PROTOCOLO N 1

CULTURA DE CLULAS E TECIDOS

CURSO:

ANO:

Biologia Marinha e Biotecnologia

Clonagem in vitro de couve-flor

PROTOCOLO

ANO LECTIVO:

2007/2008

SEMESTRE:

1. Introduo
A micropropagao de plantas consiste na regenerao de plantas completas a partir
de pequenos fragmentos de tecido (conhecidos como explantes) colocados em meios
nutritivos esterilizados. Os explantes utilizados podem ter origens muito variadas, permitindo
distinguir-se vrios tipos dentre os quais se destacam os meristemas apicais. As plantas
produzidas a partir de meristemas apicais so rplicas idnticas (clones) da planta me com a
particularidade de serem geneticamente estveis.
A couve-flor uma planta pertencente espcie Brassica oleraceae ou seja a mesma
famlia que as couves. uma planta anual, que se reproduz por semente e que muito
utilizada a nvel de ensino de tcnicas de cultura in vitro devido sua disponibilidade, robustez
e rpido crescimento. Aps 10 dias em cultura j se pode observar crescimento e as
plantinhas ficam completas e prontas a ser transplantadas em cerca de 12 semanas. Estas
tcnicas so utilizadas comercialmente na produo de clones de couve-flor destinados a
produo de sementes.
A formulao dos meios de cultura in vitro varia com a espcie de planta que se est a
tentar crescer. Usualmente estes meios contm:

Todos os minerais e vitaminas necessrios ao crescimento e diferenciao;

Fontes de carbono ou energia pois muitas vezes a fotossntese encontra-se

reduzida;

Reguladores do crescimento que permitem a diviso e diferenciao das clulas;

Agar para solidificar o meio.

Neste caso vamos utilizar o meio de Murashige e Skoog (1962) suplementado com
vitaminas, sacarose e kinetina e solidificado com agar.

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2. Protocolo Experimental
2.1. Objectivos
Clonagem de couve-flor utilizando tcnicas de cultura in vitro em condies asspticas
utilizando meios de cultura com reguladores do crescimento.
2.2. Material e Reagentes Necessrios:
Para cada um dos grupos de trabalho:
Couve-flor (parte branca) fresca
Placas de Petri limpas, pinas e bisturis
100 ml de uma soluo a 20% de lixvia com detergente (Domestos por exemplo)
300 ml de gua destilada esterilizada
4 copos de vidro esterilizados e tapados com folha de alumnio
Copo com 100 ml de etanol
Frascos de cultura com meio de crescimento MS contendo kinetina
Placas de Petri em vidro esterilizadas
Algodo e etanol para desinfeco da cmara de fluxo laminar
Material no fornecido:
Bata, luvas, marcadores de acetato
2.3. Procedimento:
1. Ligar a luz UV da cmara de fluxo laminar durante 15 minutos.
2. Lavar a couve-flor (parte branca) em gua corrente.
3. Utilizando uma placa de Petri como suporte e um bisturi, cortar um fragmento de
couve-flor do tamanho aproximado de uma cereja.

4. Dividir o fragmento em 3 pedaos de tamanho mais ou menos idntico.

5. Colocar os fragmentos (explantes) no copo com a soluo de lixvia e detergente
durante 10 minutos. Este procedimento esteriliza a superfcie dos tecidos. A partir deste
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ponto fundamental trabalhar em condies de esterilidade de modo a evitar

contaminaes, ou seja todos os procedimentos sero realizados na cmara de fluxo
laminar.
6. Desligar a luz UV da cmara de fluxo laminar e desinfectar toda a superfcie com
etanol a 70%. Desembrulhar a pina e bisturi esterilizados e coloc-los no copo com
lcool.
7. Lavar os explants atravs da passagem sucessiva por 3 vezes em gua destilada e
esterilizada. Isto tem como objectivo remover a lixvia e detergente utilizados na
desinfeco, se a lixvia no for devidamente removida os explants no crescero.
Utilizar sempre pinas esterilizadas (mergulhar em lcool, passar chama, deixar
arrefecer) entre cada mudana de copo.

8. O explant pode ser deixado no ltimo copo com gua destilada e esterilizada, desde
que tapado com folha de alumnio esterilizada ou com a tampa de uma placa de Petri
esterilizada.
9. Utilizando como suporte uma placa de Petri, e pinas e bisturis esterilizados, cortar
os tecidos superficiais (cerca de 1mm de espessura) pois provavelmente estaro
danificados.
10. Abrir um dos boies com meio de cultura e colocar os 3 fragmentos de explant
preparados anteriormente no agar em posies equidistantes.
11. Colocar os frascos em cmara de crescimento com iluminao apropriada.
12. Aproximadamente 10 dias depois observar os frascos: o crescimento j deve ser
visvel assim como as possveis contaminaes. Se no ocorrer nenhum crescimento
possivelmente a lixvia no foi devidamente removida da superfcie do explante.
13. Observar regularmente as culturas e remover imediatamente quaisquer recipientes
onde ocorram contaminaes. Os rebentos estaro formados dentro de 6-8 semanas.
Quando atingirem 1-2 cm podem ser colocados em meio de enraizamento (idntico ao
utilizado mas sem kinetina). Os rebentos devero formar razes em 2-3 semanas, aps
o que as plantinhas devem ser lavadas e colocadas em vasos com composto
esterilizado e cobertas com plstico por vrios dias para no desidratarem.
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2.5. Meios de Cultura

2.5.1. Meio de crescimento de couve-flor
Formulao para meio M&S (sigma M0404) ... 4,4 g
Sacarose20 g
Agar ...5 g
Soluo stock de kinetin..2,5 ml
gua destilada at 1000 ml
Aquecer at dissolver o agar completamente aps o que se pode ento dividir o
meio pelos recipientes de cultura.
Autoclavar os recipientes a 121 C durante 15 minutos.
2.5.2. Soluo stock de kinetin
Pesar 0,1 g por 100 ml de gua destilada. A dissoluo em gua auxiliada pela
adio de algumas gotas de uma soluo de hidrxido de sdio concentrada. A
soluo stock deve ser armazenada a 4C.

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