Resumen

El presente trabajo se desarrollo en el laboratorio de microbiologa del Instituto Tecnolgico de

Sonora (ITSON), en el periodo comprendido de enero-mayo 2014. El objetivo fue aislar un cultivo
puro de levadura por mtodos normalizados y determinar su viabilidad para ser utilizados en
procesos de inters biotecnolgico. Se realizaron prcticas que comprendan las tcnicas de
diluciones mediante la NOM-110-SSA1-1194 a partir de un cultivo mixto, la tcnica de vaciado en
placa y conteo en base a la NOM-092-SSA1-1994, identificar levaduras macroscpica y
microscpicamente, primeramente desde la caja Petri se observa por encima del medio, con una
textura cremosa y microscpica dando su morfologa ovoidea caracterstica de la levadura para
despus resembrar en un medio puro para obtener un cultivo puro para fines de anlisis
microbiolgicos, tales como conteo para la curva de crecimiento, las levaduras se contaron en la
cmara de Neubauer y se midi absorbancia en el espectrofotmetro as como tambin se le
realizo la tincin Gstein donde los resultados obtenidos fueron Azules 52.53% y Rojas-Rosas
47.45%. Se concluye que se logr el aislamiento de la levadura ms sin embargo no es viable en
base a los resultados obtenidos en la tincin Gstein para ser utilizado en un proceso
biotecnolgico.

Introduccin.
El hombre utilizado las levaduras desde hace
muchos siglos para aprovechar sus usos
como la fermentacin y adems para
sintetizar ciertas vitaminas. Se encuentran en
difundidas en la naturaleza se encuentran en
frutas granos, aire, piel eh intestino de
animales. Las levaduras son organismos
hetertrofos lo cual consiguen su energa
mediante el carbono y depende de plantas
superiores y de los animales para obtener su
energa por medio de desasimilacin de
oxidante aerobia o por la fermentacin
anaerobia de los azucares. Algunas son
saprofitas
y otras son parasitas. Las
levaduras estn agrupadas en unas 350
especies (las cuales se dividen en 39 genero)
se presentan en forma unicelulares o
micelios (monocelulares) de formas muy
variadas desde esfricas, ovoides y
elipsoidales como Saccharomyces cerevisiae
(globosa a elipsoidal) y Saccharomyces
elipsoides (elptica). Dependiendo de las
condiciones del medio influyen en los hongos
para su crecimiento como filamentos o
levadura depende de la cantidad de agua, el
nivel de pH, temperatura optima de

reproduccin y tanto el oxigeno como la

ausencia de oxigeno (aerobias y anaerobias).
Las clulas de la levadura son relativamente
grandes, miden entre 1-5 micras de ancho
por 3-5micras de largo. Las levaduras no
poseen flagelos u otro tipo de rgano de
locomocin
y
de
reproducen
vegetativamente por gemacin o fisin
binaria, y sexualmente por produccin de
esporas. Por lo tanto las levaduras han sido
de gran uso al ser humano por su habilidad
de fermentar azucares utilizados en la
industria para la produccin de alcohol. Sin
embargo tambin se encuentran levaduras
que pueden producir enfermedades en los
seres humanos, por lo tanto se han aplicado
una serie de anlisis para detectar el tipo de
microorganismo que quiere identificar.

Ilustracin 1. Levadura vista microscpicamente

Objetivo
El objetivo fue aislar un cultivo puro de
levadura por mtodos normalizados y
determinar su viabilidad para ser utilizados
en procesos de inters biotecnolgico

una caja de la muestra 10-1 despus agreg

agar
nutritivo
el
cual
se
mezcl
perfectamente dando 8 giros hacia la
derecha y 8 giros hacia las izquierda y
movimientos hacia arriba y abajo, esto para
todas las diluciones y posteriormente de
solidificar el agar se llev a incubar a 35 +
2C durante un tiempo de 24-48hrs para
realizar un conteo de Unidades Formadoras
de Colonias (UFC).
Conteo

Ilustracin 2. Observacin al microscopio

Despus de incubar las cajas Petri con las

diluciones del cultivo mixto de 10 -1,10-2,10-3,
10-4,10-5, se realiza un conteo en cada una
de las cajas, primeramente a las 24 horas y
despus a las 48 horas para as despus
pasar a la identificacin de la levadura,
tomando en cuenta lo mencionado por la
Norma de tomar las cajas que estn en el
rango de 25 a 250 UFC/mL.

Metodologa.

Identificacin

Este trabajo de llevo a cabo en laboratorio de

microbiologa LV-513 del Instituto Tecnolgico
de Sonora campus Nainari en el periodo de
Enero a Mayo del 2014.

La identificacin de la levadura primeramente

se observ la caja Petri y se busc un colonia
que estuviera por encima del medio, con una
textura cremosa y de color blanca, cuando ya
se cree que es una levadura para confirmar
los datos, se realiz una tincin simple, la
cual con una asa estril se toma muestra de
la colonia y se realiza el frotis y se agrega un
colorante y se seca y se observa a 10x, 40x y
100x.

Diluciones.
Se realizaron diluciones conforme lo indica la
NOM-110-SSA1-1994 en las cual el objetivo
era realizar bajar la carga microbiana
partiendo de un cultivo mixto proporcionado
por el maestro y en una gradilla con 5 tubos
con 9 mL de agua destilada y enumerados
del 1 al 5 segn su nmero de dilucin, se
tom 1 mL del cultivo mixto previamente
mezclado perfectamente 30 veces en un
Angulo de 45 y se coloc a 9 mL de agua
destilada estril siendo este 10-1, con una
pipeta
estril,
despus
de
mezclar
perfectamente , se coloc 1ml en el tubo 2 y
as sucesivamente hasta llegar al tubo 5
realizando una perfecta dilucin.
Despus se vaci en placa como lo marca la
NOM-092-SSA1-1994 utilizando 5 cajas en la
cual se pas 1 mL con una pipeta estril a

Resembrar
Al ya confirmar que es una levadura, se
resembro por estras por agotamiento en un
medio con mayor selectividad para levaduras
como lo indica la NOM-11-SSA1-1994 que es
el Extracto de Malta, para as aislar colonias
de levaduras para su posteriores anlisis.
Curva de Crecimiento
Una vez que se obtuvo el cultivo puro de
levadura, se inoculo por doble asada en un
tubo de ensayo con 10 mL de Caldo Extracto
de Malta para pasar a un matraz de 500 mL

con un contenido de 250 mL de Caldo

Extracto de Malta. Una vez en el matraz se le
se inici el conteo de clulas vivas mediante
la cmara de Neubauer con finalidad de
llevar acabo la curva de crecimiento de las
levaduras de igual manera la curva de
absorbancia, en un tiempo determinado de
24 hrs con intervalos de tiempo de 2 hrs cada
conteo.
Tincin Gstein
Para determinar la viabilidad de la levadura
se realiz la tcnica de Tincin de Gstein.
Del cultivo puro obtenido de levadura aislada
se realiz un frotis al cual se le aadi azul
de metileno al 1% dejando actuar durante 4
minutos sobre el frotis, se enjuago con agua
destilada por 30 segundos; como siguiente
paso se aadi acido tnico al 5% dejando
actuar durante 2 minutos y se enjuago de
igual manera con agua destilada; por ltimo
se aadi safranina al 1% por 1 minuto y
finalmente se enjuago con agua destilada,
prosiguiendo a observar en microscopio
(Ilustracin 3).

Tabla 1. Viabilidad en tincin Gstein.

Color
Clulas
Viabilidad
Azul intenso
36.72%
Azul claro
15.81%
Rojo
19.77%
Rosa
27.68%
Dando as un porcentaje de Viabilidad del
52.52%, el cual es una viabilidad muy bajo
para poder ser utilizada en una proceso
biotecnolgico, debera de andar arriba del
85-90% aproximadamente.
En el anlisis de la curva de crecimiento en
base a la cmara de Neubauer y la
absorbancia del espectrofotmetro, nos
arroj los siguientes resultados que se
muestran en la tabla 2:
Tabla 2
Los graficos los podemos observar en las
siguientes graficas 1 y 2, cmara de
Neubauer y Absorbancia respectivamente.

Ilustracin 3. Tincin Gstein.

Resultados.

Grfica 1. Curva de crecimiento cmara de Neubauer

Se obtuvo un cultivo puro de levaduras a

partir de la mezcla de microorganismos
proporcionada por el maestro, que fue
identificada por su morfologa macroscpica
y microscpica mediante la tincin simple,
donde se observ la morfologa ovoidea y
elipsoidal caracterstica de la levadura.
En el conteo de mesofilos aerobios y
levaduras el resultado fue de:
Para la tincin Gstein como se muestra en
la tabla 1, se obtuvo un resultado de:
Grfica 2. Absorbancia

SSA1-1994, para la obtencin de un cultivo

puro.

Conclusin.
Segn a los resultados obtenidos se llegaron
a las siguientes conclusiones, en el presente
trabajo se identifico y se dio a conocer las
caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y de
reproduccin de una levadura, tanto como su
comportamiento en diferentes medio.
Por
medio
de
diferentes
tcnicas
implementadas como las diluciones con los
procedimientos como lo marca la NOM-111-

Se determin el crecimiento de las levaduras

con la cmara de Neubauer para el conteo
de la curva de crecimiento y su absorbancia
mediante el espectrofotmetro. As como su
viabilidad mediante la tcnica de la Tincin
Gstein.
Referencias Bibliogrficas