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AGUSTN DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA
QUMICA
GUA DE PRCTICA
BIOQUMICA APLICADA
AUTORES:
AREQUIPA PER
2012
PROLOGO
Los Autores
NDICE
PROLOGO
NDICE
PRCTICA
.............................................................................
DETERMINACIN
ESPECTROFOTOMTRICA
PROTENAS.
1:
DE
PRCTICA
2:
.............................................................................
CONCENTRACIN DE EXTRACTOS PROTEICOS POR
DILISIS.
PRCTICA
3:
.............................................................................
DETERMINACIN DE PROTENAS POR MICROKJELDAHL.
PRCTICA
4:
.............................................................................
SEPARACIN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE
AMINOCIDOS.
PRCTICA
.............................................................................
REACCIONES
DE
IDENTIFICACIN
CARBOHIDRATOS.
5:
DE
PRCTICA
6:
.............................................................................
DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES QUMICAS
DE LAS PROTENAS.
PRCTICA
7:
.............................................................................
METABOLISMO
DE
CARBOHIDRATOS:
FERMENTACIN.
PRCTICA
8:
.............................................................................
INMOBILIZACION
DE
ENZIMAS
Y
CELULAS.
PRODUCCION DE ETANOL POR Saccharomyces
cerevisiae INMOVILIZADA.
PRCTICA
9:
.............................................................................
EXTRACCIN DE ENZIMAS VEGETALES.
PRCTICA
PRCTICA
PRCTICA
10:
.............................................................................
DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN
UREASA.
.............................................................................
CINETICA ENZIMATICA EN UREASA.
.............................................................................
EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLO.
11:
12:
PRCTICA 1
DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE
PROTENAS
I.
OBJETIVO
Determinar la concentracin de una solucin de protenas
mediante la reaccin de Biuret y el espectrofotmetro
II.
FUNDAMENTO:
III.
MATERIALES Y EQUIPO
Espectrofotmetro
Gradilla para tubos de ensayo
Tubos de ensayo
Vasos de precipitado
Probetas, Pipetas
Materiales: peptona, reactivo biuret
IV. PROCEDIMIENTO
Realizacin de una curva patrn: Como se desconoce el
coeficiente de extincin molar () de las protenas coloreadas con el
reactivo biuret, se proceder a construir una curva patrn, midiendo
la absorbancia de soluciones con concentraciones conocidas de
protena, para sobre ella interpolar el valor de Abs de la solucin
problema y determinar su concentracin grficamente y tambin
por regresin lineal. Para ello se dispone de una solucin de 10
mg/ml de protena (peptona) a partir de ella se realizan diluciones
conocidas aplicando la frmula:
Ci x Vi =
Cf x Vf
Donde:
Ci = concentracin de la solucin madre inicial
Vi = volumen a tomar de la solucin madre inicial
Cf= concentracin final de la solucin a preparar
Vf= volumen total final de la solucin a preparar
En 8 tubos de ensayo se preparan, a partir de la solucin madre
(Ci=10 mg/ml) las soluciones de la tabla.
Conc.Fnal.
Sol.a
preparar
Volum
en
Sol.
Madre
inicial
Volum
en
agua
Volume
n
Rx.Biur
et
Volum
en
Final
Tubo
Mg/ml
ml
ml
ml
ml
Blanc
o
0,0
4,0
0,5
3,5
1,0
3,0
1,5
2,5
2,0
2,0
2,5
1,5
3,0
1,0
3,5
0,5
4,0
0,0
Mues
tra
4,0
0,0
Abs
570n
m
e) Limpiar con agua la cubeta, secarla por fuera y medir la Abs del
tubo muestra.
f) Con las medidas obtenidas de los tubos 1 al 8 y el blanco (Abs=0),
se construye una recta en papel milimetrado, representando las
concentraciones en el eje de abscisas y las Abs. en las ordenadas.
g) Interpolar la Abs de la protena problema en la grfica y calcular
su concentracin.
h) Considerando que la absorbancia es directamente proporcional a
la concentracin y que la relacin es lineal: Y = a + b X
(Y
= A + B x Conc.). Utilizando regresin lineal se obtiene el
valor de los coeficientes A y B y se puede despejar concentracin
que en este caso es de la muestra desconocida.
V.
CUESTIONARIO
5.1 Cul es la concentracin de protenas de la muestra?
5.4
VI.
OBSERVACIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
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______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
VII. CONCLUSIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
VIII. BIBLIOGRAFA
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______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
PRCTICA 2
CONCENTRACIN DE EXTRACTOS PROTEICOS
POR DILISIS
I.
OBJETIVO
Aumentar la concentracin de las protenas en un extracto o
solucin que las contenga.
II. FUNDAMENTO
La dilisis es una tcnica que separa las molculas de acuerdo a su
tamao usando membranas semipermeables que contienen poros de
dimensiones menores que las macromolculas que se deseen
separar como las protenas, los poros permiten la difusin de las
molculas de solventes, sales y otras molculas pequeas, pero
bloquean el paso de protenas por su gran tamao.
Se usan membranas de celofn (acetato de celulosa), nitrocelulosa,
colodin, u otras de naturaleza semipermeable.
de
protena
con
el
de
protenas
en
el
V. CUESTIONARIO
Seale las principales tcnicas de separacin de solutos por
membrana, y las principales aplicaciones de cada una de ellas.
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Investigue la composicin qumica de la membrana utilizada y
explicar las razones de su porosidad.
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Efecte los clculos de variacin en el volumen y la concentracin
de la protena en solucin.
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VII. CONCLUSIONES
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______________________________________________________________________
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VIII. BIBLIOGRAFA
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PRCTICA 3
DETERMINACIN DE PROTENAS POR MICROKJELDAHL
I.
OBJETIVO.
Determinar indirectamente el contenido de protenas totales en una
muestra desconocida.
II. FUNDAMENTO
El mtodo de micro-kjeldahl es una simplificacin hecha por HACH
en el proceso Kjeldahl tradicional. Realizando el mismo anlisis en
un tiempo corto y con pequeas muestras.
Se funda en la transformacin del nitrgeno presente en las
protenas a nitrgeno inorgnico. Para ello se siguen tres etapas
claramente diferenciadas
1. En la primera, se digiere el material por accin del cido sulfrico
en presencia de oxidantes fuertes (peroxido de hidrgeno), de
esta manera todo el carbono presente se libera como CO2 y
nitrgeno como NH3, luego este se combina con el exceso de
cido sulfrico para dar sulfato de amonio.
2. En la segunda se destila el amonio, previamente liberado por la
accin de un lcali fuerte Na(OH), el amoniaco liberado se recibe
en una solucin de cido dbil en presencia de colorante
indicador.
3. En la tercera se titula la solucin
cuantificando el nitrgeno presente.
con
un cido
fuerte
DIGESTIN.
Medir 4 ml de muestra liquida (o 0.25 g si es slido) y
colocar en el matraz de digestin
Agregar 4 ml de cido sulfrico concentrado al matraz
Verificar que el control automtico del digestor este en
440C y que haya succin en la columna de fraccionamiento.
Digerir la muestra por 4 min despus de haber alcanzado la
temperatura indicada.
Aadir 10 ml de peroxido de hidrgeno al 50% a la muestra
a travs de un embudo de la columna de fraccionamiento. Si
el digesto no se torna incoloro, aadir porciones adicionales
de 5 ml hasta que el digesto se aclare.
Retirar el matraz del calentador y dejarlo enfriar. Quitar la
columna de fraccionamiento, y colocar el matraz sobre un
bloque y tapar hasta que se haya enfriado.
Diluir el digesto con 50 ml de agua destilada.
DESTILACIN
El digesto obtenido y diluido a 50 ml se traslada a un baln
de destilacin.
Preparar un vaso de 100 ml que contenga 12.5 ml de cido
borrico al 4% ( en volumen) adicionndole indicador azul de
metileno y rojo de metilo, dando una coloracin violeta.
El baln de destilacin que contiene el digesto se aade 13 a
15 ml de hidrxido de sodio al 50% v/v y 2 a 3 granallas de
zinc.
Conectar el equipo de destilacin y destilar el digesto
durante unos 10 a 20 min (hasta que el vaso receptor tenga
una coloracin verdusca y su volumen sea mas o menos 3
veces del volumen inicial)
TITILACIN.
Preparar una solucin de cido sulfrico 0.1 N y valorizarla.
Titular el contenido del matraz receptor hasta que vire de
verde a violeta
IV. CUESTIONARIO
Explique la diferencia entre protenas simples y conjugadas.
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_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
Indique ejemplos y estructuras primarias de dos protenas simples y
dos protenas conjugadas
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_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
VII. BIBLIOGRAFA
PRCTICA 4
SEPARACIN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE
AMINOCIDOS
I.
OBJETIVO:
Aplicar la tcnica de cromatografa en capa fina para la identificacin
de aminocidos presentes en una muestra biolgica.
II.
FUNDAMENTO TERICO:
AMINOCIDOS
Los aminocidos son las unidades estructurales de las protenas.
Por lo tanto, si a una determinada protena se le somete a una
hidrlisis ya sea cida o alcalina; ste proceso rendir una mezcla de
sus aminocidos constituyentes, los cuales pueden ser susceptibles
de ser analizados o identificados por mtodos cromatogrficos.
Todas las protenas son polmeros y los monmeros que se
cambian para formarlos son los a -aminocidos.
identificar
presentes
componentes
en
mezclas
: Slido/lquido
- Fase mvil
: liquido/gas
PROCEDIMIENTO:
Primer Proceso: Sembrado de la muestra
Se siembra los estndares y la muestra con un capilar
bastante fino.
Tener precaucin de que en el sembrado se intenta tener
una mancha entre 1 y 2 mm de dimetro.
La distancia entre las siembras puede ser no menor de 67mm aproximadamente.
Segundo Proceso: Elusin
Una vez sembrada la muestra se procede a la fase mvil con
la ayuda de un solvente de elusin.
Para ello se coloca dentro de una cmara de elusin
PARTE EXPERIMENTAL:
Sembrado de estndares de aminocidos y muestras
Corrida cromatogrfica. Elusin
Mezcla solvente entre fenol: agua (75:25)
Tapar hermticamente y dejar que proceda el desarrollo de la
separacin cromatogrfica, hasta que el solvente haya alcanzado el
frente trazado en la parte superior de la placa.
Revelado del cromatograma
-
Destapar la cmara y retirar con cuidado la placa de vidrio. Secar la placa con ayuda de una secadora de cabello.
Identificacin
Luego proceder a identificar las manchas existentes que debern
corresponder a aminocidos para ello se debern hacer los
clculos de los Rfde los estndares y luego los Rf correspondientes
a las manchas de las muestras.
Rx. Ninhidrina es la reaccin que identifica aminocidos a travs
de una coloracin azul violeta.
V.
CUESTIONARIO:
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.
5.5.
5.6.
5.7.
5.8.
5.9.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_________________________________________________________________
VI.
OBSERVACIONES
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
VII.
CONCLUSIONES
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
VIII.
BIBLIOGRAFA
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_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
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PRCTICA 5
REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS
I.
OBJETIVOS:
Tubos de ensayo
Reactivo Fehling
Pipetas
Reactivo Tollens
Reactivo Seliwanof
Pinzas
Reactivo Barfoed
Bao hirviente
Sol. glucosa 1%
Vaso de precipitados
Sol. fructuosa 1%
Luna de reloj
Sol. sacarosa 1
Sol. lactosa 1%
Sol. almidn 1%
Sol. sacarosa 5%
Sol. HCl
10%
Reaccin de Tollens
En 5 tubos de ensayo colocar a cada uno 1. ml. de Reactivo de
Tollens recientemente preparado, aadir a cada uno 2 ml. de las
soluciones de carbohidratos utilizados anteriormente.
Introducir los tubos en un bao hirviente, observe si hay
formacin de espejo de plata y cuales carbohidratos dan
negativa esta reaccin.
Realice una comparacin de estos resultados con los de la
prueba de Fehling.
Reaccin de Seliwanof
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Seliwanof,
luego aada 3 gotas de solucin de los carbohidratos utilizados
anteriormente, luego lleve los tubos a bao hirviente. Anote el
tiempo en que se colorea cadaa tubo y el color adquirido.
Reaccin de Barfoed
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Bartoed luego
aada 1 ml. de solucin de los carbohidratos utilizados
anteriormente, luego llevar los tubos a bao hirviente y observar
la formacin de un precipitado de color rojo ladrillo, lo que
indicar la presencia de monosacridos.
Los disacridos tambin precipitan xido cuproso, pero muy
lentamente.
Hidrlisis de la Sacarosa
En 3 tubos de ensayo coloque 5 ml. de solucin de sacarosa al
5%, llvelos a bao hirviente y a cada tubo aada volmenes
iguales de agua para el primer tubo, cido clorhdrico al 10% en
el segundo tubo, e hidrxido sdico acuoso al 10% en el tercero.
Calentar los tubos durante cinco minutos y ensaye a
continuacin la reaccin de una porcin de cada mezcla con la
solucin de Fehling. Qu conclusiones deduce?
Ensayo del Almidn frente al Iodo
En un tubo de ensayo coloque 6 ml de solucin de almidn al 1%,
aada una gota de solucin de Iodo - lodurada, observe el color
de la solucin. Luego caliente la solucin coloreada a ebullicin y
observe el efecto, observe tambin qu efecto produce el
enfriamiento de la solucin.
Hidrlisis del Almidn
En un vaso de precipitados coloque 50 ml de solucin de almidn
al 1%, aada 1 ml de cido dorhdrico concentrado. Hierva la
V. CUESTIONARIO:
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.
VI. OBSERVACIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
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VII. CONCLUSIONES
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______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
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VIII. BIBLIOGRAFA
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PRCTICA 6
DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES QUMICAS
DE LAS PROTENAS
I.
OBJETIVOS:
Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de describir y
demostrar de manera cualitativa las propiedades qumicas de las
protenas en base a los siguientes aspectos:
Solubilidad de las protenas.
Las propiedades electroqumicas de las protenas.
El efecto cido-bsico en la solubilidad de las protenas.
II. PRERREQUISITOS:
1. Salting In y Salting Out.
2. Agentes precipitantes de protenas.
3. Propiedades fisicoqumicas del agua.
4. Ecuacin de Henderson-Hasselbach.
III. INTRODUCCIN:
Se considera a las protenas como polmeros biolgicos de
aminocidos. En las protenas existen 20 tipos de aminocidos
diferentes los cuales estn en un nmero y secuencia determinados
por el cdigo gentico.
Con respecto a su tamao, las protenas van desde un peso molecular
de 6000 Dalton hasta varios millones de Dalton con una considerable
variacin de formas y estructuras. Para su estudio se consideran
cuatro niveles de complejidad estructural; siendo la ms simple la
estructura primaria y la ms compleja la estructura cuaternaria cuya
conformacin depende de diferentes fuerzas qumicas de atraccin y
repulsin que son ejercidas sobre la estructura molecular de la
protena y por lo tanto son responsables de su estabilidad.
Por convencin se acepta dividir a las protenas en dos grupos:
protenas simples y conjugadas, las cuales presentan diferencias en
sus propiedades qumicas y fsicas. Sin embargo, para los fines que
se persiguen en esta prctica se les mencionara en forma general.
Los factores que pueden afectar la solubilidad de una protena son:
La fuerza inica del medio, el pH. la temperatura y la constante
dielctrica del solvente. Cuando hay un cambio de cualquiera de
IV. MATERIAL:
13 tubos de ensaye de 10 X 150 mm
1 pipeta de 10 ml
5 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 5 ml
1 gradilla
V. METODOLOGA:
En esta prctica se trata de provocar cambios de solubilidad en
protenas que se encuentran en el organismo, mediante la
modificacin las propiedades de los solventes, para establecer una
relacin con los efectos que se pueden presentar en el organismo.
Fundamento Qumico:
Las protenas poseen cargas positivas y negativas dependiendo del pH
de la solucin
en la cual se encuentran; cuando se neutralizan, se presenta
precipitacin proteica.
La adicin de una sal a una solucin proteica modifica la constante
dielctrica del solvente permitiendo una mayor solubilidad de la
protena. Sin embargo, cuando se aade exceso de una sal, se
neutralizan las cargas de la protena y sta tiende a precipitar. Este
mismo efecto ocurre al aadir sales metlicas cargadas
electropositivamente. Con la adicin de un cido o una base a una
solucin proteica se alcanza un estado en que hay el mismo nmero
de aniones que de cationes. Este efecto, neutraliza la carga de la
protena y tiende a precipitar. El pH que determina el nmero igual
de cargas de signos opuestos se denomina punto isoelctrico.
Experimento No. 1
Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin de
un cido.
Preparar una solucin de caseinato de sodio, tomando 250 mg de
casena, 20 mLde agua destilada y 5 mL de NaOH 1N. Cuando la
solucin sea perfecta, se agregan 5 mL de cido actico 1 N. Mezclar
bien, diluir a 50 mL con agua destilada. Si la solucin no est
suficientemente clara, se puede filtrar.
Preparar los siguientes tuboscomo se indica a continuacin
Tub
o
1
p
H
Agua
destilad
a
8.38
Ac.
Acetico
0.01N
0.62
Ac.
Acetico
0.1
0
Ac.
Acetico
1.0N
0
Casein
ato de
Sodio
1.0
2
3
4
5
6
7
8
9
10
7.75
8.75
8.5
8.0
7.0
5.0
1.0
7.4
5.8
1.25
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0.25
0.5
1.0
2.0
4.0
8.0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1.6
3.2
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
__________________________________________________________________
___________________________________________________
6.2.
6.3.
6.4.
6.5.
6.6.
6.7.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________________________________
6.8.
VII. OBSERVACIONES
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
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_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
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_______________________________________________________________________
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VIII. CONCLUSIONES
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
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________________________________________________________________
IX. BIBLIOGRAFA
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_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
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________________________________________________________________
PRCTICA 7
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS:
FERMENTACIN.
I.
OBJETIVOS
1) Observar experimentalmente los fenmenos de respiracin
celular anaerbica (fermentacin) en levaduras.
2) Comprobar el efecto de inhibidores de la gliclisis y de la
respiracin celular.
3) Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos,
inhibidores no competitivos, oxido-reduccin, modificacin de pH
e inhibidores en la interpretacin de sus resultados.
II. ACTIVIDADES
Fermentacin alcohlica en levaduras (Saccharomycescerevisiae).
La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la
reaccin:
C6H12O6 2CO2
2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO 2 es liberado como gas, por
lo que se puede medir la fermentacin por la produccin de CO2.
III. PROCEDIMIENTOS.
3.1.
Tubos
Suspensin 1 ml
de levadura
7%
1 ml
1 ml
1 ml
Sol.
Glucosa
1 ml
1 ml
1 ml
Sol. NaF
1 ml
Agua
destilada(4
3C)
2 ml
1 ml
Sol.Rojo
Neutro
1 ml
3.3.
3.4.
3.5.
Soluciones:
1 Solucin de levadura: disolver a homogeneidad 7 g de levadura
en 10 ml de agua destilada a 43C y completar a 100 ml con
agua destilada a 43C.
2 Solucin de glucosa 0,1 M
3 Solucin de NaF0,1 M
4 Solucin rojo neutro 0,02 M
Papel pH.
IV. OBSERVACIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
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V. CONCLUSIONES
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______________________________________________________________________
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______________________________________________________________________
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VI. BIBLIOGRAFA
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PRCTICA. 8
INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION DE
ETANOL POR SACCHAROMYCES cerevisiae INMOVILIZADA.
I.- OBJETIVOS
1 Inmovilizar S. cerevisiae en soporte de agar- agar.
2 Obtener etanol a partir de levaduras inmovilizadas.
3 Evaluar por refractometra el grado alcohlico del producto de la
fermentacin
II.- ACTIVIDADES
Fermentacin alcohlica en levaduras (Saccharomycescerevisiae).
La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la
reaccin:
C6H12O6 2CO2
2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO 2 es liberado como gas, por
lo que se puede medir la fermentacin por la produccin de CO 2 y
por la concentracin del producto formado o por la disminucin de
la concentracin del sustrato (en grados Brix)
III.- MATERIALES.
-
IV.- PROCEDIMIENTO
Acondicionamiento de materiales:
Solubilizar la levadura comercial de panificacin en 50 ml de agua
destilada.
En un matraz disolver 5g de agar-agar en 250 ml de agua destilada,
con calentamiento y agitacin constante.
Calibrar el bao de mara a 40C, para mantener dentro del agar
licuado.
Colocar en una probeta de 100ml, 50ml de aceite vegetal y ponerla en
refrigeracin (aproximadamente 4C), por 30 minutos.
Inmovilizacin de la enzima:
4.- Como explica que la glucosa llegue a tener contacto con las clulas
de levadura, si estas estn atrapadas en la matriz de agar-agar.
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________________________________________________________________________________________
5-
Presente
al
menos
un
caso
detallado
de
aplicacin
de
la
inmovilizacin de enzimas.
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________________________________________________________________________________________
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PRCTICA 9
EXTRACCIN DE ENZIMAS VEGETALES
I.
OBJETIVO.
Extraer la enzima Ureasa de la cscara de frejol y comprobar su
actividad cataltica.
II. FUNDAMENTO.
Las enzimas son protenas con accin cataltica.
Las protenas se encuentran en el interior de las clulas en un
estatus particular, a pH fisiolgico, y con estructura nativa
estabilizada por diversas mezclas de sustancias.
La extraccin de enzimas debe realizarse de modo que conserven
las caractersticas estructurales y las propiedades funcionales de
las mismas.
Las leguminosas son conocidas por su alta actividad uresica,
debido a la enzima ureasa presente en la cscara.
La enzima ureasa al actuar sobre el sustrato rea provoca la
hidrlisis de esta con la consiguiente liberacin de amoniaco y
anhdrido carbnico, segn la siguiente reaccin.
NH2
O=C
H2O ----------
2NH3 + CO2
NH2
La actividad uresica se puede comprobar haciendo reaccionar el
amoniaco liberado con el Reactivo de Nessler (K2Hg14). Este
reactivo es el Yoduro doble de Mercurio y
Potasio, que al
reaccionar con el amoniaco en medio alcalino da productos de color
amarillo-anaranjado (complejo cuya frmula se supone sea
HgONH2I), cuya intensidad de color puede medirse a longitudes de
onda de 405 a 420 nm.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
150 gr. De cubierta de frejol, solucin de rea0.3 M, agua
destilada
Bufer fosfato 0.005 M de pH=7.4, reactivo Nessler.
Espectrofotmetro, Bao Mara, Balanza, Equipo de filtracin,
papel filtro, Gradilla de tubos, 02 fiolas de 100ml,04 tubos de
BUFFER
AGUA
EXTRACTO
FINAL (ml)
VI. OBSERVACIONES
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_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
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VII. CONCLUSIONES
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VIII. BIBLIOGRAFA
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PRACTICA 10
DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN
UREASA
I.
OBJETIVO
Determinar la capacidad cataltica o actividad enzimtica de la
enzima ureasa.(enz. Urea-amidohidrolasa EC.3.5.1.5)
II. FUNDAMENTO.
La actividad enzimtica (U) es la expresin del poder cataltico de
la enzima y se obtiene midiendo la velocidad de la reaccin que
cataliza.
La actividad enzimtica (U) se define como la cantidad de enzima
contenida en 1 ml de solucin que transforma o produce 1 mg de
sustrato producto por minuto medidas en las condiciones optimas
de operacin de la enzima.
La ureasa es una enzima que se encuentra en diversos organismos
vivos, mas no en el organismo humano. Algunas fuentes comunes
son las bacterias, o la cscara de frejol.
La ureasa cataliza la descomposicin de la rea segn la reaccin:
NH2
CO
+ H2O
2NH3 + CO2
NH2
La velocidad de una reaccin enzimtica como la velocidad de
cualquier reaccin puede ser determinada midiendo:
1 la cantidad de sustrato transformado en un determinado
tiempo de reaccin
2 la cantidad de productos formados. Cualquiera de ellos.
Para el caso de la reaccin catalizada por ureasa se puede hacer el
ensayo midiendo la cantidad de urea en el tiempo, o midiendo
cualquiera de los productos (CO2 NH3) producidos en un tiempo
determinado.
Por facilidad se medir la cantidad de amoniaco formado, lo cual se
hace por medios espectrofotomtricos utilizando el reactivo Nessler
que es un ioduro doble de mercurio y potasio que al reaccionar con
el amoniaco en medio alcalino forma un complejo de color
anaranjado castao.
2K2HgI4 + NH3 + 3KOH
soluciones
de sulfato de
Patr
n
N
Concentra SO4(NH ml
de Buf
cin (NH3) 3)2
SO4(NH er
mol/ml
nmol/ml 3)2
(ml)
Nessl Volum
er
en
(ml ) final
ml
Blan
co
00
0.0
0.0
7.50
0.5
8.0
5.0
0.01
7.49
0.5
8.0
10
0.02
7.48
0.5
8.0
Absorban
cia
420 nm.
15
0.03
7.47
0.5
8.0
20
0.04
7.46
0.5
8.0
25
0.05
7.45
0.5
8.0
30
0.06
7.44
0.5
8.0
I.
OBSERVACIONES
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
II. CONCLUSIONES
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________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
III. BIBLIOGRAFA
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________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
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________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
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________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
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PRACTICA 11
CINETICA ENZIMATICA EN UREASA
I.
OBJETIVO.
Verificar la variacin de la velocidad de las reacciones enzimticas
con la concentracin del sustrato.
II. FUNDAMENTO.
La rea puede descomponerse por accin de la enzima Ureasa,
para formarse amoniaco y bixido de carbono segn la
siguiente ecuacin.
NH2
CO
+ H2O
2NH3 +
CO2
NH2
Luego el Amoniaco liberado puede ser cuantificado por
espectrofotometra a
= 420 nm, si previamente se le
compleja con reactivo Nessler.
Cintica de MichaelisMenten.
La velocidad de las reacciones enzimticas varan con la
concentracin del sustrato segn una cintica autosaturante
que se describa por la Ec. DeMichaelis-Menten.
V = Vmax. [S]
Ks + [S]
La representacin grfica de tal ecuacin tiene la forma:
[S]
vVmaxKs
III. MATERIALES Y EQUIPOS
Materiales.
20 ml de solucin de sulfato de amonio al 5x10-4 M
50 ml de solucin de ureasa 0.6 mg/l. En bufer fosfato de
pH=7.4, con EDTA, 0.5 nM.
Agua destilada.
reactivo Nessler.
Bao de hielo.
Equipos y material de vidrio.
fiolas de 50 y 100 ml.
07 tubos de ensayo de 10 ml.
02 matraz de 100 ml.
pipetas de 1, 2, 5, y 10 ml.
Equipo de bao mara.
01 espectrofotmetro Espectronic 20D+
01 termmetro de 0- 100 C
IV. PROCEDIMIENTO.
Preparacin de muestras.
Hacer los clculos y preparar la solucin patrn de sulfato
de amonio al 5x10-4 M
Hacer los clculos y preparar la solucin de urea 0.3 M
Calibracin del Espectrofotmetro.
Sol.
de Contenido
Contenido
Equivalencia
sulfato(ml)
nmol
de nmol
de en nmol de
sulfato
NH3
rea
50
100
150
200
250
300
Utilizar los datos obtenidos de la curva de calibracin de la
prctica anterior.
Completar la siguiente tabla.
Tabla N 2
Muestra N
Blanco
1
2
3
Volumen
de NH3
en
sulfato tomado ( muestra
ml)
(nmol)
la Absorbancia
4
5
6
Construir la curva de equivalencia y encontrar la ecuacin que
relaciona DO vs
[NH3], haciendo
necesarios.
los
tratamientos
estadsticos
que
sean
Pruebas cinticas.
A partir de la muestra madre de urea 0.3 M. preparar 6
muestras y un blanco para completar la tabla 3 como se
muestra.
Preparar solucin madre de ureasa 6gr/l en bufer fosfato
Tabla N 3
Tubo
Ure
a
M
ol
Ure
a
o.3
M
ml
Incub
ar
37C
Ba Nessl Repos
o
er
ar
hiel ml
5
o
15
min.
min
Volum
en
final
ml
Blan
co
7.0
0.5
0.5
60
0.2
6.8
0.5
0.5
120
0.4
6.6
0.5
0.5
180
0.6
6.4
0.5
0.5
240
0.8
6.2
0.5
0.5
300
1.0
6.0
0.5
0.5
360
1.2
5.8
0.5
0.5
Ab
s
42
0
nm
.
Muestra
1
2
3
4
5
6
Blanco
Tabla N 4
[urea]
en Densidad
Nmol
de Nmol
de
nmol/ml x10 ptica
NH3
urea
que
2
(Abs)
producidos
reaccionan
0.1
1.0
3.0
4.0
5.0
6.0
-
Tratamiento de datos.
Para cada muestra calcular la velocidad de reaccin
mediante la relacin v = P/t, donde (p) es nmol de NH3
producidos, y (t) es el tiempo de reaccin enzimtica ( 15
min.) y completar la siguiente tabla.
Tabla 5
Muestra
V(nmol/min.) 1/v
1
2
3
4
5
6
Graficar v vs. [S], y ajustar a una curva autosaturante.
V. OBSERVACIONES
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________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
VI. CONCLUSIONES
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________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
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________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
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VII. BIBLIOGRAFA
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PRACTICA 12
OBJETIVO
Extraer ADN de un tejido animal
II.
MARCO TEORICO
El ADN y ARN son biomolculas que intervienen en el
almacenamiento y la transferencia de la informacin gentica.
Son componentes fundamentales de la clula y constituyen en
conjunto, entre el 5 y el 10% del peso seco.
Normalmente no se encuentran solos sino que se hallan formando
ncleo protenas, ya que suelen unirse a determinados tipos de
estas, como las histonas.
El ARN se localiza tanto en el citoplasma celular como en el
ncleo , mitocondrias y cloroplastos, mientras que el ADN se sita
fundamentalmente en el ncleo de la clula y tambin
cloroplastos y mitocondrias en pequeas cantidades.
Poseen una importancia manifiesta por el hecho de que ellos
dirigen y llevan a cabo la sntesis de protenas, y por tanto de las
enzimas necesarias para el funcionamiento celular.
Por otra parte el ADN es el vehculo de la herencia que se
transmite de padres a hijos de generacin en generacin.
III.
FUNDAMENTO:
El ADN se puede aislar mediante una tcnica relativamente
sencilla, consiste en primer lugar en romper las membranas
celulares para liberar los ncleos, para ello se tritura el hgado de
pollo en un mortero.
IV.
V.
MATERIALES
Hgado de pollo 10 gr
Cloruro de sodio 2M
Etanol 96|
SDS 20%
Arena
Varilla de vidrio
vasos de precipitados
Mortero
Embudo
Pipetas
Probetas
Gasa
METODOLOGA
1.- Triturar 10 gr de hgado de pollo, dentro de un mortero, con la
adicin de 5gr de arena lavada, para promover el rompimiento
de las membranas celulares.
2.- Aadir al triturado de hgado 50 ml de agua destilada hasta
obtener una papilla.
3.- Filtrar varias veces, en una probeta de 100 ml, logrando
separar los restos de tejido que quedaron sin romper
membranas.
4.- Medir el volumen del filtrado final.
5.- Aadir al filtrado un volumen igual de NaCl 2M., verterlo todo
a un vaso de precipitados.
6.- Aadir 1 ml de SDS 20%.
IX. CONCLUSIONES
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X. BIBLIOGRAFA
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