La doble hlice es una

molcula bastante rgida y

viscosa de una longitud
inmensa y un dimetro
pequeo. En esta
molcula se puede
observar un surco mayor y
un surco menor.
El surco mayor es
profundo y amplio, el
surco menor es poco
profundo y estrecho.
Las interacciones ADNprotena son procesos
esenciales en la vida de la
clula (activacin o
represin de la transcripcin, replicacin del ADN y reparacin).
Las protenas se unen a la parte interior de los surcos del ADN, mediante
uniones especficas: puentes de hidrgeno, y uniones no especficas:
interacciones de van der Waals, y otras interacciones electrostticas
generales.
Las protenas reconocen donantes y aceptores de puentes de hidrgeno,
grupos metilo (hidrofbicos), stos ltimos exclusivos del surco mayor;
hay cuatro patrones posibles de reconocimiento en del surco mayor , y
slo dos en el surco menor (ver figuras).
Algunas protenas se unen al ADN por el surco mayor, algunas otras por
el surco menor, y algunas necesitan unirse a ambos.
transferencia de energa por resonancia de fluorescencia
(FRET), tambin llamada transferencia lineal de energa (en ingls,
fluorescence resonance energy transfer) es una interaccin que ocurre
solo a muy corta distancia entre dos estados de excitacin electrnica
de dos molculas fluorescentes en la que la longitud de onda de emisin
de una de ellas coincide con la de excitacin de la otra.

La FRET es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia

entre los dos fluorocromos por lo que solo puede producirse cuando
estn muy prximos.
En el ejemplo de la figura, la Blue fluorescent protein (donador) se
excitara con un fotn ultravioleta y emitira en el rango del azul,
mientras que la green fluorescent proten (aceptor) se excitara con los
fotones azules emitidos por la BFP y emitira fotones verdes. Por si solos
los fotones ultravioletas seran incapaces de conseguir la emisin de
fotones verdes de la GFP por lo que la emisin de estos solo podra
realizarse si ha habido FRET.
La FRET es una tcnica importante para investigar una gran variedad de
fenmenos biolgicos que implican la proximidad entre dos molculas.
Quencher
El trmino Quenching fluorescente o Desactivacin
fluorescente hace referencia a cualquier proceso que produzca una
disminucin en la intensidad de la fluorescencia emitida por una
determinada sustancia. Una gran variedad de procesos pueden provocar
una desactivacin fluorescente, tales como reacciones en estado
excitado, transferencia de energa, formacin de complejos y quenching
por colisiones moleculares. Como consecuencia, la desactivacin
fluorescente es altamente dependiente de la presin y la temperatura.
El oxgenomolecular y los iones ioduro y cloruro son desactivadores
qumicos muy frecuentemente utilizados. El ion cloruro es un muy
conocido desactivador para la fluorescencia de la quinina.1 2 3 La

desactivacin de la fluorescencia representa un problema para los

mtodos espectroscpicos no instantneos, tales como la fluorescencia
inducida por lser. El efecto de desactivacin fluorescente se utiliza para
construir algunos sensores de tipoptodo; por ejemplo el efecto de
desactivacin que provoca el oxgeno en ciertos complejos
de rutenio permite la medicin de la saturacin de oxgeno de una
solucin. Por otra parte la desactivacin de la fluorescencia es el
mecanismo bsico en el cual se basan los ensayos de tipo
de transferencia de energa de resonancia (FRET).4 56 Los mecanismos de
desactivacin y activacin de la fluorescencia luego de la interaccin con
molculas biolgicas diana es la base para el funcionamiento de los
agentes de contraste para la generacin de imgenes moleculares. 7 8

Conformacionales
En qumica orgnica, los ismeros
conformacionales o confrmeros son estereoismeros que se
caracterizan por poder interconvertirse (modificar su orientacin
espacial, convirtindose en otro ismero de la misma molcula) a
temperatura ambiente, por rotacin en torno a enlaces simples. Estas
conformaciones se denominan: anti, eclipsada o alternada. Son
compuestos que, generalmente, no pueden aislarse fsicamente, debido
a su facilidad de interconversin
Estereoisomeros. Ismeros que difieren del arreglo 3-D de sus tomos,

no son estructurales
Actividad exonucleasa
5 3, cuya funcin es eliminar el RNA iniciador en la sntesis de la
cadena discontinua y tambin interviene en reparacin de DNA. Es muy

til para marcar el DNA radiactivamente mediante el proceso

llamado traslado de la mella (nick translation).
Una actividad exonucleasa 5' ---> 3' que elimina todos los nucletidos
(ribonucletido o desoxiribonucletido) situados al final del cebador. Esta
actividad es muy til para la reaccin en cadena en tiempo real y en la
tcnica del marcado de sondas denominada translacin nick (nick
translation).
Se considera que la actividad exonucleasa 5' ---> 3' destruye una parte
de los cebadors y como tal se pueden encontrar polimersas desprovistas
de stas actividades.

http://atlasgeneticsoncology.org/Educ/DNASpID30001SS.html
http://www.cnb.csic.es/~fotonica/Photonic_en/Review/transfer_fl.htm
https://books.google.com.mx/books?id=5TsMx_fySYC&pg=PA143&lpg=PA143&dq=sondas+molecular+Beacons&source
=bl&ots=_PyT0h5tFs&sig=tCBvGD6PEorLxANikY4lHhJZoUg&hl=es419&sa=X&ved=0ahUKEwiqq_7F57nJAhUKRCYKHYChA8MQ6AEIZDAN#v
=onepage&q=sondas%20molecular%20Beacons&f=false

La hibridacin de cidos nucleicos (ADN o ARN) es un proceso por el

cual se combinan dos cadenas de cidos nucleicos antiparalelas y con
secuencias de bases complementarias en una nica molcula de doble
cadena, que toma la estructura de doble hlice, donde las bases
nitrogenadas quedan ocultas en el interior. Esto hace que si irradiamos
la muestra con la longitud de onda a la que absorben estas bases (260
nm), la absorcin de energa ser mucho menor si la cadena es doble
que si se trata de la cadena sencilla, ya que en esta ltima los dobles
enlaces de las bases nitrogenadas, que son las que captan la energa,
estn totalmente expuestos a la fuente emisora de energa.
Los nucletidos se unirn con sus complementarios bajo condiciones
normales: A=T; A=U; CG; GC; T=A o U=A

As que dos cadenas perfectamente complementarias se unirn la una a

la otra rpidamente. Por el contrario, debido a las diferentes geometras
de los nucletidos, una simple variacin de las parejas anteriores lleva a
inconsistencias entre las cadenas y dificultar la unin
(Tamay , Ibarra& Velasquillo, 2013)

Actualmente, la PCR en tiempo real es el mtodo ms sensible para

detectar y cuantifi car los cidos nucleicos. Aun teniendo una cantidad
muy pequea de templado, el sistema garantiza una alta sensibilidad,
especifi cidad y efi ciencia. Una de sus aplicaciones ms usadas es para
cuantifi car cambios muy pequeos en la expresin gnica mediante la
deteccin de los niveles del ARNm procedente de clulas o tejidos. La
cantidad de ARNm que puede detectar la reaccin puede ser a partir de
concentraciones bajas a diferencia de la PCR, punto fi nal que necesita
una mayor concentracin. Los ingredientes qumicos en la PCR en
tiempo real, son los mismos utilizados en la PCR punto fi nal, slo que
generalmente la enzima, dNTPs, Mg +, el buffer y el sistema reportero
de fl uorescencia para detectar los productos amplifi cados se venden
juntos en una solucin conocida como Master mix, el agua es
proporcionada por separado y tambin es libre de nucleasas. Los primers
deben ser diseados especialmente para garantizar una alta especifi
cidad y para que generen amplicones de un tamao que oscile entre
100-150 pb; si stos son ms grandes, la efi ciencia de la reaccin
disminuye considerablemente. Para evitar estos problemas, una
alternativa es disear los primers, utilizando programas informticos
disponibles, o comprarlos ya validados de las compaas de biologa
molecular, quienes garantizan resultados altamente efi cientes y
satisfactorios para los usuarios.
Mtodos especficos
Los mtodos especfi cos parten de principios distintos a diferencia de
los no especfi cos y tienen en comn la seal de fl uorescencia emitida
para detectar los productos amplifi cados. Estos mtodos siguen el
principio conocido como transferencia de energa de resonancia fl
uorescente (FRET, por sus siglas en ingls) para generar la seal; este
mtodo consiste en transferir energa desde un donador o reportero fl
uorescente a un aceptor o quencher. Para ello, existen dos mtodos
especfi cos, stos son: pruebas basadas en hidrlisis y por hibridacin.

Los primeros se basan en sondas fl uorescentes de oligonucletidos

etiquetados con un reportero fl uorescente y un quencher, ambos se
encuentran en estrecha unin mientras la sonda no hibride a su
secuencia blanco. Cuando hibrida, ocurren cambios conformacionales en
el reportero y el quencher, lo cual permite que la actividad exonucleasa
5-3 de la Taq polimerasa rompa esta unin, logrando que la fl
uorescencia emitida por el reportero sea liberada y capturada por el
equipo. Estos mtodos son muy seguros, ya que mientras no haya unin
de la sonda a su blanco, no habr amplifi cacin y tampoco seal de fl
uorescencia; es por eso que la especifi cidad es muy alta. Un ejemplo de
estos sistemas son las sondas comerciales conocidas como TaqMan12
(Figura 5), aunque existen otras en el mercado. Los mtodos por
hibridacin consisten en una sonda unida a un reportero fl uorescente
que est en estrecha proximidad con un aceptor fl uorescente unido a
otra sonda. Tanto el reportero como el aceptor presentan un espectro de
excitacin y de emisin similar, de tal forma que cuando las dos sondas
hibriden a su templado blanco, el reportero es excitado y la seal
emitida es transferida al aceptor, generando un incremento en la
cantidad de fl uorescencia. Un ejemplo de este mtodo son las sondas
molecular Beacons13 que tambin son comerciales. Los mtodos
especfi cos son ms costosos que los no especfi cos, pero son ms efi
cientes al garantizar la especifi cidad de la reaccin, evitando la
formacin de productos inespecfi cos. Cualquiera que sea el mtodo
que se aplique, se pueden adquirir fcilmente, ya que la gama de
sondas para desarrollar, tanto los mtodos especfi cos como los no
especfi cos, es amplia.