Effects of light intensity and phosphate supply on algal density and growth

of Dunaliella viridis.

Garca-Gutirrez Ana.1.
1

University of Mlaga, Faculty of Sciences, 0617514422@alu.uma.es

Resumen. Dunaliella es un tipo de micro-alga holafila que puede encontrarse con facilidad en lagos poco
profundos y ambientes hipersalinos conocida por su actividad antioxidante y su capacidad de producir gran
cantidad de carotinoides (Wikfors & Ohno, 2001). El crecimiento de cultivo de las algas puede ser
monitorizado en funcin de la turbidez y medidas sobre la deflaccin de la luz (Borowitzka 1992, Hosseini &
Shariati 2009). Cuando el nmero de clulas aumenta en la solucin, esta, se vuelve cada vez ms turbia
debido a que la luz que pasa a travs de ella es dispersada por las partculas en suspensin presentes. Los
organismos fotosintticos como las algas pueden tambin ser monitorizados midiendo la produccin de
clorofila. Independientemente del tipo, la clorofila es una molcula que puede ser detectada por absorbancia
(Lichtenhaler 1977). En el presente estudio se prepararon varios cultivos experimentales de Dunaliella
Viridis y se realizaron mediciones durante un periodo de 12 das de su tasa de proliferacin celular,
produccin de clorofila (a y b) y de -caroteno, entre otras medidas, que se estudiaron en condiciones de baja
irradiancia (50 mmol m s) y alta irradiancia (500 m s mu mol), con y sin limitacin de Fosfato. Al termino
del experimento, y visto los resultados, concluimos que la irradiancia no es un factor clave en la tasa de
crecimiento del cultivo mientras que la cantidad de fosforo disuelto en el medio acta como un factor
limitante, siendo ambos determinantes en la capacidad de carga del sistema.
Palabras clave: Algae, irradiancia, Fosfato, Clorofila, Caroteno, Dunaliella Viridis
Abstract. Dunaliella is a type of halophile green-orange microalgae especially found in lake and salty fields
and is known for its antioxidant activity; because of its ability to create large amount of Carotenoids (Wikfors
& Ohno, 2001). Growth on algae cultures can be monitored using turbidity or light scatter measurements
(Borowitzka 1992, Hosseini & Shariati 2009). As the number of cells increases the solution becomes
increasingly cloudy or turbid because light passing through it is scattered by the suspended particle present.
Photosynthetic organisms such as algae can also be monitored using Chlorophyll. Regardless of the type
Chlorophyll is a molecule that can be detected by absorbance (Lichtenhaler 1977). In the present study,
Dunaliella Viridis isolates were cultured and their cell proliferation rate, chlorophyll (a and b) and -carotene
production, and other measures were studied under conditions of low irradiance (50 mol m s) and high
irradiance levels (500 mol m s), with and without Phosphate limitation. At the end of the experiments, we
conclude that the irradiance isnt a key factor in cell growth rate while the amount of phosphate dissolved in
the medium acts as a limiting factor, both being crucial in the capacity of the system jointly or separately.
Keywords: Algae, irradiance, Phosphate, Chlorophyll, Carotene, Dunaliella Viridis.

Introduction

Las algas eucariotas del gnero Dunaliella resultan muy interesantes no solo por sus caractersticas
propias, entre las que destacan su tolerancia a la alta salinidad del medio y produccin de sustancias
osmoreguladoras junto con otras de inters (Ben-Amotz et al., 1982) tanto para su uso con fines
cientficos, con fines alimenticios o dietticos (Spectovora et al., 1982), comerciales (como
biocombustibles, sntesis de metabolitos secundarios (Tafreshi & Shariati, 2009), o en acuicultura
entre otras aplicaciones.

El gnero Dunaliella fue descrito por primera vez por Teodoresco en el ao 1905. Hoy da pertenecen
a este gnero 23 subespecies, cada una de las cuales, muestra un crecimiento ptimo a distinta
concentracin salina (Massyuk, 1973).
En nuestro estudio emplearemos al alga Dunaliella Viridis, una microalga unicelular verde biflagelada
(flagelos de la misma longitud), fotosinttica (clorofila a y b adems de una serie de pigmentos
accesorios), que carece de pared celular (lo que le permite cambiar de tamao y de volumen en
respuesta al estrs) y de un solo cloroplasto en forma de copa (Borowitzka and Borowitzka, 1992),
cuyo crecimiento se ve condicionado por los valores de nutrientes, temperatura y salinidad. Su forma
de reproduccin es la biparticin, aunque tambin forma quistes de resistencia ante condiciones
adversas (Teodoresco, 1906).
En general, Dunaliella spp. destaca en aguas que sean hipersalinas, donde forman flores, coloreando
las aguas de colores verdes o rojos, ya que algunas especies de Dunaliella forman blooms rojos ya que
acumulan una parte de su peso seco de -caroteno, que es muy apreciado por las industrias de
alimentos y piensos (Jin and Melis, 2003).
Dunaliela Viridis, es por tanto un alga halfila, que resiste elevadas concentraciones de sales gracias a
la acumulacin del glicerol, que acta como soluto osmoregulador (Ben-Amotz & Avron, 1973). Se
sabe que es capaz de sobrevivir en medios por encima de la salinidad marina, tolerando
concentraciones de NaCl de entre 0,2 y el 35% (Ben-Amotz and Avron, 1983, 1990). La temperatura
ptima de Dunaliela vi. est entre 14-30 C con un lmite superior de supervivencia de hasta 35 C
(Goldman, 1977). La concentracin ptima de fosfato que se conoce para Dunaliela Viridis. est entre
115-144 mM, solo concentraciones por encima de 28.7 mM le son toxicas, y pueden dar lugar a
inhibicin en su crecimiento (Milko et al., 1962). .Con respecto a la salinidad ptima se da entre 5.88.9% (w/v) con una tolerancia de hasta 32.2% de NaCl (Borowitzka et al., 1977). El PH ptimo de
crecimiento para Dunaliella Viridis es de un valor de 9 (Loeblich, 1972)

Materiales y mtodos

2.1

Preparacin y diseo del experimento

La cepa de Dunaliella Viridis que hemos utilizado provena del Instituto de Ciencias Marinas de
Andaluca, perteneciente al Centro superior de investigaciones cientficas (CSIC) en Puerto Real
(Cdiz).
Sometemos nuestra cepa a cuatro tipos diferentes de condiciones de cultivo como se describi
previamente en la introduccin:
Alta irradiancia (500 mol m s) y alto Fosfato (250 mM) (I+P+)
Alta irradiancia (500 mol m s) y bajo Fosfato (50 mM) (I+P-)
Baja irradiancia (50 mol m s) y alto Fosfato (250 mM) (I-P+)
Baja irradiancia (50 mol m s) y bajo Fosfato (50 mM) (I-P-)
En el da 0, se inoculan 300.000 clulas por mililitro para cada cultivo, que tendran un volumen de
300ml. Todas se mantienen en aireacin constante, controlando la temperatura a 25 grados
centgrados y con luz permanente sin descansos las 24 horas.
Se prepararon dos cultivos de cada medio manteniendo las mismas condiciones en la rplica para
minimizar el error en las mediciones.

Todas las variables de inters fueron estudiadas y medidas a lo largo de los das 3,6 y 11 del periodo
de experimentacin.
El da 12, finalmente se hizo una ltima medida de densidad celular y se midi el pH.

2.2

Densidad celular

La medida de densidad celular fue obtenida mediante conteo directo haciendo uso un microscopio
optico. Se tom 1ml de cada cultivo y se deposit sobre una cubeta de Technicon, a la que
posteriormente se le aadi una gota de lugol (que tie el almidn celular) para fijar las clulas y
teirlas. Se tom una gota de la mezcla con una pipeta Pasteur y se coloc sobre una cmara de conteo
Neubauer (o cmara cuenta glbulos) que nos permiti poder contar el nmero de clulas en un
volumen determinado de cultivo puesto que dispone de una cuadrcula de dimensiones conocidas.
Hecho esto, lo cubrimos con un porta objetos y se realiz el conteo sobre la superficie de 20
cuadrculas con el microscopio. El valor medio del nmero de clulas en cada cuadrado se multiplic
por 160000 (factor de correccin) y por el factor de dilucin empleado para obtener la densidad en n
cel/ml. Si el nmero de clulas por cuadrado sala de media mayor de 30 se realizaron diluciones. La
medida se realiz durante los das 3,6,11.
2.3

Tasa intrnseca de crecimiento r y capacidad de carga del sistema k

Linealizando la ecuacin del crecimiento logstico y representando la densidad celular con respecto al
tiempo se calcul la tasa intrnseca de crecimiento, r, y la capacidad de carga del sistema, k, (densidad
mxima que soporta el cultivo) se estim a partir de los datos de crecimiento de cada cultivo, de cada
uno de los cuales se obtuvo una densidad celular mxima.
Operando tenemos que,

crt=ln

K N
N

N=

K
1+ecrt

c=ln(

K
1)
N0

De donde obtenemos

ln

K N
N

ln(

K
1)rt
N0

Siendo r la tasa intrnseca de crecimiento (en este caso indica la pendiente de la recta), y K la
capacidad de carga del medio.
Se sabe por estudios anteriores que La mxima tasa intrnseca de crecimiento (r) y la mxima
capacidad de carga (k) se obtiene a 250 moles m s (Gordillo et al., 2001).

2.3

Nefelometria

La nefelometra es un procedimiento analtico que se basa en la dispersin de la radiacin que

atraviesan las partculas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una
suspensin de partculas slidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa
turbia. Se midi la turbidez del cultivo in vivo , es decir, su absorbancia, usando el espectofotmetro a
750nm. Se us 1ml de cultivo y se calibr el espectrofotmetro usando como blanco medio de cultivo
sin clulas o agua destilada. De esta manera se pudo enfrentar la absorbancia a 750nm al nmero de
clulas/ ml y ajustarlo a una recta llevndose a cabo un anlisis de correlacin (los clculos
algebraicos pueden consultarse en detalle en el anexo 2 del presente documento).

2.4

Produccin de pigmentos

Para estimar los pigmentos fotosintticos se filtraron 3ml de cada cultivo por jeringuilla con soporte
Swinnex y filtros de microfibra de vidrio GF/F. Se sumergi el filtro en 3 mL de acetona al 90% en
un tubo Falcon de 15 mL y se dej 20 min en oscuridad. Transcurrido ese tiempo se recogi el
sobrenadante y volvi a filtrarse. De esta manera se evita el margen de error debido a un aumento de
turbidez que puede causar la acetona al descomponer parcialmente el filtro.
Despus se pas a medir la absorbancia en el espectrofotmetro del sobrenadante a las distintas
longitudes de onda: 750 nm (para la turbidez), 664 nm (el mximo de absorbancia de la clorofila a),
647 nm (mximo de absorbancia de la clorofila b) y 480 nm (mximo de absorbancia de los carotenos)
segn (Lichtenhaler 1977). Se us de nuevo acetona como blanco, lo que obliga en este caso a usar
cubetas de vidrio y no de plstico en el espectofotmetro.
El valor de 750 nm se us para obtener los valores sin turbidez de los 3 tipos de pigmentos
mencionados. Como a 750 nm se mide la turbidez del extracto acetnico, hay que restar 750 a las
dems medidas para poder efectuar los clculos de la concentracin de cada pigmento de forma
correcta:
Clorofila a (g ml-1) = 12.25 DO664 2.79 DO647
Clorofila b (g ml-1) = 21.5 DO647 5.1 DO664
Carotenoides totales (g ml-1) = (1000 DO470 1.82 Clor.a 85.02 Clor.b)/189)

2.5

Efecto de empaquetamiento

El PE o efecto empaquetamiento, indica la diferencia de absorcin entre la clorofila presente en los

tilacoides y la clorofila en solucin. Podemos calcularlo fcilmente a partir de la concentracin de
pigmentos mediante la siguiente ecuacin:
P.E. = 1 (DO668 / DO664).
Donde,
664 nm es el mximo de absorbancia de la clorofila a y 668 nm es el mximo de la clorofila a en vivo
Al igual que los casos anteriores a ambos valores de DO se le rest previamente los valores de DO750
nm que corresponde a la turbidez para el clculo de la concentracin de pigmentos en el apartado
anterior, (DO668-DO750) para el cultivo in vivo y (DO664-DO750) para el extracto en acetona.

2.6

Irradiancia

Usando la irradiancia a la que se expusieron cada uno de los cultivos que se calcul con un radimetro
ponindolo en el punto central del matraz el valor del coeficiente de extincin de la luz o Kd para cada
uno de ellos. Lo que nos permite aplicar la ley de Lambert-Beer que describe las propiedades de la
muestra atravesada en funcin de la absorcin de a luz.

I x =I 0 . eKd . x
Donde,

Ix es la radiacin incidente en el centro del cultivo en los que se toma una distancia consensuada de 5
cm por ser este el radio del matraz (x) e I0 es la irradiancia inicial. La irradiancia se midi usando un
luxmetro colocado en el centro del cultivo durante los das 3, 6 y 11 del experimento
Con los datos obtenidos para la Kd se calcul la correlacin entre la concentracin de pigmentos
totales y el coeficiente de extincin de la luz, que puede consultarse en detalle en el anexo 2.

2.7

Tasa de fotosntesis y respiracin

Para calcularla las tasas de respiracin y de fotosntesis necesitamos medir la cantidad de oxgeno de
cada cultivo usando un oxmetro en varias situaciones. Usamos matraces de 125 ml, que enrasamos
con cada medio, del que tomaremos usando el oxmetro la cantidad de oxgeno de forma inicial.
Tomada la medida, tapamos cada matraz con un parafilm procurando que no queden burbujas y se
somete cada matraz a un tratamiento de 20 minutos en luz, transcurrido los cuales se vuelve a medir la
cantidad de oxgeno. Repetimos la misma operacin, 20 min pero esta vez en oscuridad y se volvi a
medir la cantidad final de oxgeno. Una vez obtenidas las medidas de oxigeno inicial y final, en luz
(para fotosntesis) y en oscuridad (para respiracin), se calcularon las tasas:

moles O2 cel min = (O2final-O2inicial)//(num.cel/mL min.incubacin)

2.6

Fosfato inorgnico

Se utiliz el mtodo del verde malaquita (Fernndez et al. 1985). Se filtraron 3 mL de cada cultivo por
filtros GF/ de fibra de carbono, se incubaron para cada caso 0,5 ml de cultivo con 1 ml de verde
malaquita haciendo dos rplicas durante 5 minutos, y pasados estos se midi la absorbancia a 660 nm.
Las absorbancias que se obtuvieron de dichas muestras se extrapolaron con una recta patrn para
calcular las concentraciones de fosfato en moles/ L. Esta recta se construy midiendo la absorbancia a
660 nm de una serie de soluciones de concentraciones conocidas de fosfato de 2.5-5-10-15-25 moles/
L. El blanco se hizo con una mezcla de un mililitro de reactivo junto con 0,5 ml de agua destilada.

Resultados

3.1

Densidad celular

Sabemos que Dunaliella Viridis sigue un crecimiento logstico (Rodriguez-Martinez 2010), en el que
el nmero de clulas del cultivo va en aumento hasta alcanzar un mximo (dN/dt = r.N.(1-N/K))).
Interpretando los datos de nuestro experimento elaborados en la grfica superior ( densidad celular en
millones de clulas por mililitro enfrentada a tiempo en das )podemos observar que efectivamente la
densidad celular va aumentando progresivamente a lo largo de los das de experimentacin, siendo
este crecimiento ms destacado para el tratamiento I+P+ cuya densidad aument progresivamente
hasta el da once . Igualmente llamativo resulta el crecimiento del tratamiento I+P-, que alcanz una
densidad mxima el da 6, vindose mermada la densidad a partir de ese da. I-P- decrece a partir del
sptimo da y I-P+ presentaron un crecimiento sostenido desde el da 3.

Ilustracin 1. Densidad celular (en millones de clulas por mililitro) frente a tiempo (en das) para los cultivos de
Dunaliella Viridis

3.2

Tasa intrnseca de crecimiento y capacidad de carga

La siguiente tabla representa las medias y desviaciones tpicas de r y k para los cuatro tratamientos de irradiancia
y fosfato. Podemos observar que para la tasa intrnseca de crecimiento que el tratamiento I+P- es el que valores
ms elevados tiene, seguido de cerca por I+P+. En cambio, I-P+ y I-P- tienen valores mucho ms bajos. Con
respecto a la capacidad de carga es el tratamiento P+I+ el que destaca siendo mucho superior a los otros tres.

Tabla 1 Valores para la r y la k para los 4 parmetros de irradiancia fosfato.

3.3

I+, P+ d

0,490,04

6525,46

I+, P- sd

6525,46

6,820,52

I-, P+ sd

0,290

7,150,21

I-, P- sd

0,370,05

2,850,81

Nefelometra

Se realiz una correlacin entre la variacin de absorbancia de 750 nm y la densidad celular en millones de
clulas (para estimar la turbidez).
La correlacin que se obtuvo fue de R2 =0,5579, siendo la ecuacin de la recta obtenida
Y = 0,0142X + 0,3575
El coeficiente de correlacin result significativo ya que se puede observar que la absorbancia aumenta
proporcionalmente a medida que aumenta la densidad celular.

Ilustracin 2. Correlacin entre la absorbancia a 750 nm frente a la densidad celular (en millones de clulas) para
los cultivos de Dunaliella Viridis
Sin embargo por la forma de la distribucin de los datos, podran estudiarse en posteriores experimentos,
relaciones de correlacin diferentes al lineal. Por ejemplo, si tratamos de ajustar un polinomio de tercer grado,
vemos que el coeficiente de correlacin aumentara hasta 0,7164 para los datos dados, sin embargo con la corta
duracin del experimento y el pequeo nmero de valores no parece prudente hacer conjeturas en este aspecto.

3.4

Medicin de la acidez (pH)

La medida y el equilibrio de pH est intimamente relacionado con los procesos de respiracin y

fotosntesis. El pH es la medicin de la alcalinidad o la acidez de una solucin. Un pH de 7 es neutral.
Un pH por debajo de 7 indica una naturaleza cida; por encima de 7 indica naturaleza alcalina.
A partir de los datos recogidos, se realiz un diagrama de barras que enfrenta el pH a lo largo de los
das 3,6,11 y 12 de experimento para los cuatro tratamientos (figura
En general pudo verse un descenso del pH a lo largo de los das en todos los casos, siendo ms
destacable ese descenso en el tratamiento I+P-. El resto aunque tambin descendieron, lo hicieron de
forma ms suave e incluso en el caso de I-P- e I-P+ hubo un ligero aumento en el da 12.

Ilustracin 3. Niveles de pH frente al tratamiento de irradiancia y fosfato aplicado para los cultivos de
Dunaliella Viridis.

3.5

Produccin de pigmentos

3.5.1 Clorofila a
Se realiz un diagrama de barras que enfrenta la cantidad de clorofila A a lo largo de los das 3,6 y 11
de experimentacin para los cuatro tratamientos a los que fue sometida Dunaliella . El tratamiento
I+P+ destac en la concentracin de clA en el da 6 sobre los otros tres tratamientos, siendo este
tratamiento el que mayor cantidad alcanz a lo largo de todo el periodo de experimentacin. I-P+
tambin obtuvo valores elevados en el da 11 alcanzando la concentracin para el mismo da de I+P+.
I-P- se mantuvo en aumento suave pero progresivo, mientras que I+P- mostr un leve descenso en el
da 11.

Ilustracin 4. Concentracin de clorofila a (g/ml)frente al tiempo (en das) de cada uno de los tratamientos de
irradiancia y fosfato aplicados a los cultivos de Dunaliella Viridis

3.5.2 Clorofila b
Se realiz un diagrama de barras que enfrenta la cantidad de clorofila B a lo largo de los das 3,6 y 11 de
experimentacin para los cuatro tratamientos a los que fue sometida Dunaliella. Los tratamientos I+P+, I-P+ y IP- presentaron un aumento progresivo de la concentracin de clorofila b a lo largo de los das, siendo el ms
destacado el de I+P+, como vimos que ocurri tambin con la concentracin de clorofila A. I+P- sin embargo
presenta un descenso en el da 6 y un nuevo aumento de cara al da 11.

Ilustracin 5. Concentracin de clorofila b (g/ml) frente al tiempo (en das) de cada uno de los tratamientos de
irradiancia y fosfato aplicados a los cultivos de Dunaliella Viridis

3.5.3 Caratonoides
A Se realiz de nuevo un diagrama de barras que enfrenta la cantidad de carotenoides a lo largo de los das 3,6 y
11 de experimentacin para los cuatro tratamientos a los que fue sometida Dunaliella. En este caso, I+P+, I-P+ e
I-P- presentaron un aumento de carotenoides progresivo siendo en todos los casos el da 11 el de mayor
concentracin y volviendo a destacar como en los casos anteriores de clorofila A y B el tratamiento I+P+. I+Ppor el contrario mostr aumento hasta el da 6, tras el cual empez a disminuir.

Ilustracin 6. Concentracin de carotenos total (g/ml) frente al tiempo (en das) de cada uno de los tratamientos
de irradiancia y fosfato aplicados a los cultivos de Dunaliella Viridis.

3.8

Efecto de empaquetamiento

Como se aprecia en la grfica 7, el tratamiento I-P+ es el que present mayor empaquetamiento desde el da
tres hasta el da 11, aunque experimento un gran descenso a lo largo de los das que finaliz a partir del da seis
manteniendo constante el valor. I-P- no experiment cambios, mantenindose constantes a lo largo de todos los
das de medida. P+ I+ en este caso desciende progresivamente mientras I+P- primero desciende del da 3 al 6 y
luego sufre un ascenso.

Ilustracin 7. Efecto empaquetamiento (PE) frente a tiempo en das medidos para los cultivos de Dunalliela
viridis.

3.9

Irradiancia

Se realiz una regresin de los datos que se obtuvieron donde el coeficiente de correlacin fue de 0,9055 (el
procedimiento algebraico puede consultarse en el anexo 2.
Usamos los datos obtenidos para la Kd (coeficiente de extincin de la luz) y los enfrentamos a la concentracin
de pigmentos totales, resultando la tabla superior, en la que podemos observar que conforme aumenta la
concentracin de pigmentos en el medio, la luz se ve cada vez ms atenuada. Este hecho resuelta especialmente
visible para I+P+ e I-P+.

Ilustracin 8. Coeficiente de extincin de luz (Kd) frente a pigmentos totales (g/ml) para los cultivos de
Dunalliela Viridis

3.9

Tasa de fotosntesis

En esta prueba se observ que los tratamientos que mayor tasa de fotosntesis presentaron entorno al da 3 fueron
los de I-P- y el de I+P+, pero tambin fueron los que del da 3 al 6 presentaron mayor descenso pronunciado de
la misma. I+P- presenta una tasa de fotosntesis muy baja, que baja aun ms a lo largo de los das. I-P+ por el
contrario aumenta la tasa de fotosntesis del da 3 al 5, para despus disminuirla entre el da 6 y el 12.

Ilustracin 9. Tasa de fotosntesis frente a tiempo en das del tratamiento para los cultivos de Dunalliela viridis

3.9

Tasa de respiracin

Se represent los datos obtenidos en una tabla que enfrent la tasa de respiracin de cada tratamiento con el
tiempo en das transcurridos de experimentacin. Se observ que el tratamiento I-P- fue el que mayor tasa
present en el da 3, descendiendo esta pronunciadamente entre el da 3 y el 6 y volviendo a aumentar levemente
hacia el dia 11. Los otros tres tratamientos presentan tasas y trayectorias parecidas. I-P+ es la que le sigue a I-P-.
I+P- aumenta del da 6 al 11 levemente mientras que I+P+ disminuye hasta alcanzar practicamente el cero en el
da 11.

Ilustracin 10. Tasa de respiracin frente al tiempo en das de tratamiento para los cultivos de Dunalliela viridis.

3.9

Fosfato inorgnico

En este caso se observ que I-P+ fue el tratamiento que present lo mayores valores de fosfato inorgnico,
siendo el mximo en el da 3, trasd el cual sufri leve descenso entre el da 3 y 6 para despus descender ms
bruscamente del da 6 al 11. El segundo tratamiento que present valores ms elevados fue I+P+ en el da 3, pero
este sufri un descenso acentuado de cara al da seis y alcanz casi el cero en el da 11. I-P- e I+P- presentan
trayectorias parecidas, presentando sus valores ms elevados el da tres y confluyendo con I+P+ en los resultados
medidos en el da 11 de experimentacin.

Ilustracin 11. Concentracin de fosfato (mmoles L) frente a tiempo en das para los cultivos de Dunalliela
Viridis

3.9

Incorporacin de Fosfato

Para esta tabla se enfrent la incorporacin de fosfato como necesidad nutricional frente de Dunaliella para cada
tratamiento frente al tiempo en da de experimentacin. Se observ que los valores ms altos se dieron en I-P+
entorno al da 3. Ese valor descendi notablemente en la medida del da seis y volvi a resultar menos en el da
11. El tratamiento I-P- fue el segundo que mayor valor obtuvo tambin entorno al da seis e igual que el I-P+, del
da tres al seis sufri un bruco descenso, y del seis al once sigui descendiendo pero de una forma mas suave.
I+P+ en el da 3 tuvo un valor muy bajo que se hizo casi inexistente entorno al da 6 y 11. I+P- presenta los
valores ms bajos de todo el periodo de experimentacin.

Ilustracin 12. Incorporacin de fosfato (mmoles/Mcel) frente a tiempo (das) de tratamiento para los cultivos de
Dunalliela Viridis

3.9

Indice de produccin de biomasa

El tratamiento I+P+ present los valores ms altos de todo el experimento .El da 3 fue el da de menos valor y
este alcanz el mximo el da 11. I+P- alcanz el valor mximo el da 6 y el ms bajo el da 11. I-P+ se mantuvo
estable en todos los das de experimentacin, con un ligero aumento el da 11. Por ltimo I-P- que el da 6 tuvo
se mayor valor, que fue disminuyendo hasta el da 11 a partir de ah.

Ilustracin 13. Tasa de renovacin de los cultivos de Dunalliela viridis frente al tiempo medido en das

Discusin

4.1

Densidad celular, capacidad de carga y tasa intrnseca de crecimiento

Observando los datos reflejados en la grfica 1 y las medias y desviaciones tpicas de r y k para los
cuatro tratamientos de irradiancia y fosfato recogidos en la tabla 1, podemos concluir que, a la vista de
los datos la interaccin de ambos parmetros ponen de manifiesto en la grfica un volumen celular de
I+P+ muy superior a los otros tratamientos. Este volumen celular crece hasta alcanzar una capacidad
de carga a partir de la cual la densidad celular debe disminuir por muerte de la poblacin celular, que
se hace tan densa que no permite el paso de la irradiancia necesaria para la fotosntesis y que consume
las reservas de fosfato haciendo que merme la produccin de dems nutrientes.
Por tanto la densidad celular s que presenta diferencias en base al tratamiento al que se la somete,
siendo muy parecido a lo largo de los das de experimentacin para los tratamientos en los que uno o
varios parmetros son negativos.

Adems, los datos para r y k de la tabla 1 se ven apoyados por los resultados del contraste de
varianzas adjuntos en el anexo1 que finalmente confirman que las variaciones de irradiancia no
producen diferencias significativas en los valores de r, mientras que las variaciones de fosfato si y que
la variaciones de irradiancia, las de fosfato, as como la combinacin de ambos afectan a la capacidad
de carga del sistema. Es decir, tanto por separados (Sathasivam & Juntawong 2013) como en
interaccin, fosfato e irradiancia controlan la densidad celular del cultivo. Irradiancia necesaria para
fotosntesis y el fosfato acta como factor limitante (Gordillo et al. 2001)
4.2 Nefelometra
En base a los resultados obtenidos y a la correlacin (Grfica 2) en la que se obtuvo un valor bajo al
ser de 0,55, asumimos que al aumentar el nmero de clulas de la muestra, aumenta tambin la
turbidez del medio y por tanto menos luz atraviesa el cultivo. De esta manera a medida que aumenta la
turbidez mediada por el aumento de la densidad celular, La absorbancia tambin se vera modificada
por las clulas que alcanzada la capacidad de carga van muriendo, pero que igualmente permanecen en
el contenido de la muestra. Esta podra ser una posible explicacin al por qu el coeficiente de
correlacin no alcanza valores cercanos a 1, sino que se queda en 0,5579, ya que cuanto ms cercano
es el valor a 1, ms significativa y mejor sera la correlacin entre los datos. Este hecho hace
cuestionar que la nefelometra sea un estimador fiable de la densidad celular una vez alcanzada k.
4.3 Medidas del PH
El PH del medio depende de las relaciones metablicas que se dan en las clulas de Dunaliella, puesto
que, el crecimiento celular, la fotosntesis y la respiracin intercambian en su procesos Co2, protones,
y otros metabolitos con el medio. Sabemos que el PH ptimo de Dunaliella Viridis est en torno a
9.Observando los datos obtenidos en la grfica 3, podemos ver como la tendencia a lo largo de los das
de experimentacin en los cuatro tratamientos es que el PH disminuya, especialmente de forma
destacable en el tratamiento I+P-. Esta disminucin de Ph est relacionada con la fotosntesis que se ve
favorecida por la irradiancia y que, retira protones del medio, por lo que el Ph se hace ms bsico a
medida que aumenta la fotosntesis ,pero adems tambin se retira Co2. En el caso de la respiracin
ocurre justo lo contrario, libera Co2 al medio que al combinarse con el agua forma protones que se
liberan al medio y acidifican el Ph.
4.4 Medida de pigmentos
El valor de la correlacin entre la densidad celular y la clorofila adjunto en el anexo2 dan un valor de
R2 = 0,4365, que resulta ser muy bajo . Esto no concuerda con los estudios conocidos (Hernndez et
al., 2011)los cuales describen una buena correlacin entre ellos. Por tanto, debieron cometerse errores
experimentales durante la realizacin del estudio de correlacin y debemos asumir que las
concentraciones de clorofila a son un buen estimador de la biomasa.
Si observamos los datos de las grficas 4, 5 y 6 podemos ver que los medios con bajo fosfato y baja
irradiancia muestran una baja concentracin de clorofila a, b y de carotenos. Cuando organismos
fotosintticos estn sometidos a condiciones de baja irradiancia aumentan el nmero de pigmentos
para captar la luz de la forma ms eficiente. El tratamiento I+P+ tiene mayor densidad celular en la
grfica 1 y esto puede estar relacionado con que se alcancen valores mximos en el tratamiento.
Mientas que la clorofila a, parece que aumenta en la mayora de los casos, a excepcin de I+P-, en los
que se ve estancada desde el sexto da del experimento, no pasa as con la clorofila b y si en los
carotenos, cuya subida podra deberse tanto a la densidad celular como a la intensa irradiancia puesto

que estos actan como protectores de la auto oxidacin celular, adems de intervenir en la
transferencia de energa.
4.5 Efecto de Empaquetamiento
El efecto empaquetamiento trata de calcular el grado de apilamiento de los pigmentos en los tilacoides
de los cloroplastos. Estos pigmentos se encuentran formando parte de antenas de captacin de luz. Es
esta la forma en la que Dunaliella se aclimata a los cambios de irradiancia para no resultar daada,
cambiando el apilamiento de los pigmentos de esas antenas recolectoras de luz, ya que al estar ms
juntos, disminuye la cantidad de energa que llega a las cadenas de electrones. Es por eso que el
nmero y el tamao de las antenas fotosintticas es regulable y que el efecto de empaquetamiento
juega su papel como defensa frente a la irradiancia.
Si observamos los datos de la grfica 7, vemos que el empaquetamiento en I+P+ va disminuyendo
con los das de experimentacin, mientras que para I+P- se produce un descenso que se para en el da
6 . Si esto lo comparamos con los datos obtenidos para la tasa de fotosntesis en la grfica 9 vemos que
los datos para el tratamiento I+P+ la tasa de fotosntesis va disminuyendo y para I+P- en el da 6 se
produce un descenso de la fotosntesis que la lleva hasta los mnimos.
4.6 Coeficiente de extincin Lumnica kd e Irradicancia
Los niveles de irradiancia que llegan a los cultivos sufren un proceso de absorcin y dispersin que
denominamos extincin o atenuacin. Las aguas ms transparentes presentan un Kd menor que las
aguas ms turbias que contengan materia orgnica disuelta, las cuales tendrn un Kd mayor. En base a
esto la grfica 8 nos confirma que cuantos ms pigmentos y ms clulas hay en el cultivo mayor es el
coeficiente de extincin de la luz , puesto que menor irradiancia puede atravesar la muestra. Los
tratamientos I+P- e I-P- son los que presentan valores ms bajos, coincidiendo esto, con los valores
de estos tratamientos en la grfica 1 con los de menor densidad celular de los 4 estudiados. El
coeficiente de correlacin R2=90,55 indican que efectivamente hay una correlacin entre el nmero de
pigmentos e indirectamente la densidad celular y el coeficiente de extincin de la luz.
4.7 Tasa de Fotosntesis y Tasa de respiracin
Gracias a experimentos realizados anteriormente sabemos que el valor de irradiancia para el cual se
alcanzan una mayor tasa de fotosntesis en D.viridis es de 250 moles de fotones . m-2 . s-1, valores
superiores o inferiores al mismo producen una disminucin de dicha tasa (Gordillo et al., 2001)
Los resultados de la tasa de fotosntesis en la grfica 9 tienden a disminuir a lo largo de los diferentes
das de experimentacin excepto en el caso de I-P+. Esto podra justificarse por una disminucin en
los niveles de nutrientes a lo largo del tiempo de experimentacin ya que la disminucin de los
niveles de fosfatos produce una disminucin de la energa disponible en las clulas (ATP), energa
necesaria entre otras cosas para realizar fotosntesis, al ser este un factor limitante como dijimos
anteriormente. El incremento en la densidad celular podra estar tambin relacionado con este
descenso de la tasa de fotosntesis, ya que, como antes comentamos la muerte celular y el exceso de
clulas pueden dificultar la llegada de irradiancia a los centro de reaccin.
La tasa de respiracin deben estar directamente relacionados con los de densidad celular, siendo esto
lo esperado para los tratamientos I+P+ e I+P- , pero si observamos la grfica 11 y la comparamos con
la grfica 1 vemos que los valores no se corresponden con lo dicho anteriormente, ya que para el
tratamiento I+P+ se obtienen los valores ms bajos de tasa de respiracin, y para el tratamiento I+Plos valores son muy bajos pero aumentan los ltimos das del experimento. Tambin se puede ver que

en el tratamiento I-P- se produce los valores ms altos de tasa de respiracin, lo que tampoco se
corresponde con lo que es de esperar. Estos valores contrarios pueden deberse a posibles errores
experimentales y errores en los aparatos de medida.
4.8 Incorporacin y asimilacin de Fosfato
Las clulas de los cultivos acumulan el fosfato presente en el medio en el interior de sus vacuolas,
producindose a lo largo del tiempo una disminucin de las concentraciones de fosfato del medio.
Como dijimos anteriormente el fosfato es necesario para aumentar las reservas de energa de las
clulas, y es esta por tanto, la razn por la que los tratamientos de alta irradiancia que deberan tener
mayor tasa de fotosntesis, son las que ms rpidamente consumen el fosfato del medio de cultivo, esto
est directamente relacionado tambin con el nmero de clulas, es decir con la densidad celular, ms
clulas supone mayor necesidad de fosfato para su crecimiento y metabolismo.
4.9 ndice de P/B
El tiempo que tarda un cultivo en renovar su biomasa es el inverso del ndice P/B .Si observamos en
la grfica 13 los tratamientos a alta irradiancia I+P+ e I+P- , vemos que estos tuvieron un ndice P/B
mayor durante los primeros das y bajaron en los ltimos das debido a la disminucin celular que
sufren cuando van muriendo las clulas de los cultivos. Deducimos por tanto que la irradiancia es un
factor determinante para la velocidad de renovacin de la biomasa de los cultivos.

Referencias

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Anexo 1: Anovas o analisis de la varianza

Para comprobar si la capacidad de carga k o la tasa intrnseca de crecimiento r se ven afectados o no por los
parmetros de los distintos tratamientos a los que sometimos los cultivos de Dunaliella Viridis, se llevan a cabo
dos Anovas, una para la r y otra para la k que se desarrollan a continuacin:
ANOVA de la r:
Se realiz un ANOVA de dos factores con dos rplica ,con un nivel de significacin de 005.
Las hiptesis nulas son:
Ho: No existen diferencias significativas en la tasa intrnseca de crecimiento debido a las distintas variaciones
de irradiancia.
Ho: No existen diferencias significativas en la tasa intrnseca de crecimiento debido a las distintas variaciones
de de fosfato.
Ho: No existen diferencias significativas en la tasa intrnseca de crecimiento debido a
La interaccin de los factores irradiancia y fosfato.
Las hiptesis alternativas son:

H1: Si existen diferencias significativas en la tasa intrnseca de crecimiento debido a las distintas variaciones de
irradiancia.
H1: Si existen diferencias significativas en la tasa intrnseca de crecimiento debido a las distintas variaciones de
fosfato.
H1: Si existen diferencias significativas en la tasa intrnseca de crecimiento debido a la interaccin de los
factores irradiancia y fosfato.
Datos:
TRATAMIENTO

RPLICA

VALOR DE r

I+P+

0.459

0.511

0.511

0.529

0.290

0.286

0.406

0.338

I+P-

I-P+

I-P-

Clculos:
Suma total = 333
Suma total de cuadrados = 1,45774
Suma de los cuadrados de cada subgrupo = 1,454
Suma de las columnas al cuadrado = 1,393
Suma de cuadrados en filas = 1,446
Trmino de correccin = 1,386
SC total = 0072
SC de los subgrupos = 0068

SC A = 0007
SC B = 006
SC A x B = 0001
SC del error (intragrupo) = 0004
MC de las columnas = 0007
MC de las filas = 006
MC de la interaccin = 0001
MC del error = 0004

Frecuencias:
Irradiancia
(A)
Fosfato (B)
Interaccin
(A x B)
Error

GL
1

SC
0.007

MC
0.007

F observada
7

F crtic
7.71

1
1

0.06
0.001

0.06
0.001

60*
1

7.71

0.004

0.001

Al obtener en la tabla un Fcrtico de 7.71 podemos afirmar que Ho se rechaza y se acepta la hiptesis
alternativa H1 ,y que se aceptan las hiptesis nulas para Ho y Ho por lo que podemos afirmar con un
95% de fiablididad que las variaciones de irradiancia no producen diferencias significativas en los
valores de r, mientras que las variaciones de fosfato s.
ANOVA de la K:
Se realiz un ANOVA de dos factores con dos rplicas ,con un nivel de significacin de 005.
Las hiptesis nulas son:
Ho: No existen diferencias significativas en la capacidad de carga debido a las distintas variaciones de
irradiancia.

Ho: No existen diferencias significativas en la capacidad de carga debido a las distintas variaciones de de
fosfato.
Ho: No existen diferencias significativas en la capacidad de carga debido a la interaccin de los factores
irradiancia y fosfato.
Las hiptesis alternativas son :
H1: Si existen diferencias significativas en la capacidad de carga debido a las distintas variaciones de irradiancia.
H1: Si existen diferencias significativas en la capacidad de carga debido a las distintas variaciones de fosfato.
H1: Si existen diferencias significativas en la capacidad de carga debido a la interaccin de los factores
irradiancia y fosfato.
Datos:
TRATAMIENTO

RPLICA

VALOR DE k

I+P+

47

83

6.45

7.18

7.30

7.00

3.42

2.28

I+P-

I-P+

I-P-

Clculos:
Suma total = 163,63
Suma total de cuadrados = 9310,03
Suma de los cuadrados de cada subgrupo =
8661,375
Suma de las columnas al cuadrado = 5299,03
Suma de cuadrados en filas = 5257,39
Trmino de correccin = 3346,84
SC total = 5963,19
SC de los subgrupos = 5314,53

SC A = 1952,1947
SC B = 1910,55
SC A x B = 1451,79
SC del error (intragrupo) = 648,66
MC de las columnas = 1952,19
MC de las filas = 1910,55
MC de la interaccin = 1451,79
MC del error = 162,165

Frecuencias:
Irradiancia
(A)
Fosfato (B)
Interaccin
(A x B)
Error

GL
1

SC
1952.18

MC
1952.18

F observada
12.03

F critic
7.71

1
1

1910.54
1451.81

1910.54
1451.81

11.78
8.95

7.71

648.96

162.24

Al obtener en la tabla un Fcrtico de 7.71 y siendo los valores Fobs mayores en todos los casos, podemos afirmar que las tres
hiptesis nulas Ho, Ho y Ho se rechazan y se aceptan las alternativas,por lo tanto la variaciones de irradiancia, las de
fosfato, as como la combinacin de ambos ,afectan a la capacidad de carga del sistema con un 95% de fiabilidad.

Anexo 2: Ajuste de una recta de regresiones y medicin de la correlacin

Regresin de los inversos del coeficiente de extincin de la luz y la concentracin de pigmentos totales:

Representacin de la concentracin de clorofila a (g/ml) frente a densidad celular por mililitro: