccin pronuclear
Es el primer mtodo desarrollado, se inici en el ratn y es el ms ampliamente
utilizado. Permite la adicin del gen exgeno a todas las clulas del animal incluso
las de lnea germinal con lo que pueden transmitir el transgn a su progenie.
Las hembras donantes de embriones son tratadas previamente con hormonas
para inducir una superovulacin. A continuacin se cruzan con machos frtiles y
posteriormente a la monta (por aparicin de tapn vaginal) se sacrifican para recoger los embriones producidos. Los embriones se recogen en estadio de dos proncleos y son necesarios varios cientos por experimento. Los embriones se mantienen
en placas de cultivo y en un microscopio dotado de un sistema de micomanipuladores, se sujeta mediante una pipeta de sujecin. Con una finsima aguja de vidrio
(dimetro inferior a 1 mm) se le inyecta en uno de sus proncleos (normalmente el
paterno) una solucin inocua cargada con entre 20 y 200 copias del transgn. Los
embriones as tratados son implantados en grupos a varias madres adoptivas en
las que completarn su desarrollo. Una vez terminada la gestacin y mediante tcnicas de anlisis del ADN como PCR o Southern blot se identifican los animales
224
transgnicos (si hay alguno, pues la eficacia de la tcnica no supera el 5-15% para
construcciones gnicas no muy grandes y con tcnicos muy experimentados) y a
travs de un sistema adecuado de cruzamiento se obtienen las lneas transgnicas
de inters.
Transgnicos Knock Out

Permite la mutagnesis de genes en ratones. Su desarrollo se basa en el establecimiento de lneas de clulas madre embrionarias (ES) derivadas de la masa celular
interna del embrin que una vez transferidas a blstulas pueden dar lugar a cualquier lnea celular del ratn (totipotencia).
El gen exgeno se integra gracias al mecanismo conocido como recombinacin
homologa. Este sistema se suele utilizar para estudiar la funcin de un gen pues la
forma salvaje se sustituye especficamente por el transgen de inters. Otra aproximacin consiste en la inactivacin de un gen, en cuyo caso la modificacin afecta
a la totalidad del organismo.
Con este sistema se obtuvieron los primeros ratones transgnicos en los aos
ochenta y es una tcnica que se encuentra actualmente en auge en investigacin
bsica aplicada a la clnica.
Mutagnesis condicional. Sistema Cre/lox P

El sistema Cre/lox se basa en la capacidad que tiene la enzima recombinasa Cre
(bacterifago P1) de reconocer una secuencia de ADN llamada lox P. Si encuentra
dos copias de la secuencia lox P con igual orientacin, se produce una recombinacin en la que se ve interesado el fragmento de ADN qu est entre ellas. Es decir,
la accin de Cre elimina o sustituye (segn en que condiciones) ese fragmento. El
desarrollo del sistema recombinasa Cre-secuencia de reconocimiento lox P ha
permitido trabajar en modificaciones casi puntuales y especficamente dirigidas
sobre el genoma del ratn. La cualidad ms sobresaliente de este novedoso sistema
es la capacidad de inactivar la funcin de un gen tan solo en aquellas clulas del
organismo que expresen la recombinasa Cre.
Para producir transgnicos por este sistema se necesitan dos lneas diferentes de
ratn (la primera creada por mutagnesis dirigida y la segunda por microinyeccin
pronuclear):
1. Un ratn portador del gen floxeado (flanqueado por las secuencias lox
P).
2. Un ratn que exprese Cre en un tejido diana.
Del cruce de ambos (a ser posible de distinto sexo) obtendremos un individuo
que ha perdido el gen floxeado en los tejidos diana que expresan Cre.
Un esquema con dos de los sistemas se presenta en la Fig. 15.5:
225
Gen endgeno
Obtencin de
embriones
Recombinacin homloga en clulas ES

lox P
lox P
Gen flanqueado por secuencias lox P

Microinyeccin e integracin del transgn
X
Ratn portador gen
loxeado
lox P
Ratn expresando Cre en

partes de sus tejidos
lox P
Promotor
Cre
Transferencia a madre
adoptiva
El gen loxeado se pierde en los
tejidos que expresan Cre
Identificacin de
transgnicos
Figura 15.5. Esquema transgnicos. (A): Esquema de transgnesis por microinyeccin pronuclear. (Foto cortesa de Dept. de Biologa Molecular y Celular CIEMAT). (B): Esquema de transgnesis en sistemas inducibles crelox.
Los transgnicos en la industria

Hasta el momento solo se ha hablado de ratones transgnicos con aplicaciones
en experimentacin bsica y/o clnica. Pero una tcnica con tantas posibilidades no
queda fuera de los procesos industriales por mucho tiempo.
En 1985 se publican los primeros xitos en la produccin de conejos, ovejas y
cerdos transgnicos. Sin embargo la tcnica tiene limitaciones, como ya se ha indicado anteriormente se necesitan muchos embriones y muchas madres de alquiler
para obtener un animal transgnico. En el caso de roedores (como el ratn o el conejo) el elevado numero de cras por camada, su relativa facilidad de cra y su rpido
desarrollo permiten obtener buenos resultados a medio plazo con lo que el establecimiento de lneas animales productoras es complicado pero abordable.
En el caso de animales como ovejas, cerdos, vacas o cabras las eficiencias de la
tcnica bajan espectacularmente (entre el 1 y el 2 % de los embriones manipulados
dan lugar a animales transgnicos. A nadie se le escapa que conseguir 50 embriones
de vaca, manipularlos, implantarlos en otras tantas vacas nodrizas y esperar el nacimiento de terneros trasnsgnicos es un proyecto muy largo y costoso (el proceso de
gestacin en las vacas es de nueve meses, pero luego hay que esperar a tener individuos adultos y del sexo requerido) y sin una seguridad de xito a medio plazo,
pues en ocasiones no se pueden regular todos los factores de los sistemas biolgi-
226
cos lo que provoca en ocasiones que el transgn no tenga ningn efecto o su efecto
sea negativo.
De todas formas existen pequeos rebaos de ovejas, cabras y vacas transgnicas que producen en la leche diferentes protenas de inters comercial.
Los conocimientos de la glndula mamaria y su capacidad de generacin lctea
de manera ms o menos continua y estable y la relativa facilidad de separacin de
productos en la misma, han ayudado a ello:
1. Produccin de frmacos en leche. En la produccin de protenas con carcter
teraputico en este tipo de animales se pueden conseguir concentraciones de
incluso 1 a 10 g/l. La caracterizacin de los elementos reguladores de la
expresin de distintos genes codificantes de protenas lcteas ha permitido su
empleo para dirigir la sntesis de protenas de inters en la leche de hembras
transgnicas, con eficiencias del orden de 1 a 40 gramos de protena por litro
de leche producida (calcitonina, _-1-antitripsina, antitrombina III, factores de
coagulacin. Como ejemplo de los problemas que pueden surgir en la aplicacin industrial de estas tcnicas mencionaremos el caso del factor activador
del plasmingeno humano. Cabras transgnicas que generaban de 1 a 7 g/l de
esta protena en leche, tenan perodos de lactacin muy cortos y presentaban
signos similares a la mastitis debido a la insolubilidad del plasmingeno a esas
altas concentraciones. El mayor problema que se plantea en estos casos es el
conseguir lotes de produccin estables y consistentes que puedan abastecer un
mercado muy exigente. Normalmente las producciones de referencia en artculos suelen contabilizar un nmero muy reducido de animales y adems
estos animales se ven afectadas por las diferentes estaciones, el clima, la alimentacin y las enfermedades que suelen contraer de manera natural.
2. Leche humanizada. Los intentos principales se dirigen a producir leches
humanizadas enriquecidas (ricas en lactoferrina) para minimizar intolerancias alimentarias.
De todas maneras en 1998 se pusieron en marcha protocolos de ensayo clnico para
protenas recombinantes que se extraan de diferentes animales transgenicos como la
alfa-glucosidasa de conejo (actualmente en fase II) y la antitrombina III de cabras
transgnicas (fase III). An no est resueltos ciertos problemas de bioseguridad y regulacin y no se conocen los efectos de una posible interferencia de secuencias retrovirales.
Produccin de rganos para xenotrasplantes

Actualmente la tcnica de trasplante de rganos (tanto en ciruga como en control del rechazo) es de uso comn y es la falta de donantes lo que limita el uso de la
misma (se estima en un 50 % los trasplantes que no se realizan por falta de donantes). La posibilidad del xenotrasplante (trasplante entre distintas especies) como
alternativa, pasa por evitar el rechazo hiperagudo. Este rechazo viene provocado por
227
la unin de anticuerpos del organismo receptor a molculas xenorreactivas del tejido trasplantado y que desencadena la activacin del sistema del complemento, que
se traduce en alteraciones de los vasos del rgano injertado.
Se han generado cerdos con protenas humanas reguladoras del complemento
as como cerdos con bajos niveles de xenorreactivos, en un intento de evitar el
rechazo hiperagudo del trasplante.
El uso de rganos de estos cerdos transgnicos, unido a los moderadores de
rechazo utilizados en trasplantes humanos, permiti notables resultados en xenotrasplantes cerdo-mono. El uso de este tipo de rganos est actualmente condicionado a la posibilidad de transmisin de enfermedades vinculadas al xenotrasplante.
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16
Biologa molecular y endocrinologa:
El ejemplo de los animales
transgnicos
J. Reventos, D. Martnez-Selva, O. Martnez-Tirado,
T. Pino, F. Munell
Introduccin
En septiembre de 1980, Gordon et al. consiguieron el primer xito en la produccin de un animal transgnico (1). Ello consisti en incorporar de forma permanente un gen clonado previamente en el genoma del embrin de un mamfero, en
este caso, de un ratn. Estos autores acuaron el trmino transgnico para referirse
a estos ratones (2). Este trmino es el usado actualmente para referirse tanto a animales como a plantas a los cuales se les ha transferido artificialmente material
gentico que en principio no poseen naturalmente.
Cules son las razones por las que esta tecnologa la creacin de animales
transgnicos ha revolucionado de forma tan notable la investigacin en biologa
y medicina y ha permitido este sustancioso avance en la comprensin de la regulacin gentica y del desarrollo embrionario? (3).
La repuesta a esta pregunta podra resumirse de la siguiente manera: los genes
inyectados se expresan correctamente en los ratones. Sabiendo que la distribucin
tisular de la expresin de un gen, as como su regulacin durante el desarrollo, estn
controlados por secuencias de ADN situadas muy cerca del gen mismo, se podr
dirigir la expresin de stos a voluntad del investigador siempre y cuando dichas
secuencias reguladoras (promotores y enhancers) se siten por delante del gen que
se quiere expresar. Este descubrimiento fue realizado por Brinster et al (4) al dirigir el gen de la timidin quinasa del herpes hacia el hgado de ratones transgnicos,
poniendo adems este gen bajo el control del promotor del gen de la metalotionina
de ratn, que normalmente se expresa en el hgado.
230
Mtodos utilizados para generar animales transgnicos

Mtodos clsicos
Los primeros ratones transgnicos fueron realizados por el mtodo de microinyeccin (2) en el proncleo, aunque actualmente existen otros tres mtodos que son
tambin de gran utilidad para la produccin de estos animales. stos son la infeccin de embriones por retrovirus portadores del gen que se quiere transferir (5), la utilizacin de clulas pluripotenciales embrionarias previamente transfectadas con
ADN (6) y la trasferencia gentica mediada por espermatozoides (los detalles de los
cuatro mtodos para producir animales transgnicos pueden verse en detalle en las
Figuras 16.1, 16.2, 16.3 y 16.4). Estos mtodos tienen ventajas e inconvenientes
cuando se comparan entre s. Los puntos principales de esta controversia se hallan
resumidos en la Tabla 16.1.
Transferencia mediada por espermatozoides

A mediados de los ochenta, en Roma, en el laboratorio de Corrado Spadafora,
se desarroll un mtodo nuevo para crear animales transgnicos que se denomin
transferencia gnica mediada por espermatozoides (7). El mtodo en cuestin consista en incubar el ADN que se quera introducir en el ratn transgnico con espermatozoides de ratn. Despus de dicha incubacin se proceda a fertilizar in vitro
vulos de un ratn hembra donante con dichos espermatozoides. El resultado era la
incorporacin del ADN externo en algunas de las cras resultantes (Fig. 16.4). La
aparicin de este mtodo fue ampliamente discutida por la comunidad cientfica que
no consigui repetirlo en otros laboratorios. Sin embargo, en un pasado ms reciente, han seguido apareciendo publicaciones de distintos laboratorios confirmndose
su validez.
Recombinacin homloga
Los genetistas de las levaduras fueron los primeros en observar que un ADN
externo transferido a una clula de levadura se integraba en el mismo locus que el
gen endgeno. Ese mecanismo se denomin recombinacin homloga, a diferencia
del anteriormente descrito que era al azar o recombinacin no-homloga. Poco
tiempo despus se conoci que este tipo de recombinacin tena tambin lugar en
las celulas de mamferos pero en una frecuencia bajsima de aproximadamente
1:1.000. El descubrimiento importante lleg de las manos del laboratorio de Mario
Capecchi, en la Universidad de Utah, con la propuesta del mtodo de seleccin llamado positivo-negativo (8) que permita identificar esta recombinacin homloga
entre otras 999 no-homlogas (ver detalles en la Figura 16.5, en su leyenda y en la
referencia (9)).
BIOLOGA MOLECULAR Y ENDOCRINOLOGA: EL EJEMPLO DE LOS
231
Embrin unicelular
en estadio
pronuclear
ADN ajeno
Microinyeccin en el proncleo
Implantacin
oviductal
Pseudogestante
Identificacin de animales con el gen
Southern-blot
Reaccin
en cadena
de polimerasa
Figura 16.1. El gen que se quiere transferir se inyecta normalmente en el proncleo masculino
de un embrin unicelular, con la ayuda de un microscopio y de un micromanipulador. Estos
embriones se obtienen a partir del oviducto de hembras normales inmaduras superovuladas con
FSH y LH que han sido cruzadas el da anterior con machos frtiles normales. Despus de inyectarlos, los embriones manipulados sern transferidos al oviducto de una hembra pseudogestante, es decir que ha sido cruzada el da anterior con un macho estril. Esta madre portadora dar
a luz a cras que habrn incorporado o no el gen inyectado (esto se detectar a travs de un
Southern blot o estudio del ADN de las cras por PCR). Las cras que posean el gen (muestra
nmero 3 en la Figura ), se irn cruzando progresivamente entre s hasta obtener la lnea de animales transgnicos.
232
Vector retroviral
infeccioso
Embriones de ratn
Clulas productoras
de retrovirus
Insercin del
ADN retroviral
en el genoma
Ratn con ADN retroviral
Figura 16.2. Transferencia de genes mediada por retrovirus. El grupo de Rudolph Jaenisch fue
el pionero en la utilizacin de los retrovirus como vectores para transferir genes en embriones de
ratn. Estos son desprovistos de la zona pelcida y puestos en contacto con clulas productoras
de virus (Moloney Murine Leukemia Virus, en la figura). Una vez inyectados, los embriones sern
implantados en una hembra portadora pseudogestante.
ADN ajeno
Inyeccin de clulas pluripotenciales

transfectadas en blastocitos
normales de ratn
Clulas pluripotenciales
(stem cells)
Ratn normal
Ratn
quimrico
Hbrico F1
El 50% es portador del nuevo gen
Figura 16.3. Utilizacin de clulas pluripotenciales (stem cells) para crear animales transgnicos. Las clulas pluripotenciales existen en lneas establecidas a partir de embriones de ratn.
Estas clulas pueden ser mantenidas indefinidamente en cultivo y se les puede transfectar el ADN
que convenga. Las clulas as manipuladas sern a continuacin inyectadas en los blastocitos de
ratones normales y posteriormente implantadas en las madres portadoras. Los ratones resultantes, que sern quimeras, sern cruzados con ratones normales hasta obtener la lnea de ratones
transgnicos.
233
Esperma
de ratn
ADN ajeno
El ADN ajeno
se incorpora a
los genes del ratn
vulo
de
ratn
Figura 16.4. Transferencia gnica mediada por espermatozoides. Este mtodo se basa en el
hecho de que el esperma maduro tiene la capacidad de incorporar ADN exgeno al ponerlo en
contacto con l. Los espermatozoides de ratn obtenidos a partir del epiddimo son incubados con
el ADN de inters que se desea transferir. Dichos espermatozoides incorporarn el ADN y sern
posteriormente utilizados en un proceso de fertilizacin in vitro. Los embriones as fertilizados
sern reintroducidos en el oviducto de hembras pseudogestantes y las cras transgnicas identificadas como se describe en la leyenda de la Figura 16.1.
234
Tabla 16.1. Comparacin de las ventajas e inconvenientes de los tres mtodos ms

comnmente utilizados para producir animales transgnicos
Mtodo
Ventajas
Inconvenientes
Microinyeccin
Tcnicamente fcil, alto

nivel de expresin.
Existencia de cambios importantes en

los cromosomas (concatmeros).
Infeccin por retrovirus
Tcnicamente fcil,
integracin de una sola
copia de ADN, lo que facilita
la posterior clonacin.
Bajo nivel de expresin. Limitacin

de tamao de ADN que se puede
inyectar.
Utilizacin de clulas
pluripontenciales
Se puede seleccionar antes

de producir el animal.
Tcnicamente muy difcil.

La transmisin a las lneas celulares
germinal no siempre ocurre (quimeras).
Eliminacin de una alelo en un animal:

el ejemplo de los ratones knock-out
La estrategia de la recombinacin homloga, ampliamente utilizada en la actualidad, permite, no solo expresar el gen de inters bajo control de los promotores
endgenos existentes en el genoma del receptor, sino la misma sustitucin del gen
endgeno, evitando pues su expresin, por un nuevo gen externo o construccin
gnica que se desee insertar (10). Esta metodologa permiti, adems de la transgnesis convencional, en este caso dirigida, la eliminacin de un gen de forma selectiva. Los animales resultante de dicha manipulacin se han denominado alelos
nulos o knock-outs. Conceptualmente, estos modelos representaran los opuestos a los transgnicos clsicos en los que se sobreexpresaba un gen externo de inters. Estos modelos estn contribuyendo de forma extraordianaria al establecimiento de la funcin de los genes y de sus correlaciones entre genotipos y fenotipos.
Veremos en el curso de esta revisin algunos de los modelos de knock-out ms
relevantes en la endocrinologa.
Animales transgnicos de expresin inducible

Sin embargo, cuando un gen, ya sea sobreexpresado o anulado por transmisin
germinal en un animal transgnico, est presente en dicho animal desde el inicio del
desarrollo embrionario, ste puede en muchas ocasiones hacer inviable el desarrollo del animal y por tanto la no obtencin del modelo deseado. Esta estrategia, til
en muchos ejemplos, puede no serlo en otros. Para ello, varios grupos han diseado un modelo de animal transgnico inducible externamente o condicional. Este
mtodo de expresin inducible y tejido-especfica, basado tambin en la recombinacin homloga, se fundamenta en el sistema de recombinacin Cre-loxP (11,12)
(vase Fig. 16.6).
235
Gen clonado X
interrumpido por la
insercin del gen aph
Gen tk
Recombinacin
homloga
Recombinacin
no-homloga
aph
tk
Clula resistente al G 418

y sensible al ganciclovir
aph
Gen X interrumpido, clula
resistente al G 418 y al ganciclovir
Figura 16.5. Seleccin positiva-negativa para identificar los eventos de recombinacin homloga. El gen clonado X ha sido interrumpido por la insercin de un gen aph (que codifica para la
resistencia al anlogo de la neomicina G418). En direccin 3 se ha clonado un marcador tk. La
incorporacin de un marcador positivo se utilizar para seleccionar las clulas que hayan incorporado el vector de ADN despus de la transfeccin. La prdida del marcador negativo se utiliza
para distinguir las clulas que han incorporado la construccin al azar de las que lo han incorporado por recombinacin homloga. El marcador negativo est clonado en un extremo de la construcccin, donde hay una regin de no homologa entre el vector de inyeccin y el ADN cromosmico. Cuando la recombinacin homloga tiene lugar, esta zona es eliminada por la maquinaria
que gobierna la recombinacin homloga, y las clulas adquieren la capacidad de sobrevivir en
un medio selectivo que contenga el anlogo de la timidina ganciclovir. En las clulas que han
incorporado el ADN al azar, la presencia de un tk activo permitir la seleccin con ganciclovir.
Ejemplos de utilizacin de los animales transgnicos

en biomedicina
Los animales transgnicos se han utilizado para resolver una gran variedad de
problemas que la biologa tiene planteados, principalmente relacionados con la
regulacin gnica. En la segunda parte de esta revisin, presentamos brevemente
algunos de los trabajos de ms relevancia en campos tan distintos como la oncolo-
236
ga, la inmunologa, la terapia por genes, la endocrinologa (vanse revisiones en (13)

y (14), etc.
Oncologa
La posibilidad de introducir en animales genes potencialmente oncognicos clonados a partir de virus o de clulas tumorales, ha permitido estudiar detalladamente la funcin que tales genes pueden desempear en el desarrollo y en la evolucin
del cncer (3).
La introduccin en ratones del oncogn c-H-ras unido al promotor de la elastasa pancretica del tipo I caus la aparicin de tumores de pncreas exocrino; sin
embargo, cuando es el proto-oncogn ras el que se introduce, los tumores pancreticos no aparecen.
Gen diana
Recombinacin
homloga
Gen diana
HSV-tk
loxP
HSV-tk
Construccin diana
neo
loxP
loxP
Recombinacin
homloga de
la lnea
germinal
neo
Recombinacin mediada por

Cre-loxP + tratamiento con
ganciclovir
gen diana flanqueado por loxP
Deleccin del gen diana
Knockout inducible
Knockout no inducible
Figura 16.6. Estrategia para generar deleciones de genes inducibles en clulas embrionarias
por recombinacin homloga. En un primer tiempo, una construccin gnica direccional que
albergue tres sitios loxP flanqueando al gen diana y un cassette con un marcador de seleccin
que contenga el gen para la resistencia a la neomicina (neo r) y un HSV-TK son recombinados con
el ADN de la lnea germinal. En un segundo tiempo, la enzima Cre se expresa en las clulas
embrionarias que contienen el ADN recombinado homlogamente. La expresin de Cre podr
resultar ya sea en la delecin del gen diana producido por las clulas embrionarias portadoras de
la delecin en la lnea germinal, o en una delecin del cassette con el marcador de seleccin productor del gen flanqueante en el locus diana, permitiendo la inactivacin inducible en las clulas
embrionarias resultantes.
237
La introduccin de genes virales en ratones transgnicos ha permitido crear modelos para estudiar la malignidad y el potencial oncognico de los virus. La inyeccin
en ratones del virus SV40 o de su antgeno T, origina la aparicin de papilomas del
plexo coroideo. Cuando este gen se une al promotor de la insulina, los tumores aparecen en el pncreas endocrino. Este tipo de experimentos ilustra claramente el poder
de esta tecnologa al dirigir la expresin de oncogenes hacia tejidos especficos, permitiendo con ello seguir de forma precisa el proceso de transformacin celular.
Creacin de animales con enfermedades genticas
De la misma manera que la transferencia de un gen puede corregir una enfermedad gentica, aquella puede tambin originarla. El mejor ejemplo de este tipo de
experimentos fue el crear un modelo portador de la mutacin letal responsable de
la osteognesis imperfecta, que es una enfermedad en la que existe una alteracin
de la formacin del colgeno. Para producir dicho modelo animal, Stacey et al.
mutaron in vitro el gen clonado de la cadena alfa 1 del colgeno, insertando una cistena o una arginina en la posicin 849 de la protena. Cuando el gen mutado artificialmente se transfiri a los ratones, stos desarrollaron la enfermedad letal parecida a la osteognesis imperfecta (13).
Ratones transgnicos como modelos para terapia por genes
Los ratones que tienen una mutacin especfica responsable de una enfermedad
son modelos ideales para ser tratados restituyendo el gen anmalo o ausente (terapia por genes). Los ratones portadores de una delecin del gen de la beta globina,
al ser cruzados hasta obtener homocigocidad, desarrollan la enfermedad conocida
como beta talasemia, que es una hemoglobinopata corriente en humanos.
Costantini et al. consiguieron corregir la beta talasemia en estos ratones inyectndoles el gen de la beta globina humana (3).
Endocrinologa
La determinacin del sexo, en los animales superiores, requiere la expresin de
un gen del cromosoma Y, el SRY, que es capaz de inducir el desarrollo de la gonada indiferenciada hacia testculo en lugar de ovario. La evidencia directa de que el
gen SRY era el gen determinante de la aparicin de testculos se obtuvo gracias al
anlisis del genoma de hembras XY con disgenesia gonadal. La prueba definitiva
para demostrar la funcin del gen SRY se obtuvo, sin embargo, al introducir dicho
gen en embriones XX y observar si stos desarrollaban un fenotipo masculino (15).
Este experimento, cuyos resultados fueron positivos, permiti identificar la secuencia concreta del gen SRY responsable de la diferenciacin testicular y del desarrollo masculino.
238
Todas las protenas de la familia de las inhibinas y de las activinas han sido utilizadas en animales transgnicos ya sea sobreexpresndolas o anulando su expresin. En este sentido, y lejos de querer hacer cualquier tipo de revisin exhaustiva
en el presente manuscrito, quisiramos mencionar nicamente algunos de los
modelos de knock-out obtenidos por recombinacin homloga que han contribuido enormemente a la comprensin de la funcin de estas protenas en la reproduccin. Estos modelos, la mayora provenientes del laboratorio de Martin Matzuk
del Baylor College of Medicine de Houston, incluyen prcticamente la totalidad de
los genes de la familia (16,17). El gen de la subunidad alfa de la inhibina fue delecionado por recombinacin homloga en ratones. Los animales con el alelo nulo,
aunque fueron viables en su desarrollo, presentaron, posteriormente y en ambos
sexos, tumores de los cordones sexuales. Este hallazgo confirm la funcin de la
inhibina como gen supresor de tumores. Su funcin en la reproduccin, sin embargo, se afectaba de forma distinta en cada sexo. Mientras las hembras deficientes en
inhibina eran estriles, los machos, inicialmente, eran frtiles, con presencia de
esperma en sus epididimos y con la capacidad de entrecruzarse. Sin embargo, la
presencia de los tumores mencionados anteriormente acababa alterando la fertilidad normal.
El nanismo hipofisario y el hipogonadismo hipogonadotropo constituyen dos
ejemplos de enfermedades endocrinas congnitas que tambin han sido curadas en
ratones al inyectarles el gen deficitario. En el primer ejemplo, Palmiter et al. (18) consiguieron normalizar el crecimiento (e incluso sobrepasar la normalidad) de los
ratones enanos (lit/lit) mediante la insercin de gen de la hormona de crecimiento
de rata. Mason et al. (19) hicieron lo propio con los ratones mutantes portadores de
una delecin en el gen del factor liberador de las gonadotrofinas. Al inyectar el gen
de dicha hormona, estos autores consiguieron restituir los valores normales de LH
y de FSH, as como de fertilidad.
Otro modelo creado en ratones transgnicos ha sido el de la diabetes mellitus
insulino-dependiente. Una teora de base autoinmune explicara esta enfermedad
como consecuencia de una inflamacin pancretica de origen infeccioso que a su
vez inducira la produccin de interfern, causando sta la aparicin de molculas
del antgeno mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II en las clulas de los
islotes pancreticos. La asociacin de estos determinantes antignicos MHC con
antgenos especficos del pncreas es la causa de que las clulas T no reconozcan
como propias a las clulas de los islotes. Ello comportar el consecuente rechazo
autoinmune. Sarvetnick y colaboradores inyectaron en embriones de ratn el gen de
interfern o el del MHC unidos al promotor de la insulina produciendo en ambos
casos la destruccin de las clulas de los islotes pancreticos (3).
Conclusiones
Estamos viviendo unos aos de intensa revolucin en la investigacin en biologa y medicina. El descubrimiento de los animales transgnicos a finales de 1980 ha
239
contribuido notablemente al avance y mejora de la utilizacin de las tcnicas de biologa molecular (1-3,13,14,19).
La medicina y la biologa se basaron en una poca en los estudios en pacientes
y animales de laboratorio. Esto fue seguido por el aislamiento de rganos y tejidos
y el consecuente estudio histolgico y anatomopatolgico individualizado. Los
importantes avances de la bioqumica permitieron posteriormente identificar de
forma muy precisa las sustancias producidas por los tejidos aislados. A todo ello le
sigui la explosin de la biologa celular y el desarrollo de los cultivos de clulas in
vitro. A partir de este momento fue posible determinar las funciones de las clulas,
estableciendo una relacin causa-efecto casi perfecta. Los cultivos celulares, sin
embargo, prescinden de la inervacin, de la vascularizacin as como de otros sistemas de comunicacin paracrina que el tejido posea in vivo, por lo que muchos de
los resultados obtenidos con esta metodologa deben ser analizados con cierta prudencia. La biologa molecular cambi por completo las tcnicas de investigacin
hasta entonces utilizadas, ya que permiti identificar genes, as como conocer sus
secuencias, establecer comparaciones filogenticas, etc. Hasta la llegada de las primeras tcnicas de transfeccin de genes en clulas en cultivo no se pudo profundizar en la compresin de los efectos de dichos genes en sistemas biolgicos. En este
sentido, los animales transgnicos representan, en cierto sentido, la culminacin de
una tecnologa muy sofisticada de investigacin, ya que permiten estudiar los efectos de un gen o parte de un gen (promotores, enhancers, etc.) en el contexto del animal vivo.
La tecnologa de los ratones transgnicos y su extensin a animales mayores ha
demostrado ser de grandsima utilidad en aspectos muy diversos de la biologa y de
la medicina. Esta tcnica tiene aplicaciones en todos los aspectos del desarrollo de
los mamferos en los que la endocrinologa ocupa un lugar prioritario (13,14,19,20-23). El
hecho de poder dirigir la expresin de un gen a un rgano o tejido especfico ha permitido la produccin de hormonas de forma no fisiolgica, para con ello alterar los
sistemas de feed-back normales y poner en evidencia mecanismos de regulacin
endocrina hasta ahora desconocidos.
Aunque creemos que los aspectos mencionados, as como otros muchos presentes en la literatura cientfica, permiten augurar un rpido incremento de la aplicacin de la tecnologa de los animales transgnicos en la mayora de las reas de
las ciencias biolgicas y mdicas, es oportuno sealar tambin que siguen existiendo dudas y problemas todava no resueltos que estos modelos plantean y que deberan ser objeto de futuras investigaciones.
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17
Bases moleculares de la deficiencia
y resistencia a la accin
de la hormona de crecimiento:
Entidades sindrmicas
J. A. Chowen y J. Argente
Introduccin
El crecimiento humano, entendido como un proceso biolgico determinado
genticamente y modulado por factores ambientales, puede alterarse por defecto
(hipocrecimiento) o por exceso (hipercrecimiento). El desarrollo espectacular de los
conocimientos moleculares en los ltimos aos ha permitido un diagnstico cada
vez ms preciso de las anomalas moleculares del crecimiento humano, distinguiendo eficientemente aquellas alteraciones debidas a lesiones genticas, de las
causas nutricionales, orgnicas, tumorales, psicolgicas o traumticas. Esta revisin
se centrar, exclusivamente, en el anlisis de las bases moleculares conocidas en el
momento actual, capaces de generar deficiencia de hormona de crecimiento (GH),
aislada o combinada o resistencia a la accin de la misma.
Las bases moleculares de la talla baja debida a deficiencia o resistencia a la
accin de la hormona de crecimiento, se han desarrollado gracias a la localizacin
y caracterizacin en el ser humano de los genes que codifican protenas implicadas
en la regulacin hormonal del crecimiento. Todo ello ha contribuido al descubrimiento de nuevas enfermedades, como es el caso de la deficiencia combinada de
hormonas hipofisarias. Asimismo, ha mejorado el conocimiento de las deficiencias
de GH originadas por mutaciones del gen GH1 y del gen del rGHRH, demostrndose al menos en un caso mutaciones en el gen de IGF-I. Finalmente, se ha consolidado la comprensin de la heterogeneidad molecular de los sndromes de resistencia perifrica a la GH por anomalas del gen del rGH, tanto en la forma clsica
como en la forma parcial, ya por la existencia de mutaciones en el dominio extracelular, transmembrana o intracelular.
Las bases moleculares de la talla baja debida a anomalas en determinados genes
localizados en los gonosomas, tanto cromosoma X como Y, ha despertado un enorme inters y se encuentra en fase de profunda investigacin. En la porcin terminal
244
del brazo corto, en la regin pseudoautosmica, de los cromosomas X e Y se ha cartografiado un gen relacionado con la talla baja (SHOX), cuya presencia o ausencia,
tiene un efecto significativo sobre la estatura. Adems, algunas mutaciones en el
gen BTK (Xq21.3-q22) estn implicadas como nica causa de inmunodeficiencia y
dficit aislado de GH (tipo III). Junto a ello, ciertos casos de talla baja y delecin del
brazo largo del cromosoma Y (46, XYq-), apoyan la hiptesis de la presencia de uno
o ms genes relacionados con el crecimiento en el brazo largo del cromosoma Y. De
hecho, se ha cartografiado en su porcin proximal, cercano al centrmero, un gen
especfico de crecimiento (GCY -growth control in the Y).
Bases moleculares del hipocrecimiento armnico

La deficiencia en factores de crecimiento semejantes a la insulina, en particular
del nmero I (IGF-I), ya por deficiencia o insuficiencia de hormona de crecimiento (GH), ya por resistencia, completa o parcial, a la accin de la misma, ya por
deficiencia primaria de IGF-I, de naturaleza congnita, se caracteriza por la ausencia, absoluta o relativa, de IGF-I detectable en suero o plasma. La resistencia a la
accin de IGF-I originara, en teora, un fenotipo similar con niveles normales o elevados de IGF-I.
La deficiente accin de IGF-I conduce, sea cual fuere su etiologa, a un fenotipo caracterizado por un hipocrecimiento armnico, facies de mueca con frente
abombada y puente nasal escasamente desarrollado. La longitud al nacimiento es
normal o est ligeramente disminuida en la mayora de los nios con deficiencia de
IGF-I; sin embargo, el crecimiento postnatal es completamente anmalo, debido al
enlentecimiento progresivo de la velocidad de crecimiento, en especial a partir de
los seis meses de edad.
I. Hipocrecimiento por deficiencia gentica de hormona
de crecimiento
En la actualidad puede procederse al diagnstico de mutaciones en los genes de
GH1, Pit1, Prop1, Lhx3, Hesx1, rGHRH y SHOX. La posible implicacin de otros
factores de transcripcin [RPX, PITX1 (5q31), PITX2 (4q25-q26), IsI1 (5q)] en la
produccin de deficiencia de GH en humanos, est en estudio.
Se conocen al menos cuatro tipos mendelianos de dficit aislado de la GH
(DAGH) (1). La deficiencia combinada de hormonas hipofisarias, denominada con
anterioridad panhipopituitarismo, es una alteracin caracterizada por el dficit de al
menos una hormona hipofisaria, adems de la deficiencia en GH, que puede presentar patrones variables de herencia: autosmica recesiva o ligada al cromosoma X.
El dficit de hormona de crecimiento puede asociarse tambin a alteraciones del
desarrollo embriolgico secundarias a anomalas monognicas o cromosomopatas.
En general, las anomalas en el desarrollo de la lnea media cerebral pueden cursar
BASES MOLECULARES DE LA DEFICIENCIA Y RESISTENCIA
245
con afectacin hipofisaria o hipotalmica y, por consiguiente, con deficiencia de

GH. Entre estos cuadros clnicos se incluyen la ausencia aislada de hipfisis, la
anencefalia, la holoprosencefalia, algunos casos de displasia septo-ptica o sndrome de de Morsier, el sndrome ectrodactilia-displasia ectodrmica-labio leporino
(sndrome EEC), la anemia de Fanconi, el sndrome de Bloom, la delecin del brazo
corto del cromosoma 18 (18p-) y el cromosoma 18 en anillo.
Los genes conocidos relacionados con la expresin de la GH humana, son los
que siguen:
Cluster de la GH: El cluster del gen de la GH humana se localiza en el brazo largo del cromosoma 17 (17q22-24) y ocupa una distancia de 66,5 kilobases
(kb) (2). Se compone de cinco genes alineados en la misma orientacin transcripcional 5 a 3: gen de la GH hipofisaria (GH1), pseudogn 1 de la hormona somatomamotropina corinica (CSHP1), gen 1 de la hormona somatomamotropina corinica (CSH1), gen de la GH placentaria (GH2) y el gen 2 de la hormona
somatomamotropina corinica (CSH2). Cada uno de los cinco genes consta de
cinco exones con cuatro intrones intercalados y todos ellos muestran entre s un alto
grado de homologa (92-98 %) en toda su secuencia. El anlisis de esta importante
homologa ha sugerido la hiptesis de que todos estos genes surgieron de un gen
ancestral comn a travs de una serie de recombinaciones homlogas, pero desiguales, que dieron lugar a duplicaciones gnicas (3).
El gen GH1 se expresa en las clulas somatotropas de la hipfisis anterior,
mayoritariamente como una protena de 191 aminocidos (GH de 22kDa).
Gen de la hormona hipotalmica liberadora de la GH (GHRH): El gen que
codifica la GHRH en el hombre es nico y ha sido localizado en el brazo largo del
cromosoma 20 (20q11.2) (4). Su longitud es de aproximadamente 10 Kb y contiene
5 exones. La transcripcin del gen da lugar a un ARNm de aproximadamente 750
bases, cuya traduccin origina un pptido de 107-108 aminocidos que contiene: un
pptido seal, los 44 aminocidos de la GHRH y un pptido carboxi-terminal, cuya
funcin, si es que la tiene, se desconoce (5).
Todava no se han descrito mutaciones del gen de GHRH en humanos ni en otras
especies. De hecho, se ha excluido su existencia en la totalidad de casos familiares
de dficit aislado de GH en que se ha estudiado (6).
Gen de la hormona hipotalmica inhibidora de la GH (Somatostatina): El gen
que codifica la SS en el hombre es nico y se encuentra localizado en el cromosoma 3 (7). Su expresin da lugar a una molcula de 116 aminocidos, la pre-prosomatostatina (pre-proSS), que tras ruptura del pptido seal da lugar a la prosomatostatina (proSS). sta es una prohormona de 92 aminocidos con un peso
molecular de 10,3 kD de la que, en todos los mamferos estudiados, se originan
tanto la SS-14, como la SS-28 (8). Del procesamiento de la proSS derivan otros pptidos que no contienen la estructura de la SS-14 y por tanto no poseen actividad
somatostatinrgica y cuyas funciones son desconocidas; stos son: SS-28(1-12),
proSS(1-76), proSS (1-63) y antrina.
246
Las posibles implicaciones de este gen en trastornos del crecimiento humano,

an estn por dilucidar.
Gen del receptor de GHRH: El gen que codifica el receptor de la hormona
liberadora de la GH (rGHRH) ha sido recientemente clonado y caracterizado (9), y
asignado al cromosoma 7p14. (10).
Una mutacin homocigota en el receptor de GHRH ha sido definida como la
base molecular del defecto del ratn Little (Little mouse), un modelo animal de
deficiencia aislada de GH autosmico recesivo (11), sugiriendo que el gen homlogo
humano podra ser un buen candidato para explicar al menos algunos casos de dficit familiar aislado de GH. Posteriormente, se han descrito anomalas en el gen del
rGHRH causantes de talla baja en el ser humano y que proporcionan las bases
moleculares en algunos casos del dficit familiar de GH tipo IB (12).
Gen del factor de transcripcin hipofisario nmero 1 (Pit1): La activacin especfica de los genes de GH, prolactina y `TSH, requieren la presencia del factor de
transcripcin Pit1 (13,14). Pit1 o GHF-1 es una protena de 33 kD que contiene dos
dominios (POU-specific domain y POU-homeodomain). El gen del Pit1 humano se localiza en el cromosoma 3p11 (15); consta de seis exones y cinco intrones. El
inters en dicho gen radica en el hecho de que ya ha sido demostrada la existencia
de anomalas en el mismo causantes de patologa en el crecimiento humano, como
se describir ms adelante.
Gen del factor de transcripcin hipofisario Prop1: El profeta del Pit1, denominado Prop1 y localizado en el brazo largo del cromosoma 5, ha sido recientemente implicado en patologa humana (16).
A. Deficiencia aislada de GH familiar
Las cuatro formas descritas varan en cuanto a la intensidad del dficit, el modo
de herencia y la respuesta al tratamiento sustitutivo con hormona de crecimiento.
DAGH IA
Es el ms intenso. Los pacientes afectos de DAGH IA son, habitualmente, de
longitud normal o algo pequeos en el momento del nacimiento, pudiendo presentar hipoglucemias en el perodo neonatal; sin embargo, todos ellos muestran un
hipocrecimiento muy marcado a los seis meses de edad.
Los niveles circulantes de GH son indetectables tanto en condiciones basales
como tras respuesta a cualquier estmulo provocativo.
La base molecular de esta enfermedad autosmica recesiva, en la mayora de los
casos, consiste en una delecin de ambos alelos en homocigosis del gen que codifica para la GH hipofisaria (GH1). La forma ms frecuente (aproximadamente en el
70 % de los casos) es de 6,7 kilobases (kb). El resto de las deleciones descritas, son:
7,6 kb, 7 kb, 45 kb, y una doble delecin en el cluster del gen de GH (17).
247
Adems de las deleciones, se han descrito otras mutaciones en el gen GH1

(T20X, IVS4+1GfiT, 300 del AG) en asociacin con un fenotipo severo de DAGH
IA y niveles plasmticos indetectables de GH (18). Todas estas mutaciones originan
alelos nulos del gen GH1, dando lugar a la produccin de una protena truncada que,
probablemente, es degradada intracelularmente.
DAGH IB
Enfermedad con patrn de herencia autosmico recesivo, asocia niveles plasmticos de GH bajos pero detectables tras estmulos farmacolgicos estndar, con
el resto de las funciones endocrinolgicas normales, y un fenotipo menos severo
que el tipo IA.
El gen de GHRH ha quedado excluido (6) y se han demostrado, recientemente,
mutaciones en el gen del rGHRH (12) que podran establecer las bases moleculares
de esta anomala en algunos casos.
DAGH II
Presentan las mismas caractersticas clnicas y similares criterios diagnsticos que los pacientes con DAGH IB (1). El modo de herencia es autosmico dominante. Los estudios de ligamiento gentico son compatibles con cosegregacin
de DAGH II con el gen GH1 en la mayora de las familias, mientras que el gen de
GHRH ha sido excluido mediante anlisis de ligamiento en todas las familias
estudiadas (6).
La alteracin molecular causante del dficit aislado de GH tipo II ha sido descrita en varias familias no relacionadas. Curiosamente, en todos los casos se trata de
mutaciones en un alelo en el intrn III del gen GH1 (18). Tres de ellas son sustituciones de un nucletido en la secuencia 5 donante para el empalme del ARNm (IVS3
+ 1G c A, + 2T c C y + 6 T c C) (19), mientras que otras dos, una sustitucin simple (IVS3 + 34 G c A) y una delecin de 18 pares de bases (IVS3 + 27 del 18) dentro de la secuencia intrnica (20,21), afectan secuencias necesarias para el procesamiento normal del ARNm (splicing enhancers) (22) o la estructura secundaria del
ARN heteronuclear. Todas estas mutaciones intrnicas producen el mismo efecto en
el procesamiento postranscripcional del ARN originando un escape o prdida completa del exn 3 de GH1 en el ARNm maduro.
La protena mutante que resulta de la traduccin del ARNm mutado sera la GH
descrita de 17,5 kD que carece de los aminocidos 32 a 71, incluyendo un residuo
de cistena. Aunque el efecto negativo dominante de estas mutaciones no se encuentra claramente definido, podra suponer la existencia de dimerizacin de la protena mutante con la GH normal gracias a la formacin de puentes disulfuro intermoleculares entre los residuos libres de cistena.
248
DAGH III
Se han descrito escasas familias con deficiencia aislada de GH mostrando un
patrn de herencia recesivo ligado al cromosoma X, en las que todos los varones
afectos presentaban tambin hipogammaglobulinemia (23,24). El tratamiento de estos
pacientes con GH se ha asociado con un incremento de los linfocitos B y unos niveles plasmticos ms elevados de inmunoglobulinas (25). El anlisis gentico en varias
de estas familias sugiri que la combinacin de agammaglobulinemia ligada al X
(XLA) y deficiencia aislada de GH podra ser debida a una alteracin genmica que
afectase al gen de XLA (BTK) en el cromosoma Xq21.3-q22 y/o un locus contiguo
probable necesario para la expresin de GH. Sin embargo, se ha comprobado la
existencia de mutaciones puntuales en BTK como nica causa de la inmundeficiencia y del dficit de GH en al menos dos familias (26,27).
Es probable la existencia de otras formas de DAGH ligadas al X. Estas alteraciones explicaran el exceso de varones afectos en relacin a mujeres en los casos
de DAGH. En la actualidad, existen evidencias que sugieren la presencia de varios
loci en el cromosoma X capaces de intervenir en la regulacin de la hormona de crecimiento. As, se han descrito algunos pacientes con DAGH asociado a anomalas
en distintas regiones del cromosoma X, incluyendo una delecin intersticial de
Xp22.3 y una duplicacin de Xq13.3-q21.2 (28,29).
B. Deficiencia combinada de hormonas hipofisarias

La deficiencia combinada de hormonas hipofisarias, se caracteriza por presentar deficiencia de una o ms de las hormonas trficas hipofisarias (TSH, ACTH,
FSH, LH), adems de deficiencia de GH. Aunque la mayora de los casos son espordicos, se han descrito varias familias en las que se sugiere un modo de herencia
autosmico recesivo (tipo I) y una forma ligada al cromosoma X (tipo II) (1).
Algunos de los supuestos casos autosmicos recesivos presentan anomalas anatmicas con una silla turca pequea o alargada. El grado de expresin fenotpica de
las diferentes deficiencias en las hormonas trficas hipofisarias presenta variabilidad inter o intrafamiliar.
Los loci responsables de la mayora de los casos de estas enfermedades hereditarias no han sido todava establecidos, excepto para el subtipo autosmico recesivo debido a mutaciones en el gen Pit1 que asocia especficamente dficit de GH,
prolactina y, en ocasiones, TSH, con normalidad del resto de la funcin hipofisaria
y, ms recientemente, para el subtipo debido de mutaciones en el gen Prop1 causantes de deficiencias en GH, TSH, prolactina, FSH y LH, y del gen Lhx3 causantes de deficiencia, asimismo, en GH, TSH, prolactina, FSH y LH.
La similitud de este fenotipo humano con la de los ratones enanos Snell y
Jackson, en los que el fenotipo autosmico recesivo es causado por mutaciones
en el locus Pit1, condujo al anlisis del gen de Pit1 en las familias afectas con
deficiencias de GH, prolactina y TSH. La produccin de una protena truncada en
249
homocigosis por la mutacin R172X se asocia a un fenotipo muy llamativo en el

que predomina dficit de TSH con cretinismo congnito (30,31). Una mutacin missence R158P en el dominio especfico POU, bien en homocigosis o en heterocigosis con el otro alelo nulo origina en los pacientes la ausencia de secreccin de GH
y prolactina junto con una deficiencia parcial de TSH y un tamao de la hipfisis
normal (32). Por ltimo, una mutacin missence de novo se ha descrito en un
paciente heterocigoto con el fenotipo de enanismo panhipopituitario (33). Esta mutacin est localizada ms all del dominio de unin al ADN (R271W) y, curiosamente, la protena mutante parece tener un efecto dominante negativo que inhibe la
unin al ADN de la protena normal. No obstante, el hallazgo de la misma mutacin
en otra familia japonesa en la que varios portadores no presentaban fenotipo alguno, ha puesto en cuestin la significacin biolgica de ese efecto dominante negativo (34).
Un segundo ratn mutante, denominado enano Ames, el cual es no allico,
pero fenotpicamente similar a la mutacin que exhibe el ratn enano Snell, define
un segundo locus para el enanismo. Tras la localizacin del gen de Prop1 en el ratn
Ames por Sornson et al. en 1996 en el ratn (16), se ha podido localizar el gen en el
ser humano en el brazo largo del cromosoma 5 (5q). Recientemente, Wu et al. han
demostrado la existencia de mutaciones en el gen Prop1 del ser humano (35). Todas
parecen mutaciones hipomrficas o amrficas y las variantes allicas descritas hasta
ahora incluyen dos sustituciones simples de aminocidos, R120C y F117I (35), y una
delecin de dos pares de bases en el exn 2 (301delAG) que conduce a un error de
lectura desde el codn 101 con un codn de finalizacin prematuro en 109 (35). Ms
recientemente, Cogan et al. (36) analizaron 10 casos familiares y 21 espordicos de
deficiencia combinada de hormonas hipofisarias. Demostaron que de los casos
familiares estudiados, cinco fueron homocigotos y uno heterocigoto para la mutacin 301delAG, mientras que entre los 21 casos espordicos estudiados, encontraron la misma mutacin en dos casos en homocigosis y en un caso en heterocigosis(36). Por tanto, esta mutacin puede ser la causa ms frecuente de deficiencia
combinada familiar de hormonas hipofisarias.
C. Alteraciones embriolgicas
Entre el amplio nmero de alteraciones embriolgicas y algunos otros sndromes genticos que cursan con dficit asociado de hormona de crecimiento, se conocen las bases moleculares siguientes:
Holoprosencefalia
Se trata de una malformacin de la lnea media asociada con frecuencia a labio
leporino o hendidura palatina y que cursa con alteraciones del desarrollo del tracto
olfatorio y de los globos oculares, as como dficit motores y psquicos y grados
variables de hipofuncin hipotalmica. Pueden presentar dficit aislado o combi-
250
nado de GH. La mayora de los casos son espordicos o secundarios a cromosomopatas (trisoma 13, 13q-, 18p-, 7q-), pero el 30 % son familiares con transmisin
autosmica dominante o recesiva. Recientes estudios han demostrado mutaciones
en genes que codifican seales de migracin neuronal, ZIC2 en 13q32 (37) y Sonic
Hedgehog en 7q36 (38), como responsables de dos tipos de holoprosencefalia.
Existen al menos otros dos loci implicados en este cuadro, HPE1 localizado en
21q22.1, y HPE2 en 2p21, pero los genes responsables no han sido aislados todava.
Sndrome de Rieger
Se caracteriza por la existencia de displasia del iris, hipodontia, atrofia ptica y
dficit de GH ocasional (39). Se hereda de modo autosmico dominante con expresin variable. Se trata de un sndrome heterogneo en el que se han descrito al
menos dos genes implicados: RIEG1 (4q25-q26) (40) y RIEG2 (13q14) (41).
Displasia septo-ptica o sndrome de Morsier

Cursa con hipoplasia del nervio ptico acompaada o no de anomalas del septum pellucidum y del cuerpo calloso. El grado de insuficiencia hipofisaria vara
desde un dficit aislado de GH hasta situaciones de panhipopituitarismo. La diabetes inspida suele estar presente en ms de la mitad de los casos. La alteracin parece radicar en el hipotlamo. Se trata de una entidad casi siempre espordica, aunque
algunos casos sugieren una herencia monognica autosmica recesiva.
Recientemente, se han implicado mutaciones en el gen HESX1 como causantes de
algunos casos de displasia septo-ptica (42).
Sndrome de ectrodactilia-displasia ectodrmica-labio leporino

Tambin denominado sndrome EEC. Se ha demostrado herencia tanto autosmica dominante [EEC1 (7q11.2-q21.3)] como autosmica recesiva [EEC2] (43,44). El
cuadro clnico queda definido por el nombre del sndrome, a lo que se asocia dficit de GH con ausencia del septum pellucidum en algunos casos.
Anemia de Fanconi
Entidad nosolgica que se hereda de un modo autosmico recesivo y se caracteriza por anemia, leucopenia, trombocitopenia, talla baja, hiperpigmentacin cutnea, anomalas del pulgar, malformaciones cardacas y renales y, ocasionalmente,
dficit de GH. Se distinguen ocho grupos bien diferenciados por estudio de com-
251
plementacin celular (A-H) (45), cada grupo probablemente debido a una anomala
gentica especfica (46). Se han identificado los genes mutados en los grupos A, C y
G (47-49). El gen del grupo D (FANCD) se localiza en el cromosoma 3 (3p22-26) (50).
Sndrome de Bloom
Se trata de una anomala que se hereda con patrn mendeliano autosmico recesivo que cursa con exantema facial teleangiectsico, hipersensibilidad lumnica con
piel hipo e hiperpigmentada y predisposicin al padecimiento de procesos malignos. El gen responsable se ha aislado por clonacin posicional desde el brazo largo
del cromosoma 15 (15q26.1) (51), aunque se desconoce el mecanismo por el cual
puede aparecer dficit de GH.
Sndrome de Aarskog
Talla baja, hipertelorismo y anomalas del escroto caracterizan a este sndrome,
habindose demostrado un patrn de herencia recesivo ligado al cromosoma X. El
cuadro est causado por mutaciones en el gen FGD1, que codifica una protena
implicada en transduccin de seales importantes para el crecimiento durante el
desarrollo (52).
II. Hipocrecimiento por resistencia gentica a la hormona

de crecimiento
En 1966 Laron et al. publicaron los casos de tres hermanos con elementos clnicos y bioqumicos de deficiencia de hormona de crecimiento (GH), pero en los
que se detectaban niveles extremadamente elevados de GH (53). En los dos aos
siguientes, los mismos autores diagnosticaron 22 pacientes similares de descendientes de judos orientales (54). El diagnstico de resistencia a la hormona de crecimiento se efectu tanto por los niveles elevados de GH como por la incapacidad de
la hormona de crecimiento administrada exgenamente para incrementar los niveles plasmticos de factor de IGF-I. (55,56).
En 1984 se demostr que esta enfermedad es debida a la existencia de una anomala en el receptor de GH que conduce a un sndrome de resistencia a esta hormona (57). La clonacin (58) y caracterizacin (59) del gen de rGH y la introduccin de
nuevas tcnicas de biologa molecular, han proporcionado la identificacin de una
serie de defectos moleculares en dicho receptor de GH.
El consenso internacional sobre la nomenclatura a emplear, as como los criterios taxonmicos del sndrome de insensibilidad o resistencia a la GH, se efectu en
1993 (60). Los nombres ms comnmente empleados en la actualidad son los de sndrome de Laron, sndrome de resistencia primaria a la GH o sndrome de insensi-
252
bilidad primaria a la GH, diferencindolo, de este modo, de los sndromes de resistencia secundaria a la GH.
Hasta la fecha, se han diagnosticado varios cientos de pacientes. Los anlisis
genticos demuestran la existencia de un modo de herencia autosmico recesivo (61).
Un listado ms detallado puede obtenerse a partir de una revisin reciente de este
sndrome (62).
Los nios pequeos se asemejan a los afectos de deficiencia aislada hereditaria
de GH; poseen cabello ralo y la cabeza parece grande debido a la falta de desarrollo de los huesos faciales, as como a la acromicria. No obstante, el permetro craneal se encuentra por debajo del tamao normal (63). Todo ello proporciona la apariencia tpica de frente prominente, nariz en silla de montar y mirada en puesta
de sol.
Si no reciben tratamiento, como ocurre en la mayora de los pacientes con sndrome de Laron, la talla adulta se sita entre 119 y 142 cm en varones y entre 108
y 136 cm en mujeres (64).
El gen del rGH localiza en el brazo corto del cromosoma 5 (p13-p12) (65). Est
compuesto de 620 aminocidos, una secuencia seal de 18 aminocidos, y conformado por 9 exones, con una extensin de 87 Kb. Los exones 2 a 7 codifican
el dominio extracelular de 246 aminocidos. El exn 8 corresponde al dominio
transmembrana, conformado por 24 aminocidos. Finalmente, los exones 9 y 10
corresponden al dominio intracelular, quedando conformado por 350 aminocidos.
La forma clsica de resistencia a la GH tipo 1a es debida a la existencia de mutaciones del rGH. Hasta la fecha, se han descrito una amplia variedad de ellas: sin
sentido, error de lectura, y de empalme, afectando tanto a exones como a intrones (66-74).
La mayora de las anomalas se localizan en el dominio extracelular del receptor (exones 3-7 e intrones 2-7), dando lugar a la ausencia de niveles circulantes de
GHBP (75,76). Solamente se han descrito dos publicaciones con anomalas en el
dominio transmembrana (exn 8) (71,72), y otras dos mutaciones en el dominio intracelular (exn 10) (74). Se han descrito tres hermanos con una anomala post-receptor,
an no bien definida (76).
La demostracin de niveles sricos bajos de GHBP en los parientes de pacientes con sndrome de Laron ayuda a identificar los portadores heterocigotos por anomalas en el dominio extracelular del rGH (77,78). Por el contrario, la existencia de
niveles sricos de GHBP normales o elevados en pacientes con sndrome de Laron
implica la existencia de una anomala, ya en el dominio transmembrana, ya en el
dominio intracelular, ya post-receptor de GH (sndrome de Laron tipo b o c).
Anomalas Post-receptor de GH
La primera familia descrita con esta anomala se comunic en 1993. El test de
estimulacin de IGF-I no produjo respuesta de IGF-I, aunque produjo una elevacin
253
de IGFBP-3, (76) demostrando que la ltima va est intacta. La naturaleza de esta

anomala no se ha dilucidado todava.
Delecin del gen de IGF-I

Recientemente, Woods et al. (79) describieron un varn, hijo de progenitores
consanguneos, con talla baja extrema, en el que se demostr la existencia de una
delecin homocigota de los exones 4 y 5 del gen de IGF-I. El paciente mostraba:
marcado retraso del crecimiento, permetro craneal pequeo, acromicria, hipogonadismo, retraso del desarrollo motor, hipoglucemia en la infancia, niveles sricos
elevados de GH (94 mg/mL) y bajos de IGF-I, que no se incrementaron tras la
administracin de hormona de crecimiento humana.
Pigmeos
Los pigmeos parecen tener una disminucin en el nmero de receptores de GH,
lo que podra constituir la anomala primaria. En una revisin reciente, Merimee y
Laron (80) afirman que la talla baja de los pigmeos africanos es debida primariamente, quizs exclusivamente, a una deficiencia de IGF-I por deficiencia del rGH. Dado
que los pacientes con sndrome de Laron son ms bajos que los pigmeos y sus niveles de IGF-I tambin ms bajos, los pigmeos podran tener una anomala gentica
diferente, probablemente menos completa. El conjunto de las alteraciones metablicas reflejan una disminucin en receptores de hormona de crecimiento, incluyendo una disminucin de los niveles sricos de GHBP, lo que indica la posibilidad de
una anomala en el dominio externo del receptor de GH.
Resistencia a IGF-I
Existen muy pocas referencias sobre tallas bajas que puedan enmarcarse en esta
categora. En el caso clnico comunicado por Bierich (81) de un nio con un retraso
severo de crecimiento y niveles elevados de IGF-I y, el de Momoi et al. (82), en una
nia con hallazgos similares, no se ha podido demostrar una base molecular.
III. Hipocrecimiento por anomalas en genes de los gonosomas

Se conocen al menos ocho genes localizados en la regin pseudoautosmica
(PAR) del brazo corto de los cromosomas X e Y (83,84). La PAR del brazo corto
(PAR1) est conformada por 2.500 kb de longitud. Las PAR de los cromosomas X
e Y presentan una homologa del 99 %. La asociacin de talla baja y deleciones
tanto del brazo corto del cromosoma X, como del brazo corto del cromosoma Y,
254
sugiere la presencia de un gen para la talla en los 700 kb distales de PAR1, ya que
los pacientes con una nica copia de esta regin presentan talla baja.
Se ha clonado un gen desde un segmento crtico de 170 kb de PAR1, que se ha
denominado SHOX (short stature homeobox-containing gene). Dicho gen codifica
protenas de 292 y 225 aminocidos y se ha encontrado delecionado al menos en 36
pacientes con talla baja y reorganizaciones en el Xp22 o en el Yp11.3. Entre 91
pacientes con talla baja idioptica sin otras complicaciones, Rao et al. (85) slo
encontraron uno con una mutacin sin sentido en el gen SHOX, detectando, asimismo, una mutacin similar en otros cuatro miembros de la familia, en tres generaciones, afectos de talla baja.
La causa de la talla baja en las pacientes con sndrome de Turner puede ser
explicada, al menos en parte, por la prdida del gen SHOX, debida a la ausencia de
un cromosoma X.
Adems, los casos con talla baja y delecin del brazo largo del cromosoma Y
(46, XYq-) apoyan la hiptesis de la presencia de uno o ms genes de crecimiento
en el brazo largo del cromosoma Y. En efecto, mediante la realizacin de estudios
genticos de pacientes varones con deleciones parciales del Yq, una regin cuya
presencia o ausencia tiene un marcado efecto sobre la talla, se ha logrado cartografiar por diferentes investigadores en la porcin proximal del brazo largo del cromosoma Y, cercana al centrmero, un gen que se denomina Control de
Crecimiento en el cromosoma Y, Growth Control in the Y, (GCY) o gen especfico del crecimiento en el cromosoma Y (86-88), habindose empleado marcadores con
secuencias especficas para el cromosoma Y completo, capaces de definir la lesin
del punto de ruptura.
Los estudios moleculares en una translocacin cromosmica X; Y [46, X,
der(X)t(X;Y) (p22.3; q11.2)] en una mujer con delecin de la regin pseudoautosmica (Xp22.3) que presentaba una talla normal, sugieren que el gen especfico de
crecimiento del cromosoma Y (CGY) en el Yq puede compensar el gen SHOX de
crecimiento perdido (89).
Se presume que puedan existir ms genes que intervengan en la regulacin del
crecimiento humano en los gonosomas, por lo que es menester que las investigaciones en esta lnea continen desarrollndose.
IV. Hipocrecimiento de origen prenatal

El enanismo primordial constituye un retraso de crecimiento de origen prenatal
que contina en el periodo postnatal y que se subdivide en dos grandes grupos,
segn se asocie o no a microcefalia. Una forma especfica de enanismo primordial
no microceflico es el sndrome de Russell-Silver, que asocia unos rasgos craniofaciales tpicos con facies triangular, orejas prominentes, posibilidad de asimetra en
miembros y clinodactilia del quinto dedo de las manos. La causa de este cuadro es
probablemente heterognea y quiz la mayora de los casos se deben a mutaciones
dominantes de novo. Se ha sugerido la posible implicacin en el fenotipo de un
255
locus en 17q25 basado en alteraciones cromosmicas recurrentes (90). Sin embargo,

la primera pista sobre una de las posibles bases moleculares reales de estos cuadros
fue la observacin de disoma uniparental materna del cromosoma 7 en un individuo homocigoto para una mutacin causante de fibrosis qustica siendo slo la
madre portadora (91). Este paciente, al igual que otros descritos posteriormente, presentaba retraso de crecimiento intrauterino y postnatal no justificable por su fibrosis qustica. Posteriormente, se detect la existencia de disoma uniparental materna del cromosoma 7 en el 10 % de los pacientes con enanismo primordial del tipo
del sndrome de Russell-Silver (92). Por consiguiente, los resultados indicaban la
existencia de uno o varios genes en el cromosoma 7 reguladores del crecimiento y
sometidos a impronta gamtica, bien genes potenciadores del crecimiento que se
expresen slo desde el cromosoma de origen materno, o bien genes represores del
crecimiento que se expresen slo desde el cromosoma paterno. El hallazgo de un
caso familiar de sndrome de Russell-Silver (madre e hija) con una duplicacin en
tndem de la regin 7p13-p11.2, permiti definir el intervalo crtico del cromosoma 7 a una regin que contiene los genes IGFBP1, IGFBP3 y GRB10 (growth factor receptor-binding protein 10) (93). Posteriormente, se ha encontrado una duplicacin similar en un paciente, cuya caracterizacin molecular ha demostrado la
inclusin de los genes citados y el origen materno de la regin duplicada (94). Por
tanto, parece que el retraso de crecimiento que se produce en estos cuadros se debe
probablemente a la existencia de uno o varios genes represores del crecimiento que
se expresan exclusivamente desde el cromosoma materno en condiciones normales
y cuya expresin se encuentra aumentada en casos de disoma uniparental materna
o de duplicaciones maternas de la regin. El gen GRB10 es un candidato ptimo
dado que se encuentra en el intervalo crtico de las citadas duplicaciones y que el
ortlogo de ratn (gen Meg1/Grb10, localizado en el cromosoma 11) tiene expresin exclusiva desde el cromosoma materno y est probablemente implicado en los
defectos de crecimiento que se observan en los ratones con duplicaciones del cromosoma 11 y deficiencia recproca (95). La funcin de la protena GRB10 tambin es
sugerente, dado que se une al receptor de insulina y al receptor de IGF-I (IGF1R) a
travs de un dominio con homologa a Src (SH2), e inhibe la actividad tirosn-quinasa asociada al receptor, actividad que est implicada en las acciones promotoras
del crecimiento de la insulina, IGF-I e IGF-II. (96)
Consideraciones finales
En resumen, en las ltimas dos dcadas hemos asistido a la identificacin, caracterizacin y secuenciacin de mltiples genes, localizados tanto en los autosomas
como en los gonosomas, involucrados en la regulacin del crecimiento humano.
Asimismo, se han identificado mutaciones en muchos de ellos que conducen a la
produccin de patologa del crecimiento por defecto o por exceso.
El hipocrecimiento armnico de base gentica puede ser debido a una deficiencia de GH, aislada o combinada, a una resistencia a la accin de la misma, a una
256
anomala del gen de IGF-I y, tal vez, a una resistencia a la accin de ste; conduciendo, en cualquier caso a una deficiencia en IGF-I y, por ende, a una talla baja.
Existen adems genes reguladores del crecimiento que son dependientes de dosis y
presentan sistemas de control epigenticos del tipo de impronta gamtica. La alteracin de estos genes se asocia con trastornos del crecimiento de origen prenatal.
Por ltimo, se han identificado genes relacionados con el crecimiento en los gonosomas, aunque todava se requiere ms investigacin.
En conclusin, la patologa del crecimiento humano por defecto incluye numerosas enfermedades cuya base molecular es conocida en la actualidad, y es de esperar que la lista vaya aumentando en los prximos aos. El clnico debe aproximarse a su conocimiento para un mejor diagnstico y consejo gentico apropiados.
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Patologa molecular de la hiperplasia
suprarrenal congnita
B. Ezquieta, E. Cueva, F. J. Fernndez, J.M. Varela, y C. Jariego
Introduccin
El trmino Hiperplasia Suprarrenal Congnita (HSC) engloba todos aquellos
dficit enzimticos de carcter hereditario que dan lugar a una disminucin en la
sntesis del cortisol y a la consiguiente estimulacin del eje hipotlamo-hipfisissuprarrenal. Se han descrito cuadros clnicos por la deficiencia de los enzimas
implicados: 3`hidroxiesteroide deshidrogenasa, 17_hidroxilasa, 21-hidroxilasa
(21-OH) y 11`hidroxilasa, siendo todos ellos de carcter autosmico recesivo; reconocindose, al menos a escala bioqumica, tanto formas neonatales como formas no
clsicas o tardas de cada una de estas deficiencias. Los distintos pasos metablicos
de la sntesis del cortisol tienen lugar en distintos compartimentos celulares (mitocondria, citoplasma, microsomas); siendo debida la hiperplasia lipoide al dficit
hereditario de la protena de transporte requerida para dicho cambio de compartimento (protena StAR). Las bases moleculares de las formas severas, neonatales, de
HSC se conocen para cada uno de los dficit, conocindose la localizacin, estructura y mutaciones de los genes implicados en cada uno de ellos (1). Este estudio est
centrado en el anlisis gentico molecular de la deficiencia de esteroide 21-hidroxilasa, por ser la causa mayoritaria de HSC (90-95 % de los casos; para una revisin
reciente del tema, vase White y Speiser 2000) (2).
La deficiencia de 21-OH es una enfermedad monognica autosmica recesiva.
Se debe a mutaciones en un solo gen, el gen de la esteroide 21-hidroxilasa, y ello,
tanto en sus formas severas como tardas. Las enfermedades con este patrn de
herencia suelen presentar una misma alteracin en los dos alelos mutados (los
pacientes son homocigotos), y ello ocurre generalmente por consanguinidad. A diferencia de estas otras enfermedades, en la deficiencia de 21-OH, los enfermos frecuentemente son heterocigotos compuestos. Slo en el caso de mutaciones frecuentes, y por supuesto, en el caso de consanguinidad, los enfermos son
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homocigotos. Los portadores de esta deficiencia presentan un solo cromosoma

mutado y, en principio, no manifiestan signos clnicos, aunque s una respuesta elevada del metabolito marcador de esta deficiencia, 17-hidroxiprogesterona, en el
test de Synachten. En ocasiones se ha descrito la presencia de signos clnicos de
hiperandrogenismo en nios portadores, definidos tanto a nivel molecular como
bioqumico (1,3).
La incidencia de las formas clsicas es de aproximadamente 1:10.000 a
1:15.000, lo que supone una elevada frecuencia de portadores (1:50 a 1:60) con
variaciones significativas segn las zonas geogrficas (2,4,5). Las formas tardas se
presentan con una frecuencia de 1:1.000 (frecuencia de portadores 1:15). Aunque,
sobre la base de datos hormonales, se han estimado incidencias superiores, del 1%
en el rea Mediterrnea (4,6,7), e incluso de 1/40 y 1/50 en zonas de la antigua
Yugoslavia, Italia y Espaa; estos datos podran estar magnificados, como est
ponindose de manifiesto al disponer de los datos moleculares. De cualquier manera, las formas tardas de 21OHD constituyen una de las enfermedades autosmicas
recesivas ms frecuentes en humanos. Es especialmente llamativo el hecho de que,
incluso las formas severas que pueden comprometer la vida, y con ello autolimitar
la diseminacin de estos alelos, sean tan frecuentes. Ello podra ser debido al peculiar mecanismo de produccin de las mutaciones que existe en este gen por la existencia de un pseudogn; y/o a una posible ventaja de los heterocigotos portadores,
como recientemente se est volviendo a plantear (8,9).
El gen responsable del dficit se denomina CYP21B y se encuentra localizado
en el brazo corto del cromosoma 6, en la regin III del complejo mayor de histocompatibilidad (HLA, Fig. 18.1. A). Muy prximo a l se encuentra su pseudogn
(o gen no funcional), CYP21A, que tiene una homologa del 96 % (Fig. 18.1. B). Este
pseudogn presenta una serie de mutaciones que impiden su expresin y/o su funcionalidad. Los genes CYP21B y CYP21A se encuentran muy prximos uno del
otro, a una distancia de 30 kb (kb: 1.000 pares de bases) y dispuestos en tndem con
los genes C4A y C4B (Fig. 18.1. B) que codifican para el cuarto componente del
complemento y tambin presentan una homologa importante (2,6,10).
El gen CYP21B tiene 3,2 kb, est constituido por 10 exones y da lugar a un
mRNA de aproximadamente 2 kb. La protena tiene 500 aminocidos y contiene
como grupo prosttico el grupo HEM. Es una monooxigenasa de esteroides en posicin 21, de localizacin microsomal. Son dominios importantes para su funcionalidad, la regin de anclaje a la membrana del microsoma y la regin de centro activo
donde se unen los sustratos, 17OHP y progesterona (Fig. 18.2). CYP21B se expresa en el tejido suprarrenal dando lugar al enzima especfico. Tambin se ha detectado su expresin en linfocitos (Zhou et al. 1997), as como una actividad 21 hidroxilante inespecfica, que podra parcialmente compensar la deficiencia suprarrenal
severa en el adulto.
La gran mayora de las mutaciones que causan deficiencia de este enzima son el
resultado de dos tipos de mecanismo: la recombinacin asimtrica en la meiosis,
que se ve favorecida por la regin duplicada de 30 kb existente en el locus de la 21OH, que origina deleciones (Fig. 18.3. A); y la conversin gnica que introduce en
PATOLOGA MOLECULAR DE LA HIPERPLASIA SUPRARRENAL
265
Brazo corto del cromosoma 6

Locus HLA
Clase I
B
CYP 21 B
DR
DQ
Clase III
DP
Clase II
Gen de la 21-Hidroxilasa
30 kb
C4 A
CYP 21 A
Pseudogn
C4 B
CYP 21 B
Gen funcional
esteroide
21-hidroxilasa
Figura 18.1. (A) Esquema del cromosoma 6 de humanos, en que se indica la localizacin del
gen de la esteroide 21-hidroxilasa en el locus HLA. Ntese que B y DR son los antgenos HLA ms
prximos por lo que su informatividad ha sido de utilidad en el seguimiento del gen 21-OH.
(B) Esquema del locus de la 21-OH; CYP21B es el gen funcional, CYP21A en humanos es un
pseudogn (homlogo al gen funcional pero incluye mutaciones en su secuencia que lo hacen
no funcional). Las flechas bajo los correspondientes genes indican la direccin de expresin,
vase que en el caso de C4 (factor 4 del complemento) ambos genes se expresan, aunque la protena tiene distintas propiedades hemolticas y antignicas.
el gen funcional mutaciones puntuales (Fig. 18.3. B), por transferencia de las mismas desde el pseudogn. El mecanismo de la conversin gnica, que no est completamente establecido, fue descrito en levaduras en sistemas que requieren diversificacin, como las protenas de apareamiento. Los datos existentes en humanos
sobre este mecanismo han sido aportados por el propio gen de la 21-OH. Estas
mutaciones puntuales se denominan microconversiones para diferenciarlas de las
conversiones grandes que involucran a varios exones o a la totalidad del gen.
La recombinacin asimtrica y la manera en que se generan las deleciones y
duplicaciones estn esquematizadas en la Figura 18.3. A. Las deleciones y duplicaciones del pseudogn mantienen un gen funcional por lo que, per se, no son las alteraciones responsables del dficit. En algn caso una determinada mutacin puntual,
266
17-OHP
NADP
NADPH
e-
P450reduc
Arg356Trp
11-Deoxicortisol
Triple mut ex 6
Pro453Ser
P450c21 Val281leu
e1le172Asn
HEM
Pro30Leu
Delecin
Conversin
655 AoC-G
Gln318Stop
306insT
Delecin 8pb
Mutaciones que dan lugar a
ausencia de la protena
NADP+
b5
NADPH
Centro activo y/o interaccin con reductasa

Unin de grupo prosttico (HEM)
Anclaje a la membrana
Dominios de la protena cuyos aminocidos
mutados dan lugar a prdida de la funcionalidad
Figura 18.2. Esquema de la protena esteroide 21-hidroxilasa ubicada en la membrana microsomal junto a sus enzimas auxiliares. Sobre la protena se indican las mutaciones localizadas en
los dominios cuya funcionalidad afecta esencialmente a la actividad enzimtica. En el recuadro
externo se recogen las mutaciones que daran lugar a una carencia de la protena.
Val281Leu, se asocia a la duplicacin de CYP21A. Las tradicionalmente denominadas deleciones del gen 21-OH corresponden con un hbrido pseudogn-gen no
funcional que es el resultado de una recombinacin intragnica.
Las deleciones y conversiones grandes dan cuenta de aproximadamente un 25-30
% de los alelos mutados (11,12,13). Cuando el mecanismo de conversin gnica acta
sobre una regin limitada de la secuencia del gen funcional el cambio introducido
en el gen funcional se comporta como una aparente mutacin puntual. La aplicacin
de la amplificacin mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) permite el estudio de estos alelos que presentan mutaciones puntuales, y que constituyen
un elevado porcentaje de los alelos mutados, 70-90% en las formas severas y tardas
respectivamente.
En la Figura 18.3. B se recoge el esquema de la estructura del gen con sus diez
exones o zonas codificantes, y regiones intrnicas o no codificantes. En l se indican las 10 mutaciones descritas en el pseudogn, que cuando son transferidas a
CYP21B lo inactivan. Todas ellas se encuentran en la regin codificante excepto la
mutacin 655 A o C G que se localiza en el intrn 2 y afecta al procesamiento del
RNA mensajero, que como veremos es la mutacin ms frecuente en las formas
severas. Las mutaciones especficas en el gen dan lugar a una prdida de la actividad enzimtica de la esteroide 21-OH ms o menos severa, que segn su grado se
267
A Generacin de deleciones y duplicaciones de CYP21B y A

C4A
CYP21A
C4B
CYP21B
C4A
CYP21A
C4B
CYP21B
1
Puntos de recombinacin
C4A
CYP21A
C4B
C4A
CYP21A
Duplicacin del pseudogn
C4B
CYP21B
CYP21B
Delecin del pseudogn-gen

2
C4A
21A-21B
Hbrido pseudogn-gen denominado clsicamente delecin del gen 21-OH
B Microconversiones de CYP21B
Exones
I
II
III
IV
VI
VII
VIII
IX
3
1
Pro30Leu
655G
mutacin de procesamiento 1le172Asn

5
Mutaciones severas
Mutaciones leves
10
7
8
306insT
Stop318
6
Del8pb
Val281Leu
Pro453Ser
9
Arg356Trp
Ile236Asn/Val237Glu/Met239Lys
Figura 18.3. (A) Esquema de la recombinacin asimtrica y de las duplicaciones y deleciones

del gen. Los puntos 1 y 2 son los puntos de recombinacin que dan lugar a estas entidades. La
recombinacin por delante de C4A (punto 1) da lugar a las deleciones y duplicaciones del pseudogn, que mantienen en su estructura un gen funcional. La recombinacin intragnica (punto 2)
da lugar a un hbrido pseudogn-gen no funcional. (B) Esquema del gen 21-OH con sus diez exones o zonas codificantes y regiones intrnicas. Se indican las mutaciones puntuales que existen
el pseudogn de la 21-OH y por conversin gnica pueden transferirse a CYP21B hacindolo no
funcional. Las mutaciones subrayadas dan lugar a una afectacin moderada de la actividad enzimtica y se asocian con formas leves o tardas de la deficiencia. El resto de mutaciones afectan
de forma severa a la enzima y se encuentran primordialmente en formas clsicas de 21-OHD (ver
correlacin genotipo-fenotipo).
268
puede correlacionar con las distintas formas clnicas (11,12,13), como se comentar
ms adelante al discutir las relaciones genotipo-fenotipo. De cualquier manera,
tambin se han descrito, mediante secuenciacin (vase revisin White y Speiser
2000 (2)), otras mutaciones del gen no atribuibles a los mecanismos indicados.
El planteamiento molecular aplicado al tratamiento de la Hiperplasia
Suprarrenal Congnita es todava muy limitado en lo que se refiere a la terapia gnica. A nivel experimental, se ha conseguido rescatar mediante transgnesis de
CYP21B humana a ratones deficientes en 21-hidroxilasa (14). Por el momento existen dificultades importantes para este tipo de abordaje, derivadas de la necesidad de
mantener un nivel elevado de funcionalidad en el tejido especfico para suprimir los
andrgenos ya que los resultados obtenidos han requerido inoculacin intrasuprarrenal y la actividad se ha mantenido nicamente siete das. La terapia sustitutiva es
efectiva y econmica y se han centrado esfuerzos en conseguir definir nuevos abordajes farmacolgicos combinando el bloqueo del receptor de andrgenos y la inhibicin de la aromatasa con niveles reducidos de glucocorticoides (15).
El tratamiento prenatal de la HSC s se ha visto beneficiado muy directamente
por la aportacin del diagnstico molecular. El tratamiento prenatal persigue frenar
la suprarrenal fetal mediante dexametasona administrada a la madre para evitar la
virilizacin de las nias afectas. La efectividad del tratamiento, debidamente iniciado, dosificado y pautado, fue descrita por Forest et al (16) y recientemente confirmada (17); Speiser et al. (18) sealan la utilidad del diagnstico molecular en la definicin de la situacin de enfermo, sano portador del feto a riesgo. Si bien parece
ser importante el tratar los embarazos a riesgo, tambin es importante no mantener
un tratamiento que no es necesario, y en ambos aspectos es el anlisis molecular el
que nos permitir definir tanto los portadores de mutaciones severas como la situacin de afecto-sano-portador del feto.
En este estudio se presentan los resultados del anlisis del gen de la 21-hidroxilasa en poblacin espaola y se analizan las relaciones genotipo-fenotipo. El anlisis se plantea en formas severas y tardas de la deficiencia tanto en estudios de tipo
familiar como en diagnsticos prenatales, discutindose las aportaciones del abordaje molecular al estudio de estos pacientes.
Pacientes y mtodos
Sujetos
Trescientas quince familias (367 pacientes, 923 individuos) con al menos un
caso afecto de deficiencia de 21-OH de las distintas formas clnicas (109 pierde-sal
PS, 26 virilizantes simples VS y 180 no clsicas o tardas NC) procedentes de distintas Comunidades (Andaluca, Catalua, Pas Vasco, Navarra, Valencia, Castilla
Len, Castilla La Mancha, Murcia, Asturias, Extremadura, Aragn) del mbito
nacional. Tambin hemos estudiado 60 casos de pacientes con hiperandrogenismo
y 17OH progesterona (17OHP) en test de Synachten en el rango de portadores del
269
dficit de 21-OH (7), que se discuten brevemente en el apartado relativo a las aportaciones del anlisis molecular. En 23 familias se realiz estudio de muestra prenatal, 11 muestras de vellosidad corinica y 12 de lquido amnitico.
Mtodos
Anlisis directo del gen de la esteroide 21-hidroxilasa
Las deleciones del gen se estudian mediante la tcnica de Southern (13). El
polimorfismo que gen y pseudogn presentan para determinados enzimas de restriccin (Taq I, Bgl II, Kpn I, entre otros) permite estimar la intensidad relativa
(mediante densitometra) de los fragmentos generados cuando el ADN genmico de
cada paciente es tratado con estos enzimas. En esta tcnica, los fragmentos de ADN
se separan en una electroforesis segn su tamao molecular y son transferidos, tras
ser desnaturalizados, a un soporte (membrana de nailon) que nos permite su revelado con la sonda especfica del gen, en este caso pC21/3c marcada radiactivamente. El empleo de varios enzimas de restriccin permite excluir la posibilidad de
interpretar incorrectamente como deleciones, patrones que podran ser debidos a
una conversin de una zona que incluyera los sitios de restriccin analizados.
El estudio de las microconversiones o mutaciones puntuales se hizo mediante
PCR e hibridacin especfica de alelo (13,19). La amplificacin especfica del gen se
realiz utilizando como zonas de especificidad el exn 3, que tiene una delecin de
8 pares de bases, y el exn 6 que tiene una triple mutacin (ambas en el pseudogn
CYP21A). El gen completo se amplifica en fragmentos solapantes que son desnaturalizados y fijados sobre membranas de nailon. De esta manera, en forma paralela, se estudian sobre estas membranas las distintas mutaciones mediante hibridacin
especfica de alelo (ASO). En esta tcnica se utilizan pequeas sondas u oligonucletidos marcados especficos de las secuencias normal y mutada que hibridarn
especficamente con las secuencias correspondientes.
El anlisis de los alelos no caracterizados mediante el cribado de las mutaciones
ms frecuentes se hizo mediante una tcnica de screening basada en el polimorfismo que presenta la cadena sencilla de ADN a la presencia de cambios puntuales y
posterior secuenciacin (20).
Anlisis indirecto de CYP21B mediante microsatlites en la regin HLA

La ubicacin del gen 21OH en el locus HLA (Fig. 18.2. A) hace que su haplotipaje sea de utilidad en el anlisis indirecto de esta enfermedad. Aparte de los problemas de recombinacin y mutaciones de novo, estos marcadores presentaban
algunos inconvenientes, especialmente en el caso de muestras prenatales (21), como
la frecuente homocigosidad de B, la falta de expresin de DR en amniocitos, y el
requerimiento de anlisis mediante Southern para A y B, tcnica que exige cantida-
270
des grandes de ADN de calidad o pureza elevada). Ello llev a que se planteara en
este estudio la utilizacin de nuevos marcadores, planteamiento que se recoge en el
estudio de Ezquieta et al (22). La amplificacin de la regin que incluye el microsatlite se hace utilizando oligonucletidos cebadores marcados radiactivamente
con fluorescencia, y su posterior resolucin se realiza mediante electroforesis en
condiciones desnaturalizantes en acrilamida o mediante electroforesis capilar utilizando el secuenciador automtico ABI prism 310 (20).
Resultados y discusin
Anlisis del gen de 21-OH en poblacin espaola
El anlisis directo del gen de la 21-OH mediante Southern y PCR-ASO nos ha
permitido la caracterizacin de una gran mayora de los alelos mutados (93%, 236/
265 cromosomas de formas clsicas y 84 %, 302/360 cromosomas de formas no clsicas).
La distribucin de mutaciones se muestra en la Tabla 18.1. Hemos estudiado de
formas separada las formas clsicas y tardas, ya que las mutaciones no se distribuyen por igual en dichos grupos, y el porcentaje de las distintas mutaciones dentro
de una serie global se ve muy influenciado por el nmero de pacientes de cada una
de las formas que se incluyan. La mutacin ms frecuente en formas severas es el
cambio 655 A C en el alelo normal por G (30%) en el intrn 2 originando un sitio
de procesamiento incorrecto en el ARNm); hecho tambin descrito en otras poblaciones de distintas razas. Algunos alelos que han presentado esta mutacin han
mostrado, de forma adicional, una segunda mutacin (13) (doble microconversin),
Val281Leu o Pro453Ser. Este hecho pone de manifiesto la importancia de establecer la segregacin de alelos cuando se analiza el gen de la 21-OH a la hora definir
Tabla 18.1.
espaola
Frecuencia y distribucin de las mutaciones del gen 21-OH en poblacin

Formas clsicas
265 alelos
Formas tardas
360 alelos
Deleciones
Conversiones
15%
15%
5%
intrn 2G
del8pb
Ile172Asn
Exn6 (3x)
306 insT
Gln318Stop
Arg356Trp
30%
3%
5%
0,8%
3%
14%
4%
5%
1%
2%
0%
0,8%
4%
2%
Pro30Leu
Val281Leu
Pro453Ser
1%
2,6%
0%
3%
60%
4%
271
las mutaciones existentes en un determinado individuo. Ello tiene tambin trascendencia al estimar el porcentaje de cromosomas caracterizados, se tratara de dos
mutaciones pero de un solo cromosoma caracterizado; y al pretender establecer
correlacin genotipo-fenotipo, en la que slo pueden valorarse aquellos pacientes
con dos alelos caracterizados, no dos mutaciones caracterizadas que podran estar
en el mismo alelo. Estas consideraciones han de aplicarse tambin a los cromosomas que presentan conversiones que incluyen varios exones del gen y por ello dan
resultado positivo para varias mutaciones.
Las deleciones y conversiones grandes dieron cuenta, en conjunto, de un 30%
de los alelos severos. El resto de mutaciones severas, excepto la mutacin
Gln318Stop (14 %), resultaron ya menos frecuentes (0,8 al 4 %). Comparativamente
con otras poblaciones, la distribucin de mutaciones en poblacin espaola no es
distinta salvo en la mutacin mencionada, que en otras poblaciones se presenta en
el 4 % de los alelos. Determinadas reas de nuestra geografa han mostrado esta
mutacin con elevada frecuencia (9). Otra de las mutaciones severas, aunque mucho
ms infrecuente, 306insT, fue documentada por primera vez por nuestro grupo en
un paciente con una forma pierde-sal en heterocigosis con una delecin (13), y ha sido
posteriormente detectada en otros pacientes. Estos pacientes, por otro lado, mostraron en el anlisis indirecto idnticos marcadores polimrficos, sugiriendo un origen
comn y reciente de este alelo mutado en nuestra poblacin. Todos estos pacientes
procedan de Castilla La Mancha. Estas particularidades mencionadas, en las mutaciones Stop318 y 306insT en nuestra poblacin, parecen poner de manifiesto la
importancia del mecanismo de diseminacin de mutaciones en este gen por un efecto fundador (9). Recientemente se ha vuelto a poner en relevancia la existencia del
efecto fundador en la diseminacin de las mutaciones de este gen y la posible ventaja en los heterocigotos portadores (8).
La mutacin ms frecuente en formas tardas fue Val281Leu (60 %), al igual que
en otras poblaciones. Esta mutacin junto a las mutaciones Pro453Ser y Pro30Leu,
constituye el grupo de alteraciones que producen una afectacin moderada de la
actividad enzimtica (ver correlacin genotipo-fenotipo). Como puede verse en
la Tabla 18.1., las formas NC tambin mostraron mutaciones severas, en este caso
en uno solo de los cromosomas; este hecho tiene trascendencia en cuanto al consejo gentico en estas pacientes y ser analizado ms abajo.
Las formas virilizantes simples, por constituir un grupo reducido en esta serie
(26 pacientes), no se han separado para el estudio de frecuencias en formas clsicas
y se han analizado junto a las formas pierde-sal. Queremos sealar que estos pacientes presentaron la mutacin Ile172Asn con una frecuencia superior (25 % de los cromosomas, 50 % de los pacientes; ver a continuacin correlacin genotipo-fenotipo).
El estudio de las mutaciones ms frecuentes permite caracterizar la gran mayora de los alelos mutados pero no su totalidad y ha de recurrirse a tcnicas complementarias de anlisis como el SSCP y la secuenciacin (20). Este tipo de abordaje nos
ha permitido caracterizar nuevos alelos mutados: 64insT, mutacin severa de desplazamiento de la fase de lectura encontrada en homocigosis en un paciente con una
forma pierde-sal en que aparentemente no exista consanguinidad y en el que el
272
tipaje de microsatlites nos permiti documentar dicha consanguinidad; e His61Leu

y Met283Val en pacientes con formas leves de la deficiencia en heterocigosis compuesta con mutaciones severas (23).
Correlacin genotipo-fenotipo
Los estudios de actividad enzimtica de los alelos mutados se realizan in vitro.
La mutacin se introduce en el gen mediante mutagnesis dirigida, expresndose
posteriormente y evaluando la actividad del enzima mutado frente a un control, que
proviene de la expresin, tambin in vitro, del gen normal. De esta manera se ha
definido como mutacin severa del gen de la 21-OH, aquella que deja una actividad
residual menor o igual que el 1%. Se incluyen tambin como mutaciones severas
aquellas que, en homocigosis, se asocian invariablemente con formas pierde-sal.
Son, por ello, mutaciones severas: las deleciones y conversiones grandes; las mutaciones que dan lugar a que aparezca un codn de parada, tanto porque el cambio de
base genere un codn de parada (Gln318Stop), como porque suponga una insercin
o delecin de base/s y el consiguiente desplazamiento de la fase de lectura con la
aparicin del Stop (delecin 8pb y 306insT); mutaciones de cambio de aminocido que se ubican en el dominio de centro activo (Arg356Trp y triple mutacin del
exn 6); y la mutacin que afecta al procesamiento del mRNA (655 A/C a G). La
mutacin de cambio de aminocido, Ile172Asn, da lugar a un enzima con una actividad residual del 1-2 % y se asocia con formas virilizantes simples.
Las mutaciones se consideran leves cuando el enzima mutado in vitro muestra
una actividad igual o menor al 25 % y/o sus constantes enzimticas se ven afectadas
(velocidad mxima, especificidad de sustrato). Estas mutaciones son: Val281Leu,
Pro30Leu y Pro453Ser. La mutacin Arg339His es tambin una mutacin leve aunque no se debe al mecanismo de microconversin y es ms infrecuente. En la Figura 18.2., se esquematiza la esteroide 21-hidroxilasa con sus enzimas auxiliares en la
membrana microsomal, indicando la ubicacin de las mutaciones de cambio de
aminocido en los correspondientes dominios funcionales de la protena: centro
activo (triple mutacin en exn 6 y Arg356Asn), unin a membrana (Ile172Asn y
Pro30Leu) y unin de grupo prosttico (Val281Leu y Pro453Ser).
Para el estudio de la correlacin genotipo-fenotipo los pacientes se agrupan
segn combinen en su genotipo dos mutaciones severas, una mutacin leve y una
severa o dos mutaciones leves (11,12,13). Segn defini Speiser et al. (11) la afectacin
enzimtica esperada de la combinacin de dos mutaciones severas sera total (actividad nula), mientras que sera parcial cuando se combinaran dos mutaciones leves
o una mutacin leve y una severa. El estudio de correlacin genotipo-fenotipo slo
puede hacerse sobre los pacientes completamente genotipados (mutaciones caracterizadas en ambos alelos paterno y materno). En nuestra serie son 260 los pacientes de los que se presenta este anlisis (Tabla 18.2.). En conjunto, podemos afirmar
que existe una fuerte, aunque no total, relacin (248/260, el 95 % de los pacientes
mostraron el fenotipo esperado). Todos los pacientes con dos mutaciones severas
273
Tabla 18.2. Correlacin genotipo-fenotipo para los 260 enfermos en que el estudio
molecular permiti el genotipaje completo (caracterizacin de las mutaciones de ambos
alelos)
Severa/Severa
(112 pacientes)
112 formas severas (100%)
60 formas leves (90%)

Severa/Leve
(67 pacientes)
7 formas severas (5 VS)
76 formas leves (94%)
Leve/Leve
(81 pacientes)
5 formas crpticas
95% (248/260 correlacin genotipo-fenotipo)
(112/112) mostraron formas clsicas. Los pacientes con dos mutaciones leves nunca
mostraron una forma severa y la gran mayora de ellos (76/81) mostraron una forma
NC; los cinco pacientes restantes presentaron una forma crptica. Las formas crpticas s manifiestan bioqumicamente la deficiencia, tanto su 17OHP basal como
tras estmulo con ACTH es alta; la falta de relacin estara, no entre los hallazgos
moleculares y el dficit enzimtico, sino entre el grado de dficit enzimtico y el
hiperandrogenismo generado por esos andrgenos en exceso. De cualquier manera,
se han contabilizado como falta de correlacin genotipo-fenotipo.
Las formas virilizantes simples presentaron mayoritariamente una heterocigosis
compuesta para Ile172Asn y mutacin severa (13/26), aunque tres pacientes mostraron Val281Leu en heterocigosis con una mutacin severa. La mutacin
Ile172Asn mantiene in vitro una actividad residual, aunque reducida, que podra
justificar la produccin mnima de aldosterona que previniera la prdida de sal y por
ello se asociara fuertemente con las formas pierde-sal. Una forma virilizante simple mostr la mutacin de procesamiento del intrn 2 en sus dos alelos (13) este
hecho, que ha sido descrito en otras series (11,12), se atribuye a un cierto grado de procesamiento alternativo correcto del ARNm en estas pacientes. El resto de pacientes
homocigotos para esta mutacin en nuestra serie (18 pacientes) presentaron formas
pierde-sal.
Los heterozigotos compuestos para mutacin leve y severa presentaron mayoritariamente (60/67) una forma leve, como podamos esperar del dficit enzimtico
parcial producido por este genotipo. En este grupo se encontr una mayor dispersin, ya que se encontraron siete pacientes con formas CL, todos ellos con
274
Val281Leu en el alelo leve; cabe sealar que dos de ellas fueron formas VS sin sndrome pierde-sal como se ha comentado ms arriba. No podemos excluir que existiera una segunda mutacin severa no caracterizada en el alelo portador de la
Val281Leu. Esta heterocigosis compuesta para mutacin severa y leve (Val281Leu)
en pacientes con formas pierde-sal se ha descrito en otras series de otras poblaciones (11). Cabe sealar que en este grupo de mutacin leve/severa tambin se encontraron formas crpticas y oligosintomticas. Recientemente hemos descrito
(Martnez Olmos et al. 1997) una forma oligosintomtica en dos hermanas, cuyo
genotipo fue 655G (severa)/Val281Leu (leve).
La fuerte correlacin genotipo-fenotipo en esta enfermedad ha llevado a algunos
autores (12) a considerar que el genotipaje de mutaciones puede ser ms relevante que
la propia categorizacin clnica de estos pacientes. Ya que, segn argumentan, la
severidad clnica puede estar condicionada por el estrs y otros factores ambientales y queda oscurecida por factores relacionados con el sexo. Los nios pueden ser
diagnosticados y tratados antes de que aparezcan los signos clnicos y el tratamiento prenatal ha de plantearse siempre que exista un feto a riesgo de presentar dos
mutaciones tipo severa/severa.
Aportaciones del anlisis gentico molecular

en la deficiencia de 21-OH
De manera general, tanto en formas tardas como neonatales, el anlisis molecular nos ha permitido realizar el diagnstico de portadores. Hemos de sealar que
un 20% de los portadores genotipados (con mutacin caracterizada mediante anlisis del gen) presentaban unos valores de 17OHP tras estmulo con ACTH en el
rango de la normalidad. El anlisis molecular nos ha permitido confirmar el diagnstico en la gran mayora de los casos, con algunas salvedades.
Un importante porcentaje (38 %) de las formas tardas ha presentado en uno de
sus alelos una mutacin severa, es decir, que se encuentran a riesgo de, si tienen descendencia con otro portador de mutacin severa, tener un hijo/a con una forma neonatal, pierde-sal o virilizante simple. De hecho, incluso en formas crpticas y oligosintomticas de la deficiencia hemos constatado a nivel molecular en algn caso la
existencia de mutacin severa en uno de los alelos (24). Teniendo en cuenta que en
esta enfermedad es posible realizar tratamiento prenatal, que evita la masculinizacin de genitales externos en la nias afectas y prevenir el sndrome pierde-sal si se
conoce la situacin de afecto del feto varn o nia, habra de plantearse adecuadamente el consejo gentico de estas pacientes.
Por otro lado, la realizacin del anlisis molecular nos ha permitido perfilar
mejor los dinteles diagnsticos del test de Synachten, separando formas clnicas que
podran ser susceptibles de distinto seguimiento, tratamiento, etc. Los denominados
hiperandrogenismos funcionales son pacientes que presentan signos clnicos de
virilizacin sin hiperandrogenemia bioqumica y en los que nicamente la 17OHP
tras estimulacin con ACTH es superior a la normalidad, aunque situndose en el
275
rango definido para portadores (7). En el anlisis molecular realizado a estos pacientes no se encontraron en ningn caso dos alelos mutados, aunque s resultaron portadores de la deficiencia con una frecuencia superior a la poblacin normal (1/3 vs
1/15). Los resultados de este estudio sugieren que: si se encuentran unos niveles de
17-OHP tras estmulo con ACTH por debajo de 12 ng/ml es muy probable que no
se trate de una forma tarda; que si se detectan unos niveles entre 12 y 16 ng/ml, se
encuentran por encima del 95 % de los portadores genotipados, pero en ellos se ha
podido documentar la existencia de pacientes con dos alelos mutados; y que las formas tardas con diagnstico molecular que evidencia la presencia de dos alelos
mutados presentaron niveles superiores de este metabolito. En dos de estas formas
tardas la 17O-HP tras el estmulo con ACTH fue de 17 y 18 ng/ml. El resto, present niveles superiores a 20 ng/ml.
En cuanto a las basales de 17-OHP, no permiten el diagnstico de portadores en
ningn caso, y s pueden permitir el diagnstico de forma tarda (no en todos los
casos), que habra de confirmarse con el test de ACTH. Azziz et al (7) sugieren que
cifra de 17-OHP basal por encima de 5ng/ml permiten efectuar el diagnstico.
Algunas formas tardas presentan 17-OHP basal en el rango, o prxima, a la normalidad y slo son diagnsticas con el test de estimulacin. Una paciente homocigota
para Val281Leu mostr una basal de 2,4 con un test de estimulacin de 21 ng/ml.
Las aportaciones del estudio molecular en las formas clsicas de la deficiencia
en lo que se refiere al diagnstico, son por lo general, nicamente de tipo confirmatorio, aunque en algunos casos de HSC con 17-OHP elevada y 11-deoxicortisol
superior a la normalidad que plantearon dudas sobre si se trataba de un dficit de
21-OH o de 11-OH, se pudo constatar que existan alteraciones moleculares en el
gen de la 21. Los valores altos de 11-deoxicortisol, metabolito por debajo del bloqueo enzimtico, pueden ser debidas a la interferencia del 21-deoxicortisol (metabolito no fisiolgico cuya concentracin se hace relevante en aquellos casos en que
la 17-OHP se encuentra muy elevada y es hidroxilada en posicin 11) y a una cierta inhibicin de la 17-OHP sobre la 11-hidroxilasa. Otro tipo de interferencias en
la determinacin de 17-OHP, que son especialmente importantes en neonatos han
podido llevar en alguna ocasin al diagnstico de forma virilizante del dficit de
21 con valores de 17-OHP entre 10-20 ng/ml, que a nivel molecular no se ha evidenciado como tal. La trascendencia de estos hechos se plantea especialmente en
el consejo gentico y diagnstico prenatal en estas familias. El diagnstico molecular mediante anlisis directo del gen permite evitar estos problemas. El diagnstico prenatal constituye otra importante aportacin del anlisis molecular al
estudio de la HSC y se describen a continuacin los resultados de dicho estudio en
nuestra poblacin.
Diagnstico prenatal
El tratamiento prenatal en la HSC por deficiencia de 21-OH se plantea en la
embarazada a riesgo de tener un hijo con una forma clsica de la deficiencia (fami-
276
lia que tiene ya un caso afecto o en pareja de portadores de mutacin severa). De los
23 estudios de muestras prenatales realizados por solicitud de endocrinlogos,
genetistas y gineclogos de distintos hospitales del mbito nacional incluidos en
este trabajo, slo en 17 casos se daba esta circunstancia, y lo que es ms importante, en slo 10 de los 17 casos se haba iniciado adecuadamente el tratamiento prenatal. El resto de casos eran parejas en que la madre presentaba una forma tarda de
la deficiencia y en cinco de los casos se haba iniciado un tratamiento que no hubiera sido necesario.
En referencia concreta a aquellos casos en que el diagnstico prenatal tuvo que
definir si el tratamiento haba de ser retirado o mantenido (10 casos de los que 6 fueron nias): dos eran nias afectas en las que el tratamiento se mantuvo y evit la
virilizacin neonatal (25), y en cuatro se pudo retirar el tratamiento, tres de ellas eran
portadoras. La constatacin de que se trate de un nio, sea o no afecto, o de una nia
portadora o sana nos lleva a retirar el tratamiento. En lo que se refiere a los casos
que hubieran requerido tratamiento prenatal previo al diagnstico molecular por
estar ste indicado, hemos de resear que en dos de los casos se trat de nios afectos: una nia afecta recibi tratamiento unicamente a partir de la 21 a semana
(momento en que se contact con nuestro laboratorio para el estudio molecular y en
ella no se pudo prevenir la virilizacin; el otro fue un varn en el que se hubiera retirado el tratamiento y en el que el diagnstico molecular permiti prevenir el sndrome pierde-sal al nacimiento).
Los estudios prenatales se realizaron por dos abordajes distintos y complementarios que permiten una mayor fiabilidad de los resultados, ambos han de ser
concordantes para marcar la actitud a seguir: un anlisis directo del gen (13,19) y un
anlisis indirecto mediante microsatlites en la regin HLA (22). Estos marcadores
fueron desarrollados por nuestro grupo para solventar algunos de los problemas que
presentaban los tradicionales marcadores indirectos, antgenos HLA. La utilidad de
estos microsatlites se describe en Ezquieta et al. (22). La heterocigosidad (probabilidad de que un individuo presente dos alelos distintos) de estos marcadores es muy
elevada (0,62-0,76) y por ello, su informatividad. El anlisis indirecto permite
seguir aquellos alelos no caracterizados pero adems es til como elemento independiente de confirmacin del diagnstico que se hace por anlisis directo. La alta
heterocigosidad de estos marcadores ha permitido la deteccin de contaminacin
con tejido materno de una de las muestras prenatales estudiadas.
Los errores descritos en el diagnstico prenatal de 21-OH a nivel molecular
hasta el momento han sido atribuidos a distintos motivos como la contaminacin de
la muestra prenatal con tejido materno o la recombinacin entre el gen mutado y los
marcadores HLA utilizados. Los marcadores de tipo microsatlite pueden ayudar a
reducir o solventar estos problemas. Su gran informatividad permite que puedan
seguirse los cromosomas no caracterizados, detectar contaminacin de tejido
materno y recombinaciones. Sin olvidar la utilidad adicional de permitirnos definir
el diagnstico prenatal mediante dos abordajes independientes, solventando los
problemas de errores en el diagnstico directo de 21-OHD por alelos no amplificables as como errores de la PCR de 21-OH, que tambin han sido descritos
277
(Donohue et al (10). De cualquier forma, ambos abordajes anlisis directo e indirecto han de aplicarse para un correcto diagnstico de enfermos, portadores y muestras prenatales.
Estos datos en conjunto muestran que el anlisis del gen 21-OH es de gran utilidad en la HSC tambin en poblacin espaola, tanto en diagnstico de portadores
como prenatal; que la distribucin y frecuencia de alelos mutados es similar a la
encontrada en otras poblaciones aunque presenta algunas peculiaridades que ponen
de manifiesto la existencia de un mecanismo de distribucin de alelos por efecto
fundador, ya sugerido por otros autores, que junto al mecanismo de conversin
gnica, contribuira a la elevada frecuencia de alelos mutados para esta deficiencia.
Tambin se ha podido comprobar la existencia de una fuerte correlacin genotipofenotipo y la utilidad diagnstica del anlisis.
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19
Terapia celular de la diabetes mellitus
B. Soria Escoms
Introduccin
La diabetes mellitus consiste en un conjunto de sndromes metablicos cuya
caracterstica comn es el aumento de la glucosa sangunea, se trata de una enfermedad crnica que tiene tratamiento pero no tiene curacin. Tanto en la diabetes
tipo 1 (insulino-dependiente) como en la tipo 2 (no-insulino dependiente) hay un
dficit en la liberacin de insulina. Dicho dficit es especialmente grave en la tipo 1, en la que por un proceso autoinmune hay una prdida de la poblacin celular
beta de los islotes de Langerhans. Los diabticos tipo 1 son subsidiarios del tratamiento con insulina durante toda su vida. Los estudios de tipo prospectivo y epidemiolgico (DCCT (1), UKPDS (2)) han demostrado que el control intensivo de la glucemia disminuye de forma significativa la aparicin de complicaciones
microvasculares (retinopata, nefropata, neuropata). El tratamiento intensivo
intenta reproducir el control fisiolgico (permanente, preciso y regulado) de la glucemia sangunea, para ello el paciente debe someterse a un control permanente de
la glucemia y a la administracin intensiva (4-6 veces da) de insulina, la tarea que
el pncreas endocrino realiza de forma continua es sustituida por la conducta de un
paciente entrenado y motivado, como afirma Mara de Alva (3), diabtica y
Presidenta de la International Diabetes Federation: my brain is my pancreas. Sin
embargo, este tratamiento precisa de pacientes muy motivados.
La curacin de la diabetes tipo 1 slo puede venir de la reposicin de la poblacin celular beta. Hasta ahora, el trasplante de islotes pancreticos haba tenido un
xito limitado, sin embargo, la introduccin de un nuevo tratamiento inmunosupresor es capaz de resolver la dependencia de insulina por perodos de ms de doce
meses (4). Este nuevo protocolo supone un claro avance en el trasplante de islotes,
sin embargo deja dos puntos abiertos: en primer lugar los diabticos trasplantados
necesitan terapia inmunosupresora continua y en segundo lugar, para cada diabti-
280
co se necesitan de dos a tres donantes. Dado que las cifras de donantes, incluso en
pases como Espaa, con un alto nivel de donacin de rganos, nunca alcanzarn las
necesidades de la poblacin de diabticos tipo 1, se impone la necesidad de buscar
otras fuentes de clulas beta para poder ser trasplantadas. Dichos procedimientos
teraputicos utilizan los conceptos, mtodos y conocimientos que pueden englobarse en lo que entendemos por ingeniera celular.
Qu es la ingeniera celular?
La ingeniera celular es un nuevo campo interdiciplinar que aplica los principios
de la ingeniera y de las ciencias de la vida a la obtencin de sustitutos biolgicos
para restaurar, mantener o mejorar la funcin tisular (5). Los avances considerables en
Ciencia de los Materiales, Gentica Molecular, Biologa del Desarrollo, Biologa
Molecular y Celular, junto con un conocimiento ms profundo de la fisiologa de las
clulas, tejidos y rganos, han permitido que por primera vez se plantease la obtencin de clulas y tejidos para su implante en humanos. En muchas ocasiones la ingeniera celular imita los procesos biolgicos del desarrollo intrauterino o de la
reconstruccin fisiolgica de tejidos para la consecucin de sus objetivos. Las tcnicas de ingeniera celular han permitido hasta el momento la obtencin de piel artificial, tendones, ligamentos, etc. Cabe preguntarse si las nuevas tcnicas de ingeniera
celular pueden ser tiles para generar nuevas clulas beta que trasplantadas al paciente consigan normalizar la glucemia y evitar las complicaciones de la enfermedad.
Obtencin de clulas beta artificiales mediante tcnicas

de bioingeniera
Ingeniera de clulas de origen tumoral
Las primeras propuestas consistieron en transfectar lneas de origen tumoral
con los genes de aquellas protenas que no se expresan adecuadamente y por lo
tanto, normalizar un fenotipo defectuoso. Por ejemplo, es muy frecuente que las
lneas tumorales presenten un umbral demasiado bajo para la glucosa (en el rango
sub mM), esto es debido a que expresan las isoformas I-III de la hexokinasa, que
posee una mayor afinidad por glucosa. La transfeccin con el gen de la glucokinasa (hexokinasa IV) permite obtener un patrn de respuesta a la glucosa en el rango
fisiolgico. Existen varias lneas celulares de origen tumoral derivadas a partir de la
clula beta por irradiacin (clulas RINm5F, INS-1, etc.) o por transformacin viral
mediante SV40 acoplado al promotor de la insulina (clulas `TC). Tambin pueden
utilizarse lneas tumorales de origen neuroendocrino, que comparten con la clula
beta una serie de propiedades, como por ejemplo, el procesamiento, almacenamiento y secrecin de pptidos. La lnea AtT-20, derivada de la adenohipfisis de
TERAPIA CELULAR DE LA DIABETES MELLITUS
281
ratn, puede ser transfectada con el gen de la insulina, con lo que se obtiene la lnea
AtT-20 ins (6). La facilidad con la que ciertas lneas celulares pueden ser transfectadas de forma reiterada permite la ingeniera iterativa, es decir, la transfeccin con
otros genes como el de la glucokinasa y el del transportador GLUT-2 (7). Mediante
este procedimiento se ha generado una lnea celular que responde a la glucosa en el
rango fisiolgico, si bien posee una cintica de secrecin sin primera fase (Fig. 19.1).
Las lneas tumorales presentan, no obstante, una serie de problemas no bien resueltos, como por ejemplo, la inestabilidad del fenotipo, la expresin de genes no deseados, y sobre todo su proliferacin incontrolada ya que son de origen tumoral. Con
el fin de controlar la proliferacin se ha propuesto la utilizacin de genes cuya
expresin es sensible a la presencia de un determinado ligando, como la tetraciclina (8), o a la temperatura.
Produccin de insulina en otros tejidos

La produccin de insulina en otros tejidos (produccin ectpica) puede conseguirse mediante la transfeccin de clulas no beta con el gen de la insulina humaAtT-20
hlns
Glut-2
GK
Slo 2.a fase
0
Tiempo, min
30
Insulina
Insulina
Lnea celular secretora

de insulina
10
Glucosa, mM
15
Figura 19.1. Bioingeniera de lneas celulares neuroendocrinas. La lnea celular AtT-20 procedente de la pituitaria anterior es tranfectada de forma progresiva (iterative engineering) con el
gen de la insulina humana (hIns), el del transportador de glucosa (Glut-2) y el de la glucoquinasa
(GK). La nueva lnea celular responde a glucosa a concentraciones fisolgicas aunque no est
presente el primer pico de la secrecin bifsica de insulina.
282
na. Por ejemplo, se pueden tomar fibroblastos de un paciente, transfectarlos con el

gen de la insulina y reinyectrselos al propio paciente. Este sistema genera una
liberacin basal, constitutiva y no regulada, de insulina. Siempre que no se alcancen niveles muy altos de insulinemia basal (peligro de hipoglucemia), la insulinemia basal no permite enfrentarse a los aumentos de glucemia postprandial pero
quizs le permita el mantenimiento de la glucemia basal. Es decir, la dependencia
de insulina no desaparece, pero puede utilizarse alguna insulina rpida, incluso de
las nuevas formulaciones de insulina inhalada, en el control de la glucemia postprandial. La ventaja de estos procedimientos es que no necesitan inmunosupresin.
Los inconvenientes son: no se ha conseguido una expresin estable por periodos
prolongados, el fibroblasto carece de los enzimas para transformar la proinsulina
en insulina y, lo que es ms importante, el fibroblasto carece de la maquinaria para
procesar, almacenar y secretar insulina, por lo que la secrecin no es una secrecin
regulada. El peligro de un aumento no controlado de la insulinemia basal, y de
hipoglucemia severa, es una de las complicaciones ms graves del tratamiento
mediante insulinas.
Quizs, el problema ms difcil de resolver en la terapia celular de la diabetes
mellitus es la reproduccin de la liberacin finamente regulada de la insulina en
respuesta a las variaciones de glucosa. A diferencia de otras endocrinopatas carenciales en las que la presencia de la molcula puede considerarse aceptablemente
buena para un rango amplio de concentraciones en el caso de la insulina el mecanismo es extraordinariamente preciso y debe ajustarse a lo que en cada momento
necesita el organismo. Este planteamiento hizo que se pensase en la utilizacin de
otras estrategias para conseguir la secrecin regulada de insulina en estructuras
ectpicas. Por ejemplo, la transfeccin de hepatocitos con un gen quimrico consistente en la fusin del promotor de la piruvato quinasa o de la fosfoenolpiruvato
carboxiquinasa con el gen estructural de la insulina. Dado que la expresin de
ambos enzimas hepticos est regulada por glucosa, los aumentos extracelulares
de glucosa se traduciran en la expresin heptica de insulina. La principal dificultad de esta propuesta teraputica es que lo que est regulado por la glucemia es
la expresin del gen y no la liberacin de la hormona. Como la sntesis de protenas es un proceso lento (30-60 min) en la prctica el sistema de retroalimentacin
funciona como un loop demasiado lento generando periodos de hiperglucemia e
hipoglucemia intensas.
Esta dificultad puede resolverse mediante la transfeccin de clulas endocrinas
intestinales en las que la liberacin hormonal est regulada por glucosa, como ocurre con las clulas K encargadas de la liberacin de GIP (polipptido insulinotrpico dependiente de glucosa) en presencia de glucosa. El gen quimrico resulta de la
fusin del promotor del GIP con el gen estructural de la insulina. Este procedimiento impide la progresin de la diabetes experimental en ratones (9). No obstante,
el epitelio intestinal est en continuo recambio lo que impide una accin prolongada de la terapia. Alternativamente, puede conseguirse el control farmacolgico de la
secrecin proteica mediante un procedimiento que permite la liberacin rpida y
pulstil de protenas teraputicas (10). Para ello se disea el precursor proteico de
283
forma que se almacena formando agregados en el retculo endoplsmico. La secrecin puede estimularse mediante un frmaco que produzca desagregacin y permita la accin de las furinas, proteasas ubicuas que rompen el enlace peptdico que une
la protena teraputica al dominio de agregacin condicional. Por ltimo, la observacin casual de que las clulas eucariotas pueden capturar DNA crudo del ambiente e incorporarlo a su maquinaria de produccin de protenas ha hecho que se
empiece a utilizar la inyeccin de ADN crudo en la musculatura esqueltica. La
electroporacin puede utilizarse in vivo para facilitar la incorporacin del gen de la
insulina al msculo esqueltico. Este procedimiento posee en este momento las
mismas dificultades descritas para la transfeccin de otros tipos celulares como los
fibroblastos.
Ingeniera celular de precursores. Estmulo y control del crecimiento, regeneracin y neognesis de islotes
La masa celular ` aumenta por diferenciacin a partir de clulas precursoras del
epitelio ductal del pncreas, aunque parece ser que tras el nacimiento la replicacin
de clulas beta preexistentes es el principal mecanismo de aumento de la masa
celular. La posibilidad de que ambos mecanismos coexistan en el adulto ofrece la
posibilidad de aprovechar dicha capacidad en la prevencin o en el tratamiento de
la diabetes. Susan Bonner-Weir et al (11) han desarrollado un protocolo de cultivo que
permite la obtencin de islotes pancreticos a partir de las clulas ductales de pncreas de donantes. En sntesis, consiste en cultivar las clulas en monocapa durante 1-2 semanas en un medio que contiene factor de crecimiento de queratinocitos,
nicotinamida e ITS (insulina + transferrina + selenio) hasta que las clulas estn casi
confluentes. A continuacin son transferidas a un medio con una preparacin de
matriz extracelular (Matrigel) durante 1-7 semanas. El principal obstculo de este
procedimiento es que se consigue una proliferacin muy limitada y por lo tanto no
se alcanza la cantidad de material necesaria para un trasplante. Otros autores han
utilizado clulas beta procedentes de neonatos con PHHI, hiperinsulinemia e hipoglucemia persistente de los neonatos. En este cuadro clnico debido a una mutacin
del canal de potasio regulado por ATP (12), las clulas beta estn permanentemente
despolarizadas, lo que provoca la entrada continua de calcio y la liberacin persistente de insulina. Desgraciadamente el canal mutado es insensible a diazxido
por lo que los recin nacidos con este cuadro precisan de una pancreatectoma del
95% para resolver la hipoglucemia en la que se encuentran. A partir de las clulas
beta obtenidas tras la pancreatectoma se ha desarrollado una lnea celular que responde a concentraciones fisiolgicas de glucosa (13). El procedimiento incluye la
transfeccin con el gen del canal K ATP y con el gen que codifica el factor de transcripcin PDX-1. PDX-1 es un factor de transcripcin que juega un papel central en
la diferenciacin de la clula beta pancretica y en la regulacin de la expresin de
la insulina.
284
Clonacin teraputica y diferenciacin in vitro de clulas beta

El descubrimiento de que la informacin contenida en el ADN de una clula
adulta puede ser reprogramada, de forma que se puede desarrollar un mamfero
superior a partir de la informacin contenida en el ncleo de una clula de una oveja
adulta (14), ha cambiado el paradigma existente hasta el momento. Las clulas adultas-diferenciadas mantienen su estado diferenciado gracias a que han silenciado
muchos de sus genes, se supone que por procesos de metilacin. Una clula diferenciada slo expresa un determinado men de su repertorio de genes, sin embargo, una clula totipotencial puede an expresarlos todos y, por lo tanto, dar lugar a
cualquier tipo celular de los aproximadamente 200 que existen en un organismo
adulto. En el caso de Dolly se consigui la totipotencialidad, el ncleo transferido
dio lugar a todos los tipos celulares, incluyendo las clulas germinales. La clonacin
reproductiva permite la obtencin de transgnicos para la produccin de sustancias
con aplicaciones biotecnolgicas (pptidos hormonales, etc.) o de rganos para su
trasplante en humanos (xenotrasplante). En la actualidad y, dado el nmero de malformaciones asociadas al proceso, puede afirmarse que intentar la clonacin reproductiva humana sera una aberracin criminal e irresponsable. No as la clonacin
teraputica que abre la posibilidad de obtener in vitro clulas y tejidos que pueden
ser utilizados en terapia celular de enfermedades como la diabetes, el Parkinson, etc.
Nuestro grupo ha demostrado que es posible obtener clulas que contengan y liberen insulina a partir de clulas embrionarias de ratn. Dichas clulas normalizan la
glucemia en animales diabticos (15). En sntesis, la clonacin teraputica consta de
cuatro pasos: a) Transferencia del ncleo de una clula procedente de un paciente
(por ejemplo de un fibroblasto o de la piel) a una clula receptora que puede ser un
ovocito humano, no humano (se ha ensayado con xito los ovocitos de ternera) u
otros tipos celulares con pluripotencialidad suficiente; b) Diferenciacin in vitro
hacia el tipo celular deseado; c) Seleccin clonal; y d) Maduracin y diferenciacin
terminal.
En teora, la diferenciacin in vitro puede promoverse generando unas condiciones ambientales similares a las del desarrollo embrionario. Por ejemplo, la polaridad, los factores de crecimiento o la presencia de matriz extracelular (16). Sin
embargo, la obtencin de poblaciones celulares puras exige la utilizacin de tcnicas de seleccin clonal eficientes. En general, los mtodos de seleccin clonal se
basan en la expresin de determinadas protenas en la membrana celular y la seleccin mediante FACS (fluorescence activated cell sorting). Se puede conseguir
una seleccin ms especfica utilizando la seleccin en base a la expresin de marcadores genticos representativos del tipo celular que se desea seleccionar (17,18). La
metodologa, que nosotros hemos adaptado para la seleccin de clulas que contengan insulina consiste en transfectar las clulas con un gen quimrico formado
por la fusin funcional del promotor de la insulina acoplado a un gen de resistencia a la neomicina (Fig. 19.2). As, aquellas clulas que contengan el complejo de
transcripcin que activa la expresin de dicho gen, tendrn tambin activado la
expresin del gen de resistencia a la neomicina. Este procedimiento ha permitido
285
la obtencin de cardiomiocitos (17) y de precursores neurales (18) a partir de clulas

madre embrionarias.
Trasplante de clulas beta obtenidas a partir de clulas

madre embrionarias
El mtodo descrito previamente ha permitido la obtencin de una lnea celular
que no slo contienen insulina, sino que posee secrecin regulada de la misma. El
procedimiento de obtencin que se sumariza en la (Fig. 19.2), y consiste en:
a) Transfeccin mediante electroporacin o lipofeccin de clulas madre
embrionarias con un constructo similar al descrito en la (Fig. 19.2). Dicho
constructo est diseado para que exprese el gen de resistencia a la neomicina slo en aquellaos tipos celulares que expresan insulina.
b) Seleccin mediante higromicina de las clulas transfectadas.
c) Diferenciacin in vitro con formacin de cuerpos embrionarios y cultivo en
monocapa.
d) Seleccin de clones resistentes a neomicina (y que por lo tanto estn expresando insulina).
e) Maduracin de clones que expresan insulina (2 semanas en 10 mM nicotinamida y alta glucosa 25 mM + 5 das en 10 mM nicotinamida y 5 mM glucosa).
f) Caracterizacin del clon en trminos de contenido de insulina, secrecin y
liberacin de la misma en respuesta a distintos secretagogos.
g) Trasplante a animales diabticos.
El clon que se seleccion en este estudio tena un contenido de insulina correspondiente aproximadamente al 80 % del contenido de insulina de islotes de ratn (15).
Se comprob adems, que la incubacin en bajas concentraciones de glucosa aceleraba el proceso final de maduracin, ya que el contenido de insulina de los islotes
y las respuestas de secrecin basal e inducida por concentraciones estimulatorias de
glucosa (16,7 mM) o tolbutamida (100 M), iba aumentando con los das de incubacin en glucosa. Al final, obtuvimos unas clulas cuya liberacin basal de insulina era la mitad de la de los islotes de raton, y que en respuestas a secretagogos, tenan una secrecin de insulina que corresponda aproximadamente al 55 % de la
secrecin de islotes de ratn. Cuando estas clulas se trasplantaron en un modelo de
animal se comprob que eran capaces de mantener normoglicmicos a dichos animales desde los primeros dos das del trasplante y durante todo el tiempo que dur
el estudio (19).
En base a lo anteriormente expuesto (20), pueden postularse las siguientes predicciones en relacin con el trasplante de islotes pancreticos y el uso de clulas
madre en ingeniera celular y diabetes mellitus:
286
R1 mESC
Transfeccin
h Ins prom
B-geo
PGK/Hygro
+ Higromicina
Clones resistentes
a higromicina
Diferenciacin in vitro
+ Neomicina
Clones resistentes
a Neomicina
Clulas con bajo contenido en insulia
2 semanas Nic
Maduracin
5 das Nic-baja glucosa
Clulas con alto contenido en insulina
Figura 19.2. Diagrama de flujo del proceso de diferenciacin desde clulas madre embrionarias
pluripotenciales (mESC) a clulas que contienen insulina. NIC: nicotinamida (modificado de Soria
et al (20).
1. En un futuro prximo se observar un aumento en los trasplantes de islotes

para el tratamiento de la diabetes tipo 1.
2. A corto y medio plazo se desarrollarn nuevos mtodos para la obtencin in
vitro de clulas beta, bien a partir de precursores, como las clulas ductales,
o a partir de clulas madre.
287
3. La clonacin teraputica, autorizada ya en pases como el Reino Unido,

EEUU. y Japn, se extender a otras regiones permitiendo el tratamiento de
la diabetes mellitus mediante clulas ` producidas a medida.
4. A medio plazo se dispondr de mtodos para la diferenciacin a partir de
clulas madre del adulto. Una vez resuelta la expansin necesaria para generar una masa notable de clulas beta ser factible tanto el alotrasplante como
el autotrasplante.
5. La ingeniera celular permitir la modificacin de las clulas con el fin de
hacerlas ms resistentes al ataque inmunitario, a la apoptosis, etc.
6. Se desarrollarn terapias inmunosupresoras que permitirn suprimir la respuesta autoinmune en la diabetes tipo 1, lo que permitir el trasplante de
clulas beta con efectos secundarios mnimos.
7. El desarrollo de tcnicas de encapsulacin permitir la tolerancia al alotrasplante de clulas beta pancreticas.
En suma, junto con la biologa molecular y el conocimiento de la estructura y
funcin del genoma humano, la ingeniera celular puede convertirse en la nueva
revolucin biomdica del siglo XXI.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido realizado, en parte gracias a Ayudas del Ministerio de
Ciencia y Tecnologa (PM99-0142), Fundaci Marat TV3 (99-1210), Fundacin
Salud 2000 y Juvenile Diabetes Foundation (1-2000-575).
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20
Aproximacin gentica
a los pseudohermafroditismos
M. L. Gaspar
Determinacin y diferenciacin sexual. Pseudohermafroditismos

El proceso de determinacin sexual de un feto comprende aquellos eventos
genticos que producen un desarrollo gonadal masculino o femenino. La diferenciacin sexual se refiere a los siguientes eventos morfognicos y fisiolgicos que
finalmente establecen la funcionalidad sexual, el dimorfismo sexual y las caractersticas sexuales secundarias. Los genitales se desarrollan durante el primer trimestre de vida intrauterina, bajo la influencia de hormonas esteroideas sexuales, por lo
que como consecuencia de alteraciones en la sntesis o accin de estas hormonas
pueden existir cambios en el desarrollo sexual normal del feto.
Prcticamente todas las etapas de la diferenciacin sexual estn determinadas
genticamente, por lo que cada una de ellas puede fallar como consecuencia de la
mutacin de los genes correspondientes. Estas mutaciones ocasionan cuadros de
indefinicin sexual en grados diversos, que conllevan la aparicin de pseudohermafroditismo. Se llama pseudohermafroditismo o estado intersexual a aquellas entidades en las que los genitales externos del individuo son ambiguos o son discordantes con el sexo gonadal o el cromosmico del sujeto.
El pseudohermafroditismo masculino es una patologa de la diferenciacin
sexual en la que se produce una incompleta diferenciacin de los genitales masculinos (ductos genitales y/o genitales externos) en presencia de gnadas masculinas
Abreviaturas utilizadas: Dihidrotestosterona (DHT); Factor inhibidor de tumor de Wilms
(Wilms tumor inhibiting factor, WT-1); Factor esteroidognico (steroidogenic factor-1, SF-1);
Hiperplasia adrenal congnita (HAC); Hipoplasia de clulas de Leydig (HCL); Hormona antimulleriana (mullerian inhibiting substance, MIS); Hormona gonadotropina corinica (HCG); Hormona
luteinizante (HL); Reaccin de polimerasa en cadena (PCR); Receptor de andrgenos (RA); Receptor
de HL (RHL); Secuencias de reconocimiento esteroideo (SER); Sndrome de Feminizacin Testicular
(Tfm).
290
o de tejido testicular en individuos genotpicamente varones (46,XY). Est causado por fallos en el proceso secuencial de desarrollo embrionario del testculo.
Normalmente durante la vida embrionaria en presencia de un testculo funcional los
conductos de Muller regresan por accin de la hormona antimulleriana (o mullerian inhibiting substance, MIS) y los conductos mesonfricos y el sinus urogenital se diferencian hacia genitales externos e internos masculinos por accin de la
testosterona y la dihidrotestosterona (DHT). Si en este periodo de la vida embrionaria no se produce una adecuada exposicin a hormonas testiculares (testosterona
y MIS), o el individuo es genticamente incapaz de responder a ellas, el proceso de
diferenciacin de genitales masculinos no se produce o lo hace parcialmente, ocasionando la aparicin de pseudohermafroditismo masculino. La causa ms frecuente de pseudohermafroditismo masculino en ausencia de gnadas disgenticas
es el Sndrome de feminizacin testicular (Tfm) o Sndrome de insensibilidad a los
andrgenos, ocasionado por mutaciones en el gen que codifica para el receptor de
andrgenos (RA) (1). La segunda causa ms frecuente de pseudohermafroditismo
masculino es el dficit de 17` hidroxilasa, que ocasiona un defecto en la biosntesis de testosterona, lo que produce un cuadro de pseudohermafroditismo incompleto con insuficiencia adrenal (2).
El pseudohermafroditismo femenino es una patologa de la diferenciacin sexual
en la que se produce una diferenciacin de genitales externos masculinos en ausencia de tejido testicular, en individuos que son genotpicamente hembras (46,XX). En
estos pacientes se encuentran genitales internos femeninos junto con grados diversos de virilizacin en genitales externos.
Est producido por exposicin del feto femenino a un exceso de ambiente
andrognico durante el embarazo. De esta forma, los andrgenos masculinizan los
genitales externos, pero el feto conserva sus ovarios, y derivados mullerianos. La
causa ms frecuente de este cuadro es la hiperplasia adrenal congnita (HAC) producida por dficit de 21 hidroxilasa (3), y la segunda causa ms frecuente se debe a
un exceso materno de andrgenos, generalmente a consecuencia de tumores ovricos.
Las principales causas de pseudohermafroditismo se resumen en la Tabla 20.1.
En todos estos cuadros se produce la mutacin en alguno de los genes relevantes en
alguna etapa concreta de la sntesis o accin de los andrgenos y/o la MIS. El cuadro clnico que presenta cada uno es muy variable, pero el patrn de niveles hormonales de los pacientes afectados es orientativo del diagnstico, que finalmente se
confirma por la deteccin directa de las mutaciones correspondientes. La presencia
de las mutaciones de alguno de estos genes se determina por tcnicas de biologa
molecular, como son el anlisis de polimorfismo conformacional de ADN de cadena sencilla (SSPC), o la reaccin de polimerasa en cadena (PCR), que permite
amplificar el ADN de los distintos exones, intrones y regiones promotoras de los
genes, que son posteriormente secuenciados. Por ltimo, la funcin anmala de la
protena mutada se demuestra por la introduccin del ADNc portador de la mutacin correspondiente en clulas carentes de la protena nativa, o por la produccin
de animales transgnicos con el ADNc mutado.
APROXIMACIN GENTICA A LOS PSEUDOHERMAFRODITISMOS
Tabla 20.1.
291
Causas genticas de pseudohermafroditismo
1) Dficit de respuesta testicular a la gonadotropina corinica y a la hormona luteinizante.

(por mutaciones en su receptor).
2) Dficit enzimticos en la biosntesis de cortisol/testosterona.
3) Anomalas en la accin de los andrgenos.
a) por defectos en el metabolismo intracelular de la testosterona.
b) por resistencia a la accin de los andrgenos (mutaciones en su receptor).
4) Defectos sntesis o accin de la h. antimulleriana.
Dficit de respuesta testicular a la gonadotropina corinica

y a la hormona luteinizante: mutaciones del gen de su receptor
El desarrollo sexual masculino est regulado por la hormona gonadotropina
corinica (HCG) y la hormona luteinizante (HL), que actan en la gnada indiferenciada del feto por unin al receptor de HL (RHL) presente en las clulas de
Leydig. Mutaciones que inactivan el RHL causan una inadecuada diferenciacin
fetal de clulas de Leydig en el testculo, lo que ocasiona una aplasia o hipoplasia
de estas clulas (Hipoplasia de clulas de Leydig, HCL).
La HCL es una patologa autosmica recesiva, causada por mutaciones en el gen
que codifica para el RHL. Se han localizado mutaciones a lo largo de todo el gen de
RHL, que incluyen mutaciones puntuales, inserciones y delecciones (4). El RHL es
una protena transmembrana, con un gran dominio extracitoplsmico, siete dominios transmembranales unidos por tres lazos intracelulares y tres extracelulares, y
una cola intracitoplsmica. Esta protena est codificada en el cromosoma 2p21, y
consta de 11 exones. Los 10 primeros codifican todo el dominio N-terminal extracelular, que es donde se encuentra el lugar de unin a la hormona, mientras que el
exn 11 codifica la regin C-terminal, que comprende el resto de los dominios. La
mayora de las mutaciones descritas en el gen de RHL, sobre todo las inserciones y
delecciones, o las mutaciones puntuales ocasionando cambios sin sentido, ocasionan diversos grados de prdida de actividad del RHL, desde su total falta de funcin
hasta una menor capacidad de unin a sus ligandos (4). En general corresponden a
mutaciones en el dominio extracelular del RHL que afectan al sitio de unin de la
HL o la HGC con el receptor y al anclaje de la protena a la membrana. La extensin de la mutacin correlaciona con el cuadro clnico porque las manifestaciones
clnicas en pacientes homocigticos correlacionan con la actividad residual de sus
correspondientes RHL (5). El cuadro clnico de los sujetos 46,XY afectos, es por
tanto de espectro variable, que va desde formas leves de hipogonadismo masculino,
que se presentan como nios varones con falo hipoplsico e hipospadias al nacimiento, o como adultos con micropene, a formas graves, con cuadros completos de
pseudohermafroditismo masculino, con genitales externos femeninos y criptorquidia, junto con ausencia de derivados mullerianos y de clulas de Leydig maduras en
los testculos. Las alteraciones analticas caractersticas incluyen bajos niveles sricos de testosterona, incluso tras estimulacin con HGC, con niveles normales de
precursores esteroideos y niveles elevados de HL. En mujeres homocigotas las
292
Tabla 20.2.
Manifestaciones clnicas de mutaciones del gen del RHL
Mutaciones
Activadoras
Individuos
46, XY
Individuos
46, XX
Pubertad precoz familiar

o espordica
Asintomticos
Inactivadoras
Defectos severos
Hipoplasia de clulas de Leydig
Amenorrea u oligomenorrea
Poliquistosis ovrica
Defectos leves
Micropene y/o hipospadia
No descrito
mutaciones del RHL causan cuadros de hipogonadismo hipergonadotrpico, con

amenorrea u oligomenorrea primaria, ovarios qusticos e infertilidad (4).
Algunas mutaciones del gen del RHL, que pueden ser espordicas, producen
activacin constitutiva del RHL. En general estas mutaciones ocasionan cambios
puntuales de aminocidos del 6.o dominio transmembrana y del tercer lazo intracelular del RHL (codificado por el exn 11). Esta activacin constitutiva del RHL ocasiona pubertad precoz en nios, espordica o familiar (pubertad precoz familiar en
varones, autosmica dominante). En la Tabla 20.2 se resumen las manifestaciones
clnicas de las diversas mutaciones del gen del RHL (4).
Por ltimo, recientes descripciones de casos de HCL que muestran un RHL normal, aportan evidencias sobre una posible heterogeneidad gentica, an por caracterizar, en esta entidad (6).
Dficit enzimticos en la biosntesis de andrgenos

Producidas por mutaciones de genes de enzimas que participan en la biosntesis
de la testosterona, que tiene varios pasos en comn con la del cortisol, y que ocasionan diversos cuadros de pseudohermafroditismo femenino o masculino, con alteraciones fenotpicas muy variables, y que en general se asocian con defectos en la
sntesis de otras hormonas esteroideas, lo que ocasiona adicionalmente otras patologas asociadas.
Los principales defectos enzimticos en la sntesis de cortisol/testosterona se
resumen en la Tabla 20.3. Todos aquellos en los que se produce un defecto final en
la sntesis de cortisol (3` hidroxiesteroid-dehidrogenasa, 17_ hidroxilasa, 21 hidroxilasa, 11` hidroxilasa) causan incremento en la secrecin de ACTH y excesivo crecimiento adrenal, junto con un aumento en la produccin de andrgenos, produciendose as distintos sndromes de hiperplasia adrenal congnita (HAC) (3), que
presentan importante patologa de insuficiencia adrenal o distintos grados de nefropata, junto con cuadros de pseudohermafroditismo femenino (las cuatro enzimas)
y masculino (21 hidroxilasa, 11` hidroxilasa).
De entre estos defectos enzimticos, sealaremos aqu nicamente la hiperplasia adrenal congnita producida como consecuencia de mutaciones del gen de la
Hormona
deficitaria
Hormona
acumulada
Anomala en la
diferenciacin sexual
En varones
(46, XY)
Principales defectos en la sntesis de cortisol/testosterona
Cortisol
y aldosterona
Cortisol
y aldosterona
Cortisol
y aldosterona
17_ hidroxilasa
21 hidroxilasa
11` hidroxilasa:
11-Desoxicortisol
17OH-progesterona
Corticosterona
y desoxicorticosterona
Dihidro
epiandrosterona
Asintomticos
Asintomticos,
pubertad precoz
Feminizacin variable,
hipogonadismo
y ginecomastia
Feminizacin,
ginecomastia
Testosterona
Testosterona
17/20 liasa
17` hidroxiesteroid
dehidrogenasa:
Androstenediona
17OH-progesterona
Fenotipo femenino,
neonatal, virilizacin
en pubertad
Genitales ambiguos
en neonato o
feminizacin
Cuadros que cursan con pseudohermafroditismo masculino nicamente
Progesterona
3` hidroxiesteroid
dehidrogenasa
Cuadros que cursan con hiperplasia adrenal congnita y pseudohermafroditismo
Enzima
deficitaria
Tabla 20.3.
Asintomticas
Asintomticas
Virilizacin
Virilizacin
Fenotipo
prepber
con amenorrea
Hirsutismo
En mujeres
(46, XX)
Hipertensin
Insuf. Adrenal
Hipertensin,
alcalosis
hipocalimica
Nefropata con
prdida de sal
Patologa
asociada
(ambos sexos)

293
294
21-hidroxilasa, que es la primera causa de pseudohermafroditismo femenino (95%

de los casos) (3). La incidencia de formas graves de la enfermedad es de 1 en 10.000,
pero la de formas leves llega hasta 1 en 1.000. Se han descrito mutaciones que van
desde grandes delecciones del gen hasta mutaciones puntuales, incluyendo aquellas
que afectan a regiones reguladoras que impiden la transcripcin. La HAC por dficit de la 21-hidroxilasa es una enfermedad autosmica recesiva, en la que est alterada la sntesis de cortisol y aldosterona y se produce un acmulo de 17-hidroxiprogesterona, que se deriva hacia una anmala produccin de testosterona. Las
enfermas afectas presentan un cuadro clnico de insuficiencia adrenal grave y pseudohermafroditismo femenino, con grados variables de virilizacin. Resulta fundamental el diagnstico temprano de la entidad, que en los casos severos tiene una
importante tasa de mortalidad debido a la insuficiencia adrenal que se produce en
las primeras semanas de la vida. Este diagnstico se hace mediante determinacin
por RIA de la 17-hidroxiprogesterona, junto con ecografa abdominal/plvica, para
iniciar tratamiento sustitutivo con corticoides y mineralocorticoides que evite la
insuficiencia adrenal. La mejora en el manejo clnico de estas enfermas ha elevado
el nmero de ellas que llegan a presentar embarazos con fetos heterocigotos normales, por lo que se comienza a plantear el tratamiento muy temprano (incluso prenatal) de los fetos femeninos que portan estas enfermas, para evitar la insuficiencia
adrenal y prevenir la ambigedad genital (7). En sujetos varones homocigotos se producen manifestaciones de insuficiencia adrenal, junto con cuadros de pubertad precoz en grado variable (3).
Algunos de los defectos enzimticos en la sntesis del cortisol/testosterona cursan con pseudohermafroditismo masculino, que se presenta en ausencia de otras
patologas (17/20 liasa, 17` hidroxiesteroid-dehidrogenasa) (2,8), o junto con cuadros
de insuficiencia adrenal o nefropata pierde sal e hipertensin (3` hidroxiesteroiddehidrogenasa, 17_ hidroxilasa). Todos ellos se transmiten en forma autosmica
recesiva, y en general se presentan como cuadros de genitales ambiguos al nacimiento, con grados variables de virilizacin/feminizacin en la pubertad, que a
menudo condicionan cambios de sexo en ese momento o tratamientos quirrgico/hormonales.
Anomalas en la accin de los andrgenos

a) Defectos en el metabolismo intracelular de la testosterona: mutaciones del gen
de la 5_ reductasa-2.
La testosterona es sintetizada en el testculo, pero en sus clulas diana es convertida en un metabolito ms activo, la dihidrotestosterona (DHT), por accin del
enzima 5_ reductasa-2. Mutaciones en el gen de este enzima impiden la formacin
de DHT a partir de testosterona (8). Como la testosterona regula negativamente la produccin de HL en la hipfisis, sta presenta tambin niveles normales, y no se produce un exceso ni de testosterona ni de estrgenos. La presencia de niveles norma-
295
les de testosterona y la ausencia de DHT y de hiperestrogenismo son los que condicionan el fenotipo del cuadro, ya que la testosterona es responsable de la formacin
durante la vida embrionaria de estructuras testiculares (epiddimo, vasos deferentes
y vescula seminal) a partir de los conductos wolffianos mientras que la DHT es la
responsable de la masculinizacin de genitales externos y de los derivados del seno
urogenital, que en su ausencia tienen aspecto femenino. As, estos pacientes tienen
un fenotipo externo general femenino con una falsa vagina, cltoromegalia/hipospadias y testculos abdominales o inguinales, pero en ausencia de tero y trompas de
Fallopio y en ausencia de ginecomastia. En la pubertad estos sujetos pueden presentar un grado variable de virilizacin en respuesta a la testosterona producida, que
pueden condicionar cambios de sexo (si fueron educados como nias) y/o tratamientos hormonales y quirrgicos en ese momento. Los pacientes presentan niveles
normales de testosterona, HL y estrgenos, y ausencia o bajo nivel de DHT. La actividad enzimtica reducida puede demostrarse en biopsias tisulares o en cultivos de
fibroblastos, y la presencia de mutaciones puede mapearse directamente por aislamiento y secuenciacin del ADN de los 5 exones del gen, siendo las mutaciones ms
frecuentes cambios puntuales localizados en cualquiera de los exones.
b) Resistencia a la accin de los andrgenos: mutaciones del gen de
su receptor
Mutaciones del gen del RA causan una resistencia a la accin de los andrgenos,
y ocasionan el llamado sndrome de feminizacin testicular (Tfm) o de insuficiencia andrognica (1). El gen del RA se encuentra en el cromosoma X, por lo que los
cuadros clnicos de pseudohermafroditismo masculino producidos por mutaciones
del gen de RA se presentan como cuadros ligados al sexo, con afectacin clnica
nicamente en varones y siendo las hembras portadoras asintomticas.
Las mutaciones del gen del RA afectan la diferenciacin sexual masculina
andrgeno-dependiente en diversos grados (9). Existen cuadros severos de insensibilidad de andrgenos que presentan un fenotipo externo femenino completo, incluyendo una vagina corta y cerrada. Se encuentran testculos, que pueden ser abdominales, inguinales o en los labios mayores, en ausencia de otros rganos sexuales
internos. En los casos parciales el fenotipo vara en un espectro desde cercano al
femenino hasta el masculino normal con signos de poca virilizacin, que incluyen
o no la presencia de ginecomastia, junto con hipospadias y criptorquidia. Estas formas parciales pueden dividirse en varios cuadros segn la forma de presentacin,
que van desde el sndrome de Reifenstein hasta formas que se presentan nicamente como varones con azoospermia, o muy leves como varones normales frtiles con
baja virilizacin. El grado de afectacin est en relacin con la actividad del RA: en
las formas graves el RA est completamente inactivado, y en las parciales o leves
existe una actividad residual variable (1). Sin embargo, se han descrito diferentes
niveles de afectacin clnica entre sujetos de la misma familia que portan diferentes mutaciones, o en individuos no relacionados que presentan la misma mutacin.
Existen tambin descripciones de cuadros de pseudohermafroditismo 46,XY oca-
296
sionados por una mutacin puntual en el RA producida de novo en el individuo

afectado, que presenta un mosaicismo tisular (10). Se han descrito tambin casos de
mutaciones somticas del gen RA en cncer de prstata metastsicos, en los que se
produce un RA con afinidad ms relajada, y que puede ser anormalmente estimulado por otros ligandos (9). Finalmente, aunque no produce un cuadro de pseudohermafroditismo, es tambin relevante la demostracin de que la anormal expansin de
una determinada regin de poliglutaminas en el primer exn (dominio de transactivacin) del RA es la causante de la atrofia muscular espino-bulbar ligada al sexo
(sndrome de Kennedy ) (11).
En pacientes con mutaciones en el RA existe un defecto de inhibicin de la produccin hipofisaria de HL por la testosterona circulante. El patrn hormonal caracterstico incluye por tanto niveles plasmticos elevados de HL, que produce un
excesivo nivel de testosterona y de estrgenos. La actividad del RA presente in vivo
en pacientes afectos de IA se comprueba de diversas formas, que incluyen el clculo de la asociacin mxima A-RA y de las constantes de asociacin y disociacin
(Bmax, la Kd) del andrgeno al RA, as como el clculo de la termolabilidad de la
formacin de los complejos A-RA. La mutacin se demuestra, como en el caso de
los otros defectos genticos, aislando el ADN de los exones/intrones del RA
mediante tcnicas de PCR y por posterior secuenciacin de los fragmentos amplificados. Por ltimo, la introduccin y expresin de la forma mutante del receptor en
clulas eucariontes (que no lo expresan espontneamente) permite la demostracin
final de la causalidad de la mutacin.
El receptor de andrgenos es una protena nuclear, que acta como un factor de
transcripcin, y que pertenece a la familia de los receptores esteroideos. Se trata de
una familia de protenas que presentan una estructura similar. Estn compuestas por
diferentes dominios que guardan una importante homologa entre los distintos componentes de la familia: Un dominio carboxi-terminal para la unin a sus correspondientes ligandos (dominio de unin hormonal), un dominio central, para la unin al
ADN (dominio de unin al ADN, con dos regiones Zinc finger) a travs de
secuencias especficas de reconocimiento que se encuentran en sus genes diana
(secuencias de reconocimiento esteroideo, SRE), y un dominio amino-terminal,
ms variable, para la unin de diferentes factores de transcripcin que modulan o
regulan su actividad (dominio de transactivacin). Estos receptores actan como
dmeros (en general homodmeros), o tetrmeros. Los receptores esteroideos se
encuentran normalmente en el ncleo de las clulas diana, donde las hormonas
esteroideas llegan por difusin a travs de la membrana. La unin a sus ligandos
produce un cambio conformacional en los receptores, que exponen los sitios especficos para dimerizacin y para unin al ADN, de forma que el receptor adquiere
as su forma activa, capaz de activar los genes que presenten sus SRE. Existen
modelos animales del sndrome de feminizacin testicular. En concreto las mutaciones del RA causantes de estos cuadros en rata (12) y en ratn (13) fueron descritas y
caracterizadas en el momento de identificarse la secuencia de los genes correspondientes, y son representativas de dos de los posibles tipos y localizaciones de las
mutaciones humanas. En el caso del modelo de rata (12), la mutacin se encuentra en
297
la regin de unin al ligando, afecta a un residuo crtico en esta unin y produce un

cuadro de feminizacin, en presencia de una protena con muy baja afinidad por sus
ligandos. Un buen nmero de las mutaciones descritas en humanos son semejantes
a sta, aunque afectan a diferentes residuos de aminocidos, lo que condiciona si se
mantiene una cierta actividad hormonal residual y el fenotipo correspondiente. En
el caso del modelo de ratn (13), la mutacin se encuentra en la regin amino-terminal de transactivacin de la protena, y se trata de una delecin puntual de una base
que produce un corrimiento en el marco de lectura y origina una protena truncada,
que carece de regin de unin a la hormona y al ADN. Sin embargo, se ha demostrado que el ARN mensajero (ARNm) que presenta esta mutacin es capaz de traducir una protena ms corta originada por iniciacin interna de la traduccin en un
lugar de la secuencia del ARNm posterior al codn de terminacin. Este dato concuerda con la descripcin de una protena RA ms corta en el ratn Tfm y con el
hecho de que en sujetos normales se ha demostrado la presencia de una protena RA
ms corta, en cantidades muy inferiores a la forma completa, y con menor actividad
funcional (14). Estas mutaciones han sido tambin encontradas en humanos, aunque
el tipo (insercin o delecin con cambio en la fase e interrupcin de lectura, o mutacin puntual con cambio de residuo) y posicin de la mutacin son variables, lo que
condiciona la actividad residual del RA y por tanto su fenotipo. De hecho, existe
una base de datos en la que se reflejan todas las mutaciones descritas en humanos
hasta la fecha, a la que se puede acceder por internet (15). En el caso de mutaciones
puntuales con cambio de residuo, si la mutacin est en el dominio de transactivacin la protena resultante puede unir los ligandos normalmente y reconocer las
SRE en sus genes diana, pero no ser capaz de activarlos. Si la mutacin est en el
dominio de unin a los ligandos o al ADN de sus genes diana, tampoco podr activarlos o lo har ineficientemente. En el caso de protenas truncadas, la posible actividad del RA depender de la presencia de la forma corta del RA, que a su vez solo
ser posible si la mutacin de parada se encuentra en el primer exn antes del lugar
de reiniciacin interna.
Mutaciones de los genes implicados en la accin de la hormona

antimulleriana
En el feto masculino los derivados del conducto de Muller regresan durante la vida
fetal por accin de la MIS, producida por las clulas de Sertoli fetales. Los defectos
en el gen de esta hormona o en el de su receptor causan cuadros caractersticos en los
que estas estructuras han diferenciado hacia trompas y tero. Se trata de varones con
fenotipo externo masculino, que virilizan en la pubertad, pero que presentan adicionalmente tero y trompas, y constituyen el llamado sndrome de conductos mullerianos persistentes (16). Los testculos pueden ser intraabdominales o estar en el canal
inguinal, en el escroto o en hernias inguinales. Estos sujetos presentan niveles normales de HL, testosterona y estrgenos. La enfermedad se produce en forma familiar
(autosmica recesiva) o por mutaciones espordicas en sujetos sin historia familiar.
298
Recientemente se han descrito otras mutaciones que afectan la produccin de

MIS. La transcripcin de MIS est regulada positivamente por el receptor nuclear
SF-1 (steroidogenic factor-1). La unin de este factor al gen de MIS es activada a
su vez por el factor WT-1 (Wilms tumor inhibiting factor), e inhibida por accin del
factor DAX-1 (Dossage sensitive sex reversal gene 1). Defectos en los genes de los
factores SF-1 y WT-1 condicionan una menor transcripcin de MIS.
El factor SF-1 controla tambin el desarrollo de los ejes hipotalmico-pituitariogonadal y adrenal, y su mutacin produce en ambos sexos insuficiencia adrenal,
junto con el cuadro de pseudohermafroditismo masculino (17).
El gen WT-1 est compuesto por 10 exones que codifican una protena con cuatro motivos Zinc finger con actividad reguladora transcripcional positiva de ciertos genes y reguladora negativa de tumores. Se pueden producir cuatro isoformas
por edicin (splicing) diferencial, una de las cuales (producida edicin alternativa
en el intrn 9) presenta tres aminocidos extra entre dos de los dominios Zinc
finger (isoforma KTS). Las mutaciones en el gen WT-1 se asocian a patologa
neoplsica (tumor de Wilms, mesotelioma, leucemias, carcinoma de mama) o no neoplsicas, dando lugar a cuadros sindrmicos caractersticos. Entre stos destacaremos: 1) el Sndrome de Denys Drash, que asocia nefropata mesangial difusa precoz, con cuadros de pseudohermafroditismo masculino y tumor de Wilms y que est
ocasionado por mutaciones puntuales heterocigotas del gen WT-1, en los exones 8
y 9 (regin Zinc finger 2 y 3), que producen protenas truncadas que se comportan
como dominante negativo, como se demuestra en el modelo de ratn transgnico en
el que el animal heterocigoto reproduce la enfermedad (18); y 2) el Sndrome de
Frasier, que asocia glomeruloesclerosis focal-segmental, gonadoblastoma y pseudohermafroditismo masculino, y que est ocasionado por mutaciones en el sitio de
edicin del exn 9 de la protena WT-1, impidiendo la produccin de la forma KTS
de la protena (19). Finalmente, se ha demostrado tambin la presencia de este tipo de
mutaciones del gen WT-1 en nias heterocigotas que presentan cuadros de glomeruloesclerosis focal-segmental de aparicin temprana (20).
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21
Patologa molecular de la neoplasia
endocrina mltiple (MEN-1,
MEN-2A, MEN 2B) y del Carcinoma
medular de tiroides
M.a J. Lorenzo Benayas
Introduccin
La neoplasia endocrina mltiple (MEN) (1) es un sndrome cancergeno que se
caracteriza por la presencia de tumores en dos o ms glndulas endocrinas en el
mismo paciente. En un principio se conoca con el nombre de adenopatia endocrina mltiple, pero debido a que algunos pacientes desarrollan verdaderos tumores o hiperplasia de la glndula endocrina afectada, finalmente se denomin
MEN.
Existen dos tipos principales de neoplasia endocrina mltiple, la de tipo 1 (MEN
1) y la de tipo 2 (MEN 2) que se diferencian en las glndulas endocrinas afectadas
(Tabla 21.1). El MEN 1, tambin denominado sndrome de Wermer, se caracteriza
por el desarrollo de hiperplasia o tumores en las glndulas paratiroideas, en las
clulas de los islotes pancreticos y en la pituitaria anterior (1,2). El MEN 1 se hereda de una forma dominante, se localiza en el cromosoma 11q13 (3), y el gen responsable se ha identificado recientemente (4). El MEN 2, tambin conocido con el nombre de sndrome de Sipple, se caracteriza por la presencia de tumores en las clulas
C de tiroides (carcinomas medulares de tiroides, MTC), en la mdula adrenal (feocromocitomas, Pheo) e hiperplasia o adenomas de las paratiroides (PTH) (1,5). El gen
que predispone al MEN 2 es el proto-oncogen ret, localizado en el cromosoma
10q11.2, que codifica a un receptor de membrana con actividad tirosina quinasa (57). Aunque el MEN 1 y el MEN 2 son sndromes diferentes, en algunos pacientes se
ha descrito la presencia de tumores asociados a ambos sndromes, por ejemplo,
tumores pituitarios y feocromocitomas. No se sabe si esta coincidencia se debe al
azar (8) o si es un nuevo tipo de MEN mixto.
302
Tabla 21.1.
Glndulas endocrinas afectadas en el sndrome MEN
MEN 1
MEN 2
Paratiroides
Clulas C del tiroides
Pituitaria anterior
Mdula Adrenal
Islotes pancreticos
Paratiroides
Corteza adrenal
Neoplasia endocrina mltiple de tipo 1

Caractersticas clnicas
Las manifestaciones clnicas del MEN 1 se relacionan con la glndula en la que
se va a desarrollar la hiperplasia o los tumores y a sus productos de secrecin (2,9,10).
El hiperparatiroidismo primario es la caracterstica clnica ms comn y aparece en ms del 95 % de los pacientes con MEN 1.
La incidencia de tumores en las clulas de los islotes pancreticos en pacientes
con MEN 1 vara de un 30 % a un 80 % dependiendo de las series de pacientes analizados. La mayora de estos tumores producen cantidades excesivas de hormonas,
como por ejemplo, gastrina, insulina, glucagn o pptido intestinal vasoactivo
(VIP) y estn asociados con distintos sndromes clnicos. Los tumores secretores de
gastrina, los gastrinomas, representan cerca del 50 % de los tumores de los islotes
pancreticos asociados a MEN 1 y son la principal causa de muerte en pacientes con
MEN 1. Los tumores de las clulas secretores de insulina, los insulinomas, representan el 30 % de todos los tumores pancreticos que presentan los pacientes con
MEN 1. Y, en menor proporcin, los pacientes con MEN 1 pueden tambin desarrollar tumores secretores de glucagn, los glucagonomas; tumores secretores de
VIP, VIPomas y tumores secretores de polipptido pancretico, Ppomas.
La incidencia de tumores pituitarios en pacientes con MEN 1 varia entre un 15%
a un 90 % dependiendo de la serie de pacientes estudiada (9). Aproximadamente el
60 % de los mismos secretan prolactina, el 25 % secretan hormona de crecimiento,
el 3 % secretan adrenocorticotropina y el resto son no funcionales.
Adems de estos tumores, los pacientes con MEN 1 pueden desarrollar tumores
carcinoideos en el bronquio, tracto gastrointestinal, pncreas y timo; tumores en la
corteza adrenal, lipomas, tumores tiroideos, angiofibromas faciales y colagenomas.
Bases moleculares del MEN 1

El gen causante del MEN 1 est localizado en el cromosoma 11q13 (3). Es un gen
supresor de tumores, est formado por 10 exones con una regin codificadora de
PATOLOGA MOLECULAR DE LA NEOPLASIA ENDOCRINA MLTIPLE
303
1830 pb y codifica a una protena de 610 aminocidos, a la que se ha denominado

MENIN4.
Hasta la fecha se han descrito 262 mutaciones diferentes en el gen responsable
del MEN 1 (11). El 56 % de estas mutaciones se deben a pequeas delecciones o
inserciones, de las cuales el 48 % producen un desplazamiento en la pauta de lectura. El 22 % son mutaciones puntuales con cambio de sentido y el 5 %, restante, se
caracterizan por ser mutaciones que modifican los sitios de corte y empalme. El
75 % de estas mutaciones producen la inactivacin del gen, lo que sugiere que el
gen responsable del MEN 1 es un gen supresor de tumores. Por otra parte, las mutaciones presentes en el gen MEN 1 no slo se caracterizan por ser muy diversas sino
tambin por encontrarse muy repartidas a lo largo del gen.
Diferentes estudios clnicos han puesto de manifiesto que no existe una correlacin entre las diferentes mutaciones presentes en el gen MEN 1 y las manifestaciones clnicas asociadas al MEN 1. As, por ejemplo, un estudio realizado en 5 familias con MEN 1, caracterizadas por la presencia de la misma mutacin en el gen
MEN 1 (una deleccin de 4 pares de bases en los codones 210 y 211), demostr que
aunque todos los miembros de las diferentes familias desarrollaron tumores de las
paratiroides, slo los miembros de las familias 1, 3, 4 y 5 desarrollaban gastrinomas,
mientras que los miembros de la familia 2 desarrollaban insulinomas. Por otra parte,
toda las familias, excepto la 1, presentaban prolactinomas, mientras que slo los
miembros de la familia 1 desarrollaron tumores carcinoideos. Por otra parte, tambin se ha mostrado que miembros pertenecientes a una misma familia pueden
desarrollar tumores diferentes.
La protena MENIN
El gen causante del MEN 1 codifica a una protena denominada MENIN formada por 610 aminocidos, de localizacin nuclear (12) y de funcin desconocida. La
mayora de las mutaciones en el gen MEN 1 originan protenas MENIN truncadas,
es decir, ms cortas e inactivas, y carentes de las seales de localizacin nuclear presentes en el extremo carboxilo terminal. Como ya hemos mencionado la funcin de
la protena MENIN se desconoce, pero su localizacin nuclear hace pensar que esta
protena tenga un papel cmo regulador de la transcripcin o que intervenga en la
replicacin del DNA o en el ciclo celular.
Deteccin del MEN 1

Aunque el MEN 1 es una enfermedad poco comn, su diagnstico es importante ya que al heredarse de una forma autosmica dominante el 50 % de la descendencia de un paciente con MEN 1 tiene la probabilidad de desarrollar la enfermedad. Aunque se puede realizar el anlisis gentico del MEN 1 para identificar a los
individuos portadores de la mutacin y, en consecuencia, con un elevado riesgo de
304
padecer la enfermedad, la ausencia aparente de correlacin entre el genotipo y el

fenotipo, junto con la gran diversidad de mutaciones presentes en la regin codificadora del gen MEN 1 hace que el anlisis mutacional para el diagnstico de MEN
1 no se est llevando a cabo. En consecuencia, su diagnstico se est realizando
mediante estudios clnicos, bioqumicos y radiolgicos.
Neoplasia endocrina mltiple de tipo 2

Caractersticas clnicas
La neoplasia endocrina mltiple de tipo 2 (MEN 2) es un sndrome cancergeno
que se hereda de una forma autosmica dominante y que se caracteriza por la presencia de tumores y de anomalas en el desarrollo en cuatro tejidos diferentes: las
clulas C del tiroides, la mdula adrenal, las paratiroides y el plexo nervioso
autonmico intestinal.
Dependiendo del tejido afectado, el MEN 2 se ha subdividido en tres variedades clnicas diferentes, el MEN 2A, el MEN 2B y el cncer medular de tiroides
familiar (FMTC) (5,13) Tabla 21.2. El MEN 2A se caracteriza por la presencia tumores en las clulas c del tiroides denominados carcinomas medulares de tiroides
(MTC), en las clulas de la mdula adrenal denominados feocromocitomas
(PHEO) y por el desarrollo de hiperplasia o adenomas de las paratiroides (PTH).
El MEN 2B se caracteriza por la presencia de MTC, de PHEO y de determinadas
anomalas asociadas al desarrollo Tabla 21.2. Finalmente, el FMTC se caracteriza slo por la presencia de MTC. Todos los pacientes con MEN 2 desarrollan
MTC. Los feocromocitomas se desarrollan en un 50 % de los pacientes con MEN
2A y MEN 2B y solo un 25 % de los pacientes con MEN 2A desarrollan hiperparatiroidismo.
Tabla 21.2.
Variedades clnicas del MEN 2
Tumores asociados
Fenotipo
MEN 2A
MEN 2B
FMTC
MTC
PHEO
+ (50 %)
+ (50 %)
PTH
+ (25 %)
AD
* Hiperplasis del ganglio entrico, neuromas de la mucosa oral y conjuntiva. anomalias msculoesquelticas.
305
Bases moleculares del MEN 2

El gen causante del MEN 2 es el proto-oncogen ret que se encuentra localizado
en el cromosoma 10q11.26. Mutaciones germinales en el proto-oncogen ret se han
encontrado en la mayora de los pacientes con MEN2 (6,7,14,15).
El proto-oncogen ret est formado por 21 exones y codifica a un receptor de
membrana con actividad tirosina quinasa denominado RET (Fig. 21.1). RET est
formado por una regin extracelular, una regin transmembrana y una regin intracelular. La regin extracelular se caracteriza por poseer un dominio de homologa a
cadherinas (Cad) y una regin rica en el aminocido cisteina (Cys). La regin intracelular contiene el dominio con actividad tirosina quinasa, que se encuentra dividido en dos regiones TKa y TKb mediante un pequeo pptido formado por 28 aminocidos.
Estudios clnicos ponen claramente de manifiesto que las variedades clnicas del
MEN 2 estn fuertemente asociadas a diferentes mutaciones puntuales presentes en
el proto-oncogen ret, que producen la sustitucin de aminocidos especficos. Todas
las mutaciones son dominantes a escala celular y producen la activacin constitutiva del receptor (16).
Codn Mutado
Variedad Clnica
Cad
MEN 2A MEN 2B FMTC
Cys
609, 611, 618,

620, 630, 631, 634 98% (634)
88%
+ (4%)
TM
TKa
TKb
768,790/791,
804,844,891
883
3%
918
94%
Figura 21.1. Caractersticas principales de la protena codificada por el proto-oncogen ret y localicacin de las mutaciones germinales en las diferentes variedades clnicas del MEN 2. Cad,
dominio parecido a cadherinas; Cys, regin rica en cisteinas; TM, regin transmembrana; TK,
dominio con actividad tirosina quinasa
306
Las mutaciones presentes en el proto-oncogen ret se pueden dividir en tres grupos (Fig. 21.1):
a) Mutaciones que afectan a los residuos de cistenas, presentes en el dominio
extracelular del receptor, y que estn codificadas por los codones 609, 611,
618, 620, 630 y 634. Estas mutaciones son las responsables del 98 % de los
casos de MEN 2A y de la gran mayora de los casos de FMTC.
b) Mutaciones que afectan a los codones 768, 790, 791, 804, 844 y 891, presentes en el dominio con actividad tirosina quinasa del receptor y que son responsables de aproximadamente un 4% de los casos de FMTC.
c) Mutaciones que afectan a los codones 883 y 918, presentes tambin en el
dominio con actividad tirosina quinasa del receptor, y que estn asociadas
exclusivamente a pacientes con MEN 2B.
Efectos de las mutaciones de ret en el MEN 2
Estudios bioqumicos y moleculares utilizando construcciones de DNA que contenan el gen ret normal y el mutado en el MEN 2A (Cys 634 Arg) o en el MEN 2B
(Met 918 Thr) han puesto de manifiesto que estas mutaciones conducen a la activacin constitutiva del receptor (16,17).
Las mutaciones en cisteinas presentes en el MEN 2A activan al receptor porque
causan la dimerizacin del mismo en ausencia del ligando (16,17). Estudios clnicos,
muestran que existe una gran correlacin entre el codn de cisteina mutado y el
fenotipo asociado al MEN 2A (14). De hecho, las mutaciones que implican al codn
634 estn presentes en la mayora de los pacientes con MEN 2A que desarrollan,
adems de MTC, feocromocitomas e hiperplasia de las paratiroides, mientras que
mutaciones presentes en los codones 609, 611, 618 y 620 son ms frecuentes en
familias con MEN 2A que desarrollan MTC e hiperplasia de las paratiroides o en
familias con FMTC.
Las mutaciones presentes en el dominio tirosina quinasa de ret , tambin activan
al receptor en ausencia del ligando, pero en este caso no producen la dimerizacin
constitutiva del mismo (16,17), sino que conducen a cambios en su conformacin responsables de su activacin. La mutacin Met 918 Thr, que tiene lugar en la mayora de los pacientes con MEN 2B, no slo activa de forma constitutiva al receptor,
sino que tambin cambia su especificidad por el sustrato (18). As, se ha comprobado
que RET 2B fosforila de forma preferente a sustratos especficos de protenas citoslicas con actividad tirosina quinasa, mientras que el RET normal fosforila a sustratos especficos de receptores de membrana con actividad tirosina quinasa (18).
Aunque en la actualidad no se conoce el por qu diferentes mutaciones en ret
estn asociadas a diferentes fenotipos, se piensa que puede ser debido a uno o varios
de estos mecanismos:
a) Activan a RET con diferente intensidad.
b) Activan a RET en un tiempo errneo.
307
c) Activan a RET en un tejido no adecuado.

d) Activan rutas de transduccin de seales diferentes.
De hecho, estudios realizados in vitro sugieren que el fenotipo asociado a
pacientes con FMTC puede estar relacionado con una pequea activacin del receptor, capaz de inducir solamente el desarrollo de MTC. Por otra parte, se ha descrito
que las mutaciones presentes en pacientes con MEN 2A y MEN 2B son capaces de
producir una gran activacin del receptor, lo que inducira posiblemente la aparicin
de feocromocitomas en estos pacientes. Finalmente, las anomalas asociadas al
desarrollo presentes en pacientes con MEN 2B se explicaran por la capacidad que
tiene el receptor mutado, RET 2B, de activar nuevas rutas de sealizacin. Lo que
carece de explicacin es la ausencia de hiperparatiroidismo en pacientes con MEN
2B.
Deteccin del MEN 2

Ya que el nmero de mutaciones distintas en ret responsables del MEN 2 son
pequeas, el anlisis gentico es el mtodo ms efectivo y menos invasivo para
detectar a los portadores genticos asintomticos (19,20), siendo ste el mtodo de
diagnstico que se utiliza preferentemente en clnica. Siempre se aconseja que el
anlisis gentico se realice a nios de corta edad.
Con la realizacin de este test gentico, los miembros no portadores de la mutacin, as como sus descendientes, podrn ser excluidos de los estudios bioqumicos
a los que tienen que ser peridicamente sometidos todos los miembros pertenecientes a familias con un historial de MEN 2 claramente definido. Por otra parte, los
portadores genticos se considerarn de alto riego de desarrollar un MTC, y estarn
sujetos a las decisiones mdicas pertinentes.
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22
Mecanismos moleculares implicados
en el hipotiroidismo congnito.
Terapia gnica en enfermedades
tiroideas
Pilar Santisteban
Mecanismos moleculares implicados en el hipotiroidismo

congnito
El hipotiroidismo congnito primario es una enfermedad con una incidencia de
1/ 3.000-4.000 recin nacidos. Antes de 1974, el hipotiroidismo congnito era una
de las causas ms frecuentes de retraso mental en los nios. La introduccin de programas de screening ha llevado al diagnstico precoz y al tratamiento con hormonas tiroideas con la consiguiente reduccin del dao mental. Todos los casos de
hipotiroidismo congnito cursan con niveles elevados de tirotropina (TSH) como
consecuencia de la produccin de niveles reducidos de hormonas tiroideas. Aunque
existen casos de hipotiroidismo congnito causados por defectos hipotalmicos o
hipofisarios, en esta revisin nos vamos a centrar slo en las alteraciones de la propia glndula y ms concretamente en la disgenesia tiroidea ya que el 85% de los
casos de hipotiroidismo congnito son debidos a este problema. Dentro de los casos
de disgenesia, un 35-40% corresponde a ausencia de la glndula (agenesia tiroidea),
un 30-45% a una glndula pequea y situada sublingualmente (ectopia tiroidea) y
en un 5% la glndula es extremadamente pequea (hipoplasia tiroidea). La mayora de estos casos son espordicos, aunque se han descrito algunos casos de disgenesia hereditaria familiar.
Los fenotipos observados en la disgenesia sugieren como causa principal alteraciones en la organognesis de la glndula tiroidea. La morfognesis de esta glndula comienza con la formacin de un brote de origen endodermal en la regin posterior del suelo de la faringe. Esta formacin, que va a dar lugar a las clulas
foliculares productoras de hormonas tiroideas, migra dorso-caudalmente hasta
310
alcanzar la pared anterior de la trquea, donde emerge con otros tipos celulares.
Como causas ms especficas de la disgenesia se han definido las alteraciones en el
desarrollo del tiroides y las alteraciones en los genes que afectan a la sntesis de las
hormonas tiroideas.
El conocimiento que se tiene actualmente sobre las causas de las disgenesias
tiroideas ha surgido como consecuencia de la identificacin y clonacin de los
genes que codifican por los factores de transcripcin tiroideos. Para entender la
implicacin de estas protenas en la morfognesis tiroidea vamos a dividir este trabajo en tres apartados: 1) Factores de transcripcin especficos de tiroides, 2) Su
expresin durante el desarrollo de la glndula tiroidea, 3) Funcin de los factores de
transcripcin tiroideos: Generacin de ratones knock-out y 4) Factores de transcripcin tiroideos en el hipotiroidismo congnito.
Factores de transcripcin especficos de tiroides

Los factores de transcripcin son protenas nucleares cuya funcin es esencial
en la regulacin de la expresin gnica unindose a secuencias especficas de ADN
en los promotores de los genes que regulan. Tres factores de transcripcin especficos de tejido tiroideo han sido identificados y clonados (1-3). Estos factores denominados Thyroid Transcription Factor 1, 2 (TTF-1, TTF-2) y Pax-8 se unen a
secuencias de ADN de los promotores de los genes tiroideos Tiroglobulina (Tg),
Peroxidasa Tiroidea (TPO), Receptor de TSH (TSH-R) y el transportador de yodo
dependiente de sodio (Sodium Iodide Symporter o NIS) (Fig.1). Su caracterstica
ms importante es que son genes hometicos que pertenecen a familias de protenas con dominios de unin al ADN muy conservados y que tienen una importancia
decisiva en procesos de desarrollo, proliferacin y diferenciacin celular.
1. Factor de transcripcin TTF-1

Este factor de transcripcin tiroideo fue el primero en clonarse (1). Se une a los
promotores de los genes Tg, TPO, TSH-R y NIS activando su transcripcin
(Fig.22.1). Por ello su expresin es decisiva para que estos genes se expresen en las
clulas foliculares tiroideas. Aunque inicialmente se identific solo en tiroides (1),
hoy se sabe que se expresa tambin en las clulas parafoliculares (clulas C) y en las
paratiroideas (4), en el cerebro embrionario de rata y en el pulmn embrionario y
adulto (5, 6). El hecho de que este factor se expresase en otros tejidos, hizo a los investigadores de las distintas reas estudiar ms en detalle su funcin. En las clulas C
regula la expresin del gen de la calcitonina y se ha descrito como un posible sensor de calcio (7). La funcin extratiroidea ms importante de este factor es la que ejerce en el pulmn. Se ha demostrado que este factor se une a los promotores de los
genes que codifican por las protenas surfactantes de pulmn (SP) A, B y C y por la
protena secretada por las clulas de la Clara (CCSP) activando su transcripcin (6).
MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS EN EL HIPOTIROIDISMO
1950
170
100
+1
Pax-8
A
UF
TTF-1
5500
Pax-8
TTF-1
5200
150
4200
3100
Tg
TATAAAA
TTF-1
120
TTF-2
90
TTF-1
60
Pax-8
TTF-1
+1
30
NF-1
TTF-1
311
TPO
TATATG
TTF-2
HNF3`
210 200
TTF-1
100
68
TSH-R
TTF-1 TTF-1
TTF-1
TTF-1
CREL-BF
2495
2260
IRE TTF-1 CREB

SSBPs
550 420
245
+1
124
rNIS
AATATAT
Pax-8
Pax-8
A
UF
NTF-1
TTF-1
CREB
NTF-1
NF-1
CREL-BF
TTF-1
TTF-2
IRE
Pax-8
SSBPs
Figura 22.1. Representacin esquemtica de los promotores de los genes tiroideos Tiroglobulina
(Tg), Peroxidasa Tiroidea (TPO), Receptor de TSH (TSH-R) y Transportador de yodo (NIS). Se indican las posiciones a las que se unen tanto los factores de transcripcin especficos de tiroides
(TTF-1, TTF-2 y Pax-8) como factores ubicuos (UFA, NF-1) y factores dependientes de la induccin
por insulina (IRE) o AMPc (CREL-BF y CREB). Para mas informacin vase referencias 9 y 20.
El desarrollo proximal del tiroides y el pulmn, junto con su procedencia comn de

origen endodrmico, sugiere que la expresin de TTF-1 pueda ser la respuesta a una
activacin posicional especfica del endodermo anterior. El gen del factor TTF-1 es
un gen homeo-box que se ha denominado Tift -1 y que se localiza en el cromosoma
14 humano y en el cromosoma 2 de ratn.
2. Factor de transcripcin TTF-2
El factor TTF-2, a diferencia de TTF-1, se une y transcribe slo los genes de Tg y
TPO (Fig.1). Su clonacin (2) y los diferentes estudios de expresin han indicado que
este factor se expresa en el tiroides embrionario y adulto solo en las clulas foliculares
y no en las clulas C. Tambin se expresa, durante el desarrollo embrionario, en la hipfisis anterior. El gen del factor TTF-2 es un gen de la familia fork-head que se ha denominado Tift-2 y se localiza en el cromosoma 9 humano y en el cromosoma 4 de ratn.
3. Factor de transcripcin Pax-8
Este factor se une a los promotores de Tg, TPO y NIS, compartiendo las
secuencias de unin con TTF-1 (Fig.22.1). Adems de en tejido tiroideo, se
312
expresa en el sistema nervioso central durante el desarrollo embrionario y en el

sistema excretor (rin) de embriones y adultos. Al igual que TTF-2, el gen Pax8 no se expresa en las clulas C del tiroides. El gen del factor Pax-8, es un gen
paired-box que se localiza en el cromosoma 2 humano y en el cromosoma 2 de
ratn.
Desarrollo de la glndula tiroidea y expresin de TTF-1, TTF-2 y Pax-8

Como se coment en la introduccin, las clulas foliculares tiroideas proceden
de la invaginacin del endodermo faringeo a partir del da 8-8.5 del desarrollo
embrionario del ratn y de la rata (8). El primordio tiroideo migra hasta alcanzar su
destino final delante de la traquea entre los das 13-14 del desarrollo embrionario de
ambos animales. Solamente en el da 15 embrionario (E15), una vez completado el
proceso de migracin, las clulas foliculares se diferencian y comienza a detectarse la funcin tiroidea.
Los estudios de expresin de TTF-1, TTF-2 y Pax-8 en rata, demuestran que
estos factores se expresan muy al comienzo de la morfognesis tiroidea en el da
embrionario (E) 8.5, en aquellas clulas epiteliales cilndricas que forman una
invaginacin en el suelo de la faringe primitiva al nivel del primer y segundo arco
branquial y que posteriormente proliferan y migran hacia abajo. Sin embargo, en
contraste con la aparicin temprana de los anteriores factores, la expresin de sus
genes dianas Tg, TPO, TSH-R y NIS aparece varios das despus en el da embrionario E15 (5). As podemos decir que la expresin de los factores de transcripcin
especficos de tiroides antecede a la expresin de los marcadores especficos de la
funcin tiroidea. Ello les ha definido como los genes responsable no solo en la
organognesis del tiroides sino tambin de los procesos de diferenciacin (9). El
retraso temporal entre la expresin de TTF-1, TTF-2 y Pax-8 y la de sus genes
diana durante el desarrollo del tiroides en la rata sugiere que deben de existir otra
serie de eventos adicionales, an no identificados, que ayuden a la determinacin
del fenotipo tiroideo diferenciado. Esos eventos deben ocurrir entre los das E13 y
E15.
En humanos, el proceso de organognesis tambin est bien definido y en la
Tabla 22.1 se recoge un resumen del conocimiento que se tiene actualmente sobre
la expresin de los anteriores factores de transcripcin y el proceso de organognesis [tomado de Macchia et al. (10)].
Funcin de los factores de transcripcin tiroideos:

Generacin de ratones knock-out
El estudio de la funcin de estos factores in vivo ha sido consecuencia de la
reciente generacin de ratones knock-out. Generando ratones en los que se anula
la expresin de los factores de transcripcin tiroideos se puede conocer su fun-
28 d
6-7 s
8s
13-14 s
E 9.5
E 11.5
E 15.5
E 17.5
Expansin de la poblacin de clulas diferenciadas
Final de la migracin. Inicio de las funciones diferenciadas
Supervivencia/Proliferacin de las clulas precursoras
Migracin
TTF-1
Pax-8
(+?)
TTF-2
Genes
tiroideos
Diferenciacin
funcional
Expresin de los factores de transcripcin tiroideos durante la organognesis del tiroides. E: Estado embrionario. d: da, s: semana. Los genes tiroideos son Tg, TPO, TSH-R y
NIS. La expresin de los factores de transcipcin se ha estudiado slo en ratn. La interrogacin significa que en el caso de TTF-2 quedan estudios por hacer y que se ha descrito una down-regulacin en ese periodo embrionario (Ref. 2) de la que an no se conoce en detalle su significado.
20 d
E 8.5
Formacin
Formacin de la bolsa primitiva tiroidea
Organognesis del tiroide.
Estado embrionario
Ratn
Humano
Tabla 21.1.

313
314
cin estudiando el fenotipo del ratn al que se le ha anulado el gen motivo de

estudio.
As la generacin de un ratn en el que el gen del factor TTF-1 se ha anulado
(knock-out de TTF-1) (11) ha indicado la importancia decisiva de este factor en la
morfognesis del tiroides. El ratn homocigoto nulo para TTF-1 (Tift1 -/-) presenta agenesia de tiroides y falta total de desarrollo pulmonar con desarrollo anormal
de las reas ventrales del cerebro y ausencia de hipfisis. El animal se desarrolla en
el tero materno y muere al nacer por falta de protenas surfactante y por tanto incapacidad para respirar. La agenesia de tiroides, tanto de clulas foliculares como
parafoliculares, demuestra la importancia decisiva de esta factor en el desarrollo del
tiroides.
De la misma manera, la generacin de un ratn en el que se ha anulado la expresin de Pax-8 (Pax-8 -/-) ha indicado que esta factor es decisivo en la formacin de
las clulas foliculares y que no afecta al desarrollo de las clulas parafoliculares. Su
expresin es siempre concomitante con la de TTF-1. El fenotipo de los ratones
knock-out de Pax-8 muestra un retraso en el crecimiento y son hipotiroideos. Los
animales cuando nacen presentan hipoplasia tiroidea y no se detectan folculos,
muriendo al destete (12). Si durante las primeras semanas despus del nacimiento se
les administra hormonas tiroideas la vida de las camadas se alarga varias semanas
ms.
Finalmente la generacin de un ratn nulo para TTF-2 (Titf2 -/-) demuestra que
la funcin de este factor es la de controlar la migracin del primordio tiroideo desde
su posicin sublingual inicial hasta su posicin final en la traquea reprimiendo la
diferenciacin final de las clulas tiroideas hasta que la migracin haya tenido lugar.
Hay que destacar que los ratones nulos para este factor de transcripcin presenta
disgenesia tiroidea (tanto ectopia como agenesia) y adems paladar hendido, lo que
les impide succionar durante la lactancia y mueren por falta de alimentacin (13).
Factores de transcripcin tiroideos en el hipotiroidismo congnito

En los ltimos aos se ha estudiado la implicacin de los factores de transcripcin en patologa tiroidea humana, tanto en trastornos hereditarios de la gnesis
glandular como en procesos de malignizacin y desdiferenciacin tiroideos.
La premisa de que TTF-1 era el principal regulador de la transcripcin de Tg
llev a estudiar su posible participacin patognica en un caso familiar de bocio
congnito por defecto de sntesis de Tg. Es bien conocido que los bocios congnitos son muchas veces consecuencia de defectos en el gen de Tg. Sin embargo, se ha
puesto de manifiesto otra de las causas posibles de la bociognesis congnita: la
expresin reducida del factor de transcripcin TTF-1 (14). La paciente portadora de
este defecto, estudiada a los 15 aos por primera vez, presentaba un bocio de caractersticas compresivas e hipotiroidismo. Su desarrollo fsico y mental haban sido,
sin embargo, normales. Dos hermanos presentaban una clnica similar, lo que sugera una naturaleza recesiva de la enfermedad. Los estudios bioqumicos y molecu-
315
lares del tejido tiroideo demostraron niveles muy reducidos del ARN mensajero de
Tg junto a niveles virtualmente indetectables de TTF-1. Se comprob, adems, la
incapacidad de las protenas nucleares de este tejido para unirse a la secuencia consenso para el factor TTF-1 en el promotor de Tg. De forma compensatoria y a travs del efecto estimulador de la TSH, los niveles de expresin de TPO se encontraban muy elevados. Si bien las causas moleculares ltimas de la falta de expresin
de TTF-1 no fueron determinadas. Este trabajo establece que los defectos de transcripcin tiroideos pueden ser la causa de trastornos dishormonognicos, como lo es
el defecto de sntesis de Tg y no solo de defectos de disgenesia tiroidea.
Tambin se ha publicado que la haploinsuficiencia de TTF-1 (delecin de 1 de
los 2 alelos del gen) origina una disfuncin tiroidea leve junto a distrs respiratorio
neonatal (15). El recin nacido, que presentaba una glndula in situ de tamao normal, era eutiroideo pero mantena niveles de TSH elevados, por lo que recibi tratamiento sustitutivo. El problema respiratorio neonatal con infecciones y atelectasias pulmonares durante la infancia, se explica por una sntesis disminuida de
protenas surfactantes del pulmn, de las que TTF-1 es un potente inductor.
Son varios los trabajos que se han comenzado con objeto de estudiar el posible
papel de TTF-1, TTF-2 y Pax-8 en los trastornos disgensicos del tiroides que conducen a hipotiroidismo congnito. Como acabamos de explicar, el estudio del fenotipo tiroideo de los ratones a los que se ha delecionado artificialmente cada uno de
estos factores de transcripcin ha demostrado que los tres desempean un papel
esencial en la morfognesis del tiroides (11-13). Por este motivo y gracias al conocimiento actual de la secuencia completa de los genes que codifican tanto TTF-1
como Pax-8 y TTF-2, se ha comenzado el screening de mutaciones en casos de disgenesia tiroidea (agenesias, ectopias e hipoplasias) detectados en el screening neonatal del hipotiroidismo congnito. La tcnica utilizada es el SSCP o deteccin de
polimorfismos conformacionales en el ADN de cadena simple. Los primeros resultados en relacin a TTF-1 han sido negativos en un total de 76 pacientes incluidos
en 2 estudios distintos (16, 17).
Sin embargo, recientemente se ha comunicado que mutaciones en el gen de
Pax-8 son la causa de algunos casos de ectopia tiroidea e hipoplasia (18). Se estudiaron 149 pacientes con hipotiroidismo congnito y 120 controles. Uno de los pacientes con hipoplasia y tiroides sublingual presentaba niveles altos de TSH y normales
de T4. Los niveles de Tg circulante eran altos lo que sugera un defecto en la organizacin folicular del tiroides. Era heterocigoto para una mutacin en el codon 108
del exon 3 del gen Pax-8. Esta mutacin crea un codon de terminacin (stop codon)
lo que predice la sntesis de una protena truncada que contiene solo los 100 primeros aminocidos del dominio paired de la protena Pax-8. Es una mutacin de novo
ya que ni los padres ni los hermanos la presentaban. Un segundo paciente con hipoplasia tiroidea, altos niveles de TSH y bajos de T4 era heterocigoto para una mutacin en el codn 31 del exn 2 de gen Pax-8. Los dems miembros de la familia no
estaban afectados y eran homocigotos para el codn del gen normal. Finalmente se
ha descrito tres miembros de una familia afectados de hipoplasia severa que tienen
la misma mutacin en el codn 62.
316
Todas estas mutaciones conducen a una protena Pax-8 no funcional incapaz de

unirse a los promotores de los genes Tg y TPO y por tanto incapaz de transcribirlos. El 100% de concordancia entre las mutaciones de Pax-8 y la existencia de disgenesia (18) sugiere un papel causal de este gen en el hipotiroidismo congnito aunque en una minora de los casos examinados (5 de 149).
Se ha publicado recientemente, en dos hermanos no gemelos, la primera mutacin de TTF-2 (19). Estos hermanos presentan adems de agenesia de tiroides, paladar hendido, atresia bilateral de coanas, epiglotis bfida y cabello "erizado". Los
padres eran sanos y no estaban emparentados entre si. Al recibir T4 desde el nacimiento el desarrollo fsico e intelectual eran normales. La mutacin detectada es una
mutacin sin sentido (misssense mutation) en el nucletido 196 del codn 65 del
gen humano de TTF-2. Este codn da lugar a un aminocido muy conservado en el
dominio forkhead de unin al ADN de la protena TTF-2. Esta mutacin da lugar a
una protena TTF-2 no funcional incapaz de unirse y transcribir a los promotores de
los genes que regula (Tg y TPO). Hay una relacin causal entre sta mutacin y la
agenesia de los pacientes, siendo esta causa gentica de agenesia la primera y nica
descrita hasta el momento.
La identificacin y caracterizacin de esta serie de factores de transcripcin que
participan en la gnesis inicial del tiroides abre el camino hacia el conocimiento
detallado del complejo programa de expresin de genes necesarios para la formacin y maduracin funcional de la glndula tiroidea.
En conclusin, los trabajos resumidos en esta revisin sugieren que el hiportiroidismo congnito puede ser una enfermedad hereditaria. Adems teniendo en
cuenta los estudios de las mutaciones encontradas en los factores de transcripcin
TTF-1, TTF-2 y Pax-8 en pacientes con hipotiroidismo congnito, junto con la
generacin de las lineas de ratones en las que se ha anulado la expresin de estos
genes hace pensar en una estrecha relacin entre estos factores como causa del
hipotiroidismo congnito. Aunque es obvio que faltan por clonar nuevos genes y
realizar nuevos estudios para aclarar el origen de esta enfermedad. Otro aspecto que
deber estudiarse en un futuro prximo es el origen multignico de esta enfermedad. Esta hiptesis est siendo estudiada originando lineas de ratones que son heterocigotos mltiples para alelos nulos de Titf1, Titf2 y Pax8, ninguno de los cuales en
heterocigosis produce fenotipo anormal tiroideo.
B. Terapia gnica en enfermedades tiroideas

Uno de los objetivos ms actuales en terapias gnicas para el tratamiento de carcinomas es la bsqueda de nuevas aproximaciones experimentales que impliquen la
menor toxicidad posible. Los cnceres con alta recurrencia despus de tratamientos
con radio- o quimioterapa representan clnicamente un reto para la bsqueda de
nuevas terapias. En este sentido se tiende a desarrollar tratamientos ms localizados
y efectivos que sustituyan a tratamientos ms txicos que puedan afectar al organismo entero. Para conseguir este objetivo, se estn explorando aproximaciones
317
moleculares basadas en transferencia selectiva a clulas tumorales de genes teraputicos o de promotores especficos para localizar la expresin del transgen en
clulas tumorales. Estas aproximaciones experimentales estn en fase de desarrollo
con resultados muy prometedores.
Actualmente se est desarrollando una nueva terapia basada en el uso del gen
tiroideo NIS. Este gen codifica por la protena responsable de la captacin de
yodo, una caracterstica especfica de la clula epitelial tiroidea y el primer paso
en la sntesis y secrecin de hormonas tiroideas (20). Tras la clonacin en 1995 de
este transportador (21), el estudio de la expresin de este gen y su uso en terapia
gnica han revolucionado muchos aspectos de esta tecnologa. La expresin de
este gen se describi inicialmente como especfica de tejido tiroideo, aunque se
ha demostrado posteriormente que tambin se expresa en la glndula salival,
mamaria y en la mucosa gstrica (20). Basndose en la funcin de la protena NIS
de captar iodo, estudios muy recientes han estado encaminados a la sobre-expresin del transportador NIS en clulas tumorales y tratarlas posteriormente con
I123 o con Tecnecio Tc99 para diagnstico por imagen. Adicionalmente, si la
expresin de NIS en clulas tumorales puede exceder a la expresin existente en
clulas tiroideas diferenciadas, la acumulacin de I 131 puede resultar en ms de
50.000 cGy de dosis de radiacin ionizante. De esta forma la radioterapia con I 131
debera eliminar especficamente las clulas que expresan el transportador de
iodo.
Con esta idea trabajos recientes han expresado el tranportador NIS en clulas
tumorales de varios orgenes (melanoma, mama, colon etc.) obteniendo resultados
muy prometedores. La forma de expresin de NIS ha sido usando vectores retrovirales (22) o adenovirales (23). Ambos tipos de vectores tienen ventajas e inconvenientes, aunque actualmente el uso de ambos est bien aceptado. Con el uso de estos
vectores se han expresado altas concentraciones de NIS en clulas tumorales comprobndose que dichas clulas captaban iodo radiactivo. De esta manera se ha podido hacer un seguimiento por imagen del tumor, tras inyeccin de las clulas que
sobre-expresan NIS a ratones atmicos y posteriormente se han tratado los animales con I131 con resultados muy prometedores en cuanto a la desaparicin de tumores que sobre-expresan NIS (22, 23).
Este tipo de terapia se ha usado, como se ha mencionado, en varios tipos celulares (22, 23) y puede ser tambin usada en clulas tumorales tiroideas. Una parte de
los tumores diferenciados de tiroides retienen cierta capacidad de concentrar yodo,
lo que permite el uso de radioyodo como tratamiento para los pacientes que presentan cncer recurrente y metastsico. Sin embargo, un alto porcentaje de los
tumores de tiroides diferenciados, as como los dediferenciados, pierden la capacidad de concentrar yodo. Este hecho reduce considerablemente las posibilidades de
ser tratados de forma efectiva. Por ello se est usando tambin en cncer de tiroides,
la terapia alternativa de sobre-expresin de NIS con el uso de vectores virales, aunque no hay de momento trabajos publicados al respecto.
318
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Ribonucleico mensajero, 1
Activacin
de los aminocidos, 57
gnica, 107
Activator-Recruited Cofactor (ARC), 51
Actividad
estrella, 159
peptidiltransferasa, 62
Activinas, 238
Adaptadores de policlonaje, 184
ADN, 1, 69
circular, 167
conformaciones del, 7
copia, 162
de cadena sencilla, 167, 170
de doble cadena, 163, 167
desenrollamiento, 8
dominio de unin al, 72
estructura dimensional del, 7
exonucleasa, 161
ligasa, 162, 186
lineal, 167
mitocondrial, 13
polimerasa(s), 22, 157, 178
de T7, 161
I, 157, 161
III, 20
replicacin, 15, 16
superenrollamiento, 8
vectores de, 183
ADNasa I, 157
ADNcopia (ADNc), 158, 162, 163, 176,
182, 183, 185
ADNcs, 157, 158, 168
ADNdc, 157, 158, 168, 173, 182, 184,
185
ADNpol I, 158
ADNr, 142, 143, 144, 155, 155, 156, 181,
190, 216
Aminocidos, activacin de los, 57
AMV polimerasa, 162
AN,
de cadena doble, 168, 169
de cadena simple, 168
secuanciacin, 172
Andrgenos, dficit enzimticos en la biosntesis, 292
Anemia de Fanconi, 250
Aneuploidas, 150
Animales transgnicos, 223
Anomalas postreceptor de GH, 252
Antibiticos, 62
Anticuerpos, 90
antiinsulina, 95
antitiroideos, 97
contra clulas de los islotes (ICA), 95
monoclonales, 142, 144
322
Antgeno, 83, 84
mayor de histocompatibilidad (MHC),
238
T, 237
Antioncogenes, 108
Apoptosis, 115, 117, 119, 120, 124
ARC (Activator-Recruited Cofactor), 51
ARN,
clases de, 28
de cadena
mixta, 158
sencilla, 170
simple, 157, 158
de transferencia (ARNt), 29, 35, 55, 56,
57, 59, 60
procesamiento, 36
degradacin del, 39
estructura, 27
mensajero (ARNm), 1, 29, 30, 55, 56, 59
molde, 162
poliadenilado, 167
polimerasa, 42, 43, 163
II, 43, 46, 51, 131
procesamiento del, 29
ribosmico (ARNr), 1, 29, 37
transferencia (ARNt), 1
transporte del, 39
ARN molde, 162
ARNasa
H, 162
I, 176
P, 176
T1, 176
U2, 176
ARNdc, 168
ARNpol, 160
ARNpolia, 163
Autotolerancia, 81
Azul de metileno, 168
Bacillus subtilis, 188
Bacterifagos, 184, 185
Bad, 122
Batch, 204, 205
record, 212
Bax, 121, 122, 123
Bc12, 121, 122, 123, 125, 126
BCLR, 90
BCLRL (receptor de la clula B), 84
Bclxl, 121
Biorreactores, 198
airlift, 199
de fibra hueca, 200
de lecho fluido, 201
Biosntesis de protenas, 59
Botellas rodantes, 222
BrEt, 178
Bromuro de etidio, 166, 168, 169, 170
BTK, 244
Cncer, 99
de coln familiar, 111
CAP (Catabolite gene Activator Protein), 49
Carcinoma medular de tiroides, 301
Caspasas, 120, 125
Catabolite gene Activator Protein (CAP),
49
Cebador, 162, 163, 174
Cebadores, 175, 178
Clula(s),
B16, 149
beta,
artificiales, 280
clonacin taraputica y diferenciacin,
284
obtenidas a partir de clulas madre
embrionarias, 285
trasplante de, 285
C127, 216
CHO (Chinese Hamster Ovary), 145, 222
citolticas naturales, 82
de origen tumoral, ingeniera de, 280
dependientes de anclaje (ADC), 150
diana, 137
eucariotas, 63, 148
eucariticas de mamfero, 189
hospedadoras, 187, 190
musculares, 76
pluripotenciales mesenquimales, 137
CHO, 146
Citosinas, 82
Citocromo c, 121, 122, 126, 176
Citoquinas, 100, 123
Clonaje, 181
posicional, 176
Cloranfenicol, 63
Cluster de la GH, 245
Coactivadores, 51, 53
Cdigo gentico, 55, 56, 189
NDICE ANALTICO
Codn, 55, 59, 60, 171

Codones, 56, 62
Complejo
de Golgi, 66
de iniciacin, 59, 60
principal de histocompatibilidad (MHC),
86, 93
Concatameros, 234
Conformaciones del ADN, 7
Control,
de la actividad proteica, 70
de la degradacin de los ARNm, 70
de la transcripcin, 70
del procesamiento postranscripcional, 70
del transporte de los ARN mensajeros, 70
traducional, 70
Correpresores, 51
Csmidos, 184, 185
Cre-loxP, 234
Cremallera de leucina, 72
Cribado, 190
Cromatina, 10, 22, 131
Cromatografa,
de filtracin molecular, 220
de intercambio inico, 220
Cultivo(s), 151
batch
alimentado, 152
o discontinuo, 151
semi-continuo, 152
continuo, 151, 152
in vitro, 147
procariotas, 195
DAGH,
11, 247
1A, 246
1B, 247
IA, 246
IB, 247
II, 247
III, 247
Dedos de zinc, 72
Deficiencia,
aislada de GH familiar, 246
combinada de hormonas hipofisarias, 248
de 21-OH, 263
anlisis gentico molecular, 274
diagnstico prenatal, 275
323
gentica,
de hormona de crecimiento, 244
Dficit de 21 hidroxilasa, 290
Delecin clonal, 91
Desenrollamiento del ADN, 8
Desnaturalizacin, 178
Diabetes mellitus,
terapia celular, 279
tipo I, 95
Dietil-aminoetil-sephadex (DEAE), 201
Diferenciacin,
celular, 69, 73
etapa de, 77
Dimerizacin de protenas, 73
dominio de, 72
Displasia, septo-ptica, 250
Dominio de transactivacin AF-2, 51, 53
Dominio Visagra, 51
Downstream, 217, 220, 222
DRIP (vitamine D Receptor Interacting
Proteins), 51
E. coli, 157
ECOtPA, 146
EGF, 149
EGTA; 158
Elastasa pancretica del tipo I, 236
Electroporacin, 186
Endonucleasa, 158, 159, 161
de ADN, 157
de restriccin, 158
Enfermedades,
autoinmunes, 94
de Graves, 97
tiroideas, terapia gnica, 316
Enhancers, 229, 239
Envejecimiento, 13
Enzima(s),
de restriccin, 158, 159, 160, 173
de tipo II, 159, 182
Sau3A, 182
inmovilizadas, 144
T4 polinucletido, 176
quinasa, 173, 176
Er, importacin al, 65
Eritromicina, 63
Eritropoyetina, 177
Escherichia coli, 145, 188
Estado estacionario, 152
324
Estreptomicina, 63
Estructura dimensional del ADN, 7
Estudios farmacogenmicos, 177
Eucariotas, 45, 53, 57
Exo III, 158
Exones, 156
Exonucleasa(s), 157, 158, 161
5 flecha 3, 161
III, 157
h, 157, 158
Expresin gnica, 70, 73
Extensin, 178
Factor(es)
IX, 142
VIII, 142
VIII, 143
de crecimiento epidrmico (EGF), 189
de transcripcin, 77, 104, 310
Pax-8, 311
TTF-2, 311
TFII-B, 46
de coagulacin, 143
de crecimiento, 103, 149
receptores de, 103
de progresin, 100
de terminacin, 62
musculares reguladores, 77
FADD (Fas activating death domain), 119,
120
Fago h, 157, 185
Fagocitos, 82
Fanconi, anemia de, 250
Fas activating death domain (FADD), 119,
120
Fibroblastos, 74
Fibrosis qustica, 129
Fragmento Klenow, 158
de la ADNpol I Secuenasa, 161, 174
Gen(es),
APC, 111
de GHRH, 245
de IGF-I, delecin del, 253
de la 21-hidroxilasa, en poblacin espaola, 268
de la 21-OH, 265
de la esteroide 21-hidroxilasa,
anlisis indirecto, 269
resultados y discusin, 270
de la somatostatina, 245
del factor de transcripcin hipofisario
nmero 1, 246
del receptor de GHRH, 243, 246
estructural, 223
eucariticos, 130, 156
GHI, 243
mutadores, 112
p53, 111, 112
procariticos, 156
Rb9, 110
SHOX; 254
supresores, 108
tiroideo NIS, 317
Genotecas, 145, 162, 182, 183
de ADNc, 182, 183
GMP (Good Manufacturing Practices),
191, 211
Golgi, complejo de, 66
Gonadotropina corinica, 291
dficit de respuesta testicular a la, 291
Graves, enfermedad de, 97
Gua de fabricacin, 212
Harvest, 218, 220, 222
Helicasa(s), 17, 19, 24
Hlice-bucle-hlice, 72
Hlice-giro-hlice, 71
Hemoglobina, 176
Heterocariosis, 150
HGH, 143, 146
Hibridacin, 168, 169, 170, 172, 174, 178,
179
de los AN, 191
Hipercrecimiento, 243
Hiperplasia adrenal congnita, 263, 268,
290, 292
tratamiento, 268
Hipocrecimiento, 243, 244
de origen prenatal, 254
por anomalas en genes de los gonosomas, 253
por resistencia gentica a la hormona de
crecimiento, 251
Hipotiroidismo congnito, 309
terapia gnica, 309
NDICE ANALTICO
Histona(s), 10, 21
acetilasa, 22
desacetilasa, 22
HLA, 87, 92
Holoenzima, 42, 44
Holoprosencefalia, 249
Hormona(s)
antimlleriana, 297
mutaciones de los genes implicados en
la accin de la, 297
de crecimiento, 177, 243, 243
deficiencia gentica, 244
hipocrecimiento por resistencia gentica a la, 251
recombinante, 216
hipofisarias,
deficiencia combinada, 248
luteinizante, 291
dficit de respuesta testicular, 291
tiroideas, 49, 72, 309
Hospedadores,
eucariticos, 189
procariticos, 188
ICAM-1, 92
IGF, 149
IGF-I, resistencia a, 253
Importinas, 65
Inflamacin, 82
Informacin gentica, 6
Ingeniera de clulas de origen tumoral,
280
Inhibina, 238
Inmunidad,
adaptativa, 82, 88
adquirida, 81
innata, 81, 88, 90
Inmunodeficiencia severa combinada
(SCID)- X1, 129, 137
Inmunoglobulinas, 82, 84, 107
Insulina, 142, 143, 146, 176, 177
produccin en otros tejidos, 281
Interaccin hidrofbica, 220
Interfern _ humano, 189
Interferones, 176, 177
Interruptores moleculares, 70-71
Intrones, 33, 156, 188
Isosquizmeros, 160
325
Klenow, fragmento, 158

Knock-out, 224, 238
de Pax-8, 314
de TTF-1, 314
Layout, 203
Lentivirus, 134, 135
Leucemia,
linfoblstica aguda, 108
mieloide crnica, 108
Levaduras, 189
Ligasas, 159, 164
de ADN, 159, 163
Linfocitos, 93
B, 85, 86, 88, 90
T, 74, 86, 87, 89, 90, 95
T citotxicos, 123
T y B, 83
Linfoma de Burkitt, 107
Liposomas,
aninicos, 187
catinicos, 187
Lisosomas, importacin a los, 66
MAP quinasas, 106

Marcadores fenotpicos de seleccin, 184
Master cell bank, 192, 217
Mastocitos, 82
Matriz nuclear, 22
MCB, 217
Mdula sea, 84, 93, 137, 139
MEF-2 (Myocyte Enhancer Factor 2), 77
MEFs (muscle Enhacer Binding Factors),
78
MEN 1,
bases moleculares del, 302
de tipo I, 302
MEN 2, bases moleculares, 305
Metstasis, 100
MhC (complejo principal de histocompatibilidad), 87, 93
Microcarriers, 200
Microinyeccin pronuclear, 223
Microportadores, 200
Microsatlites, 113
Mioblastos, 76, 77
MioD, 74, 77, 78
326
Miognesis, etapas de, 75

Miogenina, 77, 78
mitocondrias, importacin a las, 65
MMLV polimerasa, 162
Mrf4, 77
Mrf4, 78
Multitray, 200
Muscle Enhancer Binding Factors (MEFs),
78
Mutgenos, 101
Myf5, 77, 78
Myocyte Enhancer Factor 2 (MEF-2), 77
Naranja de acridina, 168
Necrosis, 115
Neognesis de islotes, 283
Neoplasia endocrina mltiple, (MEN)
de tipo 1, 302, 304
de tipo 2, 304
patologa molecular, 301
NIS, 310
NO, 125, 126
sintasas, 124
Normas
GMP, 192
USP, 202
Northern, 168, 170
Nucleasa(s), 157
BA131, 158
SI, 157
Ncleo, importacin al, 65
Nucleosoma(s), 10, 21, 22, 117, 131
Oncogn(es), 99, 101, 102, 123
c-H-ras, 236
supresores, 109
Oncoprotena, 103
Oncorretrovirus, 132, 135
Opern lactosa, 48
xido ntrico, 124
P53, 123
Patologa molecular, 263
Pax-8, 310
PCR (Polymerase Chain Reaction), 11,
162, 175, 177, 178, 179, 205, 223
PDGF, 149
Peroxinitrito, 125, 126

Pfu polimerasa, 162
Pigmeos, 253
Plsmidos, 184, 185
Poli-A polimerasa, 163, 176
I, 16
II, 16
III, 16, 19
Polimerasa(s), 15, 16, 162
5 flecha 3, 161
I, 16
II, 16, 19
de cidos nucleicos, 189
de ADN (ADNpol), 160
de AN, 162
eucariticas, 23
termorresistentes, 162
Polinucleosomas, 22
Primers, 178
cebadores, 183
Procariotas, 57
Poliferacin/migracin,
etapa de, 77
Promotores, 163, 229, 239
Protenas, 55
antiapoptticas, 104
biosntesis de, 59
con homeodominio, 71
del complemento (CR), 82
dimerizacin de, 73
reguladoras, 75
transportadoras de pptidos, 89
Tus, 20
Proto-oncogn(es), 99, 101, 103, 105,
107
activacin de, 105
ras, 236
Providentia stuartii I (PstI), 160
Pseudohermafroditismos,
aproximacin gentica, 289
determinacin y diferenciacin sexual,
289
femenino, 290
masculino, 289
PstI (Providentia staurtii I), 160
Puromicina, 69
Quimeras, 234
Quimiostato, 152
NDICE ANALTICO
Quinasas,
del fago T4 (T4 quinasa), 164
Radioiodo, 317
Ratn(es),
enanos Snell y Jackson, 248
knock-out, 234
nulo para TTF-2 (Titf2), 314
Reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR), 11, 177, 179
Receptor,
del antgeno de las clulas T (TCR), 86
de retinoides, 50
interating protein (RIP), 119
Receptores,
nucleares, 50
hurfanos, 50
Regeneracin, 283
Regulacin,
de todo o nada, 203
PID, 203
Regulacin de la iniciacin, 48
Replicacin del ADN, 15, 16
Replisoma, 19
Represores, 47
Respuesta inmunitaria, 83
Retinoblastoma, 110
Retinoides, 149
Retrovirus, 133
R-hFSH, 142, 222
R-hGH, 142, 221
Ribonucleasa
A (ARNasa A), 158
H (ARNasa H), 158
T1, 176
Ribosoma(s), 59, 63
RIP (receptor interacting protein), 119
RNA polymerase Associated Protein, 47
Roller
bottles, 217
cell, 219
Salmonella, 188
Sau3AI (staphilococus aureus cepa 3AI),
160
Screening, 190
del ADN, 173
327
Secuenasa, 161, 174

Secuenciacin,
automtica con fluorocromos, 175
del ADN, 175
del ARN, 175
enzimtica, 174
por degradacin enzimtica, 176
por el mtodo de degradacin qumica,
175, 176
por el mtodo enzimtico, 175
por hibridacin, 175
Secuencias reguladoras, 223
Seleccin clonal, 83
Sensores biolgicos, 144
SHOX, 244
Sndrome(s),
de Aarskog, 251
de Bloom, 251
de conductos mllerianos persistentes, 297
de Denys Drash, 298
de ectrodactilia-displasia ectodrmicalabio leporino, 250
de feminizacin testicular, 290
de Frasier, 298
de insensibilidad primaria a la GH, 251252
de Laron, 251, 252
tipo b o c, 252
de Morsier, 250
de resistencia primaria a la GH, 251
de rieger, 250
de Russell-Silver, 254, 255
de Turner, 254
Sistema(s)
Cre/lox P, 224
de perfusin, 152
HLA, 87
inmune, 81, 90, 99, 137, 139
principal de histocompatibilidad (MHC),
87
Sondas, 145
SOP (Standard Operating Procedures), 212
Southern, 168, 170, 191
blot, 223
Spiracel, de Sterilin, 200
Splicing de ARNm, 216
Standard Operating Procedures (SOP), 212
Staphilococus aureus cepa 3AI (Sau3AI),
160
328
Subclonaje, 181, 183

Superenrollamientos del ADN, 8
Sybr-Green, 168, 169, 178
T3R_, 50
T3R`, 50
Taq polimerasa, 162
TATA, 47, 131
TCR, 87, 90, 91, 92
(Receptor del antgeno de las clulas), 86
Telomerasa, 25
Terapia gnica, 129, 137, 139, 177
en enfermedades tiroideas, 316
hipotiroidismo congnito, 309
Terapia proteica, 177
Termocicladores, 179
Testosterona, 294
Tetraciclina, 63
TFII
A, 47
B, 47
Thermus aquaticus, 162
Thyroid hormone receptor Associated
Proteins (TRAP), 51
Thyroid receptors responsive elements, 50
Thyroid transcription factor, 310
Timo, 93
Tiroides, carcinoma medular de, 301
TLCR, 86
TNF-RI associated death domain
(TRADD), 119
Tolerancia adaptativa, 90
Tolerancia B, 93
Topoisomerasa(s), 9, 17
II, 19, 20
TRADD (TNF-RI associated death
domain), 119, 120
Transcripcin, 41, 131
inversa, 136
Transcriptasas reversas, 162
Transduccin, 187
Transferasa terminal, 157, 162
Transferencia, 132
gnica, 130
horizontal, 102
vertical, 102
Transformacin,
con bacterifagos, 186
con CaCl2, 186
con fosfato clcico, 186
Trasgn, 223
Trasgnico(s), 144, 229
Transportador de yodo dependiente de
sodio, 310
Transportador NIS, 317
TRAP (Thyroid hormone Associated
Proteins), 51
Tripsinizaciones, 218
TTF-2, 310
Tth polimerasa, 162
Upstream, 217, 222
Utilities, 203
Vector(es), 132, 133, 134, 139
de ADN, 183
de clonaje, 183
de expresin, 183
virales eucariticos, 184
virales para clulas eurcariticas, 185
Vent polimerasa, 162
Virus eurcariticos modificados, 185
Virus SV40, 237
WCB, (working cell bank), 192, 217
Xenotrasplante(s), 226, 227
Este libro es el resultado final de un curso sobre introduccin a la biotecnologa,

que tuvo lugar en la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense.
En el mismo se pretende hacer una puesta al da de los conceptos bsicos de
la nueva biotecnologa para los profesionales biosanitarios, dada la importancia
creciente que est adquiriendo esta ciencia. Como estos profesionales necesitan
refrescar y poner al da toda una serie de conocimientos, se realiza primeramente
un repaso a la bioqumica de los procesos que conducen a la sntesis proteica,
con un breve recuerdo a las bases de la informacin gentica, con especial hincapi
en el ADN y su replicacin, a la estructura del ARN, la traduccin del mensaje
gentico y la regulacin del mismo. sta parte es necesaria para entender el
lenguaje del resto del contenido.
Para completar la primera parte del libro, hay un captulo sobre el reconocimiento
de antgenos y los genes que los regulan, otro sobro oncogenes y genes mutadores,
otro sobre apptosis y su regulacin gnica y finalmente, uno sobre las bases de
la terapia gnica, que aunque en sus comienzos presenta grandes expectativas.
Todos los autores de sta parte, son profesores de bioqumica y biologa molecular
de la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense y de la Universidad
Autnoma de Madrid.
En el segundo gran captulo del libro, se hace una introduccin a la biotecnologa.
Hay dos lecciones sobre ingeniera gentica y otras dos ms sobre la produccin
industrial de frmacos recombinantes. Estas lecciones estn escritas por los
responsables de la planta de produccin de GH, por tcnicas de ADN recombinante
en clulas de mamferos de Laboratorios Serono, en Madrid, con sobrada experiencia
pesonal en los temas que tratan.
La tercera parte del libro aborda las bases moleculares de las enfermedades
endocrinas y abarca, desde las tcnicas generales para crear ratones transgnicos
o KO (aquellos en los que se elimina selectivamente algn gen de su genoma)
que permiten la constatacin de las actividades potencialmente pleyotrpicas de
los mismos, a la descripcin individualizada de los aspectos genticos de una
serie de enfermedades endocrinas que comprenden desde las alteraciones del
crecimiento a la Hiperplasia Suprarrenal Congnita, la Diabetes Mellitus, los
pseudohermafroditismos, las Neoplasias Endocrinas Mltiples (MEN) y el hipotiroidismo congnito.
ISBN 84-7978-543-8
9 788479 785437

Biotecnologia Aplicada A La Medicina - Jesús A. F.-Tresguerres - 349 Pag

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Vicente Martnez Fernndez

Reservados todos los derechos.

Vicente Martnez Fernndez. Dpto.

Begoa Ezquieta. Serv. Bioqumica.

BIOTECNOLOGA APLICADA A LA MEDICINA

Alfredo Martnez Mogarra. Dpto.

Isabel Roncero. Dpto. Bioqumica y

David Martnez-Selva. Unidad de

Juan Miguel Ruiz Albusac. Dpto.

Oscar Martnez-Tirado. Unidad de

ngel Santos Ruiz. Dpto. Bioqumica y

Francina Munell. Unidad de Investigacin Biomdica. Hospital Materno

Bernat Soria Escoms. Instituto de

Toms Pino. Unidad de Investigacin

Elena Vara. Dpto. Bioqumica y Biologa Molecular. Facultad de Medicina.

Jos Regueiro. Dpto. Inmunologa.

Jos Manuel Varela. Servicio de Bioqumica. Hospital La Paz. Madrid.

Jaume Revents. Unidad de Investigacin Biomdica. Hospital Materno

Esther Velzquez Snchez. Dpto. Bioqumica y Biologa Molecular. Facultad

BIOTECNOLOGA APLICADA A LA MEDICINA

Gentica molecular, con un inters clnico diagnstico e ingeniera gentica, con

1. Concepto de informacin gentica. cidos nucleicos, estructura

Flujo de la informacin gnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2. Replicacin del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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3. Estructura y procesamiento del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4. Mecanismo de la transcripcin: regulacin de la iniciacin . . . . . . .

5. Sntesis de protenas: Traduccin y transporte . . . . . . . . . . . . . . . . .

6. Fundamentos de regulacin de la expresin gnica. Diferenciacin

BIOTECNOLOGA APLICADA A LA MEDICINA

Regulacin de la actividad de las protenas reguladoras . . . . . . . . . . . .

7. Genes para la presentacin y el reconocimiento de antgenos . . . .

8. Oncogenes. Protenas tumorales. Mecanismos de activacin de

Funciones de los proto-oncogenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

10. Terapia gnica en clulas somticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129

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Logro de la terapia gnica en la inmunodeficiencia severa combinada

11. Introduccin a la Biotecnologa y generalidades sobre cultivos

12. La ingeniera gentica I. Herramientas y Metodologa . . . . . . . . . . . 155

13. La ingeniera gentica II. Protenas recombinantes . . . . . . . . . . . . . . 181

14. Produccin industrial de frmacos recombinantes . . . . . . . . . . . . . . 195

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16. Biologa molecular y endocrinologa: El ejemplo de los animales

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18. Patologa molecular de la hiperplasia suprarrenal congnita . . . . . 263

Anlisis del gen de 21-OH en poblacin espaola . . . . . . . . . . . . . .

19. Terapia celular de la diabetes mellitus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279

20. Aproximacin gentica a los pseudohermafroditismos . . . . . . . . . . 289

21. Patologa molecular de la neoplasia endocrina mltiple

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22. Mecanismos moleculares implicados en el hipotiroidismo

NDICE ANALTICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321

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