I - CAPTULO 1

1. Objetivo del cultivo:VLELHQHVGLItFLOWUDWDU

GHFODVLFDUODVDSOLFDFLRQHVTXHVHSHUVLJXHQ
FRQHOFXOWLYRGHWHMLGRVVHSRGUtDHVTXHPDWLzarlas en aplicaciones para:

Establecimiento de cultivos de
tejidos vegetales
Luis Mroginski, Pedro Sansberro y
Eduardo Flaschland
1 Introduccin
El cultivo de tejidos en su acepcin amplia
SXHGHVHUGHQLGRFRPRXQFRQMXQWRPX\KHWHrogneo de tcnicas que presentan en comn
el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser protoplastos
clulas desprovistas de pared celular clulas,
tejidos u rganos) se cultiva aspticamente en
XQPHGLRDUWLFLDOGHFRPSRVLFLyQTXtPLFDGHQLGD\VHLQFXEDHQFRQGLFLRQHVDPELHQWDOHV
FRQWURODGDV/DLPSUHFLVLyQGHHVWDGHQLFLyQ
puede generar muchas polmicas, pero es actualmente aceptada. Generalmente es comn
dividir las tcnicas del cultivo de tejidos en dos
grandes grupos: a) cultivos en medios semisOLGRV\EFXOWLYRVHQPHGLRVOtTXLGRVORVTXH
a su vez pueden ser agitados (mediante el empleo de agitadores de uso continuo) o estacionarios. Tambin es frecuente dividir al cultivo
de tejidos atendiendo a los niveles de complejidad en cultivo de rganos, cultivos celulares y
cultivo de protoplastos. Para el establecimiento de los cultivos utilizando cualquiera de los
sistemas es necesario tener en cuenta algunos
aspectos generales comunes relacionados con
el explante, la asepsia, el medio de cultivo y
las condiciones de incubacin. La discusin de
estos aspectos constituye el objetivo de este
FDStWXOR$GLFLRQDOPHQWHVHLQFOX\HHOWHPDGH
la aclimatacin de las plantas regeneradas in
vitro, TXHHVGHJUDQLPSRUWDQFLDHQODPD\RUtD
de las aplicaciones del cultivo de tejidos en la
agricultura.
2 Explante
Varios factores deben ser tenidos en cuenta
en la eleccin del explante apropiado para el
establecimiento de los cultivos in vitro, entre
ellos:

Estudios bsicos. En este caso, los explantes cultivados pueden ser diversos. Si lo nico
que se quiere lograr es un sistema de callos
SDUD HVWXGLDU DOJ~Q SURFHVR VLROyJLFR VH
puede cultivar cualquier rgano, tejido o clula
viva. En este caso en que lo nico que se busca es la induccin de callos lo ideal es cultivar
explantes jvenes, derivados de semillas en
germinacin, donde se obtienen respuestas rpidas y, en general, hay menores problemas de
FRQWDPLQDFLyQ FRQ PLFURRUJDQLVPRV$ YHFHV
se hace uso del cultivo de tejidos porque repreVHQWD XQ VLVWHPD H[SHULPHQWDO TXH VLPSOLFD
la complejidad generada por los fenmenos
de correlacin entre las distintas partes que
normalmente estn presentes en una planta
entera. El explante que se usar estar condicionado por lo que se quiere estudiar. Un buen
ejemplo lo constituye el cultivo de ovarios fecundados del tomate para estudiar los requerimientos nutricionales durante el crecimiento
GHORVIUXWRV$VLPLVPRHOFXOWLYRGHyYXORVKD
sido muy til para estudiar aspectos relacionaGRVFRQODIRUPDFLyQGHODVEUDVHQDOJRGyQ
El cultivo de discos de tallos brind una valiosa
ayuda para estudiar la rizognesis in vitro.
Obtencin de plantas con sanidad controlada. Es muy comn la utilizacin del cultivo de
tejidos para la obtencin de plantas libres de
virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello es
el meristema (dependiendo de la especie, de
0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y
de un par de primordios foliares.
Micropropagacin. En este caso depender del sistema que se quiere utilizar. Si lo que
se quiere explotar es la brotacin de meristemas, los pices terminales y los segmentos
uninodales de ramas jvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el cultivador de tejidos debe conocer perfectamente la
ELRORJtDGHODUHSURGXFFLyQGHODSODQWDSDUD
aprovechar aquellos explantes que en forma
natural son propgulos. En cambio, si se pretende micropropagar mediante el empleo de
VHPLOODVVLQWpWLFDVYHU3DUWH,9FDStWXORHO
explante original deber posibilitar la induccin

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

17

de la embriognesis somtica. En este caso, la

utilizacin de embriones zigticos inmaduros u
hojas, suelen ser frecuentes como explantes.
 Obtencin de Kbridos interespeccos.
Una de las primeras aplicaciones del cultivo de
tejidos en la agricultura lo constituy su empleo
FRPRD\XGDSDUDODREWHQFLyQGHKtEULGRVGHULYDGRVGHFUX]DPLHQWRVLQWHUHVSHFtFRVGRQGH
se produce el aborto temprano de embriones.
En estos casos, el explante cultivado es el
embrin cigtico en estadios tempranos de su
GHVDUUROOR&RQODPLVPDQDOLGDGWDPELpQVH
utilizan ovarios u vulos fecundados.
Obtencin de plantas de semillas con embriones rudimentarios 3DUD HVWD QDOLGDG ORV
H[SODQWHV SXHGHQ VHU VHPLOODV SRU  HM RUTXtGHDVRELHQVHDtVODQORVHPEULRQHVHQXQHVtado temprano de desarrollo (corazn) como
en el caso de yerba mate o de algunas variedades de duraznero.
 Obtencin de plantas haploides (consiGHUDQGR FRPR KDSORLGH D XQ HVSRURWR TXH
contiene el complemento gamtico de cromosomas). En este caso, los explantes ms utilizados son las anteras, aunque tambin pueden emplearse microsporas aisladas, vulos y
ovarios no fertilizados.
Induccin de variacin somaclonal. En este
caso se pueden utilizar varios explantes, pero
VLODQDOLGDGGHVXXWLOL]DFLyQHVODDSOLFDFLyQ
en planes de mejoramiento gentico de plantas, los explantes utilizados deben posibilitar la
regeneracin de plantas enteras.
 Produccin y/o conversin de sustancias
tiles. Se puede utilizar una gran variedad
GH H[SODQWHV /RV GH UDtFHV VXHOHQ VHU PX\
utilizados.
Obtencin de hbridos somticos. Para esta
QDOLGDGVHUHFXUUHDODIXVLyQGHSURWRSODVWRV
(QODPD\RUtDGHORVFDVRVVHDtVODQORVSURWRSODVWRVGHPHVyORVGHKRMDV\GHVXVSHQViones celulares.
 Conservacin e intercambio de germoplasma. Los meristemas son los explantes
preferidos para el desarrollo de sistemas de
conservacin D PHGLDQR \ ODUJR SOD]R FUtR
FRQVHUYDFLyQ FRQ QLWUyJHQR OtTXLGR \ SDUD HO
intercambio de material gentico.

18

 Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar los culWLYRVDSDUWLUGHH[SODQWHVH[WUDtGRVGHVHPLOODV

en germinacin (hipoctilo, epictilo, cotiledoQHVUDtFHV.
2. Posibilidad de contaminacin con microorganismos. De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas donantes que crecen
en condiciones de invernadero, con ello se
reduce sustancialmente las tasas de contaminacin. Por otra parte, es recomendable evitar
HOXVRGHH[SODQWHVVXFLRVUDtFHVUL]RPDV
que provienen de plantas crecidas en macetas
RHQHOFDPSRGDGRTXHHQODPD\RUtDGHORV
casos no es posible conseguir una buena desinfeccin de los mismos.
3. Edad siolgica. Este es un aspecto de
JUDQLQXHQFLDHQODPRUIRJpQHVLV&RPRUHJOD
general se puede decir que cuando ms joven
e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor ser su respuesta in vitro. Es por
ello que los meristemas apicales y axilares son
ampliamente usados en numerosas especies.
En el caso de la micropropagacin de plantas leosas, la edad del explante es un factor
FUtWLFR6LORVWHMLGRVVRQMyYHQHVODPLFURSURpagacin tiene mayores posibilidades de ser
exitosa que con tejidos maduros. Este hecho
genera la necesidad de realizar tratamientos
de rejuvenecimiento de las plantas donantes
de explantes.
4. Tamao. En general, cuanto ms grande
sea el explante mayores sern las posibilidades de inducir la proliferacin de callos o la regeneracin directa de rganos. Sin embargo,
a mayor tamao de explante tambin son mayores las probabilidades de que los cultivos se
contaminen con microorganismos. Tambin es
necesario tener en cuenta que existe un taPDxRPtQLPRGHOH[SODQWHTXHGHSHQGHGHOD
especie y del material vegetal, por debajo del
cual no es fcil lograr el establecimiento de los
cultivos. Los explantes muy pequeos suelen
requerir del empleo de medios ms complejos
o de los denominados medios acondicionados.
5. Epoca del ao. Es un factor que suelen
tener mucha importancia en la micropropa
gacin y que generalmente est asociado al

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

grado de dormicin que presentan ciertos explantes (yemas, por ejemplo) y tambin con la
posibilidad de mayor o menor proliferacin de
microorganismos.
3 Asepsia
Uno de los principales problemas que se
presentan cuando se tratan de establecer los
cultivos es el de la contaminacin de los mismos con diversos tipos de microorganismos
KRQJRVOHYDGXUDVEDFWHULDVWRSODVPDVYLrus). El ambiente generado por explante-medio
GH FXOWLYRFRQGLFLRQHV ItVLFDV GH  LQFXEDFLyQ
es altamente propicio para la proliferacin de
muchos de estos microorganismos que pueden provocar la destruccin de los cultivos. Es
GLItFLOFXDQWLFDUHOLPSDFWRGHHVWDVSpUGLGDV
pero en promedio, en laboratorios dedicados a
la micropropagacin se lo puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los casos, estos microorganismos no destruyen los cultivos
pero compiten con el explante por los nutrienWHV GHO PHGLR GH FXOWLYR R ELHQ OR  PRGLFDQ
(VPX\GLItFLOFRQVHJXLUFXOWLYRVHVWULFWDPHQWH DVpSWLFRV GDGR TXH HQ OD PD\RUtD  GH ORV
casos es altamente probable que los mismos
FRQWHQJDQ YLUXV \ WRSODVPDV SRU  OR TXH HQ
ODSUiFWLFDFXDQGRVHUHHUHDFXOWLYRVDVpSWLFRVHQJHQHUDOVHTXLHUHVLJQLFDUTXHVRQ
cultivos donde no se produce la proliferacin
de hongos y bacterias.
Dos son las fuentes de contaminaciones: a)
microorganismos presentes en el interior o en
ODVXSHUFLHGHORVH[SODQWHV\EIDOODVHQORV
procedimientos de cultivo en el laboratorio. La
correcta deteccin de estas fuentes y del tipo
de microorganismo son aspectos importantes
para el xito de los cultivos, pues por un lado
ayuda a determinar la fuente de contaminacin
\SRURWURODGRD\XGDDODSODQLFDFLyQGHORV
procedimientos para controlarlos. Varios gneros de bacterias (Pseudomonas, Xanthomonas,
Erwinia, Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus,
Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus,
Mycobacterium, Corynebacterium) y de honJRV ODPHQWRVRV Aspergillus,
Penicilium,
Fusarium, Alternaria,
Cladosporium y
Neurospora) estn frecuentemente en los cultivos. Es conveniente inspeccionar visualmen-

te con la ayuda de un microscopio estereoscpico los cultivos en forma peridica (por lo

menos semanalmente). Tambin se pueden
realizar pruebas con medios de cultivo difeUHQFLDOHV\WHVWELRTXtPLFRVHVSHFtFRV
Para evitar y/o minimizar las contaminaciones de los cultivos con microorganismos es
necesario:
1) Conocer el material vegetal con que se traEDMD\ORVSRVLEOHVFRQWDPLQDQWHVHVSHFtFRV
2) Realizar una adecuada preparacin de la
planta dadora de explantes, cultivndola preferentemente en invernaderos tratadas con
SURGXFWRVTXtPLFRVTXHHOLPLQHQSDWyJHQRV\
HYHQWXDOHVPLFURRUJDQLVPRVHQGyWRV
3URFHGHUDODGHVLQIHFFLyQVXSHUFLDOGH
los explantes mediante el uso de compuestos
TXtPLFRVFRQHOREMHWRGHHOLPLQDUORVPLFURorganismos con el menor dao posible para
el explante. Si bien no es posible recomendar
un procedimiento general, se puede sealar
que el procedimiento ms popularizado consiste en una doble desinfeccin mediante la
inmersin de los explantes en etanol (70%v/v)
durante 20-60 segundos seguido de hipoclorito de sodio 1 -3%, contenido en el agua de
lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos,
dependiendo de la naturaleza del explante.
$OJXQRV SURFHGLPLHQWRV  VH EDVDQ HQ HO HPpleo de nicamente etanol o de hipoclorito de
sodio. Finalmente, es necesario eliminar los
restos de estos productos mediante varios lavados con agua destilada estril.
En este ltimo punto hay que aconsejar que
se utilice agua destilada estril de reciente
preparacin, dado que est demostrado que el
almacenaje prolongado del agua estril puede
ser la causa de contaminaciones con bacterias. Es aconsejable realizar estas operacioQHVGHGHVLQIHFFLyQVXSHUFLDOHQXQDFiPDUD
de transferencia con aire estril. En lugar del
hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclorito de calcio (6 -12 %) o el cloruro de mercurio
(0,1%- 1,5%). Es preciso recomendar extrema
cautela con el empleo de este ltimo compuesto, dado que es altamente txico y adems no
es removido con facilidad del explante.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

19

En los casos en que no se utilice etanol, la

adicin de agentes tensoactivos junto con el
desinfectante es una prctica recomendada.
(QWUH ORV PiV XVDGRV JXUDQ 7ZHHQ 
0.1%) o unas gotas de Triton. El lavado previo de los explantes con agua corriente y detergentes, ayuda a una mejor desinfeccin. La
inmersin de los explantes en soluciones conteniendo sustancias antibiticas y /o antimicticas (gentamicina, sulfato de estreptomicina,
ampicilina, tetraciclina, carbenicilina, sulfato de
gentamicina, pentacloronitrobenceno, rifampicina, anfotericina B, benomil, carbendazim)
puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados
en casos excepcionales. Estos productos tienen
el inconveniente de que alteran la composicin
de los medios de cultivo y adems pueden ser
metabolizados por los explantes.
ltimamente han aparecido soluciones biocidas que matan bacterias y hongos, previenen
la germinacin de esporas y a altas concentraciones pueden eliminar contaminaciones
GH PLFURRUJDQLVPRV HQGyWRV 8QR  GH HVWRV
compuestos es el PPM (Plant Preaservative
Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1,
un compuesto derivado de los furfurales de la
FDxDGHD]~FDU(VWHFRPSXHVWRTXtPLFDPHQte: 1-(5-bromofur-2-il)-2- bromo-2-nitroeteno
fue desarrollado en la Universidad Central de
las Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y
fungicida de amplio espectro.
En los casos en que se utilicen plntulas crecidas in vitro como plantas donantes de explantes, es necesario desinfectar las semillas para
su cultivo y germinacin y luego es aconsejable
desinfectar tambin las plntulas resultantes.
En algunos materiales vegetales se utiliza
la preincubacin de los explantes mediante lo
cual stos son desinfectados suavemente y
precultivados durante 24 horas en un medio
FRQWHQLHQGRVDFDURVD\QDOPHQWHVRQGHVLQfectados nuevamente y cultivados.
4) Emplear medios e instrumentos de cultivo
esterilizados, es decir, liberados completamente de cualquier microorganismo vivo o espoUDV3DUDODHVWHULOL]DFLyQHQODPD\RUtDGHORV
casos se hace uso del calor en sus diversas
formas: llama directa, calor hmedo (en forma
de vapor abierto o bajo presin), calor seco
(aire caliente). Se pueden usar hornos a mi-

20

croondas. El agua caliente tambin puede ser

usada. En el caso de sustancias termolbiles,
OD HVWHULOL]DFLyQ VH SXHGH KDFHU  PHGLDQWH OWUDFLyQDWUDYpVGHOWURVEDFWHULROyJLFRV
No es posible recomendar ningn sistema
de esterilizacin dado que la exitosa destruccin de los microorganismos depende de mltiples factores entre los que interesan el tamao del recipiente, el tiempo de esterilizacin y
la naturaleza de la sustancia a esterilizar. Sin
embargo, se pueden dar algunas sugerencias:
/DHVWHULOL]DFLyQHQHVWXIDVPHGLDQWHFDORU
seco (aire caliente) es recomendable para esterilizar recipientes de vidrios secos (pipetas,
cpsulas de Petri, tubos). En estos casos, 2-4
horas en estufas a 180-200 C brindan excelentes resultados.
/DHVWHULOL]DFLyQFRQFDORUK~PHGRFRQYDpor bajo presin (en autoclave o en una olla a
presin). Es el procedimiento ms empleado
para la esterilizacin de los medios de cultivo
(salvo, como se indic ms arriba, para aquellos que posean componentes termolbiles).
En este caso, lo ms comn es usar una presin de 1.46 kg.cm-2 durante 20 minutos, con
lo que prcticamente se destruyen todas las
formas de vida. Es importante que en todos
los puntos del autoclave se alcance dicha temperatura, para lo cual hay disponibles cintas
detectoras colorimtricas.
5) Cultivar los explantes en una cmara de
WUDQVIHUHQFLDFRQDLUHHVWpULOJDELQHWHGHXjo laminar), localizada en un ambiente limpio
y no expuesta a corrientes de aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir
con cuartos esterilizados previamente con luz
ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en
forma directa). La mesada de trabajo y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas
previamente con etanol al 70%. De la misma
manera deben ser desinfectados exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios
de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el rea
del aire estril.
Los operarios constituyen frecuentemente
una importante fuente primaria de contaminacin, porque es recomendable que, antes de
comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabn y se des-

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

infecten con etanol al 70 %. La utilizacin de Tabla 1: Composicin de tres medios bsicos

guardapolvos, guantes y mscaras protectoras usados en el cultivo in vitro de tejidos.
GHODERFD\GHODQDUL]DVtFRPRORVJRUURV
1
Medio bsico
protectores de los cabellos, ayudan a reducir Compuestos
MS
N6
B5
sensiblemente los niveles de contaminacin.
Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, NH 4NO3
1.650
--------1.900
2.830
2.500
tijeras, agujas, cpsulas de Petri) deben ser KNO 3
170
400
----KH 2PO4
esterilizados antes de su uso. Muchos de es- CaCl 2.2H 2O
440
166
150
tos instrumentos pueden ser colocados en eta- (NH4) 2SO 4
----463
134
MgSO4.7H
2
O
370
185
250
nol al 95% y, antes de ser usados, se deben
NaH 2PO 4.4H 2O
--------150
DPHDUFXLGDGRVDPHQWHHQODOODPDGHXQPH- KI
0,83
0,80
0,75
FKHUR7DPELpQHVQHFHVDULRDPHDUODERFD MnSO 4.H2O
--------10,00
H
3BO 3
6,20
1,60
3,00
de los recipientes que contienen los medios de
MnSO 4.4H 2O
22,30
4,40
----cultivo antes y despus de cultivar el explante. ZnSO 4.7H 2O
8,60
1,50
2,00
0,25
----0,25
6) Incubar los cultivos en cmaras o cuar- Na2MoO4.2H 2O
0,025
----0,025
tos de cultivo, cerrados, libres de corrientes CuSO 4.5H 2O
FeSO 4.7H 2O
27,80
27,85
27,80
de aire y bien higienizados. En lo posible se Na2EDTA
37,30
37,25
37,30
0,025
----0,025
debe restringir la circulacin de personas, y los CoCl 2.6H 2O
2,00
2,00
----recipientes con cultivos contaminados deben Glicina
Tiamina -HCl
0,10
1,00
10,00
ser rpidamente eliminados de este sector. Es Piridoxina -HCl
0,50
0,50
1,00
Nicotnico
0,50
0,50
conveniente que antes del lavado, estos culti- cido
1,00
vos sean esterilizados.
Mioinositol
100,00
----100,00
4 Medios de cultivo
8Q PHGLR GH FXOWLYR SXHGH VHU GHQLGR
como una formulacin de sales inorgnicas y
compuestos orgnicos requeridos para la nutricin y manipulacin de los cultivos. Existen
numerosas formulaciones, cada una de las
cuales comprende entre 6 y 40 compuestos.
Para dar una idea de la cantidad de formulaciones disponibles, George y col., luego de
UHYLVDUPiVGHWUDEDMRVFLHQWtFRVGHVcriben en dos tomos (casi 1.000 pginas en total) ms de 2.000 medios de cultivo. Tambin
dos empresas multinacionales ofrecen para la
venta ms de 60 medios cada una, listos para
su utilizacin especialmente en la micropropagacin comercial de plantas. En la Tabla 1 se
presentan tres medios que son muy usados en
la actualidad.
Bsicamente, los medios de cultivo se componen de compuestos que suministran:
8QDIXHQWHGHFDUERQR
1XWULHQWHVPLQHUDOHV
6XVWDQFLDVYLWDPtQLFDV
6XVWDQFLDVUHJXODGRUDVGHOFUHFLPLHQWR
 $JHQWH JHOLFDQWH HQ HO FDVR GH PHGLRV
semislidos)

Sacarosa

30.000,00

50.000,00

20.000,00

PH

5,7

5,8

5,5

1)

Composicin en mgL

-1- 1.

MS = Medio de Murashige y Skoog (Physiol. Plant. 15: 473 - 97.

1962)
N6 = Medio de Chu,C.C., Wang,C:C., Sun,C.S., Hsu, C., Yin, K,C.,
y Chu, C. (Sci. Sinica 18: 6 59- 668. 1975)
B5 = Medio de Gamborg, O.L., Miller,R.A. y Ojima, K. (Exp.Cell
Res. 50: 151 - 158. 1968)

2WURVFRPSXHVWRV
Fuente de carbono: Prcticamente todos los
cultivos son hetertrofos (comparativamente
unos pocos son auttrofos) y por ende necesitan del suministro de una fuente de carbono.
La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%,
es el azcar ms utilizado. En algunos medios
se la reemplaza por glucosa. En casos particulares se cita el empleo de maltosa o galactosa. Tambin myo-inositol (100 mg/L) suele ser
incorporado a los medios resultando un mejor
crecimiento de los cultivos.
Nutrientes minerales: Los medios de cultivo
deben suministrar los mismos macro y micronutrientes que son esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En general se
destacan las concentraciones relativamente

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

21

altas de nitrgeno y potasio. El nitrgeno es

suministrado en forma de amonio y/o nitrato.
Tambin se pueden utilizar urea, glutamina y
FDVHtQDKLGUROL]DGD(VIXQGDPHQWDOTXHHOKLHrro sea incorporado juntamente con un agente
TXHODQWH1D('7$ORTXHORKDFHGLVSRQLEOH
es un amplio rango de pH.
Sustancias vitamnicas: De todas las que
comnmente se incorporan a los medios, pareciera que la tiamina es la nica realmente
imprescindible para el buen crecimiento de los
cultivos.
Sustancias reguladoras del crecimiento: En
OD PD\RUtD GH ORV FDVRV ORV PHGLRV XWLOL]DGRV
para el establecimiento de los cultivos conWLHQHQ  DX[LQDV $1$ ' $,$ $,% 12$
'LFDPED 3LFORUDP \R FLWRFLQLQDV %$ .,1
=($ L3 7KLGLD]XUyQ /DV JLEHUHOLQDV HVSHFLDOPHQWH *$ VRQ UHTXHULGDV HQ DOJXQDV
ocasiones para el cultivo de meristemas o para
ODHORQJDFLyQGHEURWHV(O$%$HVXVDGRHQ
algunos casos.

agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y pur

de banana. Tambin en ocasiones es necesaria la incorporacin de agentes antioxidantes
/FLVWHtQD iFLGR DVFyUELFR SROLYLQLOSLUUROLGRna) para prevenir el ennegrecimiento tisular
causado por la oxidacin de polifenoles presentes en los explantes. Este ennegrecimiento
puede causar la muerte de los mismos.
La preparacin de los medios de cultivo puede llevarse a cabo de diferentes maneras, en
lecturas recomendadas se citan manuales
de laboratorio donde se describen detalladamente este punto.
5. Condiciones
incubacin.

ambientales

para

la

La incubacin de los cultivos se debe llevar

a cabo en condiciones controladas. Por lo meQRVHQORTXHVHUHHUHDWHPSHUDWXUDFDOLGDG
HLQWHQVLGDGGHOX]IRWRSHUtRGRKXPHGDGDWmosfrica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cmaras climatizadas
o cuartos especialmente preparados con aire
DFRQGLFLRQDGR IUtRFDORU \ XQD EXHQD \ XQLAgente gelicante en el caso de medios se- forme circulacin de aire en el interior y dotamislidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el com- dos de un buen sistema de alarma para cortar
puesto ms utilizado. Tambin pueden em- la iluminacin en caso de no funcionar el aire
SOHDUVH$JDUJHO7UDQVIHUJHO acondicionado. En general, los cultivos son in(2,0-2,60%), Phytagel (0,25- 0,40%), agaro- cubados a temperatura constante de 25-28 C,
sa (0,80-0.90%) y Gelrite (0,10-0,20%).
con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz
HV  JHQHUDOPHQWH SURYLVWD SRU OiPSDUDV XROtros compuestos: Muchas sustancias, de UHVFHQWHVGHOWLSROX]GtDFRQXQDLUUDGLDQFLD
YDULDGD FRPSRVLFLyQ TXtPLFD VXHOHQ VHU DGL- GHHQWUH\PROPV/DKXPHGDGDWFLRQDGDVDORVPHGLRVEiVLFRV$GHPiVGHOD mosfrica debe ser elevada (80- 90%).
glicina, otros aminocidos se pueden agregar
a los medios. Es el caso de L-tirosina, aspara6 Aclimatacin de las plantas regeneraJLQD\FLVWHtQDDXQTXHKD\TXHWHQHUSUHVHQWH das in vitro.
que en dosis altas pueden inhibir el crecimiento de los cultivos. El carbn activado (0,1 a
'XUDQWHHOSHUtRGRGHLQFXEDFLyQORVFXOWLYRV
5%) suele ser incorporado al medio, dado que VRQH[SXHVWRVDFRQGLFLRQHVDPELHQWDOHVGLVtes probable que absorba metabolitos txicos miles al ambiente externo. La atmsfera interna
para los cultivos.
se caracteriza por presentar una considerable
variacin diurna en la concentracin de CO2,
En algunos medios se incorporan cidos humedad relativa elevada, temperatura consRUJiQLFRV FRPR HO PiOLFR HO FtWULFR HO SLU~YL- WDQWH H LQWHQVLGDG OXPtQLFD EDMD$ VX YH] HO
FR\HOVXFFtQLFR\HVIUHFXHQWHHOHPSOHRGH medio de cultivo compuesto por concentracio/JOXWDPLQD\GHFDVHtQDKLGUROL]DGD$~QKR\ nes elevadas de azcares (en aquellos sistese siguen utilizando ciertos componentes de mas hetertrofos y semiauttrofos de microproFRPSRVLFLyQTXtPLFDQRELHQGHQLGDFRPRHO pagacin), sales y reguladores del crecimiento,

22

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

sumado a la ausencia de microorganismos,

generan anormalidades morfolgicas, anatPLFDV \ VLROyJLFDV  TXH ODV SODQWDV GHEHUiQ
corregir cuando son transferidas al ambiente
H[WHUQR (VWH SHUtRGR GH DGDSWDFLyQ DO QXHYR
hbitat es llamado fase o etapa de aclimatacin. La estrategia a implementarse durante el
mencionado ciclo deber contemplar el control
minucioso de los parmetros ambientales (humedad, temperatura y luz) de tal manera que
permita disminuir la deshidratacin y, al mismo
WLHPSRHVWLPXODUODIRWRVtQWHVLVFRQHOREMHWRGH
generar un rpido crecimiento de los plantines.
(OUHWUDVRHQHOGHVDUUROORGHODFXWtFXOD\OD
escasa funcionalidad del aparato estomtico
TXH SUHVHQWDQ ODV KRMDV GH OD PD\RUtD GH ODV
especies cultivadas in vitro, determinan una
alta tasa de transpiracin que puede ocasionar
la muerte por deshidratacin. El control de este
SURFHVR VLROyJLFR HV GH YLWDO LPSRUWDQFLD GXrante la aclimatacin, teniendo en cuenta que la
disminucin de la transpiracin ser gradual y
depender de la rehabilitacin de los estomas,
DVt FRPR WDPELpQ GHO GHVDUUROOR GH OD FXWtFXla. El equipamiento necesario estar sujeto a la
especie, pudiendo utilizarse desde tneles de
polietileno para plantas que posean un elevado
control de la transpiracin (por ej. Malus pumila
o Agave tequilana) o bien, a travs del empleo
de cmaras climatizadas (Fig.1) equipadas con
sensores que permiten un descenso paulatino
de la humedad relativa. En algunos casos puede resultar necesaria la aplicacin exgena de
$%$KRUPRQDLQYROXFUDGDHQHOFRQWUROGHOFLHrre de los estomas) o bien, el empleo de sustancias antitranspirantes que forman una capa
VHPLSHUPHDEOHHQODVXSHUFLHGHODKRMD(Q
este ltimo caso debern tomarse algunas precauciones debido a que pueden observarse reDFFLRQHVGHWRWR[LFLGDG
Resulta imprescindible evitar la exposicin a
temperaturas extremas tanto en la fase area
como en el substrato. Mediante el empleo de
extractores y/o acondicionadores de aire combinados con un sistema de niebla, es posible
establecer la temperatura de la fase gaseosa
entre los 25 y 30 C durante la estacin estival,
mientras que en la poca invernal es necesario, a veces, el empleo de mantas trmicas o
serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel

del substrato, para mantener la temperatura

por encima de los 18-20 C.
Sin lugar a dudas, la opcin ms econmica
es el empleo de la luz natural, disminuyendo su
irradiancia (20-50%) mediante el agregado de
mallas de sombreado (saram). No obstante,
en aquellas latitudes donde el nivel medio de
OX] QDWXUDO HV EDMR \ ORV GtDV VRQ FRUWRV GXrante una parte considerable del ao, la luz arWLFLDOSXHGHVHUDSOLFDGDFRPRFRPSOHPHQWR
GHODOX]QDWXUDO/DVOiPSDUDVWXEXODUHVXRUHVFHQWHV GHO WLSR OX]  GtD VRQ HPSOHDGDV
HQ KRUWLFXOWXUD SDUD SURORQJDU HO IRWRSHUtRGR
$VLPLVPRODVOiPSDUDVWXEXODUHVGHVRGLRDOWD
presin presentan una distribucin espectral
GHODHQHUJtDDGHFXDGDSDUDHVWLPXODUIRWRVtQWHVLV \ VH HPSOHDQ SDUD WDO Q HQ XQD DPSOLD
variedad de cultivos.
Otro aspecto importante a tener en cuenta
lo constituye la eleccin del substrato, siendo
el adecuado aquel que permita el normal creciPLHQWR\GHVDUUROORGHODVUDtFHV6HSXHGHHPplear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mezclas de ellos, teniendo la precaucin de realizar una esterilizacin previa. Es conveniente
el agregado de fertilizantes, sea a travs del
substrato (fertilizantes de liberacin controlada) o bien mediante el sistema de riego (fertilizantes solubles); emplendose proporcioQHVULFDVHQIyVIRUR13.\SRWDVLR
13.TXHIDYRUHFHUiQHOGHVDUUROOR
UDGLFXODU\ODUXVWLFDFLyQGHODVSODQWDV
En todo momento deber realizarse un riguURVRFRQWUROWRVDQLWDULRHPSOHiQGRVHDQWLELyWLcos, fungicidas e insecticidas de uso universal.
En la Figura 1, se detalla un modelo de cmara de aclimatacin diseada por los autores
y empleada por el Laboratorio de Cultivo de
Tejidos del Instituto de Botnica del Nordeste.
Bsicamente, est compuesta por una fase
area construida en aluminio y policarbonato
alveolar (9) y un recipiente o batea (11) que
FRQWLHQHJUiQXORVGHDUFLOODH[SDQGLGDDQGH
facilitar el drenaje. Mediante el agregado de
arena u otro substrato adecuado, esta cmara
puede ser utilizada tanto para el enraizamiento
ex vitro de los brotes obtenidos en la etapa de
PXOWLSOLFDFLyQDVtFRPRWDPELpQSDUDHOHQUDL]DPLHQWR FRQYHQFLRQDO D UDt] GHVQXGD
de estacas de tallos u hojas.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

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La humedad relativa de la fase area es controlada por un sensor (6) ubicado por encima
GHODWXEHUtDGHULHJR(OVLVWHPDKXPLGLcador est compuesto por picos tipo fog y
es alimentado por una bomba de bajo caudal
y alta presin (13). Con el propsito de evitar
el goteo que pudiese ocasionar el agua remaQHQWH HQ ODV FDxHUtDV HO  VLVWHPD FRQVWD GH
una vlvula solenoide de descarga y desage
(7). La fase gaseosa es renovada en forma intermitente mediante el empleo de extractores
ubicados en ambos extremos de la cmara (3)
los que, conjuntamente, introducen o extraen
aire, generando un movimiento masal.

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'HELGRDODODWLWXGJHRJUiFDHQTXHVHHQcuentra, la cmara est equipada con un aconGLFLRQDGRUGHDLUHIULJRUtDVSDUDHYLWDU

situaciones de estrs trmico en poca estival.
$VXYH]\GDGRTXHODPD\RUtDGHODVHVSHcies estudiadas son originarias de climas tropicales y subtropicales, el sistema cuenta con
mantas trmicas que son colocadas por debajo de los tubetes, manteniendo la temperatura
del substrato durante el invierno. En este ltimo caso se agrega un material aislante entre la
leca (10) y la malla de hierro (16) de tal manera
de dirigir el calor hacia la fase area.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

7. Agradecimientos.
/RV DXWRUHV DJUDGHFHQ DO ,QJ 3DEOR$ /XQD
SRUODSODQLFDFLyQGLJLWDOGHODFiPDUDGHDFOLPDWDFLyQ$ OD 6HFUHWDUtD *HQHUDO GH &LHQFLD
y Tcnica (UNNE) y al Establecimiento La CaFKXHUD SRU HO DSRUWH QDQFLHUR UHFLELGR SDUD
construir la misma.
8. Lecturas Recomendadas
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