CHAPITRE 2.10.3.

SALMONELLOSES

RSUM
La salmonellose est une maladie infectieuse de l'homme et de l'animal dont sont responsables les
organismes de 2 espces de Salmonella (Salmonella enterica et S. bongori). Bien que la bactrie soit
avant tout d'origine intestinale, les salmonelles diffusent largement dans l'environnement et sont
habituellement retrouves dans les effluents d'levage, les eaux uses dorigine humaine et au niveau
de matriels pouvant tre sujet une contamination fcale. Les salmonelles sont l'agent tiologique
dinfections diarrhique et systmique chez l'homme, le plus souvent en tant que contaminant
secondaire d'aliment partir de l'environnement, ou partir de produits alimentaires provenant d'un
animal infect. La salmonellose humaine est la plus frquente et importante maladie zoonotique cause
par les salmonelles. Ce micro-organisme est aussi trouv dans l'alimentation animale, entranant des
maladies infectieuses chez l'animal, particulirement chez les volailles et les porcs. La salmonellose a
t identifie dans de nombreux pays, mais semble tre plus frquente dans les zones d'levage
intensif, particulirement de porcs et de vaches reproductrices et dans certains levages de volaille en
confinement. Les reptiles sont aussi habituellement porteurs asymptomatiques de salmonelles. La
maladie peut atteindre toutes les espces d'animaux domestiques ; les animaux jeunes et en gestation
ou lactation sont les plus sensibles. Les maladies entriques sont la manifestation la plus frquente,
mais on peut observer une large varit de signes cliniques, tels quune septicmie aigu, un
avortement, de l'arthrite et des signes respiratoires. Beaucoup d'animaux, en particulier, le porc et la
volaille peuvent tre infects mais sans montrer de signes cliniques. Ces animaux jouent un rle
important dans la diffusion de l'infection entre les diffrents levages et galement en tant que source
de contamination des aliments et l'origine de l'infection humaine.
La typhose et pullorose S. pullorum, maladies des volailles causes par les salmonelles, sont
mentionnes dans le Chapitre 2.7.5. de ce Manuel terrestre.
Identification de l'agent pathogne : Le diagnostic est bas sur l'isolement dans l'organisme partir
soit de tissus prlevs aseptiquement lors de lautopsie, soit de fces ou dchantillons prlevs par
couvillonnage au niveau rectal, soit encore partir de prlvement raliss sur le terrain, de produits
alimentaires ou destins a lalimentation animale. En cas d'infection des organes gnitaux, lors
davortement ou au cours de la mise bas, il est ncessaire de mettre en culture le contenu stomacal du
ftus, et des frottis placentaires et vaginaux. Dans le cas de volaille, il convient de mettre en culture
des ufs embryonns.
Les salmonelles peuvent tre isoles en utilisant des techniques varies, qui peuvent inclure un
pr-enrichissement pour revivifier les salmonelles moribondes, des milieux d'enrichissement contenant
des substances inhibitrices pour liminer la flore comptitive, et des gloses pour lisolement slectif
afin de diffrencier les salmonelles des autres entrobactries.
Divers tests biochimiques et srologiques peuvent tre appliqus sur une culture pure pour obtenir
confirmation de la souche isole. Les salmonelles possdent des antignes de type somatique (O),
flagellaire (H) et de virulence (Vi), qui peuvent tre mis en vidence par des srums de typage, et le
srovar peut tre dtermin par rfrence une formule antignique du schma de Kauffman-White.
De nombreux laboratoires envoient les isolats un laboratoire de rfrence pour confirmer l'identit
srologique complte et raliser la dtermination du lysotype et du gnotype de la souche lorsque c'est
possible.

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Chapitre 2.10.3. Salmonelloses

preuves srologiques : Des preuves srologiques peuvent tre ralises sur un chantillon
statistiquement reprsentatif de la population, mais sont de valeur limite si la vaccination est
pratique. Chez les volailles, le test sur sang total est utilis dans les levages pour un diagnostic
rapide de S. Pullorum/Gallinarum, ce test tant relativement fiable dans certaines circonstances. Au
laboratoire, le test d'agglutination en tube est la mthode de choix pour les chantillons de toutes
espces animales des fins de diagnostic et d'exportation. Des preuves immuno-enzymatiques sont
disponibles pour certains srovars et peuvent tre utilises pour le diagnostic srologique et la
surveillance, en particulier pour les levages de volaille et de porc. La vaccination contribue limiter la
valeur diagnostique des preuves srologiques.
Spcifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques usage diagnostique :
Plusieurs vaccins inactivs sont utiliss contre la salmonellose et des vaccins vivants sont
commercialement disponibles. Du fait de l'efficacit plutt faible des vaccins inactivs, des adjuvants
huileux ou contenant des alhydrogels sont utiliss pour amliorer leurs proprit immunognes. Les
donnes de terrain sur l'efficacit sont souvent manquantes, bien que les tests de laboratoire puissent
fournir des informations utiles. Des tests d'innocuit sont raliss en animalerie et, dans le cas des
vaccins inactivs, des tests de strilit utilisant des milieux de culture d'enrichissement sont raliss.
Dautres prcautions, tels que l'impact environnemental et la stabilit, sont ncessaires pour la
production de vaccins prpars par manipulation gntique. L'exclusion comptitive est utilise pour
rduire l'infection salmonellique chez les volailles et dans d'autres espces animales.

A. INTRODUCTION
La classification des salmonelles a t controverse pendant de nombreuses annes. Selon la dernire
nomenclature, qui reflte les avances rcentes en taxonomie (33), le genre Salmonella comprend seulement
2 espces : S. enterica and S. bongori (21, 32). Salmonella enterica est divise en 6 sous-espces, qui se distinguent
par certains caractres biochimiques et certains d'entre eux correspondent aux anciens sous-genres. Ces
sous-espces sont :

Nomenclature ancienne
Sous-espces I
=
Sous-espces II
=
Sous-espces IIIa =
Sous-espces IIIb =
Sous-espces IV
=
Sous-espces VI
=

Nomenclature actuelle
Sous-espces enterica
Sous-espces salamae
Sous-espces arizonae
Sous-espces diarizonae
Sous-espces houtenae
Sous-espces indica

Pour le srovar S. bongori, le symbole V a t retenu pour viter toute confusion avec le nom de srovar S. enterica
subsp. enterica. Les souches de Salmonella sont classes en srovars sur la base de la diversit des antignes (O)
des lipopolysaccharidiques (LPS) et des protines flagellaires (H) en accord avec le schma de Kauffmann-White ;
actuellement environ 2 500 srovars sont reconnus (32, 33). Ce nombre est en croissance constante. Les srovars
les plus frquemment impliqus dans les infections humaine et animale appartiennent la sous-espce enterica. Les
srovars des autres sous-espces sont habituellement associs aux animaux sang froid et l'environnement, bien
que certains srovars de S. arizonae and S. diarizonae aient t associs des infections chez la dinde et le mouton.
Des noms ont t retenus seulement pour les srovars appartenant la sous-espce enterica. Ces noms ne doivent
plus tre crits en italique. La premire lettre est en capitale. Il n'est pas ncessaire d'indiquer le nom de sous-espce
en pratique clinique, mais seulement le nom de srovar de la sous-espce enterica, par exemple, Typhimurium,
London ou Montevideo sont des srovars de la sous-espce enterica. En pratique, Le nom de Salmonella
Typhimurium peut tre utilis.
Dans ce chapitre, les abrviations des nouvelles conventions sont respectes, par exemple S. Typhimurium plutt
que la nomenclature complte S. enterica, subsp. enterica srovar Typhimurium.
Les salmonelloses sont des maladies infectieuses humaines ou animales dont deux espces de Salmonella sont
responsables (Salmonella enterica et S. bongori). Bien que la bactrie soit avant tout d'origine intestinale, les
salmonelles diffusent largement dans l'environnement et sont habituellement retrouves dans les effluents d'levage,

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Chapitre 2.10.3. Salmonelloses

les eaux uses dorigine humaine et au niveau de matriels pouvant tre sujet une contamination fcale. La
salmonellose a t identifie dans de nombreux pays, mais semble tre plus frquente dans les zones d'levage
intensives, particulirement dans les levages de volaille et de porc.
La maladie peut atteindre toutes les espces d'animaux domestiques ; les animaux jeunes et les femelles en
gestation sont les plus sensibles. La maladie entrique prsentant souvent une diarrhe profuse aqueuse ou
sanglante avec hyperthermie est la manifestation clinique la plus frquente, mais il est possible d'observer une large
varit de signes cliniques tels quune septicmie aigu, des avortements, des arthrites, une ncrose des extrmits
et des signes respiratoires. Les signes et les lsions ne sont pas pathognomoniques. Beaucoup d'animaux,
particulirement les volailles et les porcs peuvent aussi tre infects sans prsenter de signes cliniques (46). Ces
animaux jouent un rle important dans la diffusion de l'infection entre les diffrents levages et galement en tant que
source de toxi-infection alimentaire. Ces dernires apparatront lorsque ces animaux entreront dans la chane
alimentaire conduisant des produits alimentaires contamins (45, 46).
L'volution de l'infection, les signes cliniques, les examens post mortem et les profils pidmiologiques varient selon
le srovar et l'espce animale atteinte. Certains srovars n'affectent que certains htes, par exemple S. Gallinarum
pour les volailles ou S. Choleraesuis chez le porc, bien que la plupart des srovars puissent tre responsables
d'infections chez une grande varit d'espces animales (37). Beaucoup de srovars (incluant ceux adapts l'hte)
ont t l'origine de toxi-infections alimentaires chez l'homme, concomitantes de celles des animaux au pralable, les
vtrinaires et les personnels en abattoir peuvent tre infects directement au cours de leur travail, de mme que le
personnel de laboratoire.
La maladie est couramment rfrence comme une salmonellose, bien que le terme paratyphode puisse tre
employ, comme par exemple, la paratyphode porcine. En volaille, les termes de pullorose ou diarrhe blanche
bacillaire et de typhose sont souvent utiliss pour dcrire l'infection cause par S. Pullorum et S. Gallinarum,
respectivement (37). La typhose et la pullorose sont traites en dtails dans le Chapitre 2.7.5. de ce Manuel terrestre.
Lors denqutes pidmiologiques approfondies, l'identification de la souche est ncessaire et de telles enqutes sont
classiquement bases sur les mthodes biochimiques et srologiques, la lysotypie de certains srovars et
l'antibiogramme. L'analyse gnotypique de l'agent pathogne par des techniques d'empreintes molculaire de l'ADN a
t utilise avec de bons rsultats ces dernires annes. L'analyse des profils plasmidiques est une mthode rapide
et relativement facile pour typer les souches, et a t utilise la fois en mdecine humaine et vtrinaire pour
tudier la diffusion des Salmonella. Cette technique a ses limites car toutes les souches de Salmonella ne portent pas
de plasmides, et les plasmides peuvent tre facilement acquis ou tre de taille identique bien que gntiquement
diffrents. Dautres mthodes gntiques, telles que l'lectrophorse en champ puls et le ribotypage ont t utilises
en complment du profil plasmidique (25, 39). Le gnotypage est un domaine qui s'est rapidement tendu et de
nombreuses nouvelles techniques ont t dveloppes ces dernires annes. Il importe de savoir qu'une seule
mthode ne fonctionne pas pour tous les isolats et qu'il peut tre ncessaire d'valuer un certain nombre de
techniques diffrentes pour trouver une mthode ou une combinaison de mthodes satisfaisantes et capables de
diffrencier les clones d'un srovar ou dun lysotype donn.
L'isolement et l'identification des salmonelles ne dpendent pas seulement de la qualit de l'chantillon, mais aussi
des milieux de culture et des caractristiques de croissance du srovar, en particulier pour ceux adapts une
espce d'hte. Une tude complte des infections Salmonella chez l'animal domestique a t rcemment publie
(46).
Des mesures nationales ont t mises en place dans de nombreux pays de faon contrler les infections
Salmonella chez l'animal afin de protger le consommateur. La directive Zoonoses 92/117/CEE de l'Union
Europenne recommande la surveillance des levages de plus de 250 animaux et des couvoirs pour S. Enteritidis et
S. Typhimurium (9). Les cultures partir des litires des botes de transport des poulets et des poussins morts ou
rforms sont ralises le jour de l'arrive. Aprs 4 semaines et 2 semaines avant la ponte, un mlange de fces
(jusqu' 60 chantillons selon la taille de l'levage) est mis en culture. Par la suite, les animaux adultes sont prlevs
toutes les 2 semaines. Au niveau des couvoirs, le meconium ou les embryons morts sont mis en culture toutes les
2 semaines. La surveillance srologique est autorise si les preuves srologiques peuvent offrir des garanties
quivalentes au systme d'inspection dans les couvoirs et si la vaccination n'a pas t utilise. Au Danemark, la
surveillance srologique pour Salmonella est utilise pour les levages de porc et les levages commerciaux de
ponte. Au moment o ce chapitre est crit, la directive Zoonose est en cours de rvision si bien que les conditions
d'chantillonnage pourraient tre modifies.

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Chapitre 2.10.3. Salmonelloses

Les infections Salmonella des animaux de rente jouent un rle important en sant publique et particulirement en
ce qui concerne la scurit des aliments, car les produits alimentaires sont considrs comme la principale source
des infections humaines Salmonella (45). Des programmes spciaux ont t mis en oeuvre pour la surveillance des
volailles, des porcs et des bovins incluant la surveillance des animaux sains porteurs asymptomatiques de la bactrie
Salmonella. Les contaminations croises au cours de la transformation dans le secteur agro-alimentaire sont
galement surveilles du fait quil peut exister une contamination partir des manipulateurs sains (46).
La contamination de lalimentation animale est une cause frquente dinfection chez lanimal. Les produits pour
lalimentation animale tels que les repas base de viande et dos devraient tre analyss pour la recherche de
salmonelles car les salmonelles responsables de la contamination des aliments pour animaux appartiennent des
srovars impliqus en sant publique (46).
Les chantillons dalimentation humaine ou animale analyss pour la recherche de Salmonella devraient tre
vraiment reprsentatifs. Des tapes appropries devraient tre mises en oeuvre pour prvenir les endommagements
survenant durant le transport ou le stockage (17, 18). En raison de la grande varit de produits alimentaires pour
lhomme et lanimal, il nexiste pas de mthode dchantillonnage approprie pour tous les produits. Cependant
diffrentes mthodes spcifiques au produit doivent tre utilises (10, 19).
LOrganisation mondiale de la sant (OMS) apporte des informations sur la mise en uvre de mesures appropries
pour la prvention et la matrise des maladies transmises par les aliments, incluant les infections Salmonella chez
lhomme. Les oeufs et les ovoproduits, la viande de volaille et la viande des autres animaux de rente, ainsi que les
produits carns sont le plus frquemment impliqus dans la transmission de linfection. Salmonella Enteritidis et
S. Typhimurium sont les srovars les plus largement identifis dans les pays europens alors que S. Typhimurium est
le srovar dominant dans lAmrique du Nord (45).
Une matrise rglementaire de Salmonella dans un but de sant publique devrait couvrir toutes les tapes de la
fourche la fourchette ou de ltable la table . Cela inclut lobligation de dclarer tous les foyers pidmiques
de la maladie (12), et de tester lalimentation animale (46). La surveillance de lalimentation animale comprend
galement les composants de lalimentation et les matires premires dorigine animale de mme que
lchantillonnage durant la fabrication des produits destins lalimentation animale. Des enqutes pidmiologiques
lchelle mondiale devraient tre faites pour surveiller la transmission des Salmonella et encourager les contrles
rglementaires de Salmonella.
Les contrles sanitaires labattoir sont essentiels et des prcautions spciales devraient tre appliques quand
labattage concerne des troupeaux infects. Des mesures de dcontamination devraient tre mises en place tout au
long de lopration.
Un autre lment essentiel dans la prophylaxie de la salmonellose humaine est lducation du consommateur, en
particulier lattention porte la manipulation et au stockage des aliments, lhygine des cuisines et une cuisson
approprie pour limiter le risque dinfection.

B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1.

Identification de lagent pathogne

La frquence dchantillonnage et le type dchantillons obtenus dpendront largement des investigations cliniques,
des quipements du laboratoire, des donnes pidmiologiques et des objectifs.
Des chantillons individuels sont collects le plus aseptiquement possible pour des tests bactriologiques et avant
que tout traitement antibiotique ait t commenc. Les chantillons sont collects prfrablement durant la phase
aigu de la maladie ou le plus prt possible aprs le dcs. Dans le cas dlevage intensif des troupeaux de volaille,
des chantillons denvironnement prlevs sur le sol tels que la litire, la poussire ou des prlvements raliss sur
les bottes laide dun couvillon (4), peuvent tre le meilleur moyen efficace didentifier les troupeaux infects. Des
prcautions doivent tre prises pour viter les contaminations croises des chantillons durant leur attente et au
laboratoire. Les emballages doivent tre gards au froid et accompagns dinformations adquates. Pour les espces
animales plus petites, il est prfrable de transmettre un nombre reprsentatif de malades ou danimaux rcemment
dcds au laboratoire si cest possible (44). Des srovars adapts lhte sont plus difficiles isoler partir de
fces, et si ces derniers sont suspects, des tissus infects devront tre mis en culture dans la mesure o cela est
possible.

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Chapitre 2.10.3. Salmonelloses

Une attention particulire doit tre porte lisolement de salmonelles partir danimaux prsentant une infection
sub-clinique, du fait que ceux-ci peuvent excrter la bactrie de faon intermittente et en faible nombre.
Laugmentation de la taille de lchantillon, du nombre dchantillons reprsentant plus dindividus associe au
poolage des chantillons et un chantillonnage rpt peuvent augmenter la sensibilit du diagnostic. Dans de
telles situations, les mthodes bactriologiques ou srologiques devraient tre utilises pour identifier un troupeau
infect plutt que pour identifier un animal infect individuellement.

Culture

De nombreuses mthodes sont largement utilises travers le monde pour lisolement de Salmonella (8, 13, 16, 23,
34, 44). Celles qui sont les plus communes sont dcrites ci-dessous. Tous les milieux de culture prpars doivent
subir un contrle de qualit et doivent permettre la croissance du micro-organisme recherch partir dun inoculum
faible. Une souche de rfrence doit tre cultive en parallle avec lchantillon tudier de faon vrifier que les
tests fonctionnent correctement.

a)

Milieux de prenrichissement
Le nombre de salmonelles dans les fces dun animal asymptomatique, dans les chantillons denvironnement,
dans les produits dalimentation animale ou humaine est trs souvent faible, et il est ncessaire dutiliser des
milieux denrichissement tels que leau peptonne tamponne, ou le bouillon universel de pr-enrichissement
pour permettre lisolement. Ceci permet aux faibles nombres de salmonelles, qui autrement auraient t tues
par les effets toxiques des milieux denrichissement, de se multiplier, ou cela peut aider revivifier des
salmonelles qui ont t stresses par des traitements au froid, la chaleur, une exposition aux biocides ou par
la dessiccation. Le pr-enrichissement peut ne pas tre la meilleure mthode pour lisolement des souches de
Salmonella moins vigoureuses, telles que celles adaptes un hte, partir des fces du fait dune croissance
importante de la flore comptitive durant la phase de pr-enrichissement non slective.

b)

Milieux denrichissement
Les milieux denrichissement sont des milieux liquides ou gloss semi-solides qui contiennent des additifs qui
permettent slectivement la croissance de salmonelles alors que la croissance des autres bactries est inhibe.
Nanmoins, certains peuvent tre toxiques pour certains srovars de Salmonella, comme par exemple, le
slnite qui inhibe S. Choleraesuis ou le vert brillant qui est toxique pour beaucoup de souches de S. Dublin.
Des tempratures leves ont aussi t utilises pour augmenter la slectivit du milieu denrichissement, et
une temprature de 43C est utilise dans certains laboratoires, bien que cela puisse tre inhibiteur avec
certains milieux, par exemple, le ttrathionate et le Rappaport-Vassiliadis inhibe les souches sensibles la
temprature, particulirement S. Dublin, et une temprature de 41,5C est maintenant recommande pour
lincubation du bouillon Rappaport-Vassiliadis. Lenrichissement slectif par mobilit peut tre aussi utilis pour
augmenter la sensibilit disolement de Salmonella et un milieu denrichissement semi-solide comme par
exemple le milieu Rappaport-Vassiliadis semi-solide ou le Diagnostic Semi-Solid Salmonella medium
(DIASALM), peut permettre une sensibilit plus grande (42). La formulation du milieu, la temprature et le temps
dincubation et le volume des chantillons utiliss pour ensemencer le milieu peuvent concourir amliorer le
taux disolement et ces paramtres doivent toujours tre pris en compte. Des exemples de milieu slectif
denrichissement sont le ttrathionate de sodium comme le bouillon Muller-Kauffman, le slnite F, le slnite
cystine, le bouillon vert brillant et les bouillons Rappaport-Vassiliadis ou le milieu Rappaport-Vassiliadis
semi-solide. Du Ferrioxamine E peut aussi tre ajout aux milieux slectifs pour amliorer lisolement de
Salmonella partir de fer ou dchantillons peu nutritifs tels que les oeufs, leau ou le sol (34).

c)

Milieux disolement slectif

Il existe des gloses slectives solides qui permettent la croissance diffrentielle des degrs variables. Ils
inhibent la croissance des autres bactries que Salmonella et donnent des informations sur les principales
caractristiques biochimiques diffrentielles - habituellement labsence de fermentation du lactose et la
production de sulfate dhydrogne (H2S). Les rsultats sont lus aprs 24 et 48 h dincubation 37C. Les
salmonelles forment des colonies caractristiques sur de tels milieux qui sont habituellement distinguables des
autres bactries de la bote, avec certaines exceptions pour Proteus, Pseudomonas et Citrobacter. Les
salmonelles fermentant le lactose peuvent parfois tre isoles et la production dH2S peut tre variable. De telles
souches atypiques peuvent tre plus facilement dtectes quand un milieu slectif semi-solide est utilis. Le
milieu DIASALM est particulirement utile dans ce cas. La confirmation par agglutination sur lame en utilisant
des antisrums polyvalents O ou H ou des antisrums spcifiques peut tre ralise sur la zone de croissance
liquide de la bote. Salmonella Abortusovis est un srovar croissance lente et il est frquent dincuber les bote
jusqu 72 h et dutiliser des gloses au sang non slectives. Des exemples de milieux slectifs sont la glose

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Chapitre 2.10.3. Salmonelloses

au vert brillant, la glose au xylose lysine dsoxycholate, la glose au doxycholate/citrate, la glose Rambach,
et la glose au sulfate de bismuth, et bien dautres encore peuvent tre identifies dans la littrature et les
catalogues de milieux de cultures.

Identification des colonies suspectes (caractristiques)

Les colonies suspectes sont mises en culture sur des gloses slectives et non slectives pour sassurer labsence
de contaminants tels que Proteus spp. En prsence dune culture pure abondante, les colonies suspectes peuvent
tre testes par agglutination sur lame laide de srums polyvalents pour le typage des Salmonella (22, 32). Dans
certains cas, la colonie suspecte peut ne pas donner dagglutination et il est ncessaire dutiliser des tests
biochimiques pour confirmer lidentit. Ces tests peuvent tre raliss en eau peptonne additionne de sucres ou
laide de systmes commerciaux (tels que le systme API (Analytical Profile Index) ou des milieux composs (tel que
la glose TSI [Triple Sugar Iron]) peuvent tre utiliss pour lidentification des micro-organismes (11).
La dtermination des facteurs antigniques O et H, et dans certains cas de lantigne Vi, est ralise par agglutination
directe sur lame ou par agglutination en tube en utilisant des antisrums spcifiques. En cas de micro-organisme
biphasique, il est ncessaire de dterminer les 2 phases par inversion de phase - cela entrane un passage en glose
semi-solide contenant lantisrum correspondent la phase connue. Lorientation est facilite par la disponibilit
dantisrums dirigs contre plusieurs facteurs, qui peut ensuite tre poursuivie par lutilisation de srums de typage
monovalent. Bien que la plupart des laboratoires peuvent identifier les srotypes les plus frquents, il est ncessaire
davoir recours un Laboratoire de rfrence pour confirmer lidentit dun isolat et lorsque cela est possible pour
obtenir une information sur le lysotype, si un schma est disponible, et le profil gntique.
Des tests biochimiques additionnels peuvent tre ncessaires pour identifier certains variants de srotype, par
exemple le d-tartrate qui permet de diffrencier S. Paratyphi B var. Java de S. Paratyphi B. Les isolats peuvent aussi
tre tests pour leur sensibilit aux antibiotiques.

Mthodes didentification immunologiques et molculaires

De nombreuse mthodes alternative sont utilises et commercialement disponibles (3, 5, 7, 27, 35, 36, 38, 40, 47).
Elles comprennent des mthodes bases sur la conductance et limpdancemtrie, sur la sparation
immuno-magntique, sur les techniques de type immuno-enzymatique (ELISA), sur des sondes gniques pour
raliser une amplification en chane par polymrase (PCR) incluant lamplification de squences nucliques (NASBA)
(15). Plusieurs de ces mthodes nont pas t valides sur des chantillons fcaux ou prlevs dans lenvironnement
et, en outre, elles sont plus adaptes lanalyse des chantillons alimentaires destins lalimentation humaine
(31). Les mthodes rapides sont souvent plus coteuses que la mthode bactriologique conventionnelle, mais
peuvent tre conomiquement intressantes pour le tri dchantillons lorsquil existe une faible prvalence de
contamination ou lorsque les produits tels que les produits pour lalimentation animale sont attendus tre ngatifs au
test. Actuellement, aucune mthode rapide nest capable de raliser une dtection directe des Salmonella, si bien que
des tapes denrichissement slectif ou non slectif sont ncessaires (29). Ceci entrane plus dtapes et ncessite
du temps dans la procdure de dtection. Pour les mthodes bases sur la dtection de lADN, linhibition de la
raction PCR par des lments de la matrice prsents dans lchantillon pose problme et ncessite des extractions
dADN adaptes (20). Des mthodologies rapides disolement peuvent tre lies des systmes sophistiqus de
dtection, telles que les biosensors (30). Il y a beaucoup de variations et de dveloppements de mthodes rapides
pour la dtection des Salmonella mais aucune na montr de faon satisfaisante quelle pouvait remplacer la culture
de lchantillon vtrinaire dans toutes les circonstances. Cest pourquoi il nest pas possible de dtailler toutes les
mthodes dans ce chapitre ou de faire des recommandations, mais les articles cits ci-dessus donneront de plus
amples informations. Les recherches sur internet sont aussi une source utile dinformation. Des efforts sont
actuellement en cours pour standardiser lutilisation de certaines mthodes rapides au niveau international (24), mais
il reste encore un travail considrable faire.

Exemple de procdures pour lisolement Salmonella partir de produits alimentaires pour

lhomme et lanimal, dchantillons fcaux et de lenvironnement
i)

Ajouter 10 25 g dchantillon 10 volumes deau peptonne tamponne temprature ambiante.

(NB : pour de nombreux srovars adapts lhte et pour certains srovars arizonae, il est prfrable
dajouter lchantillon le milieu slectif denrichissement tel que le bouillon slnite cystine, et de tester
des chantillons de tissus si cela est possible [incluant lisolement direct] ; voir la mthode de culture pour
S. Pullorum/Gallinarum dans le Chapitre 2.7.5. de ce Manuel terrestre).

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Chapitre 2.10.3. Salmonelloses

ii)

Incuber leau peptonne tamponne 37C pendant 16 20 h ;

iii)

Ensemencer 20 ml de Rappaport-Vassiliadis modifi semi-solide ou DIASALM dans une bote de Petri

avec 0,2 ml du bouillon deau peptonne tamponne incube ;

iv)

Ensemencer 10 ml de bouillon ttrathionate avec 1 ml de bouillon deau peptonne tamponne incube ;

v)

Incuber les bouillons Rappaport-Vassiliadis modifi semi-solide ou DIASALM 41,5C et ttrathionate

37C (sassurer que la marque du ttrathionate est adapte pour une utilisation 37C) ;

vi)

Aprs 24 et 48 h denrichissement slectif, isoler le Rappaport-Vassiliadis modifi semi-solide ou DIASALM

en prenant laide dune anse 1 l de produit partir de la priphrie de la zone de croissance et isoler en
stries une bote de glose Rambach ou de glose au vert brillant et une bote de glose xylose lysine
desoxycholate additionne de novobiocine ;

vii)

Isoler 10 l du bouillon ttrathionate sur une glose Rambach ou une glose au vert brillant et sur une
glose xylose lysine desoxycholate additionne de novobiocine ;

viii) Incuber les botes 37C pendant 24 h ;

ix)

Vrifier jusqu 5 colonies suspectes (rouge/rose avec un rougissement du milieu sur la glose au vert
brillant, cramoisi avec les bords ples ou orange/transparentes sur la glose Rambach, rouge avec un
centre noir xylose lysine desoxycholate) en utilisant les srums poly O et poly H (phase 1 et
phase 2) ou des milieux biochimiques composs ;

x)

Une culture de colonies hautement suspectes qui ne donnent pas de ractions dagglutination avec les
antisrums poly H sur des milieux non slectifs doit tre re-teste. Si une agglutination franche avec les
poly O et poly H peut tre obtenue, ceci est suffisant pour une confirmation prsomptive. De tels
isolats peuvent ensuite tre srogrouper. Si le rsultat de lagglutination nest pas clair, il faut procder aux
tests biochimiques en utilisant les milieux composs tels que le TSI ou les tests ONPG (o-nitrophenyl-betad-galactopyranoside) et de lure ou des tests biochimiques commerciaux tels que la galerie API ID 32 E.

2.

preuves srologiques

Identification srologique des animaux, levages et troupeaux infect

Un certain nombre dpreuves srologiques ont t dvelopps pour le diagnostic dinfection Salmonella chez
lanimal. En volaille, le test sur sang total, qui utilise un antigne color, et le test dagglutination du srum SAT
(Serum Agglutination Test) ont t utiliss avec succs depuis plus de 50 ans pour lidentification des levages
infects par S. Pullorum/Gallinarum. Du fait que S. Enteritidis possde le mme groupe antignique somatique D que
S. Pullorum/Gallinarum, le test sur sang total et les tests relis peuvent tre utiliss pour le diagnostic de linfection
mais la sensibilit est faible. Plus rcemment, dautres tests tels que les ELISA (2, 41) ont t dvelopps pour le
diagnostic dinfections S. Enteritidis et S. Typhimurium en volaille et pour dautres srovars pour les animaux
dlevage. Les tests ELISA ont t utiliss efficacement pour identifier les bovins srologiquement porteurs de
S. Dublin et peuvent tre appliqus au lait de mlange pour le dpistage dans les levages laitiers. Le mix-ELISA est
utilis au Danemark sur le srum ou le liquide provenant des chantillons de muscle congels qui sont dcongels
pour dtecter les infections Salmonella chez le porc (26). Un test similaire est utilis pour la dtection danticorps
dirigs contre S. Enteritidis et S. Typhimurium dans le jaune duf partir des levages commerciaux de poules
pondeuses (12).
Certains tests ELISA sont maintenant utiliss en routine et un certain nombre sont commercialement disponibles.
Lobjectif de cette section est de prendre en considration les preuves srologiques qui ont t pleinement values
et utilises en routine pour le diagnostic dune salmonellose chez lanimal. Dautres preuves qui sont encore au
stade du dveloppement ne seront pas examines. De nouvelles preuves sont frquemment dveloppes pour le
diagnostic Salmonella, une recherche sur internet est souvent le meilleur moyen dobtenir des informations
actualises.

Facteurs impliqus dans le diagnostic srologique

1.

Des mthodes srologiques peuvent tre utilises pour identifier un levage/troupeau infect plutt que
didentifier individuellement un animal infect, bien que des tests rpts puissent tre utiliss en levage
comme une aide dans llimination slective des animaux porteurs chroniques. Des preuves srologiques sont
habituellement connues pour dtecter un nombre limit de srovars ou de srogroupes de Salmonella.

Manuel terrestre de lOIE 2005

1123

Chapitre 2.10.3. Salmonelloses

2.

Il est maintenant bien reconnu que certains animaux prsentant une rponse positive peuvent ne plus tre
infects avec le micro-organisme Salmonella. De mme et linverse, des animaux qui sont excrteurs actifs de
salmonelles, peuvent tre srologiquement ngatifs. Des observations similaires peuvent aussi tre appliques
aux mthodes de cultures bactriologiques, et des rsultats ngatifs de culture de fces peuvent ne pas signifier
automatiquement que lanimal nest pas infect. Nanmoins, aucune de ces situations ne doit tre considre
comme un problme majeur si suffisamment de tests sont raliss. Des animaux qui sont srologiquement
positifs peuvent avoir cesss dexcrter des salmonelles bien que des taux levs dimmunoglobulines puissent
circuler. Dautres animaux de llevage peuvent tre encore infects. Des animaux srologiquement ngatifs
peuvent tre la consquence dune infection rcente avec une excrtion avant la production maximale
dimmunoglobulines ou dinfection avec des srotypes moins invasifs. Des animaux infects rcemment
devraient, en toute probabilit, tre dtects srologiquement par un programme de surveillance appropri
durant toute la dure de vie de llevage/troupeau.

3.

Les animaux nouveau-ns sont immunologiquement immatures et ne rpondent pas srologiquement au LPS
de lantigne somatique jusqu lge de 2 3 semaines. Ils doivent, nanmoins, produire une rponse
srologique la protine de lantigne flagellaire. Les bovins peuvent ne pas donner de rponse jusqu lge de
10 12 semaines.
Les poulets peuvent aussi acqurir des anticorps anti-Salmonella passivement partir des parents par
lintermdiaire de la vsicule ombilicale ; cela peut signifier un levage de parentaux infects. Les mammifres
peuvent acqurir les anticorps maternels par le colostrum.

4.

Suite une infection Salmonella, le taux dimmunoglobulines peut se maintenir lev pendant 2 3 mois. Une
rponse IgM indique une infection rcente.

5.

Limmunisation a t utilise depuis de nombreuses annes pour contrler linfection Salmonella dans les
levages, et si le diagnostic srologique est utilis, il est ncessaire de diffrencier la rponse vaccinale dune
infection en cours. Beaucoup de vaccins vivants par voie orale ne donnent pas de rponse significative en
anticorps.

6.

Les effets de lantibiothrapie sur la rponse srologique restent peu clairs. Certains travaux ont trouvs des
titres diminus suite une thrapie, alors que dautres ne trouvent aucun effet. La srologie peut nanmoins
tre une technique de diagnostic de salmonellose plus utile que la bactriologie si lantibiothrapie a t utilise.

7.

Il existe approximativement 2 500 srovars diffrents de Salmonella. En fonction de lantigne et du test utilis,
des ractions srologiques croises entre diffrent srovars peuvent se produire, par exemple entre
S. Typhimurium and S. Enteritidis.

8.

Chez les volailles, la recherche dimmunoglobulines Salmonella peut tre ralise sur le jaune doeuf et les
ufs peuvent fournir une mthode pour le dpistage chez les troupeaux. Cette approche est utilise pour la
surveillance des levages de poules pondeuses au Danemark. Chez les bovins, les anticorps anti-Salmonella
peuvent tre recherchs dans le lait afin de raliser un dpistage quotidien parmi le troupeau.

9.

Lemploi de disques de papier filtre pour la collection de srums limine la ncessit de sparer le srum. Les
disques fournissent une conservation long terme et diminue le cot du transport au laboratoire. La sensibilit
du test peut tre lgrement diminue compare aux tests effectus sur des srums frais.

a)

Test sur sang total

Le test sur sang total fourni un test rapide de dtection de la typhode aviaire et de linfection pullorum qui peut
tre mis en uvre la ferme. La sensibilit du test sur sang total est faible et des rsultats faux positifs et faux
ngatifs lis linexprience peuvent survenir.
Une description dtaille du test sur sang total est donne dans le Chapitre 2.7.5. concernant la typhode aviaire
et linfection Pullorum.

b)

Test rapide dagglutination sur lame

Le srum (0,02 ml) est mlang avec un antigne polyvalent color au cristal violet (0,02 ml). Le mlange est
doucement agit pendant 2 min, aprs cela le test est lu. Les ractifs du test sont gards 4C doivent tre
remis temprature ambiante avant dtre utiliss.

1124

Manuel terrestre de lOIE 2005

Chapitre 2.10.3. Salmonelloses

Les srums tester doivent tre exempts de contamination ou dhmolyse. Il peut tre utile de raliser une
centrifugation des chantillons qui ont t conservs pendant un certain temps.
Si des ractions faussement positives non spcifiques sont redoutes, les srums suspects positifs doivent tre
re-tests aprs un traitement la chaleur 56C pendant 30 min.

c)

Test dagglutination du srum

Le SAT est relativement peu sensible et beaucoup danimaux gs ont des niveaux faibles dagglutinines dans
leur srum dus aux entrobactries autre que Salmonella. Les chantillons individuels analyss ont peu de
valeur hormis pour effectuer un dpistage dans llevage ou pour faire un tri prliminaire. Pour confirmer une
infection en cours, il est ncessaire danalyser les chantillons en double. Le test est relativement peu coteux ;
les antignes peuvent tre prpars facilement et il nest pas ncessaire de disposer dquipement coteux. Le
SAT peut tre adapt au format des microplaques et peut tre facilement utilis pour dterminer les titres
somatiques et flagellaires. Il est conseill de disposer de srums standards pour le contrle qualit de(s) la
prparation(s) dantignes du SAT.

Prparation des antignes somatiques

i)

Isoler une culture de Salmonella partir dune culture approprie sur une glose au sang (BAB) ou un
autre milieu adapt, pour la croissance de colonies isole. Incuber toute la nuit 37C (2C) ;

ii)

Slectionner une colonie rgulire et raliser une agglutination sur lame de faon vrifier que lantigne
somatique vis est prsent ;

iii)

Inoculer la pente dune glose nutritive laide dune anse strile partir de la colonie slectionne.

iv)

incuber la culture pendant 8 12 h 37C (2C) ;

v)

Laver la culture laide dune pipette Pasteur, de prfrence lintrieur dun espace scuris avec
approximativement 2 ml dalcool absolu et transfrer dans un rcipient universel strile ;

vi)

Laisser lantigne pendant 4 6 h temprature ambiante pour permettre lalcool de tuer les bactries et
de dtacher les flagelles.

vii)

Centrifuger le rcipient universel laide dune centrifugeuse de paillasse pendant 5 min 1 000 g.
Eliminer le liquide et ajouter suffisamment de sel de phnol pour obtenir une opacit dantigne quivalente
au tube de Brown No. 2 (approximativement 108 colonies formant unit/ml) ou un autre standard
appropri ;

viii) Raliser le titrage standard avec un srum connu pour sassurer que lantigne correspond au facteur
souhait ;
ix)

Garder au froid 4C jusqu lutilisation.

Prparation des antignes flagellaires

i)

Isoler une culture de Salmonella partir dune culture approprie sur une glose au sang (BAB) ou un
autre milieu adapt, pour la croissance de colonies isoles. Incuber toute la nuit 37C (2C) ;

ii)

Raliser un passage en glose semi-solide ( approximativement 0,3 %) dans un tube de Craigie, ou un

autre rcipient adapt pour induire une expression optimale des antignes flagellaires viss. Si le srovar
est biphasique, un antisrum H correspondant la phase que lon souhaite supprimer est ajout la
glose ;

iii)

Utiliser lagglutination sur lame pour vrifier que la salmonelle est dans la phase souhaite. Si cela est
correct, inoculer une anse de culture dans 20 ml de bouillon nutritif. Incuber pendant 12 18 h 37C
(2C) pour une croissance optimale (si la phase est incorrecte, refaire un passage sur glose
semi-solide) ;

iv)

Pipetter 250 l de 40 % formol dans la suspension antignique (utiliser des gants et travailler de prfrence
en poste de scurit), et laisser une nuit ;

v)

Tester lantigne par le SAT en utilisant un srum test appropri ;

Manuel terrestre de lOIE 2005

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Chapitre 2.10.3. Salmonelloses

d)

Protocole

i)

Il est plus facile de tester les srums une dilution de 1/20 ; 0,25 ml dantigne est additionn 0,25 ml de
srum pr-dilu au 1/10 dans une solution saline ;

ii)

Les chantillons sont incubs au bain Marie 50C pendant 24 h dans le cas des antignes somatiques et
pendant 4 h pour les antignes flagellaires. La dilution et le temps dincubation peuvent varier selon les
antisrums utiliss ;

iii)

Les srums donnant une raction positive sont dilus au 1/20 jusquau 1/320 et retests avec les antignes
appropris.

Mthodes immuno-enzymatiques pour Salmonella Enteritidis

Deux principaux types de mthodes existent pour la dtection des IgG (IgY) spcifiques de S. Enteritidis :
lELISA indirect (2) et la mthode ELISA comptitive de type sandwich (41).
Le test ELISA indirect comprend lutilisation dun antigne de dtection fix sur les puits de la microplaque.
Aprs lapplication dun ractif de blocage de la raction pour rduire la fixation non spcifique, les chantillons
tester sont introduits dans les puits. Un lien spcifique lanticorps de lchantillon est dtect par laddition dun
anticorps coupl un conjugu enzymatique. Diffrents antignes comprenant le LPS, les flagelles, les fimbriae
SEF14, les protines de la membrane externe et des prparations dextrait dantignes cellulaires ont t
utiliss.
La mthode ELISA de comptition de type sandwich utilise un ractif spcifique un anticorps monoclonal
(AcM) ou polyclonal pour la fixation de lantigne aux puits. Ceci est suivi par une prparation dantigne
purifie ou non. Les chantillons sont tests suivi de laddition dun anticorps conjugu, qui ne se fixera pas
lantigne si lchantillon contient les anticorps spcifiques. La dure de lessai peut tre raccourcie en ajoutant
ensemble lchantillon tester et le conjugu. Les AcMs ont t prpars pour le LPS, les flagelles et le
SEF14 de S. Enteritidis.
Les 2 systmes prsentent des avantages et des inconvnients. Lessai indirect est plus simple et les ractifs
sont disponibles pour tous les srotypes de Salmonella provenant de poulet, dinde, canard et de mammifres.
LELISA de comptition peut tre appliqu toutes les espces animales et il montre, en gnral, une spcificit
plus importante. Quoiquil en soit, les ractifs ne sont pas commercialement disponibles pour tous les srotypes.
Il y a aussi des problmes daffinit et il peut tre moins sensible que le test indirect. En pratique, les 2 systmes
ont montr des ractions faussement positives et dans certains cas le tri avec un test ELISA indirect sur le LPS
peut tre suivi dune confirmation avec un ELISA de comptition sur les flagelles.
Les mthodes peuvent tre utilises avec du srum, du jaune doeuf ou du sang sch reconstitu partir de
disque de papier filtrer. Un ELISA mixte (ou ELISA sur jus de viande) est utilis au Danemark pour dtecter
linfection chez le porc (28). Cet ELISA contient les antignes LPS O 1, 4, 5, 6, 7 et 12, de S. Typhimurium et
de S. Choleraesuis, qui rend ce test capable de dtecter srologiquement plus de 95 % des srogroupes de
Salmonella trouvs chez les porcs danois. Le srum est utilis pour effectuer un dpistage dans les levages de
multiplication et les troupeaux reproducteurs alors qu labattoir, le test est ralis sur le liquide tissulaire (jus de
viande) qui est libr lorsque 10 g dun chantillon de muscle congel est dcongel.
Avec certains ELISAs, une diffrenciation peut tre faite entre les infections produites par des srotypes de
Salmonella appartenant diffrents srogroupes. Certaines ractions croises peuvent se produire entre les
groupes B et D et dautres srovars invasifs. Nanmoins, il y a habituellement une rponse srologique plus
grande lorsque le LPS dun srotype homologue est utilis dans le test ELISA. La mthode optimale pour choisir
le seuil de la valeur dabsorbance, au del de laquelle les srums sont considrs comme provenant dun
troupeau infect S. Enteritidis sans produire des taux inacceptables de faux positifs, na pas encore t fixe
par un accord international.
Les ELISAs sont facilement adaptables lautomatisation et par consquent des programmes de contrle
grande chelle. Un problme majeur est lquipement coteux ncessaire et beaucoup de ractifs sont aussi
trs coteux. Plusieurs trousses de diagnostic ELISA pour S. Enteritidis, S. Typhimurium et un ELISA mixte pour
le groupe B/C sont commercialement disponibles. Ils devraient idalement tre valids par des essais circulaires
internationaux avant dtre adopts des fins de surveillance.

1126

Manuel terrestre de lOIE 2005

Chapitre 2.10.3. Salmonelloses

Un exemple dELISA valid est celui dvelopp au Laboratoire de rfrence de lOIE au VLA de Weybridge (voir
Tableau dans la partie 3 de ce Manuel terrestre pour ladresse). Les exigences sont mentionnes ci dessous.

quipement

Plaques en PVC de type Falcon microtest III ; des pipettes adaptes et des prouvettes ; laveur de plaques ;
lecteur de plaques ELISA ; filtre pour le test 405-410 nm et filtre de rfrence 630 nm.

Antigne

i)

Lextrait au phnol de LPS de S. Enteritidis est commercialement disponible (Sigma Cat. No. L6011).
Celui-ci est reconstitu avec 1 ml deau dsionise et conserv 20C dans 100 l en aliquots dans une
solution physiologique tamponne au phosphate (PBS), pH 7,2, une concentration de 2,5 mg/ml. Lors de
lutilisation, lantigne sera dcongel dans le tampon de fixation la concentration approprie ;

ii)

Lantigne LPS peut aussi tre prpar par la technique de Westphal & Luderitz (43) et standardis pour
sa concentration en carbohydrate, selon la mthode de Gerhardt (14), et ajust 1 000 g/ml.

Diluant du srum et du conjugu

Ajouter la srumalbumine bovine (BSA) (2 g) et le Tween 20 (0,05 ml) au PBS (100 ml) (alternativement, la
poudre de lait [1 g] peut remplacer le BSA). Conserver 4C et faire une solution frache toutes les semaines.
Tampon de fixation : ajouter du carbonate de sodium (1,59 g) et du bicarbonate de sodium (2,93 g) leau
dsionise (1 litre) et ajuster au pH 9,6 (alternativement, dissoudre un comprim de 0,05 M Sigma de tampon
carbonate/bicarbonate [Cat. No. C-3041] dans leau dsionise [100 ml]). Conserver 4C et renouveler toutes
les 2 semaines.
Tampon du substrat : faire une solution de dithanolamine 10 % dans leau dsionnise. Le diethanolamine
doit tre prchauff 37C avant de lutiliser et le pH de la solution doit tre ajust pH 9,8 avec 1 M dacide
hydrochlorique. Conserver 4C et renouveller toutes les 2 semaines.
Conjugu enzymatique : immunoglobulines anti-poulet de chvre conjugues la phosphatase alcaline (par
exemple ICN Immunobiologicals, fournisseur alternatif Sigma: A9171) ou globulines anti-poulet dautres
espces. Conserver 4C dilu dans le diluant une concentration approprie et renouveler chaque semaine.
Substrat enzymatique : Dissoudre un comprim de phosphate disodique de p-nitrophnyl (5 mg) dans le tampon
du substrat (5 ml) pas plus de 30 min avant la rpartition et conserver lobscurit.

Standards

i)

Les antisrums tmoins positifs sont prpars par inoculation intramusculaire de 4 poulets gs de
1 semaine et exempts dorganismes pathognes spcifiques (EOPS) avec un inoculum contenant
106 S. Enteritidis. Le srum est alors obtenu 3 4 semaines plus tard quand les titres sont maximaux ;

ii)

Le srum A tmoin ngatif provient de 4 oiseaux EOPS gs de 1 semaine ;

iii)

Le srum B tmoin ngatif provient de 58 oiseaux dlevage gs de 1 semaine et connus pour tre
indemnes dinfections Salmonella. Les srums sont mlangs et conservs dans 100 l 20C.

C. SPCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES

USAGE DIAGNOSTIQUE
Beaucoup de vaccins inactivs sont utiliss contre les salmonelloses causes par diffrents srovars chez diffrentes
espces animales, comprenant un vaccin combin S. Enteritidis et S. Typhimurium pour un usage chez les
volailles. Linactivation est gnralement obtenue soit par chauffage soit par lutilisation de formol et dun adjuvant tel
que lalhydrogel, frquemment utilis. Les vaccins vivants ont galement t utiliss dans de nombreux pays ; ils
comprennent les souches semi-rough tels que 9R pour la typhode aviaire et HWS51 pour les infections S. Dublin
(26). Dautres vaccins attnus contiennent des mutants auxotrophes, qui sont souvent utiliss pour prvenir les
infections Salmonella chez lanimal dlevage en Allemagne et pour S. Enteritidis au Royaume-Uni. Des vaccins de
mutants raisonnablement attnus par des techniques de biologie molculaire de dltion de gnes ont t

Manuel terrestre de lOIE 2005

1127

Chapitre 2.10.3. Salmonelloses

dvelopps pour la volaille et dautres espces ; ils comprennent les aroA mutants et les souches avec des mutations
dans les gnes codant ladnylate cyclase (cya) et la protine du rcepteur monophosphate cyclic (crp) (6), qui est
disponible aux tats-Unis dAmrique. En Europe, les organismes gntiquement modifis ne sont normalement pas
autoriss pour les vaccins.
Les lignes directrices pour la production de vaccins vtrinaires sont indiques dans le Chapitre I.1.7., Principes de
fabrication des vaccins usage vtrinaire . Les lignes directrices donnes ici et dans le Chapitre I.1.7. sont
gnrales et peuvent tre compltes par des exigences nationales ou rgionales.

1.

Gestion des semences bactriennes

a)

Caractristiques de la semence bactrienne

Pour les vaccins inactivs ou vivants, la souche bactrienne doit tre un organisme le plus proche possible des
souches de terrain circulant. Elle doit tre choisie avec attention partir des cas cliniques et sa virulence et sa
production dantigne doivent tre estimes. Il est prfrable de tester un panel de souches potentielles dans ce
but avant de tester la slection finale. La souche vaccinale finale doit tre identifie par des donnes historiques
et caractrise par des marqueurs phnotypiques et/ou gnotypiques stables. Les souches vaccinales vivantes
doivent tre marques par des caractres stables permettant la distinction davec les souches sauvages. Des
marqueurs tels que la rsistance aux antibiotiques, par exemple la rifampicine peuvent tre utiliss.
Lattnuation de la virulence doit tre stable et obtenue de prfrence par 2 mutations indpendantes.

b)

Mthode de culture
La culture est propage et maintenue en utilisant des milieux adapts, parmi lesquels beaucoup ont t dcrits
(se reporter la littrature scientifique sur le sujet) pour la croissance de Salmonella. Les milieux utiliss ne
doivent pas contenir de srums ou de tissus dorigine animale. Les cultures peuvent se raliser sur des milieux
solides, en flacon de Roux, ou en milieu liquide, auquel cas des quipements de fermentation large chelle
peuvent tre utiliss. La restriction en fer ou lincubation basse temprature sur un milieu minimal peut
augmenter la production dantigne LPS par la souche vaccinale.

c)

Validation de la semence candidate comme semence vaccinale

i)

Puret
La souche vaccinale doit tre vrifie selon les critres suivants :

ii)

Coloration dun talement dune suspension bactrienne sur une lame de verre par la coloration de
Gram.

Homognit de la culture sur milieu non slectif.

Exigences mtaboliques comme celles indiques par les tests biochimiques.

Dtection des marqueurs et lysotypie.

Agglutination avec des srums spcifiques.

Innocuit
La DL50 (50 % de la dose ltale) ou DI50 (50 % de la dose infectieuse) doivent tre dtermines sur la
souris. Dix fois la dose vaccinale vivante de terrain et 2 fois la dose du vaccin inactiv doivent tre
administres des espces cibles avec des exigences dge et de voies dadministration. Les animaux
sont maintenus en observation. La stabilit et la non rversibilit de la virulence doivent tre dmontres
pour les vaccins vivants aprs plusieurs passages sur des espces sensibles. Il est aussi ncessaire de
considrer les vaccinations rptes. Les vaccins vivants doivent montrer quils ne persistent pas
longtemps chez lanimal vaccin ou quils ne sont pas transmis au lait ou luf qui pourraient tre
consomms, et les mthodes dutilisation ne doivent pas prsenter de danger pour loprateur.

iii)

Efficacit
Les analyses de laboratoire et les essais de terrain doivent tre utiliss pour montrer que le vaccin est
effectif. Les essais de laboratoire consistent raliser des tests dinfection pour apprcier la vaccination
dans lespce cible la dose et la priode recommande. Les rsultats defficacit peuvent aussi tre
utiliss comme base pour une srie de test dactivit. Les essais de terrain sont plus intgrer dans les
tests dactivit du fait de la difficult de standardiser lessai et dobtenir des tmoins appropris.

1128

Manuel terrestre de lOIE 2005

Chapitre 2.10.3. Salmonelloses

iv)

Aspects environnementaux
Les souches de vaccins vivants doivent tre testes pour leur possibilit de survivre dans lenvironnement
et dinfecter des cibles non spcifiques, telles que les rongeurs et les oiseaux sauvages, qui peuvent y tre
exposes. Une persistance prolonge de vaccins vivants dans les fces et la litire peut tre considre
comme un risque inacceptable pour lenvironnement lorsque ces matriels sont enlevs des btiments.

2.

Mthode de fabrication

Les vaccins doivent tre produits dans des locaux adapts propres dans lesquels ont accs seulement les personnes
autorises. Des prcautions doivent tre prises pour viter les contaminations croises entre les zones o
lorganisme est vivant et les autres zones. Il ne doit y avoir aucune contamination des oprateurs et/ou de
lenvironnement et la prparation vaccinale doit tre localise dans une zone spare du travail de diagnostic sur
culture. Les oprateurs ne doivent pas travailler avec les vaccins lorsquils sont malades et ne doivent pas tre
sensibles aux conditions dimmunosuppression ou aux mdicaments. Le personnel doit porter des vtements de
protection en zone de production et dans les animaleries.
Les lots de cultures sont prpars partir dun lot primaire et le nombre de passages dpend de la validation du
procd. Les vaccins peuvent tre prpars par inoculation dun milieu adapt, tel quun bouillon nutritif, avec une
culture frache et une incubation 37C pendant 24 h, avec ou sans oxygnation. Les organismes sont rcuprs par
sdimentation ou centrifugation. Alternativement, les organismes peuvent tre mis en culture et rcuprs sur un
milieu solide, tel que la glose nutritive. Dans le cas de vaccin vivant, la suspension est dilue en PBS, pH 7,0, et
peut tre congele dshydrate.
Le temps dinactivation dun vaccin inactiv doit tre au moins de 33 % de plus que celui ncessaire la diminution
dun nombre viable de cellules jusqu un taux indtectable. Le procd dinactivation doit tre appliqu lensemble
du volume des cellules vaccinales collectes.
Les agents de conservation, les excipients de lyophilisation, les stabilisateurs pour les conteneurs multidose ou les
autres substances ajoutes ou combins avec la prparation vaccinale ne doivent pas avoir deffets dltres sur le
potentiel immunogne du produit.

3.

Contrles en cours de fabrication

Les points suivants doivent retenir lattention :

Contrle visuel de la suspension, homognit par la coloration de Gram, culture sur milieu non slectif.

Agglutination sur lame par des antisrums spcifiques.

Titrage des bactries par turbidimtrie et/ou dnombrement sur bote.

Test dinactivation effective (vaccin inactiv) par isolement sur milieu non slectif ou utilisation dun milieu qui
donne une chance optimale de culture, par exemple milieu de production avec neutralisation des agents
dinactivation.

Titrage des bactries viables (vaccin vivant) avant et aprs lyophilisation.

4.

Contrle des lots

a)

Strilit
Les tests de strilit et dabsence de contamination des matriels biologiques peuvent tre trouvs au Chapitre
I.1.5., Contrle de la strilit ou de labsence de contamination des matriels biologiques .

b)

Innocuit
Un test de laboratoire sur souris qui a montr prcdemment une corrlation avec linnocuit sur les espces
cibles peut tre utilis pour dterminer la DL50 et/ou la DI50. Chaque lot doit tre test sur les espces cibles la
priode et aux voies dadministration recommandes, en utilisant au moins 2 fois la dose de terrain pour les
vaccins inactivs et 10 fois pour les vaccins vivants.

Manuel terrestre de lOIE 2005

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Chapitre 2.10.3. Salmonelloses

c)

Activit
Lactivit est test par une preuve dinfection pour apprcier la vaccination sur souris et/ou autres espces,
comprenant (si possible) les espces cibles et la rponse immunologique des espces cibles.

d)

Dure de limmunit
La priode dimmunit est probablement variable selon les produits, les rgimes de vaccination et les individus
vaccins. Limmunit Salmonella est normalement spcifique du srogroupe. Des consultations auprs de
collgues suggrent que les vaccins inactivs procurent une protection de 6 mois, alors que les vaccins vivants
apportent une immunit plus longue, qui peut aller jusqu 1 an ou plus. Il doit tre rappel, toutefois, quune
pression dinfection forte, telle que celle observe dans une ferme continuellement contamine ou lors de
rongeurs continuellement infects, peut dborder limmunit vaccinale.

e)

Stabilit
Les informations manquent sur la stabilit des vaccins inactivs. La stabilit peut varier selon les conditions de
conservation et par la prsence de micro-organismes contaminants poussant dans le produit. La stabilit est
value par des tests dactivit rpts un intervalle de temps appropri. La stabilit des vaccins vivants peut
tre donne par la ralisation de dnombrement des organismes viables rpt des intervalles de temps
appropris.

f)

Agents de conservation
Des produits chimiques avec une activit antimicrobienne tels que le thiomersal, le phnol ou le crystal violet,
sont souvent inclus comme agents de conservation dans les vaccins bactriens inactivs.

g)

Prcautions d'emploi et mise en garde

Certain vaccins inactivs peuvent occasionnellement engendrer des avortements du fait du LPS prsent et, pour
les mmes raisons, les vaccins virus vivants doivent tre utiliss avec prudence chez les femelles en
gestation. Cependant, Il est souvent ncessaire de vacciner les femelles en gestation afin de permettre le
transfert de limmunit maternelle leur progniture. Il peut tre utile dinclure des tests de recherche
dendotoxine dans le programme dinnocuit de manire ce que les taux puissent tre compars ceux
garantis comme srs dans les tests de double dose. Des vaccins peuvent aussi causer des tumfactions au
point dinjection.

5.

Contrles du produit fini

a)

Innocuit
Les vaccins inactivs sont tests par le test de double dose, et les vaccins vivants sont tests en utilisant 10 fois
la dose sur les espces cibles.

b)

Activit
Si possible, le contrle de lactivit doit tre reli lefficacit du vaccin dans les espces cibles, et des critres
adapts doivent tre appliqus pour valider les lots. Il peut tre possible dvaluer la rponse dun vaccin
inactiv par la rponse danticorps contre O et H produits, quoiquil faille se souvenir que la rponse anticorps
est seulement une part des mcanismes de protection de lhte contre Salmonella. Alternativement, lactivit du
vaccin peut tre obtenue par les effets de la DL50 chez la souris.

D. EXCLUSION COMPTITIVE
La sensibilit linfection Salmonella chez la volaille peut tre rduite sensiblement par un traitement par spray ou
oral avant lexposition (idalement dans lcloserie) avec une culture en anarobie de microflore caecale qui inhibe la
colonisation par Salmonella. Ce traitement est largement utilis dans certains pays mais uniquement comme une aide
la dcontamination dlevage infects de faon persistante entre autres (1, 27).

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Manuel terrestre de lOIE 2005

Chapitre 2.10.3. Salmonelloses

REMERCIEMENT
Des parties de ce chapitre ont t prises ou sont bases sur le chapitre salmonelloses de ldition prcdente du
Manuel terrestre.

RFRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1.

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NB : Il existe des Laboratoires de rfrence de lOIE pour les Salmonelloses (se reporter la liste de la partie 3 de ce
Manuel terrestre ou consulter le site internet de lOIE pour une liste actualise : www.oie.int).

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