Tesis Isabel Fortes

Huspedes alternativos
de tomato chlorosis virus: epidemiologa,

patologa y diversidad gentica en
pimiento, presencia en patata y desarrollo
de un sistema gentico en Nicotiana
benthamiana
Isabel Mara Fortes Cuenca

Mlaga, 2010
Tesis doctoral
Facultad de Ciencias
Departamento de Biologa Celular, Gentica y Fisiologa
Huspedes alternativos de tomato chlorosis virus:

epidemiologa, patologa y diversidad gentica en
pimiento, presencia en patata y desarrollo de un
sistema gentico en Nicotiana benthamiana
Memoria de Tesis Doctoral presentada por
Isabel Mara Fortes Cuenca

para optar al grado de
Doctora en Biologa
Director
Jess Navas Castillo
Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterrnea La Mayora

IHSM-UMA-CSIC
Mlaga, 2010
Don Jess Navas Castillo, Doctor en Ciencias Biolgicas, Investigador Cientfico

del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas y Profesor Asociado del
Departamento de Biologa Celular, Gentica y Fisiologa de la Universidad de
Mlaga,
INFORMA
que la Licenciada Isabel Mara Fortes Cuenca ha realizado bajo su direccin en el
Laboratorio de Virologa de la Estacin Experimental La Mayora, integrada
actualmente en el Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterrnea La
Mayora (IHSM-UMA-CSIC) el trabajo que con el ttulo Huspedes alternativos
de tomato chlorosis virus: epidemiologa, patologa y diversidad gentica en
pimiento, presencia en patata y desarrollo de un sistema gentico en Nicotiana
benthamiana se presenta en esta memoria y que constituye su Tesis Doctoral para
aspirar al grado de Doctora en Biologa.
Y para que as conste y tenga los efectos que correspondan en cumplimiento de la
legislacin vigente, firma el presente informe en Algarrobo-Costa (Mlaga), junio de
2010.
Fdo. Dr. Jess Navas Castillo
D. Jos Becerra Ratia, Director del Departamento de Biologa Celular, Gentica y

Fisiologa de la Universidad de Mlaga,
Autoriza la presentacin de la Tesis Doctoral titulada Huspedes alternativos de

tomato chlorosis virus: epidemiologa, patologa y diversidad gentica en pimiento,
presencia en patata y desarrollo de un sistema gentico en Nicotiana benthamiana,
realizada por la Licenciada Isabel Mara Fortes Cuenca para optar al Ttulo de
Doctora en Biologa.
Mlaga, junio de 2010
Fdo. Jos Becerra Ratia
Este trabajo se ha llevado a cabo en el Laboratorio de Virologa de la Estacin

Experimental La Mayora, integrada actualmente en el Instituto de
Hortofruticultura Subtropical y Mediterrnea La Mayora (IHSM-UMA-CSIC),
gracias a una beca predoctoral de Formacin de Personal Investigador del Ministerio
de Educacin y Ciencia y ha sido financiado por los proyectos de los Planes
Nacionales de I+D+I AGL2004-06959-C04-01 y AGL2007-66062-C02-01/AGR.
AGRADECIMIENTOS
AGRADECIMIENTOS
Bueno, pues ya estoy delante del orderandor para escribir los agradecimientos. Esto
es difcil para m, pues quien me conoce sabe que no me gusta mucho expresar mis
sentimientos. As que mi agradecimiento es mucho mayor que el que puedo expresar, a
todas las personas que de un modo u otro me habis ayudado durante todos estos aos y
habis hecho que en mi estancia en La Mayora haya distrufado muchsismo, tanto en los
momentos de trabajo como en otros.
Gracias Jess, por confiar en m, por estar siempre disponible, ayudarme en todo y
por darme esta oportunidad que para m ha significado mucho no slo a nivel profesional
sino en lo personal.
Gracias Enrique por todos tus consejos, disponibilidad y ayuda.
Por supuesto, a quienes tengo que agradecer muchsimas cosas son a mis
compaeros de Virologa. Muchas gracias Mara Victoria porque sin t el laboratorio no
funcionara igual, gracias por preocuparte siempre por m y todos nosotros y por tu cario.
Gracias Carmen por ayudarme tanto en el da a da en el laboratorio (gracias por ayudarme
con tus consejos con el clon infectivo) y por estar siempre dispuesta con una sonrisa a
contestar cualquier duda. Gracias Elena por tus consejos con las plantas y las inoculaciones,
(fuiste la que me ense a coger mosca) y por hacerme reir con tus cosas de petarda.
Gracias Beln por la tranquilidad que transmites y porque has trado la cordura al
laboratorio, que a veces estamos todos un poco locos. Gracias Anelise por ser como eres,
me ha encantado ser tu compaera de bancada, y muchas gracias por nuestras charlas. Eres
una maqui. Gracias Juan por escucharme alguna vez que otra y ayudarme con tus
consejos. Gracias Reme por ser siempre tan detallista, por ayudarme cuando lo he
necesitado y no voy a olvidar nuestro momento pizza en el hotel de Almera cuando
fuimos de muestreo. Gracias Diego por todas las charlas, confidencias y agobios que hemos
compartido durante todos estos aos. Debajo de esa fachada, en el fondo se esconde una
buena persona. Cuando lleg a La Mayora fue Helena la que me ense lo que estaba
haciendo hasta que ya despegu yo sola, como ella me dice. Gracias Helena por estar
siempre dispuesta a ayudar, por haber compartido tantos momentos juntas en el transcurso
de esta tesis y haber sido la alegra y chicharrilla del laboratorio. Gracias Patri por tu alegra
y tus abrazos. Gracias Gloria, ya que mi tesis contnua tu trabajo, y por ayudarme siempre
en todo lo que he necesitado. Gracias a Roco por ayudarme con las plantas y las
inoculaciones. Gracias Paco, el ltimo en llegar, por lo que me he redo contigo y los
videos de youtube que me enseas para distraerme un ratito.
Gracias a gente que ha estado o est en el laboratorio de estancia, a Rita, Kelly,
Elvira y Leo, con los que he compartido risas y buenos momentos.
En estos ltimos meses, desde que me sent a escribir esta tesis he estado en el
cuartito y he compartido mucho tiempo y momentos con gente de Fruti. Gracias a Librada
por ayudarme en lo que he necesitado, por aguantar mis locuras y mis canciones horteras.
Gracias a Caro por tu alegra y simpata, me he redo mucho con vosotras. A Jorge por tus
puntos que an hoy me sorprenden.
Gracias a Emilio y Fernando por tantos momentos que recuerdo con vosotros en La
Mayora. Gracias Emilio por la alegra que transmites, por tu comprensin y por decirme
que soy..( ja ja). Gracias Fernando por los ratos de charla, tus confidencias, por
ayudarme en tantas cosas y aguantarme cuando te he dado la tabarra sobre todo con los
problemas del ordenador. Sin vosotros dos La Mayora ya no es lo mismo.
Quera dar las gracias a gente que me ha ayudado cada ao en los muestreos, tanto a
los tcnicos: Manolo Berenguer, Rafa Gmez y los tcnicos de Almera y Murcia, como a
todos los compaeros que me han acompaado y ayudado: Helena, Anelise, Reme, Jess,
Juanfra.
Gracias Mara Jos, por preocuparte siempre por cmo me va. Mil gracias a
Severiano, Miguel ngel y Gonzalo por ayudar tanto en los invernaderos y ser tan
eficientes. A Fali y Marta, por ayudarme con la estadstica. Gracias Antonio Cordn por
atenderme siempre que lo he necesitado y resolverme mis dudas.
Gracias al resto de gente de Fruticultura, Mejora y Micologa y resto de La Mayora
con los que he compartido algn momento, comidas, desayunos, charlas, y que sera difcil
nombrarlos a todos: Mariola, Yolanda, Toi, Luis, Gabi, Xabi, Paola, Lourdes, Davinia,
Roco, Carmelina, Pablo.
Gracias a Lola por tantsismas cosas, por ayudarme tanto, por haber compartido
tantas cosas contigo y por informarme de la beca.
Gracias a los que sin formar parte de La Mayora, os habis preocupado por m,
habis intentado comprender lo que hago en mi trabajo y me habis hecho pasar buenos
momentos. Gracias a Juan y Vero por su apoyo.
Gracias a la familia de Seba por preocuparse siempre por m.
Gracias a mi hermano, Inma y mis sobrinos por darme tantos momentos de alegra.
A mis padres tengo muchsimas cosas que agradecerle, prcticamente todo lo que
soy. Gracias pap y mam porque me habis enseado muchos valores en esta vida, me
habis ayudado y me segus ayudando tanto que jams podr agradecerlo suficientemente.
A ti Seba te doy las gracias por apoyarme cada da, quererme muchsimo, subirme
el nimo cuando lo he necesitado y hacerme sentir siempre especial.
Slohacefaltaquedisfrutesdepequeasalegrasparaquetellevena
unagranfelicidad
Amispadres
ASeba
LLegar a la meta no es vencer, lo importante es el camino y en l,

caer, levantarse, insistir, aprender
RESUMEN
RESUMEN
El objetivo general de esta tesis doctoral es ampliar nuestro conocimiento
sobre el amarilleo del tomate, una enfermedad viral emergente en muchas zonas del
mundo, causada por dos virus pertenecientes al gnero Crinivirus (familia
Closteroviridae), tomato chlorosis virus (ToCV) y tomato infectious chlorosis virus
(TICV). En espaa, ToCV es el virus prevalente asociado a los amarilleos de tomate.
ToCV se transmite por tres especies de mosca blanca (Bemisia tabaci, Trialeurodes
vaporariorum y T. abutilonea ) y causa importantes epidemias en tomate en el sur y
sudeste peninsular y las Islas Canarias desde 1997. Adems, este virus infecta de
forma natural cultivos comerciales de pimiento en Espaa. ToCV posee un genoma
con la organizacin tpica de un crinivirus, formado por dos molculas de RNA
lineales y de polaridad positiva denominadas RNA1 y RNA2. El RNA 1 codifica
protenas relacionadas con la replicacin viral, mientras que el RNA 2 codifica
protenas involucradas en la proteccin del genoma, movimiento viral, y otras
funciones todava no identificadas. Adems, protenas codificadas por ambos RNAs
poseen actividad supresora del silenciamiento gnico.
En este trabajo se ha determinado la importancia que pueden tener las
infecciones de ToCV en pimiento. Por una parte, se ha estudiado la incidencia de la
enfermedad en las principales zonas de cultivo de las provincias de Murcia, Almera
y Mlaga, mediante muestreos sistemticos llevados a cabo desde 2006 a 2008. La
incidencia de ToCV en pimiento se ha mostrado variable segn las zonas y aos
estudiados. Adems, se ha desarrollado un sistema de inoculacin en condiciones
controladas mediante B. tabaci que ha puesto de manifiesto diferencias en la
susceptibilidad a la infeccin entre variedades as como la sintomatologa y las
prdidas de produccin que el virus ocasiona. Las plantas de pimiento infectadas
con ToCV presentaron una apreciable reduccin de altura y sntomas de amarilleo
internervial en hojas de altura media y basales, las cuales adems se apreciaban
ligeramente engrosadas, enrolladas longitudinalmente y quebradizas al tacto. Es de
destacar la significativa reduccin de produccin en las plantas infectadas como

consecuencia de un menor nmero de frutos y menor tamao de los mismos.
En este trabajo se describe por primera vez un nuevo husped experimental y
natural de ToCV, la patata. La confirmacin de la patata como husped experimental
de ToCV se ha llevado a cabo mediante la transmisin por B. tabaci en condiciones
controladas. A su vez, en los tubrculos procedentes de plantas infectadas se ha
detectado la presencia de ToCV mediante hibridacin molecular de improntas de
cortes transversales de yemas de tubrculos, as como en las plantas de patata
desarrolladas a partir de tubrculos infectados. Finalmente, se ha puesto de
manifiesto que las plantas de patata pueden actuar como fuente de inculo para la
infeccin de plantas de tomate mediante la transmisin por B. tabaci.
Con anterioridad a este trabajo se haba estudiado la variabilidad gentica de
poblaciones naturales de ToCV procedentes de distintas zonas de la cuenca del
Mediterrneo, habindose determinado la presencia de dos variantes de secuencia
nucleotdica del RNA1, denominadas I y II. En este trabajo se amplia el estudio de
la variabilidad gentica del RNA1 a una mayor coleccin de aislados obtenidos de
tomate y pimiento procedentes de cultivos comerciales del sudeste peninsular
(Murcia, Almera y Mlaga). Los datos obtenidos confirman la existencia de los dos
genotipos descritos y la asociacin de una subpoblacin del tipo I con las
infecciones de pimiento. Por otra parte, experimentos llevados a cabo mediante
pases sucesivos por tomate y pimiento de un aislado de ToCV apoyan la existencia
de fenmenos de adaptacin al husped sugeridos por los anlisis de secuencia.
Finalmente, se ha iniciado el desarrollo de un sistema gentico de ToCV
basado en la obtencin de clones infectivos completos de cDNA correspondientes a
los RNA1 y RNA2 del aislado espaol AT80/99. El anlisis de la infectividad se ha
realizado mediante la inoculacin de transcritos obtenidos in vitro en protoplastos de
Nicotiana benthamiana. Hasta el momento, los experimentos llevados a cabo han

permitido demostrar la replicacin del RNA1 de ToCV en ausencia del RNA2.
ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
VIRUS
BYV
CMV
CTV
CYSDV
GLRaV-1
GLRaV-1
GLRaV-3
LChV
LIYV
PepMV
PMMV
PLRV
PVA
PVS
PVX
PVY
PYVV
SPCSV
TAV
TBSV
TICV
TMV
ToCV
ToMV
ToTV
TRV
TSWV
TYLCV
beet yellows virus

cucumber mosaic virus
citrus tristeza virus
cucurbit yellow stunting disorder virus
grapevine leafroll associated virus 1
grapevine leafroll associated virus 2
grapevine leafroll-associated virus 3
little cherry virus
lettuce infectious yellows virus
pepino mosaic virus
pepper mild mottle virus
potato leafroll virus
potato virus A
potato virus S
potato virus X
potato virus Y
potato yellow vein virus
sweet potato chlorotic stunt virus
tomato aspermy virus
tomato bushy stunt virus
tomato infectious chlorosis virus
tobacco mosaic virus
tomato chlorosis virus
tomato mosaic virus
tomato torrado virus
tobacco rattle virus
tomato spotted wilt virus
tomato yellow leaf curl virus
OTRAS ABREVIATURAS
BAC
cDNA
CP
CPm
dNTP
dsRNA
dRNA
gRNA
g
HEL
Hsp70h
Kb
kDa
MTR
nt
ORF
PCR
pb
PEG
PRO
RdRp
RNasa
rNTP
RT
sgRNA
U
UTR
cromosomas artificiales bacterianos

DNA complementario
protena de la cpsida
protena menor de la cpsida
desoxinucletido
RNA de doble cadena
RNA defectivo
RNA genmico
fuerza centrfuga relativa
dominio helicasa
protena homloga a las protenas de choque trmico de 70 KDa
kilobase
kilodalton
dominio metiltransferasa
nucletido
marco abierto de lectura
reaccin en cadena de la polimerasa
pares de bases
polietilenglicol
dominio proteasa
RNA polimerasa dependiente de RNA
ribonucleasa
ribonucletidos
transcripcin reversa
RNA subgenmico
unidad de actividad enzimtica
regione no traducida
NDICE
NDICE
INTRODUCCIN Y OBJETIVOS.. 3
EL CULTIVO DEL TOMATE.. 3
EL CULTIVO DEL PIMIENTO 4
EL CULTIVO DE LA PATATA 5
VIRUS CAUSANTES DEL AMARILLEO DEL TOMATE.... 6
FAMILIA CLOSTEROVIRIDAE....... 7
Caractersticas generales.. 7
Taxonoma 8
Organizacin genmica 10
Mecanismos de expresin gnica. 16
Ciclo de infeccin de los closterovirus............. 17
Escenario evolutivo de la familia Closteroviridae 19
EL VIRUS DEL AMARILLEO DEL TOMATE
(TOMATO CHLOROSIS VIRUS, ToCV) 20
Organizacin genmica 20
Transmisin de ToCV por vectores.. 22
Sntomas en tomate............... 24
Gama de huspedes.............. 26
Distribucin geogrfica 28
Diagnstico.. 30
GENERACIN DE CLONES INFECTIVOS DE VIRUS DE RNA... 31
Clones infectivos de virus de la familia Closteroviridae. 34
VARIABILIDAD Y EVOLUCIN DE LAS POBLACIONES
DE VIRUS DE PLANTAS 39
Mecanismos generadores de diversidad gentica en los genomas virales... 39
Procesos que determinan la estructura gentica de las poblaciones virales. 42
Variabilidad gentica dentro de la familia Closteroviridae..... 45
OBJETIVOS.. 49
CAPTULO 1. INFECCIONES DE TOMATO CHLOROSIS VIRUS EN

PIMIENTO: INCIDENCIA EN EL SUDESTE PENINSULAR Y EXPRESIN
DE SNTOMAS EN CONDICIONES CONTROLADAS
1.1. ANTECEDENTES.. 53
1.2. MATERIAL Y MTODOS. 54
1.2.1. Muestreos de campo 54
1.2.2. Deteccin de ToCV. 54
1.2.3. Transmisin de ToCV a tomate a partir de plantas de pimiento
infectadas de forma natural........................... 57
1.2.4. Desarrollo de un sistema de infeccin de pimiento con ToCV
mediante Bemisia tabaci... 58
1.2.4.1. Inoculacin de ToCV en pimiento utilizando distinto
nmero de insectos. 58
1.2.4.2. Inoculacin de ToCV en diversas variedades de pimiento y
estudio del efecto de la infeccin viral... 58
1.2.5. Evaluacin de sntomas.. 60
1.3. RESULTADOS....... 61
1.3.1. Incidencia de ToCV en cultivos de pimiento y tomate de las
provincias de Mlaga, Almera y Murcia..... 61
1.3.2. Deteccin de ToCV en plantas de tomate inoculadas mediante
Bemisia tabaci a partir de pimiento.. 63
1.3.3. Influencia del nmero de adultos de Bemisia tabaci sobre la
eficiencia de transmisin de ToCV a pimiento. 64
1.3.4. Susceptibilidad a ToCV de diversas variedades de pimiento. 65
1.3.5. Determinacin de la sintomatologa inducida por la infeccin por
ToCV en pimiento........ 66
1.3.5.1. Anlisis del efecto de ToCV sobre la altura de las plantas 66
1.3.5.2. Sntomas foliares asociados a la infeccin por ToCV... 68
1.3.5.3. Efecto de la infeccin por ToCV en la produccin de
plantas de pimiento. 71
1.4. DISCUSIN 73
CAPTULO 2. LA PATATA (SOLANUM TUBEROSUM), UN NUEVO

HUSPED DE TOMATO CHLOROSIS VIRUS
2.2. MATERIAL Y MTODOS 84
2.2.1. Muestreos de campo, aislado viral y poblacin de mosca blanca.. 84
2.2.2. Deteccin de ToCV 84
2.2.3. Inoculacin de ToCV en plantas de patata mediante Bemisia tabaci. 85
2.2.4. Deteccin de ToCV en tubrculos de patata mediante hibridacin
molecular . 86
2.2.5. Inoculacin de plantas de tomate con ToCV a partir de plantas
de patata.... 86
2.3. RESULTADOS... 87
2.3.1. Infeccin natural de ToCV en patata.. 87
2.3.2. Infeccin de plantas de patata inoculadas con ToCV mediante
Bemisia tabaci.. 88
2.3.3. Presencia de ToCV en tubrculos de patata y en las plantas
desarrolladas a partir de ellos... 90
2.3.4. Infeccin de ToCV en plantas de tomate inoculadas a partir de
plantas de patata 92
2.4. DISCUSIN.... 93
CAPTULO 3. ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENTICA DEL RNA1 DE

TOMATO CHLOROSIS VIRUS EN TOMATE Y PIMIENTO: POSIBLE
IMPLICACIN DE FENMENOS DE ADAPTACIN AL HUSPED
3.2.1. Material vegetal.. 102
3.2.2. Diagnstico de ToCV...... 108
3.2.3. Extraccin de RNA total. 108
3.2.4. Regiones del genoma de ToCV analizadas. 108
3.2.5. Diseo de los iniciadores empleados en la sntesis y amplificacin

de cDNAs mediante RT-PCR... 109
3.2.6. Sntesis y amplificacin de cDNAs del RNA1 de ToCV mediante
RT-PCR 110
3.2.7. Secuenciacin de los productos de amplificacin.. 111
3.2.8. Anlisis de las secuencias nucleotdicas. 111
3.2.9. Anlisis de la secuencia nucleotdica del aislado MM8 de ToCV
procedente de pimiento en tomate y pimiento.................................................. 112
3.3.1. Variabilidad nucleotdica en el RNA1 de ToCV 115
3.3.2. Anlisis filogentico de las regiones genmicas analizadas... 116
3.3.3. Influencia del husped en la estructura genmica de la poblacin
de ToCV 123
3.3.4. Implicacin de fenmenos de adaptacin al husped en la
variabilidad del RNA1 de ToCV.. 124
3.4. DISCUSIN 127
CAPTULO
4.
DESARROLLO
DE
UN
SISTEMA
DE
CLONES
INFECTIVOS DE TOMATO CHLOROSIS VIRUS

4.2.1. Aislado viral... 139
4.2.2. Extraccin de RNA de doble cadena.. 139
4.2.3. Sntesis y amplificacin de DNAs complementarios (cDNAs) a los
RNAs genmicos de ToCV.. 140
4.2.3.1. Sntesis y amplificacin de cDNAs del RNA1. 140
4.2.3.2. Sntesis y amplificacin de cDNAs del RNA2.. 143
4.2.4. Obtencin de clones de los RNA1 y RNA2 completos de ToCV.. 147
4.2.4.1. Construccin de un clon completo del RNA1 de ToCV... 147
4.2.4.2. Construccin de un clon completo del RNA2 de ToCV... 148
4.2.5. Transcripcin in vitro del RNA1 y RNA2 de ToCV.. 150

4.2.6. Aislamiento, cultivo e inoculacin de protoplastos de mesfilo
de hoja de Nicotiana benthamiana... 150
4.2.7. Extraccin de RNA total de protoplastos de Nicotiana benthamiana 152
4.2.8. Sntesis de sondas marcadas con digoxigenina.. 153
4.2.9. Anlisis mediante northern blot. 153
4.3.1. Obtencin de clones de cDNA del RNA1 de ToCV.. 154
4.3.2. Obtencin de clones de cDNA del RNA2 de ToCV.. 158
4.3.3. Anlisis de los transcritos obtenidos in vitro correspondientes
al RNA1 y RNA2 de ToCV.. 165
4.3.4. Anlisis de la replicacin de transcritos obtenidos in vitro del RNA1
y RNA2 de ToCV en protoplastos de Nicotiana benthamiana.... 170
4.4. DISCUSIN 174
CONCLUSIONES.. 183
BIBLIOGRAFA 187
INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
Introduccin y objetivos
INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
Las virosis constituyen uno de los problemas ms serios que afectan a la
agricultura moderna, provocando el deterioro de la planta, disminuciones en la
productividad y productos de baja calidad. A diferencia de otros microorganismos,
como hongos o bacterias, no es posible aplicar tratamientos curativos contra los
virus y en ello radica la dificultad de su control. Como consecuencia del constante
intercambio de material vegetal y la desaparicin de barreras comerciales, cada vez
son ms los cultivos hortcolas que se ven afectados por enfermedades vricas. El
hecho de que muchos virus sean capaces de transmitirse mediante vectores dificulta
an ms su control. Entre los vectores ms importantes estn los insectos,
destacando los pulgones, las moscas blancas y los trips. Una estrategia
frecuentemente empeada para el control de las virosis es la lucha contra los insectos
vectores mediante tratamientos con insecticidas. La utilizacin indiscriminada de
esta estrategia puede traer consigo la generacin de poblaciones de insectos
resistentes y la destruccin de la fauna auxiliar autctona, adems de un impacto
negativo sobre el medio ambiente. En la mayora de los casos, la utilizacin de
control biolgico de los vectores y la introduccin de resistencia gentica son las
mejores alternativas para el control de las enfermedades virales. Para ello, es
fundamental poseer un conocimiento profundo de la biologa de los virus y sus
vectores, de la variabilidad natural que presentan las poblaciones virales y de las
interacciones entre los virus y las plantas husped.
EL CULTIVO DEL TOMATE
El tomate (Solanum lycopersicum L., familia Solanaceae) es una planta
perenne que cultivada se comporta como anual. Su centro de origen es la regin de
los Andes, actuales Colombia, Ecuador, Per, Bolivia y Chile. Su domesticacin y
cultivo comenz en Mxico, que se considera un centro secundario de
diversificacin.
El tomate es uno de los principales cultivos hortcolas en extensin y

produccin a nivel mundial, con una superficie cultivada de 5.227.883 hectreas y
una produccin de 129.649.883 toneladas (FAO, 2008). El principal productor
mundial es China (33.811.702 toneladas). Espaa es el segundo pas productor
europeo, tras Italia, con 55.300 hectreas cultivadas y 3.664.1000 toneladas de
produccin. Las zonas donde se concentra el cultivo son Extremadura, Islas
Canarias, Murcia, Almera, Granada, Sevilla y Mlaga (MAPA, 2008). La mayor
parte de nuestra produccin se dedica a la exportacin para su consumo en fresco en
los pases europeos. Por tanto, la importancia del tomate en la agricultura espaola
es manifiesta, de ah que sea de gran inters disponer de medidas de control eficaces
frente a las enfermedades que afectan a este cultivo y que limitan su produccin,
como son numerosas virosis. En Espaa, las principales enfermedades virales que
afectan al cultivo del tomate estn causadas por cucumber mosaic virus (CMV)
(Jord et al., 1992), tomato spotted wilt virus (TSWV) (Jord, 1993), el complejo de
especies relacionadas con tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Moriones y
Navas-Castillo, 2000; Daz-Pendn et al., 2010), tomato mosaic virus (ToMV)
(Alonso et al., 1989), potato virus Y (PVY) (Aramburu et al., 2006), tomato
chlorosis virus (ToCV) (Navas-Castillo et al., 2000), pepino mosaic virus (PepMV)
(Aguilar et al., 2002) y tomato torrado virus (ToTV) (Verbeek et al., 2007).
EL CULTIVO DEL PIMIENTO
El pimiento (Capsicum annuum L.) es una planta herbcea perenne, con ciclo
de cultivo anual, perteneciente a la familia Solanaceae. Originario de la zona de
Bolivia y Per, su cultivo ya se haba difundido en el siglo XVI en Espaa, desde
donde se distribuy al resto del Viejo Mundo.
Actualmente, el mayor productor mundial es China, seguido de Mxico,
Turqua, Indonesia y Espaa. En Espaa, el pimiento es uno de los cultivos
hortcolas ms importantes, siendo ste el pas con mayor produccin de la Unin
Europea (1.059.500 toneladas) (FAO, 2008). Las provincias espaolas con una
mayor produccin de pimiento son Almera, Murcia, Ciudad Real, Cdiz y Mlaga
(MAPA, 2008). Los virus que mayoritariamente infectan los cultivos de pimiento en
Espaa son los tobamovirus pepper mild mottle virus (PMMV), tobacco mosaic
virus (TMV) y ToMV (Alonso et al., 1989), PVY (Prez et al.,1995), TSWV (vila
et al., 1991), CMV (Avilla et al., 1996) y tomato bushy stunt virus (TBSV) (LuisArteaga et al., 1996). Recientemente, se ha mostrado que el pimiento tambin es
husped de una serie de virus emergentes transmitidos por mosca blanca, TYLCV
(Reina et al., 1999; Morilla et al., 2005), ToCV (Lozano et al., 2004) y ToTV
(Amari et al., 2008).
EL CULTIVO DE LA PATATA
La patata (Solanum tuberosum L., familia Solanaceae) se origin en la
cordillera andina y lleg a Europa en el siglo XVI a travs de Espaa y las Islas
Britnicas. Es una planta herbcea, dicotilednea, provista de un sistema caulinar
areo y otro subterrneo constituido por los tubrculos.
La patata es uno de los cultivos ms importantes en todo el mundo, con una
produccin anual de 314.140.107 toneladas en 18.192.405 hectreas de superficie
cultivada (FAO, 2008). Actualmente, el mayor productor mundial es China, seguido
de Rusia, India y Estados Unidos. En Espaa, la produccin de patata se concentra
en Castilla y Len, Andaluca, Galicia, Pas Vasco y la Rioja (MAPA, 2008).
A diferencia de la mayora de cultivos hortcolas, la patata se reproduce
vegetativamente mediante tubrculos, que actualmente se producen en la mayor
parte de los pases desarrollados en condiciones de estricto control sanitario de las
enfermedades que puedan transmitir. Se han descrito alrededor de 40 virus capaces
de infectar el cultivo de la patata (Jeffries, 1998), de los cuales los ms importantes
son potato leafroll virus (PLRV), potato virus X (PVX), PVY y potato virus S (PVS)
(de Bokx y van der Want, 1987; Stevenson et al., 2001).Adems, existe un nmero
5
de virus emergentes que constituyen una amenaza reciente para el cultivo de la

patata, como son tobacco rattle virus (TRV) y los crinivirus potato yellow vein virus
(PYVV) y tomato infectious chlorosis virus (TICV) (Wei et al., 2009).
VIRUS CAUSANTES DEL AMARILLEO DEL TOMATE
Se conocen ms de cincuenta especies virales capaces de infectar tomate,
pertenecientes a numerosas familias y transmitidas por diversos vectores como
nemtodos, pulgones, moscas blancas y trips.
A finales de los aos 80 del siglo pasado se observ en cultivos de tomate de
California un sndrome que se denomin desorden de la hoja amarilla o
amarilleo (Duffus et al., 1994). Los sntomas presentados por las plantas afectadas
se caracterizaban por la aparicin de manchas clorticas internerviales que aparecan
inicialmente en las hojas inferiores y que posteriormente se extendan hacia la parte
superior de la planta. Inicialmente, esta sintomatologa se atribuy a desrdenes
fisiolgicos o nutricionales e incluso a fitotoxicidad por pesticidas, aunque tambin
se sospech de una posible causa viral, puesto que su aparicin se asoci a la
presencia de mosca blanca. Los anlisis iniciales de las plantas que mostraban los
sntomas citados pusieron de manifiesto la presencia de un nuevo crinivirus (gnero
Crinivirus, familia Closteroviridae) al que se denomin tomato infectious chlorosis
virus (TICV), transmitido por la mosca blanca Trialeurodes vaporariorum (Duffus
et al., 1996).
Posteriormente, los estudios llevados a cabo con plantas de tomate con
sntomas similares procedentes del estado de Florida revelaron la existencia de otro
crinivirus, tomato chlorosis virus (ToCV) (Wisler et al., 1998b). La principal
diferencia biolgica entre ambos virus es la capacidad de ToCV para ser transmitido
por tres especies de mosca blanca, T. vaporariorum, T. abutilonea y Bemisia tabaci,
mientras que TICV se transmite slo por T. vaporariorum, as como un rango de
huspedes diferente. Adems de tomate, TICV puede infectar otros cultivos como
6
patata, alcachofa, lechuga y varias especies ornamentales como petunia y especies

silvestres (Duffus et al., 1996).
En 1997 se observaron de forma espordica en cultivos de tomate bajo
plstico de las provincias de Almera y Mlaga sntomas inusuales y similares a los
descritos para las infecciones de ToCV y TICV. Los anlisis llevados a cabo
pusieron de manifiesto que el agente causal era ToCV (Navas-Castillo et al., 2000)
(ver ms adelante). En verano de 2001 se identific en cultivos de tomate de la
provincia de Castelln afectados de amarilleo la presencia de TICV, que
posteriormente fue detectado en Alicante y Murcia (Font et al., 2003). Este virus
tambin se ha encontrado en nuestro pas infectando las malas hierbas Chenopodium
murale y C. album (Font et al., 2004). Recientemente se ha obtenido la secuencia
nucleotdica completa de un aislado de TICV de California (Wintermantel et al.,
2009) y del RNA2 de aislados de Espaa y California (Orlio y Navas-Castillo,
2009).
La organizacin genmica, sintomatologa, gama de huspedes y distribucin
geogrfica de ToCV se describen en un apartado posterior de esta introduccin.
FAMILIA CLOSTEROVIRIDAE
Caractersticas generales
La familia Closteroviridae comprende virus de plantas filamentosos con
genomas de RNA de cadena sencilla que presentan el mayor tamao entre los virus
de RNA de plantas. Los virus de esta familia estn limitados fundamentalmente a
clulas del parnquima floemtico del hospedador, aunque en algunas interacciones
especficas hospedador-virus algunas clulas del mesfilo pueden infectarse
(Medina et al., 1999; Karasev, 2000). En muchos casos, esta restriccin tiene como
consecuencia un bajo rendimiento en la purificacin viral, lo que, unido al gran
tamao del RNA genmico y la incapacidad de ser transmitidos mecnicamente, ha

limitado el estudio y caracterizacin de estos virus.
Los miembros de la familia Closteroviridae se transmiten de manera
semipersistente por insectos incluidos en tres familias del orden Homoptera, que
determinan los tres gneros existentes en esta familia, Closterovirus, transmitidos
por pulgones (Aphididae), Crinivirus, por moscas blancas (Aleyrodidae) y
Ampelovirus, por pseudocccidos (Pseudococcidae) (Karasev, 2000).
Estos virus infectan numerosos cultivos de gran importancia econmica como
ctricos, remolacha, tomate, lechuga, patata, batata, vid, pia, cerezo, etc., as como
especies ornamentales y silvestres. Generalmente, los sntomas de las enfermedades
causadas por los miembros de esta familia recuerdan a ciertas deficiencias
nutricionales y a senescencia prematura. Entre estos se incluyen amarilleos,
amoratamientos, aclaramiento de las venas y en ocasiones reduccin del crecimiento
y marchitamiento, que en algunos casos pueden dar lugar al colapso final de la
planta (Karasev, 2000).
Taxonoma
El principal carcter biolgico que separa los tres gneros de la familia
Closteroviridae (Closterovirus, Crinivirus y Ampelovirus) es el vector que los
transmite de forma natural (Karasev, 2000; Martelli et al., 2002). Las caractersticas
ms importantes de cada uno de estos gneros se describen a continuacin y su
estructura genmica se muestra en la figura 1.
Gnero Closterovirus. Los viriones tienen un tamao que oscila entre 1250 y 2200
nm de longitud y contienen una nica molcula de RNA de cadena sencilla, de
polaridad positiva y lineal de entre 15,5 y 19,3 kb. La especie tipo del gnero es Beet
yellows virus (BYV). Este gnero incluye virus transmitidos exclusivamente por
pulgones de manera semipersistente e infectan especies dicotiledneas. Algunos de
sus miembros son transmitidos mediante inoculacin mecnica, aunque con

dificultad.
Gnero Ampelovirus. El tamao de sus viriones oscila entre 1400 y 2200 nm de
longitud y contienen una nica molcula de RNA de cadena sencilla, de polaridad
positiva y lineal de entre 16,9 y 19,5 kb. La especie tipo del gnero es Grapevine
leafroll associated virus-3 (GRLaV-3). En este gnero se incluyen virus que infectan
especies dicotiledneas y monocotiledneas y que son transmitidos de manera
semipersistente por pseudocccidos. Ninguno de ellos es transmisible por
inoculacin mecnica.
Gnero Crinivirus. El genoma est constituido por RNA de cadena sencilla, de
polaridad positiva y lineal de entre 15,3 y 19 kb de tamao, dividido en dos
molculas, a las que se denomina RNA1 y RNA2, siendo ambas necesarias para
llevar a cabo la infeccin. Los dos RNAs se encapsidan por separado en partculas
virales cuyos tamaos oscilan entre 650-850 nm y 700-900 nm de longitud,
respectivamente. En el caso de PYVV, su genoma se encuentra dividido en tres
molculas, denominndose a la tercera RNA3. Los genes localizados en el RNA1
codifican protenas relacionadas con la replicacin, mientras que en el RNA2, y
RNA3 en PYVV, se encuentran genes que codifican protenas implicadas en la
proteccin del genoma, el movimiento del virus y la interaccin con el vector. Tres
especies de mosca blanca estn implicadas en la transmisin de crinivirus (B. tabaci,
T. vaporariorum y T. abutilonea).
Crinivirus
Ampelovirus
Closterovirus
Figura 1. Organizacin genmica de especies virales representativas de los gneros que integran la
familia Closteroviridae. BYV, Beet yellows virus; CTV, Citrus tristeza virus; LIYV, Lettuce
infectious yellows virus; SPCSV, Sweet potato chlorotic stunt virus; GLRaV-3, Grapevine leafrollassociated virus-3 (Adaptado de Dolja et al., 2006).
Organizacin genmica
La mayor cantidad de material gentico que poseen los miembros de esta
familia en comparacin con otros virus de plantas se traduce en una mayor
complejidad estructural y variacin gentica. Por una parte, los viriones
filamentosos de los virus pertenecientes a esta familia son inusualmente largos y
complejos (Dolja et al., 2006). Sus partculas virales estn compuestas por al menos
cinco protenas que se ensamblan en una estructura en serpiente de cascabel
(rattlesnake), con un largo cuerpo de morfologa uniforme y una cola corta y
segmentada (Agranovsky et al., 1995; Febres et al., 1996; Tian et al., 1999; Dolja,
2003; Dolja et al., 2006). En la figura 2 se muestran imgenes de las partculas
virales de BYV, la especie tipo del gnero Closterovirus, obtenidas mediante
microscopa electrnica de transmisin (A) o microscopa de fuerza atmica (B) que
pone de manifesto la estructura segmentada de la cola (C).
10
Cola
Cola
Cuerpo
Extremocuerpo
Figura 2. Morfologa de los viriones de beet yellows virus. A: Micrografa electrnica de dos
viriones con las colas marcadas mediante tcnicas inmunolgicas empleando un antisuero
especfico de la protena CPm (flechas). B: Imagen de una partcula viral obtenida mediante
microscopa de fuerza atmica. C y D: Reconstruccin tridimensional de los extremos del virin
obtenida mediante microscopa de fuerza atmica (Adaptado de Dolja, 2003).
En el genoma de los closterovirus se distinguen dos bloques principales de

genes, uno constituido por los implicados en la replicacin y otro integrado por
aquellos relacionados con la proteccin del genoma, el movimiento viral y la
interaccin con el vector. El bloque de genes implicados en la replicacin se localiza
aproximadamente en la mitad 5 del genoma de los virus monopartitos, gneros
Closterovirus y Ampelovirus, y en el RNA1 de las especies del gnero Crinivirus. El
producto del marco abierto de lectura (open reading frame, ORF) situado ms
cercano al extremo 5 codifica una poliprotena que posee los dominios proteasa
(PRO), RNA metiltransferasa (MTR) y RNA helicasa (HEL). Adems de la funcin
autoacataltica de PRO esta protena estara implicada en la activacin de la
replicasa viral o proteccin del RNA ante la degradacin por parte del sistema de
defensa de la planta (Dolja et al., 2006). La RNA polimerasa dependiente de RNA
(RdRp) est codificada por el siguiente ORF, denominado ORF1b, que
11
probablemente se expresa mediante el desplazamiento de la pauta de lectura del

ribosoma un nucletido (+1 ribosomal frameshift) (Agranovsky et al., 1994;
Karasev et al., 1995). As, la traduccin del RNA genmico dara lugar a dos
protenas de gran tamao, una que abarca los dominios MTR- HEL, y otra que
incluira adems el dominio RdRp. La segunda poliprotena se produce en menor
cantidad debido a la baja eficiencia del desplazamiento del ribosoma, cuantificada
en un 2% en BYV (Agranovsky, 1996). El mdulo MTR-HEL-RdRp est
universalmente conservado en toda la superfamilia de virus , en la que se incluyen
virus con genoma de RNA de polaridad positiva (Koonin and Dolja, 1993; Dolja et
al., 2006).
El bloque de genes relacionado con la proteccin del genoma, el movimiento
viral y la interaccin con el vector, se localiza en la mitad 3 del genoma de las
especies virales de los gneros Closterovirus y Ampelovirus y en el RNA2 (y
RNA3) de las especies del gnero Crinivirus. En este bloque se incluyen los genes
que codifican una protena hidrofbica de unos 6 kDa, una protena homloga a las
de la familia Hsp70 de eucariotas (Hsp70h), una protena de unos 60 kDa, la
protena de la cpsida (CP) y la protena menor de la cpsida (CPm) (Dolja et al.,
2006). Este bloque es indispensable para el movimiento del virus y es exclusivo de
los miembros de esta familia (Dolja et al., 1994).
La protena p6 posee un dominio transmembrana, se localiza en el retculo
endoplasmtico y estara implicada en las funciones del movimiento del virus de
clula a clula (Alzhanova et al., 2000; Peremyslov et al., 2004b).
La protena de la cpsida cubre aproximadamente el 95% del RNA viral,
formando el cuerpo helicoidal de los viriones filamentosos y flexuosos. La cola, que
ocupara el 5% restante, est integrada por las protenas CPm, como componente
principal, y p60 y Hsp70h, como componentes menores. Se ha propuesto que la cola
constituye un dispositivo de propulsin del virin hacia los plasmodesmos, gracias a
12
la interaccin de la protena Hsp70h con el citoesqueleto de la clula (Peremyslov et

al. 1999, 2004a; Napuli et al. 2000, 2003; Satyanarayana et al., 2000, 2004;
Alzhanova et al. 2001). En el caso de BYV, la protena p20 tambin forma parte de
la cola del virin (unida a Hsp70h) y es necesaria para el transporte sistmico del
virus a travs del floema (Prokhnevsky et al., 2002).
Se ha postulado que los ORFs CPm y p60 se originaron mediante la
duplicacin del gen de la protena CP, lo que explica que en las regiones carboxiloterminal de estas protenas se encuentren los residuos Ser, Arg y Asp conservados en
las protenas de la cpsida de los virus filamentosos de plantas (Boyko et al., 1992;
Napuli et al., 2003). La protena CPm est implicada en el movimiento clula a
clula, en la formacin de la cola de virin y en la transmisin de las partculas
virales por B. tabaci al menos en el caso de LIYV (Tian et al., 1999; Alzhanova et
al., 2001, 2007).
La protena Hsp70h, cuyo origen es eucariota, es homloga a las chaperonas
celulares de la familia de choque trmico Hsp70. En esta protena se distinguen dos
regiones, una amino-terminal y otra carboxilo-terminal. En la primera de ellas se
encuentra un dominio ATPasa altamente conservado, mientras que la segunda
presenta un dominio de unin a sustrato con menor grado de conservacin
(Agranovsky et al., 1991; Boorstein et al., 1994). Ambos dominios estn implicados
en el ensamblaje del virin (Alzhanova et al., 2001, 2007). Esta protena ejerce un
papel fundamental en la translocacin intracelular del virin anclndose a los
plasmodesmos en asociacin con el citoesqueleto de actina de la clula (Medina et
al., 1999; Prokhnevsky et al., 2005). En BYV, la protena Hsp70h acta de manera
cooperativa con la protena p64 (homloga a p59 de crinivirus), que actuara como
cochaperona, para facilitar la incorporacin de la protena CPm e interviene en la
definicin de la longitud apropiada de la cola que encapsida aproximadamente unos
700 nt de la regin 5 terminal del RNA genmico, donde deben localizarse seales
reconocidas por la protena CPm (Peremyslov et al. 2004a; Satyanarayana et al.,
13
2004; Alzhanova et al., 2007). Se ha propuesto que la cola del virin es un

dispositivo que se origin y evolucion para facilitar el movimiento de los genomas
de gran tamao de los closterovirus, tanto clula a clula como de manera sistmica
(Alzhanova et al., 2001; Prokhnevsky et al., 2002, 2005; Dolja, 2003).
A pesar de que este bloque de genes est conservado en toda la familia, no
ocurre lo mismo con el orden de los distintos genes. En los gneros Ampelovirus y
Crinivirus, el ORF CPm se sita en direccin 3 respecto al ORF CP, mientras que
en el gnero Closterovirus el orden es inverso y su tamao es significativamente
menor.
Aparte de estas funciones, en distintos miembros de la familia
Closteroviridae se han descrito protenas implicadas en la supresin del
silenciamiento gnico, como son la protena p21 de BYV (Reed et al., 2003; Ye y
Patel, 2005; Chiba et al., 2006), las protenas p20, p23 y CP de CTV (Lu et al.,
2004) y p24 de grapevine leafroll-associated virus-2 (GLRaV-2) (Chiba et al.,
2006). En el gnero Crinivirus se han descrito con esta funcin la protena p22 y una
protena homloga a la RNasa III de sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV)
(Kreuze et al., 2005), las protenas p22, CP y CPm de ToCV (Caizares et al., 2008)
y la protena p25 de cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV) (Kataya et al.,
2009).
Las secuencias de los extremos 5 y 3 no codificantes (untranslated regions,
UTR) de los genomas de los virus de RNA de cadena sencilla lineal y sentido
positivo contienen elementos, que actan en cis, implicados en el inicio de la sntesis
de las cadenas positivas y negativas genmicas y de los RNAs subgenmicos.
Asmismo, controlan el inicio de la traduccin, el ensamblaje de los viriones, la
regulacin de la expresin gnica y el movimiento dentro del husped (Duggal et
al., 1994; Buck, 1996; Turner y Buck, 1999; Miller y Koev, 2000; Dreher y Miller,
2006).
14
Las secuencias de los extremos 5-UTR estn implicadas en distintos

procesos del ciclo viral, aunque la informacin disponible sobre los elementos
reguladores es escasa. Por analoga con los elementos descritos en el extremo 3 de
la cadena positiva, las estructuras del extremo 3 de la cadena negativa
(complementaria al extremo 5 de la positiva) deben actuar como promotores de la
sntesis de la cadena positiva (Guan et al., 1997; Sivakumaran y Kao, 1999; Nagy y
Pogany, 2000; Panavas y Nagy, 2003; Panavas et al., 2003). En CTV se ha
demostrado la implicacin de las estructuras secundarias predichas en este extremo
(Lpez et al., 1998), en la replicacin y la posibilidad de que en su estructura
primaria se encuentren seales para el inicio del ensamblaje del virin (Gowda et
al., 2003b).
La regin del extremo 3-UTR de genomas virales de RNA de polaridad
positiva est implicada en el inicio de la replicacin del RNA viral, conteniendo los
motivos y estructuras implicados en distintas funciones relacionadas con la sntesis
de la cadena de polaridad negativa, tanto en su estructura primaria como secundaria
(Dreher, 1999). A diferencia de otros virus de plantas, en el extremo 3 de los
miembros de la familia Closteroviridae no se han identificado estructuras similares a
las presentes en RNA mensajeros eucariotas, como son las colas poliA o
plegamientos semejantes a los que adoptan los RNAs transferentes. En el caso de
CTV, esta regin est altamente conservada en todos los genotipos caracterizados
(Lpez et al., 1998) y se han identificado una serie de estructuras en horquilla
implicadas en la replicacin, algunas de las cuales forman parte integral de la seal
de replicacin mientras que otras no son esenciales para este proceso pero s parecen
contribuir a su mayor eficiencia (Satyanarayana et al., 2002a). En la mayora de los
crinivirus caracterizados se han descrito estructuras similares en el extremo 3-UTR
consistentes en cuatro estructuras en horquilla y uno o dos pseudonudos (Kreuze et
al., 2002; Livieratos et al., 2004, Lozano, 2007). Este extremo estara implicado,
adems de en el inicio de la sntesis de la cadena negativa, en la estabilidad del
15
RNA, ensamblaje y regulacin de la sntesis del RNA y su traduccin (Dreher,

1999).
Mecanismos de expresin gnica
Los genomas virales constituidos por RNA de cadena sencilla, lineal y
polaridad positiva, poseen una doble funcin. Por una parte son utilizados
directamente como RNA mensajero y a su vez sirven como molde para la sntesis de
la cadena de polaridad negativa que se genera como intermediario durante la
replicacin del genoma viral. Los closterovirus utilizan varios mecanismos para
regular su expresin gnica: procesamiento proteoltico de la poliprotena codificada
por el ORF1a, deriva ribosomal en la expresin de la RdRp codificada por el ORF1b
y expresin de RNAs subgenmicos (sgRNAs) 3 co-terminales (Karasev, 2000;
Dolja, 2003; Dolja et al., 2006). Esta compleja combinacin de estrategias no se ha
descrito en ningn otro grupo de virus de plantas (Koonin y Dolja, 1993).
Los genes que se encuentran en la mitad 3 del genoma de closterovirus y
ampelovirus o en el RNA2 (y RNA3) de crinivirus se expresan mediante la sntesis
de sgRNAs 3 co-terminales con el RNA genmico, que actan como RNAs
mensajeros a partir de los cuales se traduce el gen que ocupa la posicin 5 terminal
(Hilf et al., 1995; Kreuze et al., 2002). En CTV se ha demostrado que la produccin
de los sgRNAs permite la regulacin de la expresin de cada gen de forma
independiente, tanto en tiempo como en cantidad (Navas-Castillo et al., 1997).
Aunque se han localizado las secuencias reguladoras de la expresin de los sgRNAs
en el extremo 5 (Karasev et al., 1997; Aylln et al., 2003), no se ha podido
determinar si se trata de secuencias promotoras o secuencias terminadoras, por lo
que se han denominado elementos controladores (Gowda et al., 2001, 2003a; Aylln
et al., 2004). Cada elemento controlador induce la formacin no slo de los sgRNAs
de polaridad positiva y negativa, sino tambin RNAs de polaridad positiva que se
16
extienden desde el extremo 5 del gRNA a los extremos 5 de los elementos

controladores (Gowda et al., 2001).
Las plantas infectadas con closterovirus a menudo acumulan RNAs
defectivos (dRNAs) que contienen los extremos 5 y 3 del gRNA pero carecen de
una porcin variable de la regin central. Estos dRNAs han sido descritos en CTV
(Mawassi et al., 1995a y b; Yang et al., 1997a y b; Aylln et al., 1999a) y en el
RNA2 de LIYV (Rubio et al., 2000). Se ha sugerido que muchos dRNAs de CTV
pueden ser el resultado de la recombinacin de un sgRNA con zonas distantes en el
extremo 5 de su genoma (Bar-Joseph et al., 1997). En PYVV se han descrito dos
dRNAs de estructura ms compleja formados por regiones procedentes de las tres
molculas de RNA (Eliasco et al., 2006). Adems, en CTV se han descrito dRNAs
de gran tamao anlogos al RNA1 y RNA2 del genoma de crinivirus,
respectivamente (Che et al., 2002, 2003).
En virus animales, combinaciones de estrategias de expresin similares se
han descrito en arterivirus y coronavirus, pero no parece existir relacin filogentica
entre stos y los closterovirus, por lo que dicha similitud podra deberse a
fenmenos de convergencia evolutiva (Agranosky et al., 1994).
Ciclo de infeccin de los closterovirus
La mayora de los virus de esta familia son inoculados en las plantas
mediante insectos. Adems, pueden ser transmitidos por injerto y algunos de ellos
por transmisin mecnica (Karasev, 2000). El inicio del ciclo de replicacin requiere
la desencapsidacin de la partcula viral seguido de la traduccin del genoma viral,
que generar la poliprotena que suministrar los componentes proteasa y replicasa
que formarn los complejos de replicacin asociados a las membranas del retculo
endoplasmtico. A continuacin se sintetizar la cadena negativa del RNA
genmico que ser utilizada para la sntesis tanto de las cadenas positivas del
genoma como de los sgRNAs, que se exportarn al citosol. La traduccin de los
17
genomas sintetizados generar la proliferacin de los complejos de replicacin y

simultneamente comenzar el ensamblaje de los viriones al acumularse las
protenas estructurales (Dolja et al., 2006).
Los viriones realizan el movimiento clula a clula a travs de los
plasmodesmos y un transporte sistmico a travs del floema. El movimiento de los
viriones dentro de la clula se realizara gracias a la capacidad de la protena
Hsp70h, presente en la cola, de interaccionar con los microfilamentos de actina y
transportar a los viriones hacia los plasmodesmos, de manera que este movimiento
sera direccional, quedando las colas insertadas en los canales de los plasmodesmos
(Medina et al., 1999; Prokhnevsky et al., 2005). Se ha postulado que los viriones se
desencapsidan al atravesar estos canales, lo que permite que los ribosomas se unan a
los extremos 5 desnudos al entrar en la nueva clula y as comenzar
inmediatamente el proceso de traduccin (Doja et al., 2006).
El ciclo de expresin gnica y replicacin, ensamblaje del virin y
movimiento clula a clula dura aproximadamente un da (Dolja et al., 2006) y se
repite hasta que la infeccin alcanza las clulas acompaantes que tienen conexin a
travs de los plasmodesmos con los elementos cribosos, lo que permite al virus ser
transportado gracias a la corriente del floema a largas distancias hasta llegar a los
rganos sumidero (tallos, hojas y races). Las protenas que intervienen en el
transporte sistmico son p20 y PRO en BYV (Peng et al., 2002; Prokhnevsky et al.,
2002). El establecimiento de la infeccin sistmica supone al menos dos semanas
para las especies que infectan plantas herbceas y hasta varios meses para las de
huspedes leosos (Dolja et al., 2006).
El secuestro masivo del retculo endoplasmtico suele causar citotoxicidad,
que se manifiesta como aclaramiento de las venas, amarilleo y enrollado de las hojas
y marchitamiento (Dolja et al., 2006). Los supresores de silenciamiento gnico
18
codificados por el genoma viral tambin contribuyen al fenotipo de la enfermedad al

interferir con procesos del desarrollo de la planta (Dolja et al., 2006).
Escenario evolutivo de la familia Closteroviridae
Dolja et al. (2006) han propuesto que la lnea monofiltica de los
closterovirus desciende de un virus de plantas perteneciente a la superfamilia de
virus cuyo genoma codificaba una protena con actividad replicasa tpica con los
dominios MTR-HEL-RdRp, una pequea protena hidrofbica de movimiento y una
nica protena (CP) que constitua la cpsida filamentosa. Este progenitor dara lugar
al ltimo ancestro comn de los closterovirus al adquirir varios genes nuevos, como
el dominio PRO y la regin genmica situada entre los dominios MTR y HEL. A su
vez, la protena Hsp70h pudo ser incorporada mediante recombinacin con un RNA
mensajero celular y la protena p59 se originara por duplicacin del gen de la
protena CP. Este ancestro probablemente sera transmitido por insectos. Las tres
lneas actuales de closterovirus, correspondientes a los tres gneros aceptados,
evolucionaron por adaptacin a los distintos tipos de insectos vectores (Karasev,
2000). Las protenas CPm se originaron en este momento a partir de la duplicacin y
divergencia de la CP. Seguidamente, se incorporaron algunos genes adicionales
especficos y conservados dentro de cada gnero, como es el caso del gen que
codifica la protena p21 en el gnero Closterovirus y los genes que codifican las
protenas p9 y p27 en el gnero Crinivirus. De igual manera, algunas de las especies
virales adquirieron genes exclusivos.
Parece ser que la inusual plasticidad gentica de los closterovirus, frente a la
mayor conservacin del genoma de virus de RNA de menor tamao, est
condicionada por la expansin de su genoma, lo que les permite una mayor
capacidad de adaptacin a nuevos nichos ecolgicos, tanto huspedes y vectores
como condiciones medioambientales cambiantes (Dolja et al., 2006)
19
EL VIRUS DEL AMARILLEO DEL TOMATE (TOMATO CHLOROSIS

VIRUS, ToCV)
Organizacin genmica
Hasta la actualidad, se han secuenciado los genomas completos de tres
aislados de ToCV, de Florida (Wintermantel et al., 2005), Espaa (Lozano et al.,
2006b, 2007) y Grecia (Kataya et al., 2008), lo que ha permitido determinar su
organizacin genmica (Fig. 3). ToCV posee un genoma constituido por dos
molculas de RNA, lineales y de sentido positivo que se encapsidan por separado en
viriones largos y flexuosos, ambas necesarias para que el virus sea capaz de infectar
sistmicamente una planta. El RNA 1 est constituido por 8594-8595 nt y
fundamentalmente codifica protenas relacionadas con la replicacin viral, mientras
que el RNA 2, con 8242-8247 nt codifica protenas involucradas en la proteccin del
genoma, movimiento viral y otras funciones todava no identificadas.
El RNA1 est formado por cuatro potenciales ORFs flanqueados por dos
UTRs situados en los extremos 5 y 3 de la molcula (Fig. 3). El ORF1a codifica
una protena que contiene los dominios PRO, MTR y HEL conservados entre las
protenas asociadas con la replicacin viral en todos los miembros de la familia
Costeroviridae (Karasev, 2000). El ORF1b codifica la protena RdRp, que se
traduce por desplazamiento del ribosoma en un nucletido durante la traduccin (+1
frameshift). El ORF2 codifica una protena de 22 KDa, que se ha descrito como un
fuerte supresor de silenciamiento gnico (Caizares et al., 2008). El ORF3 codifica
un pptido con un posible dominio transmembrana similar a otras protenas situadas
en el extremo 3 de los crinivirus, cuya funcin es desconocida.
El RNA 2 de ToCV codifica nueve ORFs flanqueados por dos UTRs situados
en los extremos 5 y 3 de la molcula (Fig. 3). Esta molcula incluye el bloque de
cinco genes caractersticos de la familia Closteroviridae que estaran implicados en
la proteccin del genoma, movimiento viral e interaccin con el vector. Este bloque
20
de genes est formado por el ORF4 que codifica la protena p4, rica en residuos
hidrofbicos, el ORF5 que codifica una protena Hsp70h, el ORF7 que codifica la
protena p59, y el ORF9 y ORF10 que codifican las protenas CP y CPm,
respectivamente. Se ha descrito la actividad supresora de silenciamiento gnico de
las dos ltimas protenas (Caizares et al., 2008). El ORF6 de ToCV codifica la
protena p8, con tamao, posicin genmica y secuencia similar a protenas de otros
miembros de este gnero (Livieratos et al., 2004; Orlio y Navas-Castillo, 2009). El
ORF8 codifica la protena p9, que se encuentra nicamente en los miembros del
gnero Crinivirus y hasta el momento se desconoce su funcin. El ORF 11 codifica
la protena p27, que no posee ORFs homlogos en los otros dos gneros de la
familia, por lo que podra ser exclusivo de crinivirus (Dolja et al., 2006). Por ltimo,
el ORF12 codifica la protena p7, que no presenta similitud significativa con
ninguna protena codificada por los genomas de otros crinivirus, por lo que podra
ser exclusiva de ToCV (Wintermantel et al., 2005; Lozano et al., 2006b).
Cada uno de los extremos 5-UTR del RNA1 y RNA2 est constituido por
301 y 238 nucletidos respectivamente, con una identidad nucleotdica del 33%
entre ambos. Los primeros nucletidos son idnticos en el RNA1 y RNA2,
fenmeno caracterstico tanto del gnero Crinivirus como de otros grupos de virus
con genomas segmentados. La secuencia nucleotdica de los extremos 3-UTR del
RNA1 y RNA2 presenta un alto grado de conservacin, como sucede en el resto de
crinivirus (Wintermantel et al., 2005; Lozano et al., 2006b, 2007), a excepcin de
LIYV, en el que se ha propuesto que sus extremos tengan alguna funcin distinta a
la del resto de virus de este gnero (Aguilar et al., 2003).
21
RNA1
ORF1a
5
PRO
ORF1b
p6
HEL
MTR
ORF2 ORF3
RdRp
p22
RNA2
ORF4
p4
ORF5
ORF6
Hsp70h
p8
ORF7
p59
ORF8 ORF9
p9
ORF10
ORF11 ORF12
CP
3
CPm
p27 p7
Figura 3. Representacin esquemtica de la organizacin genmica de la secuencia nucleotdica del

RNA1 y RNA2 de tomato chlorosis virus. Los marcos abiertos de lectura (ORFs) se muestran como
cajas que aparecen encima, debajo o sobre la lnea que representa el RNA genmico, dependiendo
del marco de lectura en el que se encuentren. PRO, motivo proteasa; MTR, motivo metiltransferasa;
HEL, motivo helicasa; RdRp, RNA polimerasa dependiente de RNA; Hsp70h, protena homloga
de la familia Hsp70; CP, protena de la cpsida; CPm, protena menor de la cpsida.
Transmisin de ToCV por vectores

ToCV se transmite en la naturaleza de manera semipersistente por las
especies de mosca blanca B. tabaci, T. vaporariorum y T. abutilonea (Wisler et al,
1998b), de las cuales slo las dos primeras se encuentran en Europa (Jones, 2003)
(Fig. 4). Este tipo de transmisin, en el que la adquisicin e inoculacin viral
normalmente ocurre en el floema de la planta, es no circulativa, es decir, el virus no
necesita ser translocado dentro de rganos internos del vector para ser transmitido,
aunque el periodo de adquisicin es mayor que en la transmisin no persistente (Ng
y Falk, 2006b). En un estudio de Wintermantel y Wisler (2006) se ha demostrado
que la eficiencia de la transmisin de ToCV as como la persistencia del virus en el
22
vector es variable entre las diferentes especies de mosca blanca que lo transmiten.
En este trabajo se observ que B. tabaci biotipo B y T. abutilonea presentan mayor
eficiencia de transmisin que B. tabaci biotipo A y T. vaporariorum. ToCV se
mantiene hasta 5 das en T. abutilonea, 2 das en B. tabaci biotipo B y slo un da en
B. tabaci biotipo A y T. vaporariorum. Se ha comparado la eficiencia de transmisin
de ToCV y TICV mediante T. vaporariorum en infecciones simples y mixtas, no
encontrndose diferencias significativas (Dalmon et al., 2009). Adems, se ha
comprobado que la coinfeccin de ambos virus altera el patrn de acumulacin de
cada uno de ellos de una manera especfica de husped y la eficiencia de transmisin
depende de la concentracin viral en la planta utilizada como fuente de inculo
(Wintermantel et al., 2008).
Figura 4. Individuos adultos de Bemisia tabaci (A), Trialeurodes vaporariorum (B) y T. abutilonea
(C).
Desde el ltimo cuarto del siglo pasado las poblaciones de B. tabaci han
aumentado de manera significativa en muchas zonas del mundo, especialmente en
las regiones con clima tropical, subtropical, rido y mediterrneo (Morales, 2007).
No se conocen las causas de este incremento aunque se especula sobre una
combinacin de factores como son el uso abusivo de insecticidas orgnicos
sintticos que provoca la aparicin de poblaciones resistentes, la intensificacin de
las prcticas agrcolas de tipo monocultivo, el transporte de material vegetal
infestado entre pases e incluso el cambio climtico global (Lacasa et al., 1998;
Wisler et al., 1998a). Desde la dcada de 1990, las poblaciones de T. vaporariorum
23
parecen estar siendo desplazadas progresivamente por las de B. tabaci en distintas

zonas del mundo (Clix et al., 1996; Berdiales et al., 1999).
En la especie B. tabaci existen variantes denominadas biotipos,
indistinguibles morfolgicamente, pero con caractersticas biolgicas diferenciales
que incluyen la gama de plantas husped (Brown et al., 1995; Guirao et al., 1997).
Se ha sugerido que la rpida y reciente dispersin de B. tabaci en todo el mundo
podra deberse al desplazamiento de algunos de los biotipos autctonos por el
biotipo B, con mejor capacidad de adaptacin (Bedford et al., 1994). En nuestro
pas, a diferencia de lo que se ha descrito en otros, el biotipo mayoritario no es el B
sino un biotipo que es probablemente autctono de la regin mediterrnea, el biotipo
Q (Banks et al., 1998; Simn et al., 2001). En Norte Amrica, por ejemplo, s ha
tenido lugar el desplazamiento del biotipo A preexistente por el B (Wisler et al.,
1998a).
Existe poca informacin acerca de los determinantes virales de los miembros
de la familia Closteroviridae implicados en la transmisin por vectores. Los trabajos
desarrollados hasta el momento indican que la protena CPm de closterovirus est
implicada en el proceso de transmisin (Tian et al., 1999) y que las diferencias
encontradas en la secuencia y el tamao de esta protena pudieran estar implicadas
en la especificidad de estos virus por la especie de mosca blanca (Livieratos et al.,
2001). Se ha sugerido que las protenas CPm de BYV y CTV tambin estaran
implicadas en la transmisin por los vectores, en este caso pulgones (Agranovsky et
al., 1995; Febres et al., 1996).
Sntomas en tomate
Los sntomas producidos por ToCV en tomate consisten en manchas
clorticas irregulares que evolucionan hacia una clorosis internervial que aparece
inicialmente en las hojas inferiores y que posteriormente se extiende hacia la parte
superior de la planta. A veces aparecen manchas de color prpura y necrosis. Las
24
hojas viejas se enrollan longitudinalmente y adquieren textura quebradiza (Fig. 5).

Estos sntomas son similares a los producidos por TICV en tomate (Duffus et al.,
1996; Wisler et al., 1998a).
B
A
Figura 5. Sntomas de amarilleo en plantas de tomate causados por la infeccin por tomato
chlorosis virus. A: Amarilleo internervial en hojas adultas de una planta infectada (derecha) junto a
una planta asintomtica (izquierda). B: Planta de tomate totalmente afectada por amarilleo
(derecha) junto a una planta asintomtica (izquierda).
La produccin puede verse disminuida debido a la reduccin de la capacidad

fotosinttica de las plantas afectadas. En ocasiones se observa una reduccin en el
nmero y tamao de los frutos (Wisler et al., 1998a), as como aborto floral y falta
de cuajado de frutos o retraso en la maduracin y falta de coloracin adecuada de los
mismos (Lozano et al., 2006a). El sndrome de amarilleo causado por ToCV puede
ser confundido con desrdenes fisiolgicos o nutricionales e incluso con
fitotoxicidad por pesticidas (Wisler et al., 1998b).
25
Gama de huspedes
Adems de tomate, ToCV infecta de manera natural otras especies de la
familia Solanaceae, as como algunas de las familias Chenopodiaceae y Compositae
(Tabla 1). La gama de huspedes experimentales de ToCV es ms amplia,
comprendiendo al menos 25 especies pertenecientes a ocho familias, e incluye
algunos cultivos importantes, plantas ornamentales y malas hierbas (Tabla 2). Los
sntomas producidos por ToCV varan dependiendo del husped pero normalmente
consisten en un amarilleo internervial y sntomas similares a los producidos en
tomate (Wintermantel y Wisler, 2006). Estos huspedes, al actuar como reservorios
naturales del virus, podran influir en la epidemiologa de la enfermedad en tomate u
otros cultivos.
Tabla 1. Huspedes naturales de ToCV (Wisler et al., 1998b; Louro et al., 2000b; Font et al., 2004;
Lozano et al., 2004; Tsai et al., 2004; Trenado et al., 2007).
Familia
Chenopodiaceae
Compositae
Solanaceae
26
Especies susceptibles
Chenopodium album L.
C. murale L.
Zinnia elegans Jacp.
Solanum lycopersicum L.
S. nigrum L.
Capsicum annuum L.
Datura stramonium L.
Physalis ixocarpa Brot.
P. peruviana L.
Tabla 2. Huspedes experimentales de ToCV (Morris et al., 2006; Wintermantel y Wisler, 2006;
Trenado et al., 2007).
Familia
Aizoaceae
Especies susceptibles
Tetragonia expans Murr.
Amaranthaceae
Apocynaceae
Chenopodiaceae
Gomphrena globosa L.
Vinca rosea L.
Beta macrocarpa Guss.
Chenopodium capitatum (L.) Asch.
C. murale L.
Spinacia oleracea L.
Callistephus chinensis (L.) Nees
Calendula officinalis L.
Limonium latifolium (J.E. Sm.) Kuntze
Compositae
Plumbaginaceae
Solanaceae
Umbelliferae
Solanum lycopersicum L.
S. nigrum L.
S. acaule Bitter
Nicotiana benthamiana Domin.
N. clevelandii Gray
N. edwardsonii Christie & D.W. Hall
N. glutinosa L.
N. megalosiphon Huerch & Muell.
N. tabacum L.
Petunia hybrida Vilm.
Physalis alkekengi L.
P. ixocarpa Brot.
P. peruviana L.
P. wrightii Gray
Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt
Anthriscus cereifolium (L.) Hoffm.
En el ao 1999 se observaron por primera vez plantas de pimiento cultivadas

en invernadero en la provincia de Almera con sntomas de amarilleo internervial en
hojas adultas que recordaban a los ocasionados por crinivirus en otros cultivos.
Adems, estas plantas presentaban abarquillado de las hojas, acortamiento de los
entrenudos, reduccin de la altura, falta de vigor y aborto floral (Fig. 6). En estos
cultivos tambin eran frecuentes fuertes infestaciones de la mosca blanca B. tabaci,
27
lo que unido a la sintomatologa observada y a la presencia en zonas prximas de

cultivos de tomate con altas incidencias de amarilleo, hizo sospechar de la posible
infeccin por ToCV de las plantas sintomticas. El anlisis molecular confirm la
presencia de ToCV en las plantas de pimiento que presentaban el sndrome
anteriormente descrito, siendo sta la primera descripcin mundial de pimiento
como husped natural de este virus (Lozano et al., 2004).
B
A
Figura 6. Sntomas observados en plantas de pimiento cultivadas en invernadero asociados a las

primeras infecciones por ToCV detectadas en Espaa en la provincia de Almera. A: Manchas
clorticas internerviales en hojas y abarquillado hacia el haz. B: Reduccin del crecimiento de las
plantas. La flecha indica una planta sintomtica.
Distribucin geogrfica
ToCV fue detectado por primera vez en 1989 en cultivos de tomate de Florida
que mostraban un sndrome que se denomin desorden de la hoja amarilla (yellow
leaf disorder) o amarilleo, y se ha identificado en otras zonas de Estados Unidos
como Colorado y Louisiana (Wisler et al., 1998b). Posteriormente, este virus se
detect en Espaa (Navas-Castillo et al., 2000), Portugal (Louro et al., 2000a), Italia
28
(Accotto et al., 2001), Grecia (Dovas et al., 2002), Puerto Rico (Wintermantel et al.,
2001), Marruecos (Hanafi, 2002), Taiwn (Tsai et al., 2004), Israel (Segev et al.,
2004), Francia (Dalmon et al., 2005), Chipre (Papayiannis et al., 2006), Lbano
(Abou-Jawdah et al., 2006), Islas Reunin (Delatte et al., 2006), Sudfrica (EPPO,
2006), Mxico (Alvarez-Ruiz et al., 2007), Islas Mayotte (Mass et al., 2008),
Turqua (evik y Erki, 2008), Brasil (Barbosa et al., 2008), Cuba (MartnezZubiaur et al., 2008), Islas Mauricio (Lett et al., 2009), Costa Rica (Castro et al.,
2009) y Japn (Hirota et al., 2010) (Fig. 7).
Figura 7. Distribucin mundial de ToCV.
En 1997 se observaron de forma espordica en los cultivos de tomate bajo

plstico de las provincias de Almera y Mlaga sntomas inusuales y similares a los
descritos para las infecciones de ToCV y TICV (Duffus et al., 1996; Wisler et al.,
1998b). En aos posteriores el nmero de plantas afectadas por este sndrome
aument de manera notable en muchos invernaderos. Los sntomas observados,
junto con su distribucin en campo y asociacin con la presencia de la mosca blanca
B. tabaci, hizo sospechar de la implicacin de algn virus transmitido por este
29
insecto. Anlisis llevados a cabo mediante tcnicas moleculares confirmaron que

ToCV era el agente causal de esta sintomatologa (Navas-Castillo et al., 2000).
Desde entonces, se han sucedido epidemias anuales de amarilleo en el sur y sudeste
peninsular e Islas Canarias, con incidencias cada vez mayores, alcanzndose con
frecuencia infecciones del 100% (Lozano et al., 2006a). Hasta el momento se ha
encontrado ToCV en las provincias de Barcelona, Castelln, Valencia, Alicante,
Murcia, Almera, Granada, Cdiz, Mlaga, Sevilla, Islas Baleares, Santa Cruz de
Tenerife y Gran Canaria (Font et al., 2003, 2004; Lozano et al., 2006a).
ToCV tambin ha sido detectado puntualmente en Espaa y Portugal
infectando poblaciones naturales de las malas hierbas Solanum nigrum y Datura
stramonium (Louro et al., 2000b; Font et al., 2004).
Diagnstico
Los sntomas que ToCV y TICV producen en tomate son muy similares y
prcticamente indistinguibles, pero puede diferenciarse entre ambos utilizando
plantas indicadoras. As, Nicotiana benthamiana y N. clevelandii presentan
amarilleos internerviales cuando estn infectadas por TICV o ToCV, pero
nicamente TICV induce manchas necrticas (Wisler et al., 1998b). Este
diagnstico biolgico, que implica la transmisin mediante insectos vectores, no
slo es tedioso sino que requiere varias semanas para obtener los resultados y no es
prctico para el anlisis de un gran nmero de muestras.
Para el diagnstico rutinario de numerosos virus de plantas se han aplicado
con xito mtodos serolgicos como la tcnica inmunoenzimtica ELISA. Se han
producido antisueros policlonales frente a TICV (Duffus et al. 1996, Wisler et al.,
1998b) y frente a la protena de la cpsida de ToCV (Jacquemond et al., 2008), que
se han utilizado para el diagnstico de muestras de tomate infectadas de forma
natural y experimental. No obstante, se han encontrado problemas de diversa
naturaleza en la produccin de los antisueros y en el desarrollo del test ELISA: i) las
30
protenas de la cpsida de ToCV y TICV parecen tener escasas propiedades

inmunognicas, ii) son termosensibles y iii) se obtuvieron regularmente falsos
negativos, particularmente con ToCV. Esto hace que el test ELISA no sea
plenamente fiable para el diagnstico rutinario de estos virus (Jacquemond et al.,
2008).
Una alternativa a los mtodos serolgicos y que se ha aplicado con xito para
el diagnstico de virus de plantas es la hibridacin molecular con sondas marcadas
con digoxigenina. En el caso de ToCV se ha descrito la produccin de sondas
especficas de los genes Hsp70h y CP para el diagnstico en dot-blot o en improntas
de secciones transversales de peciolo de hoja (Louro et al., 2000a; Lozano et al.,
2006a).
Tambin se han desarrollado mtodos de deteccin de ToCV mediante
transcripcin reversa del RNA viral y posterior amplificacin mediante PCR. Se han
diseado iniciadores degenerados del gen Hsp70h que amplifican los genomas de
ToCV y TICV (Navas-Castillo et al., 2000) e iniciadores especficos de este gen y el
de la protena CP de ToCV (Louro et al., 2000a, Trenado et al., 2007). Dovas et al.
(2002) desarrollaron un mtodo basado en RT-PCR mltiple para la deteccin
simultnea de ambos virus; el proceso se realiza en dos pasos, RT-PCR usando
iniciadores degenerados para amplificar una regin del gen Hsp70h de ambos virus,
seguido de PCR nested mediante iniciadores especficos de cada uno de ellos.
Jacquemond et al. (2008) han desarrollado una RT-PCR mltiple con iniciadores del
gen CP para la deteccin de ToCV y TICV en un nico anlisis, permitiendo as la
deteccin de infecciones mixtas.
GENERACIN DE CLONES INFECTIVOS DE VIRUS DE RNA
La disponibilidad de clones infectivos de virus de RNA constituye una
herramienta muy valiosa para el estudio de distintos aspectos de su biologa. De
hecho, ha facilitado especialmente el estudio de aquellos virus que se encuentran en
31
la planta a ttulos muy bajos o cuya purificacin resulta muy complicada, adems de
presentar una ventaja para el estudio y manejo de aquellos virus transmitidos por
vectores. Esta herramienta permite manipular el genoma viral mediante mutaciones,
deleciones, inserciones y llevar a cabo experimentos de complementacin que
proporcionan informacin relevante sobre la biologa del virus (expresin gnica,
replicacin y movimiento) y sobre la interaccin virus-planta (Boyer y Haenni,
1994).
Los clones infectivos de virus de plantas de RNA de polaridad positiva
consisten tpicamente en un cDNA complementario al RNA genmico del virus y
una secuencia promotora de la transcripcin fusionada a su extremo 5 en un
plsmido bacteriano que acta como vector de clonacin.
Los principales pasos a seguir para la obtencin de un clon infectivo as como
algunas de las limitaciones ms comunes encontradas durante su desarrollo se
describen brevemente a continuacin. El primer paso consiste en la sntesis de un
cDNA complementario a la longitud total del genoma viral. La forma ms habitual
de obtenerlo es mediante una reaccin de transcripcin reversa sobre una
preparacin de virus purificado o extraccin de RNA total de planta infectada
utilizando un iniciador especfico del extremo 3 del genoma viral. La existencia de
estructuras secundarias en el molde de RNA viral puede complicar la obtencin de
la cadena sencilla de cDNA (Boyer y Haenni, 1994). Una vez obtenida, la primera
cadena de cDNA se convierte mediante PCR en cadena doble, iniciando la sntesis
con un segundo iniciador complementario al extremo 5 del RNA viral. Para facilitar
pasos posteriores, en los extremos de los iniciadores se suelen situar dianas de
restriccin para permitir realizar clonacin dirigida del cDNA en un vector adecuado
(Boyer y Haenni, 1994). La obtencin de un clon infectivo a partir de un genoma de
RNA de gran tamao presenta dificultad ya que la fidelidad de las transcriptasas
reversas y las DNA polimerasas decrece proporcionalmente con la longitud del
RNA (Lai, 2000). Existen alternativas como generar varios cDNAs con regiones
32
solapantes que unidos cubran la longitud total del genoma (Dawson et al., 1986).
Factores como el empleo de polimerasas termoestables de alta fidelidad y altamente
procesivas o incluso la cepa de virus con la que se trabaja puede en ocasiones influir
directamente en la infectividad del cDNA generado. Adems, una vez obtenido el
cDNA pueden surgir problemas de distinta naturaleza en los pasos posteriores que
dificulten la clonacin en s, como problemas de toxicidad en E. coli del cDNA
clonado (Boyer y Haenni, 1994) y la falta de vectores de clonacin adecuados para
genomas de gran tamao (Lai, 2000). Algunos de estos problemas se han resuelto
mediante la introduccin de intrones de planta (Yamshchikov et al., 2001),
utilizando vectores de bajo nmero de copia (Gritsun y Gould, 1998) o vectores
BAC (cromosomas artificiales bacterianos) (Almazn et al., 2000). Otro problema a
evitar es la presencia de nucletidos no virales en los extremos 5 y 3 del transcrito
que pueden reducir la infectividad (Boyer y Haenni, 1994).
En cuanto al promotor de transcripcin, un aspecto crtico en el desarrollo de
un clon infectivo es decidir si el cDNA va a ser expresado en un sistema in vitro o in
vivo. Si la expresin del cDNA va a realizarse in vitro, la seleccin del promotor
(procedente en la mayora de los casos de bacterifagos) ser muy importante ya que
puede afectar directamente al rendimiento de la transcripcin y a la secuencia de los
extremos terminales de los transcritos (Boyer y Haenni, 1994). Los promotores ms
utilizados son los de las RNA polimerasas de los bacterifagos T7, SP6 y T3. La
estrategia ms utilizada, por su simplicidad y eficacia, es la fusin del promotor al
cDNA viral por medio de PCR, introduciendo su secuencia en el iniciador del
extremo 5 precediendo a la secuencia del virus. Por otro lado, en el extremo 3 de la
secuencia viral se suele situar una diana de restriccin, para digerir el plsmido y
establecer la finalizacin de la transcripcin. Una vez obtenido el transcrito, ste
podr ser utilizado para la inoculacin de plantas (mediante inoculacin mecnica) o
de protoplastos (mediante electroporacin o mtodos qumicos como la utilizacin
de polietilenglicol). Varios parmetros pueden influir en la infectividad de los
33
transcritos: i) la heterogeneidad de la poblacin generada, ii) la presencia de

mutaciones y iii) la secuencia de los extremos 5 y 3 (presencia de nucletidos no
virales, necesidad de una estructura cap en el extremo 5 o una cola poli-A en el
extremo 3).
Para introducir el cDNA en la planta y lograr su transcripcin in vivo existen
dos alternativas principales, la infeccin mediante Agrobacterium tumefaciens
(agroinoculacin) y el bombardeo de partculas (biolstica). En la agroinoculacin
(Grimsley et al., 1986), el cDNA se sita bajo el control de un promotor de
transcripcin constitutivo (normalmente el promotor del RNA 35S de cauliflower
mosaic virus) y una seal de terminacin (como el terminador nos del gen de la
nopalina sintetasa de A. tumefaciens). La construccin resultante se introduce en un
vector binario que posee la secuencia repetida de los bordes izquierdo (left border,
LB) y derecho (right border, RB) del T-DNA. Durante la infeccin provocada por
A. tumefaciens, una copia de la regin del T-DNA situada entre LB y RB es
transferida al ncleo de la clula. Una vez all, acta la maquinaria de transcripcin
y, en su caso, de poliadenilacin y finalmente el RNA viral es trasladado al
citoplasma donde se inicia la infeccin viral.
Por otro lado, en la metodologa basada en la biolstica, que se ha utilizado
para la infeccin de plantas con RNA viral (Klein et al., 1987) y cDNA (Gal-On et
al., 1995), la inoculacin se lleva a cabo mediante el disparo de microproyectiles de
oro o tungsteno que van recubiertos de DNA, que se introducen directamente en el
ncleo de la clula. En este caso, el cDNA tambin se sita bajo el control de un
promotor de transcripcin y contiene una seal de terminacin.
Clones infectivos de virus de la familia Closteroviridae
Los miembros de la familia Closteroviridae poseen los genomas de RNA de
mayor tamao entre los virus de plantas. Esto determina que la obtencin de clones
34
infectivos de estos virus sea un proceso especialmente dificultoso debido a la

concatenacin de algunos de los problemas mencionados en el apartado anterior.
Hasta el momento, se ha logrado la construccin de clones de cDNA
completos e infectivos de slo cuatro especies de esta familia, tres del gnero
Closterovirus, BYV (Peremyslov et al., 1998), CTV (Satyanarayana et al., 1999) y
GLRaV-2 (Liu et al., 2009), y uno del gnero Crinivirus, LIYV (Klaassen et al.,
1996). En el caso de CTV, BYV y LIYV, la infectividad se logr en primer lugar
mediante la inoculacin de transcritos generados in vitro a partir de promotores de
RNA polimerasas de bacterifagos (SP6, T3) en protoplastos de N. benthamiana o
N. tabacum. La disponibilidad de estos clones ha permitido determinar las funciones
de algunos de los mltiples genes que conforman el genoma de estos virus.
Mediante la inoculacin de transcritos obtenidos in vitro de clones infectivos
de BYV en protoplastos de N. tabacum y anlisis mutacionales se ha identificado
que los genes ORF1a y ORF1b son esenciales para la replicacin del RNA y que la
protena p21 funciona como un intensificador de este proceso (Peremyslov et al.,
1998). Utilizando modificaciones de estos clones que incluan el gen GUS (glucuronidasa) fusionado a diversos genes virales, se ha determinado la cintica de
transcripcin de los genes Hsp70h, CPm, CP, p64, p21 y p20 de este virus
(Hagiwara et al., 1999). Utilizando diversos mutantes se ha determinado que la
protena CP es esencial en la encapsidacin del cuerpo del virin (Alzhanova et al.,
2001) y las protenas CPm, Hsp70 y p64 en la encapsidacin de la cola (Alzhanova
et al., 2001; Napuli et al., 2003). Mediante la inoculacin mecnica de transcritos
obtenidos in vitro a partir de construcciones con GFP (green fluorescent protein) de
mutantes de BYV en Claytonia perfoliata o N. benthamiana se observ que las
protenas CP, CPm Hsp70h, p64 y p6 son esenciales para el movimiento intercelular
del virus (Peremyslov et al., 1999; Alzhanova et al., 2000; Napuli et al., 2003).
35
En el caso de CTV, mediante la delecin de los 10 genes del extremo 3, se

obtuvo un clon infectivo eficiente y ms fcilmente manipulable (Satyanarayana et
al., 1999), y por tanto se determin que estos genes no son esenciales para la
replicacin viral. Mediante anlisis mutacionales en el extremo 3-UTR se
determin que esta regin est implicada en una correcta replicacin del virus
(Satyanarayana et al., 2002a). La obtencin y manipulacin de diversos
minireplicones en los que se suprimieron o mutaron distintas regiones genmicas
codificantes tambin ha permitido avanzar en el conocimiento de la regulacin
gnica. Se han caracterizado los elementos controladores de los sgRNAs de los
genes CP y CPm y se ha determinado que cada elemento produce tres sgRNAs, uno
de polaridad positiva 5 terminal y dos de polaridad positiva y negativa 3 terminales
(Gowda et al., 2001). Adems, se ha localizado un elemento controlador en el
extremo 5 del genoma de CTV que produce sgRNAs 5 y 3 terminales (Gowda et
al., 2003a). Deleciones en el gen que codifica la protena p23 pusieron de manifiesto
su influencia en la acumulacin asimtrica del las cadenas de RNA positivas y
negativas de CTV as como la regin implicada en ello (Satyanarayana et al.,
2002b). Mediante la utilizacin del sistema gentico de CTV tambin se han
determinado las protenas implicadas en un eficiente ensamblaje del virin, como
son la CP, CPm, Hsp70h y p61 (Satyanarayana et al., 2000) as como el extremo 5UTR (Gowda et al., 2003b). Se ha observado la encapsidacin del virus por parte de
la CPm en ausencia de la CP, mientras que en presencia de Hsp70h y p61 se
restringe la encapsidacin a unos 630 nt del extremo 5 (Satyanarayana et al., 2004).
A pesar de que tanto los niveles de replicacin como la cantidad de viriones
formados en protoplastos de N. benthamiana es muy baja, la amplificacin mediante
pases sucesivos a nuevos lotes de protoplastos se ha utilizado para la obtencin de
cantidades suficientes de viriones para la posterior inoculacin mecnica en plantas
de ctricos (Satyanarayana et al., 2001). Esto ha permitido poner de manifiesto que
las protenas p33, p18 y p13 no estn implicados en el movimiento, mientras que
mutaciones en los genes que codifican las protenas p6 o p20 impidieron la infeccin
36
sistmica (Satyanarayana et al., 2008). Con el sistema gentico de CTV e

inoculacin de protoplastos tambin se han realizado estudios sobre replicacin y
acumulacin de RNAs defectivos (Mawassi et al., 2000a y b).
En el caso de LIYV, especie tipo del gnero Crinivirus, los estudios con
clones infectivos en protoplastos de N. benthamiana han permitido determinar que el
RNA1 es capaz de replicarse en ausencia del RNA2 (Klaassen et al., 1996), siendo
necesarios los dos RNAs para la formacin de viriones (Medina et al., 1998). Por
otra parte, se ha observado la acumulacin asincrnica de los RNA1 y RNA2
virales, ya que se detectan desde las 12 y 36 horas despus de la inoculacin
respectivamente (Yeh et al., 2000). Mediante anlisis mutacional se confirm que
las protenas esenciales en la replicacin se encuentran en el RNA1 (Yeh et al.,
2000; Wang et al., 2009b) y que la replicacin de esta molcula tiene lugar
preferencialmente en cis (Wang et al., 2009b). Adems, se ha determinado que la
protena p32 codificada por el ORF2 del RNA1 de LIYV reduce drsticamente la
acumulacin del RNA2 (Yeh et al., 2000) y no se requiere para la replicacin del
RNA1 (Wang et al., 2009b). Tambin se ha desarrollado un sistema para la
transmisin a plantas de lechuga mediante B. tabaci de viriones de LIYV generados
a partir de inoculacin de transcritos obtenidos in vitro en protoplastos de N.
tabacum (Ng y Falk, 2006a). Mediante el sistema gentico de LIYV tambin se han
realizado estudios sobre la acumulacin y transmisin de RNAs defectivos de este
virus (Rubio et al., 2000, 2002; Yeh et al., 2001; Ng et al., 2004).
A pesar de los avances obtenidos con el sistema de protoplastos, ste presenta
importantes limitaciones como la dificultad de su inoculacin con RNAs de gran
tamao (Satyanarayana et al., 1999), la baja infectividad de los transcritos obtenidos
in vitro y la necesidad de realizar sucesivos pases para obtener una cantidad
suficiente de viriones para posteriormente infectar plantas (Satyanarayana et al.,
2001). Estos inconvenientes, unido a la posible contaminacin del cultivo, hacen que
el sistema sea muy lento e incierto en sus resultados. En un intento de disponer de
37
un sistema alternativo ms eficiente, se ha ensayado la obtencin de clones de

cDNA que contienen el promotor constitutivo 35S de CaMV para generar transcritos
in vivo. Mediante la agroinoculacin de plantas de N. benthamiana con este sistema
se ha demostrado que la protena p20 de BYV es necesaria para el transporte del
virus a travs del floema (Prokhnevsky et al., 2002) y que forma parte de la cola del
virin junto con la CPm, Hsp70h y p64, los cuales encapsidan aproximadamente
650 nt del extemo 5 (Peremyslov et al., 2004a; Alzhanova et al., 2007). Se ha
observado que la protena p6 est implicada en el movimiento viral y est asociada
con el retculo endoplasmtico (Peremyslov et al., 2004b) y se ha demostrado que la
protena Hsp70h se ancla a los plasmodesmos en asociacin con el citoesqueleto de
actina (Prokhnevsky et al., 2005). La coinoculacin de la protena p21, que posee
actividad supresora de silenciamiento gnico, junto con el clon infectivo de BYV,
result en un incremento de su infectividad en plantas de N. benthamiana en tres
rdenes de magnitud (Chiba et al., 2006).
Mediante la agroinoculacin con un vector binario portador del cDNA de
CTV de plantas de N. benthamiana se ha obtenido infeccin en las hojas
agroinfiltradas (Gowda et al., 2004; Ambrs et al., 2006) e infeccin sistmica,
(Ambrs et al. 2008) y a partir de la purificacin de viriones se obtuvo la infeccin
de plantas de ctricos en las que se reproducan los sntomas caractersticos del
aislado original (Gowda et al., 2004; Ambrs et al., 2008). Tambin se ha generado
un clon agroinfectivo de GLRaV-2 con el que se ha logrado la infeccin sistmica
de plantas de N. benthamiana (Liu et al., 2009).
Recientemente, mediante agroinoculacin con clones infectivos del RNA1 y
RNA2 de LIYV, se ha obtenido la infeccin sistmica de plantas de N. benthamiana,
logrndose reproducir los sntomas caractersticos que causa este crinivirus (Wang et
al., 2009a). A partir de viriones purificados de las plantas de N. benthamiana, se ha
logrado la infeccin de plantas de lechuga mediante transmisin por B. tabaci
(Wang et al., 2009a).
38
VARIABILIDAD Y EVOLUCIN DE LAS POBLACIONES DE VIRUS DE

PLANTAS
Los virus, y en particular los que poseen un genoma de RNA, tienen el
potencial de sufrir cambios en su genoma y establecer poblaciones muy diversas
debido a sus elevadas tasas de replicacin y a la ausencia de mecanismos correctores
durante este proceso (Hull, 2002; Roossinck, 2003). Este potencial de variacin
gentica puede plasmarse en cambios ms o menos rpidos de la estructura gentica
de sus poblaciones naturales (Garca-Arenal et al., 2001). En este apartado se
describen los mecanismos generadores de diversidad gentica y los procesos que
determinan la estructura gentica de las poblaciones de virus.
Mecanismos generadores de diversidad gentica en los genomas virales
Los principales mecanismos que generan variabilidad gentica en las
poblaciones virales son la mutacin, la recombinacin y la reordenacin de
fragmentos en virus con genomas multipartitos.
La mutacin es el proceso por el que nucletidos que no se encuentran en la
secuencia molde se incorporan, eliminan o sustituyen en la secuencia hija durante la
replicacin de los cidos nucleicos. Es importante diferenciar entre tasa de mutacin
y frecuencia de mutacin. La tasa de mutacin cuantifica la falta de fidelidad de
copia durante el proceso de replicacin, mientras que la frecuencia de mutacin es la
proporcin que representa un genoma mutado dentro de la poblacin (Domingo y
Holland, 1997). La tasa de mutacin de genomas de RNA oscila en un rango entre
10-3 y 10-5 sustituciones por nucletido incorporado y ciclo de replicacin (Domingo
y Holland, 1994; Domingo et al., 2001, 2006; Malpica et al., 2002), mientras que en
el caso de la replicacin del DNA celular se han estimado valores mucho menores,
entre 10-8 y 10-11 (Kunkel y Alexander, 1986; Echols y Goodman, 1991). Se ha
postulado que la baja fidelidad de copia durante la replicacin de RNA viral se debe
a la ausencia de actividad correctora de errores (actividad exonucleasa 3-5) de la
39
RNA polimerasa dependiente de RNA (Domingo y Holland, 1997). Aunque las

tasas de mutacin puedan ser similares en todos los virus de RNA, las frecuencias de
mutacin muestran un alto grado de variabilidad de unos virus a otros (Drake, 1993;
Roossinck, 1997, Roossinck y Schnedier, 2006). La existencia de altas tasas de
mutacin en las poblaciones virales puede ser un requisito para su supervivencia, ya
que puede ser una de las bases de su capacidad de adaptacin a cambios que puedan
surgir en el medio ambiente.
Las poblaciones de virus de RNA en general son heterogneas y no estn
constituidas por un nico genotipo, sino que siguen distribuciones dinmicas
complejas de mutantes diferentes, aunque estrechamente relacionados entre s. Esta
distribucin de mutantes en torno a una secuencia consenso recibe el nombre de
cuasiespecie (Domingo y Holland, 1994, 1997). Las cuasiespecies son un conjunto
de variantes interactivas, en continuo proceso de variacin gentica, competicin y
seleccin, que contribuyen a las caractersticas de la poblacin y su conjunto sera el
objetivo de la seleccin evolutiva (Domingo, 2006).
Las poblaciones virales pueden diferenciarse de acuerdo a factores como la
localizacin geogrfica, el husped, el tiempo o las fluctuaciones al azar en su
composicin. Algunos ejemplos sugieren que la estructura poblacional de los
huspedes o de los vectores puede tener un papel fundamental en la determinacin
de la estructura poblacional de los virus (Garca-Arenal et al., 2001).
La recombinacin es el proceso por el cual se intercambian fragmentos de
informacin gentica entre cadenas de nucletidos del genoma de diferentes
variantes durante el proceso de replicacin. ste es uno de los mecanismos ms
importantes de generacin de nuevos genomas y de adquisicin de ventajas
selectivas respecto a los genomas parentales, permitiendo as mismo contrarrestar
mutaciones deletreas (Nagy y Simon, 1997). El anlisis de secuencias de
poblaciones de virus de plantas, tanto de RNA como de DNA, ha evidenciado que la
40
recombinacin puede ser una de las mayores fuentes de variacin implicadas en su

evolucin (Chenault y Melcher, 1994; Revers et al., 1996; Padidam et al., 1999;
Moonan et al., 2000; Roossinck, 2005).
Existen numerosos ejemplos que demuestran la existencia de fenmenos de
recombinacin en genomas de virus de RNA y DNA de plantas. As, en virus de
RNA pueden citarse trabajos llevados a cabo con luteovirus (Gibbs y Cooper, 1995),
potyvirus (Bousalem et al., 2000; Moreno et al., 2004), tobravirus (MacFarlane,
1997), bromovirus (Allison et al., 1989; Bujarski y Kaesberg, 1986), closterovirus
(Bar-Joseph et al., 1997; Rubio et al., 2001b), cucumovirus (Fernndez-Cuartero et
al., 1994) y tobamovirus (Fraile et al., 1997a). A pesar de los numerosos ejemplos
existentes, la frecuencia de recombinantes no parece ser muy elevada en las
poblaciones naturales de virus de RNA (Roossinck, 1997, 2002). A diferencia de lo
que ocurre en virus de RNA, la recombinacin parece ser un fenmeno muy
frecuente y de gran importancia en la evolucin de los virus del gnero Begomovirus
(familia Geminiviridae) (cuyo genoma est constituido por DNA monocatenario
circular) (Padidam et al., 1999). Se han descrito numerosos ejemplos de especiacin
en este gnero en los que han intervenido fenmenos de recombinacin, que
incluyen virus de importancia econmica como los que forman el complejo que
causa el rizado amarillo del tomate (Monci et al., 2002; Garca-Andrs et al., 2006).
Diversos trabajos, esencialmente realizados con virus de animales, han puesto
de manifiesto que la recombinacin parece haber ejercido un papel fundamental en
la evolucin de los virus de RNA y que podra constituir un mecanismo para
contrarrestar la acumulacin de mutaciones deletreas en los genomas virales, as
como para originar nuevos genomas mejor adaptados al medio (Lai, 1992; Domingo
et al., 1996, 2006; Worobey y Holmes, 1999; Bonnet et al., 2005), lo que podra
generar cambios drsticos de las propiedades biolgicas del virus que pueden dar
lugar a un incremento de sus ventajas adaptativas (Fernndez-Cuartero et al., 1994).
Este fenmeno puede resultar en consecuencias epidemiolgicas graves como la
41
aparicin de aislados capaces de superar resistencias genticas, la ampliacin de la

gama de huspedes (Monci et al., 2002; Garca-Arenal y McDonald, 2003;
Ndunguru et al., 2005; Garca-Andrs et al., 2006) o cambios en la virulencia
(Gibbs et al., 2001).
El reordenamiento gnico o pseudo-recombinacin es el proceso por el cual
tiene lugar un intercambio de segmentos genmicos en virus con genomas
multipartitos o segmentados. Se han descrito algunos ejemplos de pseudorecombinacin en poblaciones naturales de virus de plantas con genoma de RNA en
los gneros Tenuivirus (Miranda et al., 2000), Tospovirus (Qiu et al., 1998) y
Cucumovirus (White et al., 1995). En virus de DNA tambin se han observado
fenmenos de pseudo-recombinacin, como es el caso del intercambio entre los
componentes DNA A y DNA B de especies del gnero Begomovirus descrito en
East African cassava mosaic virus (Pita et al., 2001) o cotton leaf crumple virus
(Idris y Brown, 2004).
Procesos que determinan la estructura gentica de las poblaciones virales
La estructura gentica o distribucin de las distintas variantes en una
poblacin viral, generadas por los mecanismos que se acaban de describir, va a estar
determinada principalmente por procesos que en la mayora de los casos van a
limitar la diversidad, como son la seleccin, condicionada por factores relacionados
con el ciclo de vida del virus (vector, mecanismo de transmisin, gama de
huspedes, etc.), la deriva gentica (determinada por fenmenos aleatorios) y la
complementacin (Garca-Arenal et al., 2001).
La seleccin es el proceso por el cual las variantes genticas mejor adaptadas
incrementan su frecuencia dentro de la poblacin (seleccin positiva), mientras que
las que estn peor adaptadas disminuyen dicha frecuencia (seleccin negativa). Las
presiones de seleccin pueden actuar en las distintas fases del ciclo biolgico del
virus, determinando su eficacia biolgica o fitness, que se define como la capacidad
42
de reproduccin relativa con la que cada individuo contribuye a una nueva

generacin en unas determinadas condiciones ambientales (Domingo y Holland,
1997; Garca-Arenal et al., 2001).
La seleccin puede asociarse con distintos factores del ciclo vital del virus.
Un primer grupo de presiones selectivas est relacionado con el mantenimiento de
algunas caractersticas estructurales del virus. Por ejemplo, los aminocidos
implicados en el ensamblaje y estabilizacin de la nucleocpsida estn en general
conservados dentro de grupos virales (Altschuh et al., 1987), al igual que ocurre con
las estructuras primarias, secundarias o de orden superior que son importantes en la
replicacin (Bacher et al., 1994). Otros factores de seleccin estn asociados con las
plantas huspedes o con los vectores de transmisin. En este contexto se ha
observado una gran conservacin en protenas virales implicadas en el proceso de
transmisin mediado por mosca blanca o por pulgones (Pirone y Blanc, 1996;
Flasinski y Cassidy, 1998; Liu et al., 2002). Asimismo, estudios con distintos
agentes virales o subvirales han puesto de manifiesto variaciones importantes en las
poblaciones como consecuencia de su adaptacin al husped (Liang et al., 2002;
Sacristn et al., 2005; Aylln et al., 2006). En ocasiones, los cambios son tan
drsticos que las variantes seleccionadas, tras pases de un aislado del patgeno en
una determinada especie vegetal son incapaces de infectar con eficacia al husped
original del que se obtuvo el aislado (Fagoaga et al., 1995; Liang et al., 2002; Tan et
al., 2005). El efecto que un virus puede tener sobre la poblacin de su planta
husped o sobre el insecto vector depender de su virulencia, definida como el
efecto del patgeno en disminuir las aptitudes de su husped. Esta propiedad puede
repercutir en la seleccin (positiva o negativa) de un patgeno y desempea un papel
importante en su evolucin (Garca-Arenal et al., 2001, 2003).
La deriva gentica tiene lugar como consecuencia de que las poblaciones de
la mayora de los organismos no son lo suficientemente grandes como para asegurar
que cada variante tenga descendencia en la siguiente generacin. Este fenmeno
43
consiste esencialmente en un proceso condicionado por el azar que ocurre durante la

transmisin de los rasgos genticos a la nueva generacin a partir de unos pocos
genotipos de la poblacin, fenmeno conocido como cuello de botella. Estos
cuellos de botella pueden resultar en un tipo de deriva gentica que se ha
denominado efecto fundador o efecto fundacional, en el que a partir de un
pequeo nmero de individuos se inicia una nueva poblacin (Garca-Arenal et al.,
2001). Una de las consecuencias ms importantes del fenmeno de deriva gentica
asociado con cuellos de botella es la reduccin de la eficacia biolgica del
organismo en cuestin por la acumulacin de mutaciones perjudiciales en
poblaciones que son asexuales, fenmeno denominado trinquete de Mller
(Mllers ratchet) (Mller, 1964). En cuanto a virus de plantas, se ha sugerido que
este fenmeno ha podido actuar en el desplazamiento de tobacco mosaic virus por
tobacco mild green mosaic virus en poblaciones de tobamovirus que infectan de
forma natural la especie N. glauca en Australia (Fraile et al., 1997b). Otra de las
consecuencias de este fenmeno es que se pueden establecer poblaciones virales
independientemente de su eficacia biolgica. Recientemente, se han realizado
estudios dirigidos a estimar la importancia de los cuellos de botella impuestos
durante el movimiento sistmico de los virus en las plantas ya que este proceso
tambin puede provocar una disminucin del tamao efectivo de la poblacin
(French y Stenger, 2003, 2005; Sacristn et al., 2003; Li y Roossinck, 2004).
La complementacin es un fenmeno que permite el mantenimiento en la
poblacin de variantes defectivas en alguna funcin biolgica gracias a que otra
variante suministre dicha funcin. De esta forma, este proceso puede modificar el
efecto de la seleccin y modular la evolucin de una poblacin viral, como se ha
descrito en un mutante defectivo para el movimiento clula a clula de tomato
aspermy virus que se complementa con variantes silvestres (Moreno et al., 1997).
44
Variabilidad gentica dentro de la familia Closteroviridae

A pesar de que en los ltimos aos el nmero de estudios sobre diversidad de
las poblaciones de miembros de la familia Closteroviridae ha aumentado, stos
siguen siendo limitados y se centran principalmente en poblaciones del closterovirus
CTV (Aylln et al., 1999b; dUrso et al., 2000, 2003; Kong et al., 2000; Rubio et
al., 2001b; Sentandreu et al., 2006; erni et al., 2008; Herrera-Isidrn et al., 2009;
Roy y Brlansky, 2009).
La variacin gentica est irregularmente distribuida a lo largo del genoma de
CTV, siendo la regin ms conservada el extremo 3-UTR y la ms variable el
extremo 5-UTR, clasificndose las secuencias de este extremo en tres grupos (I, II,
y III) (Lpez et al., 1998). A pesar de esta variabilidad, la estructura secundaria de
mnima energa predicha para los tres tipos de secuencia es muy similar y se ha
puesto de manifiesto experimentalmente que este extremo est implicado en la
replicacin y ensamblaje del virin (Gowda et al., 2003b).
Comparaciones de secuencia entre aislados de CTV con orgenes geogrficos
y caractersticas patognicas diferentes mostraron por una parte un alto grado de
conservacin entre genomas de CTV separados en el tiempo y espacio (Vives et al.,
1999; Albiach-Mart et al., 2000b; Ruiz-Ruiz et al., 2006) y por otra una estructura
poblacional variable entre aislados (Vives et al., 2005; Aylln et al., 2006).
Existen datos que indican variaciones de las poblaciones de CTV despus de
cambios en el husped o transmisin mediante su vector (Albiach-Mart et al.,
2000a; Aylln et al., 1999b, 2006; Sentandreu et al., 2006; Nolasco et al., 2008) y
que por tanto pueden ser un importante factor evolutivo. Estos cambios en el
genoma a veces van acompaados de alteraciones en las propiedades patognicas
(Albiach-Mart et al., 2000a; Brlansky et al., 2003).
45
Las poblaciones de CTV se ven afectadas por la dispersin natural y cultural

del virus. Los ctricos pueden vivir largos periodos de tiempo en el campo y esto
permite que a lo largo de su vida puedan sufrir repetidas inoculaciones por pulgones
portadores de variantes de secuencia divergentes del virus (Moreno et al., 2008), lo
que puede dar lugar a poblaciones virales de complejidad creciente (Kong et al.,
2000; Rubio et al., 2001b; Aylln et al., 2006). La distribucin desigual de variantes
de secuencia dentro de las plantas infectadas y/o la seleccin al azar de algunas de
ellas durante la adquisicin o transmisin por pulgones pueden ser factores
adicionales que contribuyen a cambios en la poblacin de CTV (dUrso et al., 2000,
2003).
La recombinacin homloga y no homloga podra constituir un medio
rpido de evolucin de CTV (Vives et al., 1999; Rubio et al., 2001b; Sambade et al.,
2003; Gomes et al., 2008). La recombinacin no homloga ha sido ampliamente
documentada en la generacin de mltiples RNAs defectivos (Mawassi et al., 1995a
y b; Yang et al., 1997a y b; Aylln et al., 1999a; Rubio et al., 2000), as como entre
distintos aislados del virus (Vives et al., 2005; Weng et al., 2007).
Tambin existe alguna informacin sobre la diversidad gentica de miembros
del gnero Ampelovirus, que incluye el estudio de la variabilidad existente en el gen
Hsp70h de grapevine leafroll-associated virus 1 (GRLaV-1) (Little et al., 2001;
Kominek et al., 2005) y los genes Hsp70h, RdRp y CP de GRLaV-3 (Turturo et al.,
2005).
Los estudios de variabilidad son muy escasos en el caso de las especies del
gnero Crinivirus y se reducen fundamentalmente a CYSDV y ToCV. En el caso de
CYSDV, se han analizado dos regiones correspondientes a los genes Hsp70h y CP
en una serie de aislados procedentes de reas geogrficas muy distantes (Rubio et
al., 1999, 2001a). En estos anlisis se identificaron dos grupos genticamente
distintos a los que se denomin Occidental (West), formado por aislados
46
procedentes de Espaa, Jordania, Turqua, Lbano y Estados Unidos, y Oriental

(East), constituido nicamente por aislados originarios de Arabia Saud. Por otra
parte, Marco y Aranda (2005) llevaron a cabo un estudio de diversidad gentica a
partir de las secuencias nucleotdicas consenso de cinco regiones genmicas en 35
aislados de CYSDV recogidos durante 8 aos obtenidos de pepino, meln y sanda
de un rea restringida del sur de Espaa. En este caso no se obtuvieron evidencias de
seleccin asociada con adaptacin al husped. Existen estudios de variabilidad
gentica de la regin CP de PYVV en muestras de patata procedentes de Colombia y
Per en los que se observ una baja diversidad gentica y adems se sugiere la
existencia de un origen comn entre aislados de ambas regiones (Offei et al., 2004)
y en anlisis posteriores se observaron tres patrones de restriccin tras el anlisis por
RFLP as como patrones mixtos en aislados procedentes de Colombia (Guzmn et
al., 2006). Mediante el estudio de la diversidad gentica de la regin CP y Hsp70h
de 24 aislados de SPCSV-East African se determin un alto grado de homogeneidad
y se confirm la relativa baja relacin gentica con los aislados de SPCSV-West
African (Aritua et al., 2008).
En el caso de ToCV, se ha estudiado la variabilidad gentica de poblaciones
naturales presentes en el sudeste peninsular espaol. Por un lado se ha realizado el
estudio de la estructura y diversidad gentica de las poblaciones naturales de ToCV
en Espaa, Portugal y Marruecos a partir de la secuencia nucleotdica consenso de
diversas regiones genmicas del RNA1 (extremo 5-UTR, y parte del ORF1a y
RdRp) y RNA2 (Hsp70h, CP y CPm) de ToCV de distintos aislados virales
procedentes de tomate y pimiento (Lozano, 2007). En este estudio los valores de
diversidad gentica estimados para las distintas regiones del genoma de ToCV
indican que la poblacin analizada es muy uniforme, aunque se observa cierto grado
de estructuracin geogrfica. Asmismo se han identificado dos tipos de RNA1,
denominados I y II, distinguibles por diferencias nucleotdicas y aminoacdicas en
las tres regiones genmicas analizadas del RNA1 El anlisis filogentico de los
47
aislados de ToCV obtenidos de pimiento hacen sospechar de la existencia de un

fenmeno de adaptacin al husped por parte de las regiones codificantes del RNA1
ya que todos los aislados de ToCV procedentes de pimiento posean RNA1 tipo I y
presentaban adems nucletidos exclusivos en las posiciones 342C, 370C y 7046T,
los dos primeros localizados en la regin correspondiente al ORF1a y el tercero en la
regin RdRp.
Por otro lado se ha estudiado la variabilidad gentica de la regin RdRp del
RNA1 y las regiones Hsp70h, CP y CPm del RNA2 de poblaciones naturales de
ToCV dentro de aislados procedentes de tomate, los cuales presentaron una
estructura poblacional compatible con el modelo de cuasiespecie, con una secuencia
maestra y un espectro de mutantes (Lozano et al., 2009). Este estudio ha mostrado
que la frecuencia de mutacin para la regin RdRp, localizada en el RNA1, es ms
alta que la de las regiones analizadas del RNA2. Una posible explicacin es la
especializacin del RNA1 en la replicacin, dado que esta molcula puede replicarse
autnomamente en ausencia del RNA2, puede sufrir un mayor nmero de
replicaciones que podran traducirse en una mayor acumulacin de mutaciones.
Asimismo, se ha puesto de manifiesto la presencia de un nico genoma
posiblemente recombinante entre las variantes I y II del RNA1. La baja frecuencia
de recombinantes detectada en este trabajo indicara una fuerte seleccin negativa en
contra.
48
OBJETIVOS
El objetivo general de este trabajo ha sido la generacin de nuevo
conocimiento sobre la enfermedad del amarilleo del tomate causada en Espaa
principalmente por el crinivirus tomato chlorosis virus. Este objetivo general se ha
abordado mediante los siguientes objetivos parciales que se corresponden con cada
uno de los captulos en los que se ha estructurado esta tesis:
1. Determinacin de la incidencia de las infecciones por ToCV en cultivos de
pimiento de las principales zonas de cultivo intensivo de Espaa y caracterizacin de
la sintomatologa que ToCV produce en pimiento mediante infecciones en
condiciones controladas.
2. Bsqueda de huspedes alternativos de ToCV.
3. Estudio de la diversidad gentica del RNA1 de las poblaciones naturales de ToCV
en Espaa y anlisis de la posible adaptacin de ToCV al husped.
4. Obtencin de un sistema gentico basado en la inoculacin de protoplastos de N.
benthamiana con transcritos obtenidos in vitro a partir de clones de cDNA
completos de ToCV del aislado AT80/99.
49
CAPTULO 1
INFECCIONES DE TOMATO CHLOROSIS VIRUS EN
PIMIENTO: INCIDENCIA EN EL SUDESTE PENINSULAR
Y
EXPRESIN
CONTROLADAS
DE
SNTOMAS
EN
CONDICIONES
Captulo 1
1. INFECCIONES DE TOMATO CHLOROSIS VIRUS EN PIMIENTO:

INCIDENCIA EN EL SUDESTE PENINSULAR Y EXPRESIN DE
SNTOMAS EN CONDICIONES CONTROLADAS
1.1. ANTECEDENTES
Desde 1997, cuando se observaron por primera vez sntomas aislados de
amarilleo asociado a ToCV en cultivos de tomate de las provincias de Almera y
Mlaga (Navas-Castillo et al., 2000), se han sucedido epidemias anuales en el sur y
sudeste peninsular e Islas Canarias. La incidencia de esta enfermedad es con
frecuencia muy elevada, siendo habituales porcentajes de infeccin de entre el 50 y
el 100% (Lozano et al., 2006a; Velasco et al., 2008).
En el ao 1999 se observaron por primera vez plantas de pimiento cultivadas
en invernadero en la provincia de Almera con sntomas de amarilleo internervial en
hojas adultas que recordaban a los ocasionados por crinivirus en otros cultivos.
Adems, estas plantas presentaban abarquillado de las hojas, acortamiento de los
entrenudos y reduccin de la altura. En estos cultivos tambin eran frecuentes
fuertes infestaciones de la mosca blanca B. tabaci, lo que unido a la sintomatologa
observada y a la presencia en zonas prximas de cultivos de tomate con altas
incidencias de amarilleo, hizo sospechar de la posible infeccin por ToCV de las
plantas sintomticas. El anlisis molecular confirm la presencia de ToCV en las
plantas de pimiento que presentaban el sndrome anteriormente descrito, siendo sta
la primera descripcin mundial de pimiento como husped natural de ToCV
(Lozano et al., 2004).
Los intentos de transmisin de ToCV a pimiento llevados a cabo hasta ahora
en condiciones controladas mediante B. tabaci y T. vaporariorum (Morris et al.,
2006; Wintermantel y Wisler, 2006) han sido infructuosos. Sin embargo, datos
preliminares obtenidos en nuestro laboratorio han puesto de manifiesto que diversas
53
Captulo 1
variedades de pimiento pueden infectarse por ToCV experimentalmente (Fortes et

al., 2006). No obstante, hasta el momento se desconoce la relacin precisa entre la
infeccin por ToCV y la sintomatologa que este virus pueda causar en pimiento.
En este trabajo se ha pretendido determinar la importancia de las infecciones
de ToCV en pimiento. Por una parte, se ha estudiado la incidencia de la enfermedad
en las principales zonas de cultivo de las provincias de Murcia, Almera y Mlaga.
Adems, se ha desarrollado un sistema de inoculacin en condiciones controladas
mediante B. tabaci que ha permitido determinar la patologa que este virus produce
en diferentes variedades de este cultivo.
1.2. MATERIAL Y MTODOS
1.2.1. Muestreos de campo
En 2005 se llev a cabo un muestreo en el que se recogieron veinte plantas de
pimiento de una parcela comercial al aire libre en Torre del Mar (Mlaga), que
presentaba una sintomatologa diferente a la asociada con las infecciones de ToCV
en la provincia de Almera (Lozano et al., 2004). Diez de las plantas presentaban
clorosis suave generalizada y sus hojas eran ms alargadas que las del resto de las
plantas, que presentaban un aspecto sano.
En aos posteriores se han llevado a cabo muestreos sistemticos en W
(Campbell y Madden, 1990) en las principales reas de cultivo protegido de tomate
y pimiento del sudeste peninsular (Mlaga, Almera y Murcia). En cada provincia y
ao se visitaron 10 parcelas y se recogieron 30 muestras en cada una de ellas.
1.2.2. Deteccin de ToCV
La deteccin de ToCV se llev a cabo mediante hibridacin molecular de
improntas de cortes transversales de peciolo o RT-PCR a partir de extracciones de
RNA total. Para la hibridacin molecular se us una sonda de RNA obtenida por
54
Captulo 1
transcripcin in vitro a partir de un clon que contiene el gen correspondiente a la

protena de la cpsida (CP) del virus y linealizado con el enzima de restriccin SalI.
La sonda se marc mediante la incorporacin de digoxigenina (DIG-11-UTP,
Invitrogen) durante la transcripcin con RNA polimerasa T7 (Roche). De cada una
de las muestras se realizaron improntas de cortes transversales de peciolo en
membranas de nailon cargadas positivamente (Roche) que se fijaron mediante luz
ultravioleta (Crosslinker RPN 2500, Amersham Life Science) y se prehibridaron
durante 2 horas a 65 C en tampn estndar [5x SSC (NaCl 750 mM y citrato sdico
75 mM, pH 7,0), 0,1% N-laurilsarcosina, 0,02% SDS y 2% agente bloqueante
(Roche)] con 50% de formamida. La sonda se desnaturaliz a 65 C durante 10
minutos y se incubaron con ella las membranas durante toda la noche a 65 C en
rotacin. Posteriormente, la membrana se someti a tres lavados sucesivos, el
primero con 2x SSC, 0,1% SDS durante 10 minutos a temperatura ambiente y los
dos siguientes con 0,1x SSC, 0,1% SDS durante 15 minutos a 65 C. A partir de este
momento el proceso de deteccin se llev a cabo a temperatura ambiente y con
agitacin. Las membranas se trataron durante 5 minutos en solucin de lavado [0,3%
Tween 20 en solucin I (cido maleico 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 7,5)], 1 minuto en
solucin I, 30 minutos en solucin II [solucin I con 1% agente bloqueante
(Roche)], 30 minutos en solucin II con anticuerpo antidigoxigenina conjugado con
fosfatasa alcalina 1:20000, seguido de dos tratamientos con solucin de lavado
durante 15 minutos y finalmente 5 minutos en solucin III (Tris-HCl 0,1 M, NaCl
0,1 M, pH 9,5). Para el revelado de la membrana se aadi el sustrato
quimioluminiscente de la fosfatasa alcalina CDP-Star (Roche) a una dilucin 1:100
en solucin III y se incub en oscuridad durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo
se retir el exceso de sustrato, se expuso a una pelcula de rayos X (X-Omat AR,
KodaK) a 37 C y se revel siguiendo un proceso fotogrfico convencional.
Para la extraccin de RNA total se parti de 0,1 g de hoja de planta que se
tritur en nitrgeno lquido y se homogeneiz con 0,5 ml de Trizol Reagent (Sigma).
55
Captulo 1
El homogenizado se incub 5 minutos a temperatura ambiente y se centrifug a

12000 g y 4 C durante 10 minutos para precipitar el material insoluble. Se aadi
0,1 ml de cloroformo al sobrenadante, se incub de 2 a 3 minutos a temperatura
ambiente y se centrifug a 12000 g durante 15 minutos a 4 C. El RNA presente en
la fase acuosa se precipit con 125 l de isopropanol y 125 l de NaCl 1,2 M. Tras
incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, se centrifug a 12000 g durante
10 minutos a 4 C. El precipitado se lav con 500 l de etanol 75% y se centrifug a
7500 g durante 5 minutos a 4 C y finalmente se resuspendi en 50 l de H2ODMPC. Las extracciones de RNA total se mantuvieron a -70 C hasta su anlisis
mediante transcripcin reversa y PCR (RT-PCR).
La amplificacin de ToCV mediante RT-PCR se llev a cabo con iniciadores
especficos del gen de la protena de la cpsida del RNA2 de ToCV: MA380 (+) (5GTGAGACCCCGATGACAGAT-3)
MA381
(-)
(5-
TACAGTTCCTTGCCCTCGTT-3) y en un solo paso mediante el sistema

SuperScript One-Step RT-PCR con Platinum Taq (Invitrogen). La reaccin se llev
a cabo en un volumen final de 25l que contena el tampn de reaccin Rmix 1x (0,4
mM de cada dNTP y MgSO4 2,4 mM), los iniciadores a una concentracin de 0,2
M, 0,5 l de RT Taq Mix y 5 l de extracto de RNA total diludo 1/50. El programa
de RT-PCR empleado consisti en un ciclo de 50 C durante 30 minutos para la
sntesis del cDNA y un ciclo de 94 C durante 2 minutos de pre-desnaturalizacin,
seguido de 35 ciclos de desnaturalizacin a 94 C durante 15 segundos, hibridacin
de los iniciadores a 50 C durante 30 segundos y una extensin del cDNA a 72 C
durante 30 segundos. Finalmente se llev a cabo una extensin a 72 C durante 5
minutos.
56
Captulo 1
1.2.3. Transmisin de ToCV a tomate a partir de plantas de pimiento infectadas

de forma natural
Para los ensayos de transmisin de ToCV de pimiento a tomate se emplearon
adultos de B. tabaci biotipo Q procedentes de colonias libres de virus mantenidas en
invernadero sobre meln (Cucumis melo L. ANC42) a 25-30 C durante el da y 1820 C por la noche, con un suplemento lumnico (250 mol m-2 s-1) para mantener un
fotoperodo de 16 horas.
Como fuente de adquisicin del virus se utilizaron 10 brotes de plantas de
pimiento de campo infectadas con ToCV de forma natural, recogidas en el muestreo
realizado en la provincia de Mlaga en el ao 2005. En cada uno de estos brotes se
coloc una caja pinza con 50 insectos durante un perodo de adquisicin de 48
horas. Posteriormente las cajas pinza se colocaron sobre la tercera hoja verdadera de
plantas sanas de tomate (cv. Moneymaker). Tras un perodo de transmisin de 48
horas se retiraron las cajas pinza y las plantas inoculadas se pulverizaron con un
insecticida adulticida (Confidor 20 LS, imidacloprid 20%) y un insecticida larvicida
(Atominal 10 EC, piriproxifen 10%). La presencia del virus en estas plantas se
analiz a los 15, 30 y 45 das despus de la inoculacin mediante hibridacin
molecular con una sonda del gen de la protena de la cpsida de ToCV y RT-PCR
con iniciadores especficos para la amplificacin del mismo gen como se describe en
el apartado 1.2.2. Las plantas de tomate inoculadas se mantuvieron en cmara o
invernadero alternando esqueje y transmisin peridica mediante B. tabaci. Estas
plantas se utilizaron como fuente de adquisicin en posteriores experimentos de
transmisin descritos en los apartados 1.2.4.1 y 1.2.4.2.
57
Captulo 1
1.2.4. Desarrollo de un sistema de infeccin de pimiento con ToCV mediante

Bemisia tabaci
1.2.4.1. Inoculacin de ToCV en pimiento utilizando distinto nmero de
insectos
Como fuente de adquisicin se utilizaron plantas de tomate infectadas con un
aislado de ToCV procedente de pimiento, denominado MM8, depositndose sobre
ellas adultos de B. tabaci biotipo Q libres de virus durante un perodo de adquisicin
de 48 horas. La transmisin se realiz durante un perodo de 48 horas mediante la
suelta de insectos dentro de tres cajas con 15 plantas de pimiento (cv. California
Wonder) sanas cada una. Las plantas de pimiento se encontraban en el estado de
cuatro hojas verdaderas. En cada caja se introdujeron 10, 25 y 50 insectos por
planta, respectivamente. Como control negativo se emplearon 15 plantas de
pimiento que se sometieron al mismo procedimiento pero con 40 insectos
avirulferos por planta. Tras el proceso de transmisin, las plantas se trataron con
Confidor 20 LS y Atominal 10 EC y se mantuvieron en invernadero para su posterior
anlisis, a los 15 y 30 das despus de la inoculacin, mediante hibridacin
molecular con una sonda especfica del gen de la protena de la cpsida de ToCV
como se describe en el apartado 1.2.2.
1.2.4.2. Inoculacin de ToCV en diversas variedades de pimiento y estudio del
efecto de la infeccin viral
Se depositaron adultos de B. tabaci biotipo Q libres de virus sobre plantas de
tomate infectadas con el aislado MM8 de ToCV procedente de pimiento durante un
perodo de adquisicin de 48 horas. Transcurrido este tiempo se introdujeron los
insectos en cajas pinza (50 por caja pinza y por planta) y se colocaron en la tercera
hoja verdadera de una planta de pimiento en estado de cuatro hojas (Fig. 1.1)
durante un periodo de transmisin de 48 horas. Posteriormente, se retiraron las cajas
pinza y las plantas se pulverizaron con Confidor 20 LS y Atominal 10 EC. Como
58
Captulo 1
control negativo se emplearon plantas de pimiento sometidas al mismo

procedimiento descrito pero utilizando adultos avirulferos de B. tabaci y como
control positivo 15 plantas de tomate (cv. Moneymaker) inoculadas con ToCV de
igual forma que las plantas de pimiento.
Figura 1.1. Inoculacin de una planta de pimiento con ToCV mediante B. tabaci utilizando el
sistema de caja pinza. Se realiza en la tercera hoja verdadera en plantas en estado de cuatro hojas.
Se llev a cabo la inoculacin de ToCV en las variedades comerciales de

pimiento Pescara (Rijk Zwaan), Spadi (Vilmorin), California Wonder (Ramiro
Arnedo), Yolo Wonder (Ramiro Arnedo) y Lamuyo (Clause), que son
representativas de los tres tipos bsicos de pimiento que se cultivan en el sudeste
peninsular: tipo italiano (Pescara y Spadi), tipo California (California Wonder y
Yolo Wonder) y tipo lamuyo (Lamuyo). Se utilizaron 30 plantas de cada una de las
cinco variedades ensayadas, 15 se inocularon con insectos virulferos y otras 15 se
utilizaron como control negativo.
A los 15 das despus de la inoculacin todas las plantas de pimiento se
trasplantaron a macetas de 25 litros (Fig. 1.2) y se mantuvieron en invernadero (25
C de da y 18 C de noche) libre de mosca blanca hasta los 150 das despus de la
inoculacin. Las plantas se analizaron mediante hibridacin molecular con una
59
Captulo 1
sonda especfica del gen de la protena de la cpsida de ToCV a los 15, 30 y 60 das
despus de la inoculacin, como se describe en el apartado 1.2.2.
Figura 1.2. Vista general del ensayo de inoculacin de diversas variedades de pimiento (15 dpi)
con el aislado de ToCV MM8 procedente de pimiento.
1.2.5. Evaluacin de sntomas

En cada planta de pimiento se evalu la presencia de sntomas asociados a
ToCV en comparacin con las plantas de pimiento utilizadas como control negativo
y con las pocas plantas inoculadas que no resultaron infectadas en cada variedad
estudiada. Adems de la observacin de sntomas foliares, se midi la altura de las
plantas desde la base del tallo hasta la hoja apical a 55, 90, 120 y 150 das despus
de la inoculacin. A lo largo del ensayo, tambin se recolect peridicamente el
fruto cuando alcanzaba aproximadamente el estado comercial en verde y se
determin el nmero y peso total de frutos para cada planta.
Los datos recogidos se analizaron primero con un MANOVA de 2 factores,
con produccin, altura y nmero de frutos como variables dependientes y
variedad y presencia/ausencia de infeccin como variables independientes. Al
ser el MANOVA significativo [Test de Wilks Lambda para variedad (F12,365=3,22;
P<0,001), presencia/ausencia de infeccin (F3,138=43,46; P<0,001), e interaccin
60
Captulo 1
(F12,365=43,46; P=0,003)], cada variable dependiente fue analizada por separado con
un ANOVA de dos factores. Para los anlisis estadsticos se utiliz el programa
STATISTICA (StatSoft, Inc., 2007).
1.3. RESULTADOS
1.3.1. Incidencia de ToCV en cultivos de pimiento y tomate de las provincias de
Mlaga, Almera y Murcia
De las veinte plantas de pimiento recogidas en la provincia de Mlaga en
2005 se demostr la presencia del virus en 10 de ellas tras el anlisis llevado a cabo
mediante hibridacin molecular de improntas de cortes transversales de peciolo con
la sonda correspondiente al gen CP de ToCV (Fig. 1.3) y la amplificacin mediante
RT-PCR con iniciadores especficos del mismo gen. Las muestras infectadas con
ToCV provenan de las plantas que presentaban clorosis suave y posean hojas
ligeramente afiladas, mientras que las diez muestras negativas correspondan a las
plantas con un aspecto sano.
1
2
C- C+
Figura 1.3. Deteccin de ToCV mediante hibridacin molecular de improntas de cortes
transversales de peciolo de hojas de plantas de pimiento (dos improntas por muestra) recogidas en
una parcela comercial en el ao 2005 en la provincia de Mlaga. Se us una sonda del gen CP de
ToCV marcada con digoxigenina. La fila 1 corresponde a diez plantas que presentaban una clorosis
suave y posean hojas ligeramente afiladas y la fila 2 a diez plantas de aspecto sano. C: controles
positivos (+) y negativos (-) de impresiones de cortes transversales de peciolo de plantas de tomate.
61
Captulo 1
En la tabla 1.1 se muestran los datos de incidencia de ToCV tras muestreos

sistemticos realizados en cultivos comerciales de tomate y pimiento en el sudeste
peninsular en 2006, 2007 y 2008.
Tabla 1.1. Porcentaje de incidencia de ToCV en parcelas comerciales de tomate y pimiento en el

sudeste peninsular estimado mediante anlisis por hibridacin molecular de improntas de cortes
transversales de peciolo con una sonda del gen CP. En cada provincia y ao se visitaron 10 parcelas
y se analizaron 30 muestras por parcela.
Incidencia (%)
Cultivo
Provincia
2006
2007
2008
pimiento
Mlaga
Almera
8
0,3
8
0
11
0
Murcia
Mlaga
Almera
Murcia
63
18
33
27
27
38
47
21
16
tomate
En Mlaga, las infecciones de ToCV en pimiento se mantienen durante el

periodo analizado (2006-2008) con una incidencia alrededor del 10%, mientras que
en Almera y Murcia no se detect infeccin (con la excepcin de una planta
infectada de un total de 300 en la provincia de Almera en el ao 2006). Sin
embargo, en estas dos provincias s existen importantes incidencias de ToCV en
tomate (18-27% en Almera y 16-38% en Almera). En la provincia de Mlaga, el
porcentaje de infeccin en tomate es del 27-63% (Tabla 1.1).
62
Captulo 1
1.3.2. Deteccin de ToCV en plantas de tomate inoculadas mediante Bemisia

tabaci a partir de pimiento
Con el objetivo de disponer de un aislado de ToCV procedente de pimiento
que pudiera ser utilizado como fuente de inculo en ensayos de transmisin, se llev
a cabo la inoculacin de plantas de tomate cv. Moneymaker a partir de plantas de
pimiento infectadas de forma natural de un cultivo de la provincia de Mlaga en
2005. Mediante hibridacin molecular y RT-PCR se comprob que se infectaron 8
plantas de tomate de un total de 10 inoculadas (Fig. 1.4). Este ensayo muestra que,
en nuestras condiciones experimentales, ToCV se transmite eficientemente a travs
de su vector natural B. tabaci biotipo Q, desde plantas de pimiento infectadas de
forma natural a plantas de tomate sanas
10
X
C+ C-
436 pb
C+ 1
10
C- M
500 pb
250 pb
Figura 1.4. Deteccin de ToCV en plantas de tomate inoculadas mediante B. tabaci a partir de
plantas de pimiento infectadas de forma natural (1-10) mediante hibridacin molecular de improntas
de cortes transversales de peciolo (A) a los 15 das despus de la inoculacin mediante una sonda
del gen CP de ToCV marcada con digoxigenina y RT-PCR con iniciadores especficos del mismo
gen a partir de extractos de RNA total (B). M: marcador de peso molecular. C: controles positivos
(+) y negativos (-) de impresiones de cortes transversales de peciolo de plantas de tomate. X,
ausencia de muestra.
63
Captulo 1
1.3.3. Influencia del nmero de adultos de Bemisia tabaci sobre la eficiencia de

transmisin de ToCV a pimiento
Para determinar la influencia del nmero de insectos sobre la eficiencia de
transmisin de ToCV a plantas de pimiento (cv. California Wonder) se llev a cabo
un ensayo utilizando distinto nmero de adultos de B. tabaci biotipo Q (n=10, 25,
50). Las plantas se analizaron para la presencia del virus a los 15 y 30 das despus
de la inoculacin. A los 30 das se alcanz un porcentaje de infeccin que iba desde
el 13% utilizando 10 insectos por planta hasta el 73% utilizando 50 insectos por
planta. (Fig. 1.5). Este ensayo mostr por una parte, que en nuestras condiciones
experimentales ToCV se transmite eficientemente por el biotipo Q de B. tabaci
desde plantas de tomate infectadas (aislado MM8) a plantas de pimiento sanas.
Adems, nos permiti determinar que las condiciones ensayadas, con perodos de
adquisicin y de transmisin de 48 horas y 50 adultos por planta, eran adecuadas
Plantas positivas
para ToCV (%)
para posteriores ensayos de transmisin.

100
80
60
50 insectos/planta
40
25 insectos/planta
20
10 insectos/planta
0
15 dpi
30 dpi
dpi
Figura 1.5. Evolucin de la infeccin por ToCV de plantas de pimiento (cv. California Wonder) en
funcin del nmero de adultos de B. tabaci (biotipo Q) utilizados para la transmisin. La eficiencia
se expresa como el porcentaje de plantas positivas en los ensayos de hibridacin molecular de
improntas de cortes transversales de peciolo con una sonda marcada con digoxigenina especfica del
gen CP de ToCV a los 15 y 30 das despus de la inoculacin (dpi).
64
Captulo 1
1.3.4. Susceptibilidad a ToCV de diversas variedades de pimiento

El experimento de transmisin llevado a cabo con el aislado MM8 de ToCV
utilizando B. tabaci biotipo Q como vector, puso de manifiesto que las cinco
variedades de pimiento ensayadas, representativas de los tres tipos bsicos que se
cultivan en el sudeste peninsular, se infectaron por este virus. Es de destacar que se
observaron diferencias varietales en la susceptibilidad al virus (Fig. 1.6). As,
Pescara es la variedad ms susceptible, con el 100% de las plantas infectadas a los
30 das despus de la inoculacin, mientras que la variedad menos susceptible fue
Lamuyo, con una infeccin del 53%. California Wonder, Yolo Wonder y Spadi
presentaron a los 30 das susceptibilidades intermedias del 80, 73 y 73%,
respectivamente. A los 15 das despus de la inoculacin, con la excepcin de Spadi
y Lamuyo, ya se haba alcanzado un porcentaje de infeccin superior al 50% de las
plantas que finalmente resultaron infectadas. Los porcentajes de infeccin de cada
Plantas positivas para

ToCV (%)
variedad no aumentaron entre los 30 y 60 das tras la inoculacin.
100
80
Pescara
Spadi
60
California Wonder
40
Yolo Wonder
Lamuyo
20
0
15
30
60
dpi
Figura 1.6. Susceptibilidad a la infeccin por ToCV de distintas variedades comerciales de

pimiento. Las plantas se inocularon mediante B. tabaci (biotipo Q) y se analizaron a los 15, 30 y 60
das despus de la inoculacin (dpi) por hibridacin molecular de improntas de cortes transversales
de peciolo con una sonda marcada con digoxigenina especfica del gen CP de ToCV.
65
Captulo 1
1.3.5. Determinacin de la sintomatologa inducida por la infeccin por ToCV

en pimiento
En el ensayo llevado a cabo para determinar la susceptibilidad de distintas
variedades de pimiento a ToCV (apartado 1.3.4) se analiz el efecto de la presencia
del virus sobre las plantas infectadas en funcin de la altura de la planta, la aparicin
de sntomas foliares y la produccin.
1.3.5.1. Anlisis del efecto de ToCV sobre la altura de las plantas
Las plantas de pimiento infectadas con ToCV presentaron una apreciable
reduccin de altura respecto a las plantas sanas (Fig. 1.7), que se empez a
manifestar aproximadamente a los 55 das despus de la inoculacin y se mantuvo
hasta el final del ensayo (150 dpi). Esta reduccin de altura no se manifest por
igual en las distintas variedades, existiendo un rango que iba desde el 21% en Spadi
hasta 34% en Pescara. Estas diferencias de altura entre plantas infectadas con ToCV
y plantas sanas fueron estadsticamente significativas (F1,139=248,73, P<0,001) (Fig.
1.8).
66
Captulo 1
Figura 1.7. Efecto de la infeccin por ToCV en el crecimiento de plantas de pimiento. A: Vista
parcial del experimento a los 55 das despus de la inoculacin. Con flechas se sealan plantas
sanas. B: Plantas representativas del lote de plantas sanas (izquierda) e infectadas (derecha)
mostrando el efecto de la infeccin por ToCV a los 90 das despus de la inoculacin.
67
Captulo 1
Altura (cm)
100
80
60
b
b
40
20
0
Pescara
Spadi
California
Wonder
Yolo Wonder
Lamuyo
Variedad
Plantas sanas
Plantas infectadas con ToCV
Figura 1.8. Influencia de la infeccin por ToCV en la altura de plantas de pimiento inoculadas
mediante B. tabaci biotipo Q. La medida, desde la base del tallo hasta el pice de la planta, se tom
a los 120 das despus de la inoculacin. Las plantas no infectadas incluyen tanto las plantas
utilizadas como control negativo, sometidas a la alimentacin durante 48 horas con insectos no
virulferos, como las plantas sometidas a insectos virulferos que no resultaron infectadas
(analizadas mediante hibridacin molecular con una sonda marcada con digoxigenina especfica del
gen CP de ToCV).
1.3.5.2. Sntomas foliares asociados a la infeccin por ToCV

A los aproximadamente 65 das despus de la inoculacin mediante B. tabaci
las plantas de pimiento que resultaron infectadas con ToCV en las cinco variedades
estudiadas (infeccin comprobada mediante hibridacin molecular) comenzaron a
mostrar sntomas suaves de amarilleo internervial (Figs. 1.9.B y 1.9.C). Este sntoma
no se observ en ninguna planta sana (Fig. 1.9.A). El amarilleo comenzaba
inicialmente en la parte basal y se extenda progresivamente hacia la parte media de
la planta. En fases ms avanzadas, las plantas afectadas presentaron hojas basales
ligeramente engrosadas, enrolladas longitudinalmente y quebradizas al tacto (Figs.
1.9.D y 1.9.E). Las hojas localizadas a una altura media de las plantas infectadas
68
Captulo 1
presentaban una morfologa con el extremo afilado, ms alargadas que las hojas de
las plantas sanas (Figs. 1.9.F y 1.9.G).
69
Captulo 1
Figura 1.9. Sntomas de ToCV observados en plantas de pimiento infectadas mediante B. tabaci.
Amarilleo internervial en hojas adultas de una planta de pimiento infectada con ToCV (B) frente a
una planta sana (A). C: Detalle de clorosis internervial en una hoja de pimiento infectada con ToCV
(derecha) respecto a una hoja de una planta sana y asintomtica (izquierda). E: Abarquillado de las
hojas basales hacia el haz en plantas infectadas con ToCV respecto a hojas de similar altura en
plantas sanas (D). G: Forma ms afilada en hojas de altura media en plantas infectadas respecto a
plantas sanas (F).
70
Captulo 1
1.3.5.3. Efecto de la infeccin por ToCV en la produccin de plantas de

pimiento
No se apreciaron sntomas especficos, aparte de la reduccin del tamao, en
los frutos de ninguna de las plantas infectadas, pero s una reduccin
estadsticamente significativa de la produccin en todas las plantas de pimiento
infectadas con ToCV de las cinco variedades estudiadas en relacin a las plantas
sanas (F1,139=155,29, P<0,001) (Fig. 1.10). La reduccin de produccin estimada fue
diferente para las distintas variedades, desde un 45% en Spadi hasta un 75% en
Pescara.
Produccin (g)
1000
800
600
400
200
b
b
a
b
0
Pescara
Spadi
California
Wonder
Yolo Wonder
Lamuyo
Variedad
Plantas sanas
Figura 1.10. Produccin de distintas variedades de pimiento infectadas con ToCV mediante B.
tabaci biotipo Q expresada como media del peso de los frutos producidos por planta. Las plantas no
infectadas incluyen tanto las plantas utilizadas como control negativo, sometidas a la alimentacin
durante 48 horas con insectos no virulferos, como las plantas sometidas a insectos virulferos que
no resultaron infectadas (analizadas mediante hibridacin molecular con una sonda marcada con
digoxigenina especfica del gen CP de ToCV).
71
Captulo 1
La reduccin de la produccin en las plantas de pimiento infectadas con

ToCV respecto a las plantas sanas fue consecuencia tanto de un nmero menor de
frutos como de la disminucin de su tamao (Fig. 1.11). En cuanto a la reduccin
del nmero de frutos, existen diferencias estadsticamente significativas entre las
plantas infectadas y las sanas (F1,139=102,24, P<0,001) (Fig. 1.12).
N frutos
Figura 1.11. Ejemplo del efecto de la infeccin por ToCV sobre el tamao de los frutos de las
plantas de pimiento (variedad Spadi) infectadas (arriba). Abajo, frutos representativos de plantas
sanas de la misma variedad.
25
20
15
10
5
0
a
a
a
b
b
Pescara
Spadi
California
Wonder
Yolo
Wonder
Lamuyo
Variedad
Plantas sanas
Figura 1.12. Efecto de la infeccin por ToCV en el nmero de frutos de distintas variedades de
pimiento infectadas con ToCV mediante B. tabaci biotipo Q, expresado como nmero medio de
frutos por planta. Las plantas no infectadas incluyen tanto las plantas utilizadas como control
negativo, sometidas a la alimentacin durante 48 horas con insectos no virulferos, como las plantas
sometidas a insectos virulferos que no resultaron infectadas (analizadas mediante hibridacin
molecular con una sonda marcada con digoxigenina especfica del gen CP).
72
Captulo 1
1.4. DISCUSIN
Desde el ltimo cuarto del siglo pasado las poblaciones de mosca blanca se
han incrementado drsticamente en todo el mundo, especialmente en las regiones
con clima tropical, subtropical, rido y mediterrneo (Wisler et al., 1998a; Jones,
2003; Morales, 2007). Como consecuencia de este incremento ha tenido lugar la
emergencia de enfermedades virales transmitidas por estos insectos en cultivos de
gran importancia econmica mundial, dando como resultado la reduccin en la
produccin y notables prdidas econmicas. Un importante nmero de virus del
gnero Begomovirus (familia Geminiviridae) y Crinivirus (familia Closteroviridae)
son los causantes de estos problemas en numerosas regiones de todo el mundo. El
amarilleo causado por ToCV es un buen ejemplo de la emergencia de enfermedades
virales transmitidas por mosca blanca en numerosos pases (Wisler et al., 1998a).
Dado el posible impacto econmico de las infecciones por ToCV sobre la
produccin de cultivos importantes, es fundamental conocer su gama de huspedes,
la relacin del virus con el vector y la sintomatologa que produce en la planta para
poder llevar a cabo un correcto manejo del cultivo encaminado a un control eficiente
y duradero.
Lozano et al. (2004) describieron por primera vez la presencia de plantas de
pimiento infectadas de forma natural por ToCV, en invernaderos comerciales de la
provincia de Almera en el ao 1999. En estos cultivos se observaron amarilleos
internerviales en hojas adultas, abarquillado de las hojas, acortamiento de los
entrenudos que se traduca en reduccin de la altura de las plantas. Estos cultivos
sufran infestaciones importantes de la mosca blanca B. tabaci y estaban cercanos a
cultivos de tomate con altas incidencias de amarilleo producido por ToCV.
Un objetivo de este trabajo fue determinar la incidencia de ToCV en las
principales zonas de cultivo de pimiento del sudeste peninsular y confirmar si exista
una relacin entre la infeccin viral y la sintomatologa anteriormente descrita. Para
73
Captulo 1
ello se llevaron a cabo muestreos sistemticos en parcelas comerciales de este

cultivo en las provincias de Mlaga, Almera y Murcia en los aos 2006 a 2008. En
estos muestreos slo se encontraron plantas de pimiento infectadas con ToCV en la
provincia de Mlaga (con la excepcin de una sola planta de pimiento de un total de
300 muestreadas en la provincia de Almera). Aunque no se llev a cabo una
cuantificacin de las poblaciones de B. tabaci en las parcelas muestreadas, en
general, las poblaciones de este insecto fueron mayores en los cultivos de la
provincia de Mlaga. La causa de la prcticamente nula incidencia de ToCV en los
cultivos de pimiento en la provincia de Almera puede deberse a que desde la
campaa 2005/2006 se ha producido una implementacin masiva del control
biolgico en esta regin. En esta campaa y la siguiente se aplic control biolgico
en unas 150 ha y 650 ha, respectivamente, de las cuales el 70% y 85%,
respectivamente, result satisfactorio (van der Blom, 2009). Posteriormente, en la
campaa 2007/2008 se ha conseguido un espectacular aumento en la aplicacin del
control biolgico en casi la totalidad de la superficie de pimiento en Almera (van
der Blom et al, 2008). Sin embargo, el control biolgico en los cultivos de tomate en
esta zona no est tan extendido como en pimiento ya que actualmente no se obtiene
mayor eficiencia que con el control qumico (van der Blom, 2009).
Con anterioridad a este trabajo, se ha descrito la existencia de parcelas de
cultivos de tomate en las que la infeccin por ToCV afecta a ms del 50% de las
plantas, alcanzndose con cierta frecuencia incidencias del 100% (Lozano et al.,
2006a; Velasco et al., 2008). En este estudio, aunque no se han detectado plantas de
pimiento infectadas con ToCV en las provincias de Almera y Murcia s existen
infecciones en los cultivos de tomate de ambas provincias. Los datos recientemente
publicados de un estudio llevado a cabo en Murcia confirman la existencia de
infecciones de ToCV en tomate con una incidencia entre el 7% y 15% en 2007 y
2008, respectivamente (Gmez et al., 2010). En Murcia, la diferencia de incidencia
de ToCV en tomate y pimiento se podra explicar por la distancia existente entre las
74
Captulo 1
reas de cultivo de ambas especies. Adems en esta regin el control biolgico en

pimiento se aplica en la mayora de los cultivos desde el ao 2001 (van der Blom,
2002). En contraste con esta situacin, tanto en Almera como en Mlaga los dos
cultivos se encuentran superpuestos tanto espacial como temporalmente. Sin
embargo, en Mlaga, en la que la incidencia de ToCV en pimiento se sta alrededor
del 10%, existe un agrosistema ms complejo, con mezcla de cultivo en invernadero
y aire libre que podra explicar en parte las mayores incidencias de ToCV en
pimiento.
En las parcelas de Mlaga donde se encontraron infecciones de ToCV en
pimiento no pudo establecerse una relacin clara entre presencia de sntomas y
deteccin de ToCV por hibridacin molecular. Algunas plantas que presentaban
sntomas similares a los descritos anteriormente asociados a la primera deteccin de
ToCV en pimiento en Almera (Lozano et al., 2004) no resultaron positivas para
ToCV. Por el contrario algunas plantas sin sntomas aparecan infectadas. Por otro
lado, una baja concentracin o irregular distribucin de ToCV en pimiento podra
causar falsos negativos en la hibridacin molecular.
En este estudio se ha desarrollado un sistema de infeccin de ToCV en
pimiento en condiciones controladas de laboratorio. Para ello, como fuente de
inculo de ToCV se han utilizado plantas de tomate infectadas mediante la
transmisin de ToCV por B. tabaci biotipo Q a partir de plantas de pimiento
infectadas de forma natural. Para ajustar las condiciones de inoculacin de ToCV en
plantas de pimiento se han realizado ensayos en los que se ha utilizado distinto
nmero de insectos por planta y se han establecido unos tiempos de adquisicin y
transmisin similares a los utilizados para tomate (Navas-Castillo et al., 2000). En
los ensayos se demostr que, en nuestras condiciones experimentales, ToCV se
transmite a pimiento eficientemente mediante B. tabaci biotipo Q. Sin embargo, los
intentos por parte de otros grupos de infectar pimiento con ToCV de manera
experimental han sido infructuosos (Wintermantel y Wisler, 2006; Morris et al.,
75
Captulo 1
2006), aunque recientemente se ha obtenido la infeccin de una planta de pimiento

mediante B. tabaci biotipo B a partir de plantas infectadas de forma natural en Brasil
(Barbosa et al., 2010). Wintermantel y Wisler (2006) han sugerido que su
incapacidad para infectar pimiento podra deberse a una diferencia de
susceptibilidad varietal. Por otro lado, en el presente trabajo se ha utilizado un
aislado de ToCV procedente de pimiento, y debido a que los intentos de inoculacin
de ToCV en pimiento a partir de un aislado de tomate haban sido previamente
infructuosos (nuestros resultados sin publicar) y a la existencia de estudios que
apuntan a una posible adaptacin de ToCV al husped (Lozano, 2007; captulo 3 de
esta tesis), cabe pensar en la existencia de una mayor eficiencia de transmisin o
capacidad de multiplicacin en pimiento por parte de un aislado procedente del
mismo husped.
Otro factor que puede afectar a la infeccin de ToCV en pimiento es el vector
utilizado. ToCV puede transmitirse tanto por B. tabaci como por T. vaporariorum y
T abutilonea. Existen estudios que demuestran que la eficiencia de transmisin de
ToCV en tomate varia segn la mosca blanca utilizada, observndose una mayor
eficiencia con B. tabaci biotipo B y T. abutilonea que con B. tabaci biotipo A y T.
vaporariorum (Wintermantel y Wisler, 2006). En los trabajos publicados sobre
gama de huspedes de ToCV y especificidad con el vector, se us T. vaporariorum
(Wintermantel y Wisler, 2006) y el biotipo B de B. tabaci (Morris et al., 2006),
mientras que en nuestro caso las transmisiones se realizaron con B. tabaci biotipo Q,
que es el biotipo ms ampliamente distribuido en Espaa y resto de la cuenca
mediterrnea (Simn et al., 2001).
Previamente a este trabajo se desconoca la relacin precisa entre la infeccin
por ToCV y la sintomatologa que este virus pueda causar en pimiento. Esta
informacin es fundamental para determinar la importancia de las infecciones de
ToCV en cultivos de pimiento en relacin a los daos que puedan ocasionar. Para
ello, se han realizado experimentos en condiciones controladas de transmisin de
76
Captulo 1
ToCV a plantas de pimiento sanas de cinco variedades comerciales representativas

de los tres tipos de pimiento mayoritarios en los cultivos del sudeste peninsular
(italiano, california y lamuyo). Todas las variedades de pimiento utilizadas se
infectaron con ToCV, aunque se observaron entre ellas diferencias en la
susceptibilidad a la infeccin por este virus. Se han obtenido porcentajes de
infeccin que van desde el 53% (variedad Lamuyo) hasta el 100% en el caso de la
variedad ms susceptible (variedad Pescara). En este trabajo se han observado
sntomas caractersticos de la infeccin de ToCV en pimiento en condiciones
controladas. Estos sntomas, que incluyen amarilleo internervial en hojas basales y
de altura media, abarquillado de hojas basales hacia el haz y reduccin de la altura
de las plantas, son muy similares a los observados en las primeras plantas de
pimiento que se detectaron infectadas por ToCV en la provincia de Almera en 1999
(Lozano et al., 2004). Adems, en este estudio se ha observado que las hojas
localizadas a una altura media de las plantas infectadas presentaban una morfologa
con el extremo afilado, ms alargadas que las hojas de las plantas sanas. Este
sntoma es similar al observado en las plantas de pimiento recogidas en un cultivo de
la provincia de Mlaga en 2005 que resultaron positivas para ToCV por hibridacin
molecular. La produccin en las plantas infectadas ha sido significativamente menor
que en las plantas sanas, debido a la reduccin del tamao y nmero de frutos. Esta
prdida en la produccin probablemente se debe a una disminucin del rea verde
fotosinttica de la planta causada por el amarilleo internervial en las hojas. En
tomate se han descrito sntomas similares en los frutos y como consecuencia
prdidas en la produccin debido a la infeccin por ToCV (Wisler et al., 1998a).
Existe una gradacin entre las variedades de pimiento analizadas tanto para la
susceptibilidad a la infeccin mediante la inoculacin por B. tabaci, la reduccin de
altura de la planta y la reduccin en produccin. As, la variedad Pescara, que
presenta un porcentaje de infeccin del 100%, es tambin la que sufre una mayor
reduccin de altura y produccin. En el extremo opuesto se sitan las variedades
77
Captulo 1
Lamuyo y Spadi que presentan la menor susceptibilidad a la infeccin y las menores

reducciones de altura y produccin, mientras que las variedades California Wonder
y Yolo Wonder presentan un comportamiento intermedio.
La reduccin en la produccin en pimientos infectados con ToCV que se ha
observado en condiciones controladas podra traducirse en una importante prdida
econmica en campo. Previamente, se han descrito prdidas, aunque no
cuantificadas, en la produccin de cultivos de tomate en el sudeste peninsular debido
a que las plantas sintomticas presentaban un crecimiento reducido del fruto y una
maduracin tarda como consecuencia de la infeccin por este virus (Navas-Castillo
et al., 2000). A su vez, se han descrito prdidas de produccin en cultivos de tomate
como consecuencia de la infeccin por otros crinivirus, como TICV, que en 1993
provoc prdidas econmicas importantes en cultivos de tomate en California
(Wisler et al., 1998a).
Aunque en este estudio se observ una susceptibilidad diferencial de las
distintas variedades de pimiento a la infeccin por ToCV, no se observaron
diferencias evidentes en el tipo de sntomas entre las variedades de pimiento
estudiadas. La susceptibilidad de distintas variedades, tanto de tomate como de
pimiento, a ToCV es un aspecto fundamental a estudiar para poder establecer
programas de mejora para bsqueda de resistencia gentica. Hasta el momento no se
ha detectado resistencia a ToCV en variedades comerciales de tomate, aunque se
han identificado dos lneas de tomate resistentes a este virus, una de S. chmielewskii
y otra derivada de un hbrido de S. lycopersicum x S. peruvianum (Garca-Cano et
al., 2010). Con respecto a pimiento no existe ninguna informacin sobre posibles
fuentes de resistencia a ToCV.
Las epidemias de ToCV en tomate tienen una gran importancia y repercusin
econmica (Navas-Castillo et al., 2000). Adems, en Espaa se ha detectado ToCV
infectando de manera natural a Solanum nigrum (Font et al., 2004) y en Portugal a
78
Captulo 1
Datura estramonium, Physalis ixocarca y P. peruviana (Louro et al., 2000b;

Trenado et al., 2007). La infeccin de estas plantas por ToCV podra tener
importancia en las epidemias de amarilleo en tomate al actuar como huspedes
alternativos. Por tanto, adems de los daos que puede causar ToCV en un cultivo
importante como el pimiento, un factor de riesgo adicional es la posible existencia
de las infecciones de ToCV en cultivos que coexisten o se alternan con cultivos de
tomate.
En este trabajo, se ha cuantificado por primera vez la reduccin en la
produccin de un cultivo como consecuencia de la infeccin por un crinivirus en
condiciones controladas.
79
CAPTULO 2
LA
PATATA
(SOLANUM
TUBEROSUM),
HUSPED DE TOMATO CHLOROSIS VIRUS
UN
NUEVO
Captulo 2
2. LA PATATA (SOLANUM TUBEROSUM), UN NUEVO HUSPED DE

TOMATO CHLOROSIS VIRUS
2.1. ANTECEDENTES
ToCV se ha identificado como un serio problema para el cultivo del tomate
en numerosos pases de todo el mundo, como se ha indicado en la introduccin de
esta memoria. Los estudios de incidencia de ToCV en las principales zonas de
cultivo de tomate del sudeste peninsular espaol han mostrado que son muy
frecuentes las parcelas en las que la infeccin afecta a ms del 50% de las plantas y
con cierta frecuencia se alcanzan incidencias superiores al 90% (Lozano et al.,
2006a; Velasco et al., 2008).
ToCV afecta, adems de a tomate, a una amplia gama de huspedes que
incluyen otros cultivos como pimiento (Lozano et al., 2004) y plantas ornamentales
(Tsai et al., 2004) y algunas malas hierbas como Solanum nigrum y Datura
stramonium (Louro et al., 2000b; Font et al., 2004). Estos huspedes alternativos, al
actuar como reservorios naturales, podran influir en la evolucin de las epidemias
de amarilleo en tomate.
Wisler et al. (1998a) citaron a la patata (Solanum tuberosum) como un
husped experimental de ToCV, sin facilitar informacin sobre cmo se llevaron a
cabo los experimentos de inoculacin. Este resultado no pudo ser confirmado en un
estudio sobre la gama de huspedes de ToCV llevado a cabo por Morris et al. (2006)
mediante inoculacin con B. tabaci en condiciones controladas.
En este trabajo se confirma que la patata es un husped experimental de
ToCV y se describe por primera vez la infeccin natural de plantas de este cultivo.
83
Captulo 2

2.2.1. Muestreos de campo, aislado viral y poblacin de mosca blanca
En el verano de 2006 se recogieron tres plantas de patata desarrolladas
probablemente a partir de tubrculos abandonados de un cultivo anterior al aire libre
en Algarrobo (Mlaga), fuertemente infestadas por la mosca blanca B. tabaci, que se
analizaron para la presencia de ToCV (ver apartado 2.2.2).
En los ensayos de transmisin que se describirn posteriormente se emple el
aislado PL1-2 de ToCV, que se obtuvo a partir de una planta de tomate infectada de
forma natural recogida en Mlaga tras la transmisin mediante B. tabaci a plantas
del cv. Moneymaker en la Estacin Experimental La Mayora (CSIC). Este aislado
se ha mantenido alternando esqueje y transmisin peridica mediante B. tabaci en
cmaras de cultivo (25 C da, 20 C noche, 16 h de fotoperiodo a 250 mol m-2 s-1 y
70% HR). En estos ensayos de transmisin se emplearon adultos de B. tabaci,
biotipo Q, procedentes de colonias libres de virus mantenidas en invernadero sobre
meln (Cucumis melo cv. ANC42).
2.2.2. Deteccin de ToCV
La deteccin de ToCV en las plantas procedentes de campo y en las
inoculadas en condiciones controladas se llev a cabo mediante hibridacin
molecular de cortes transversales de peciolo o RT-PCR a partir de extractos de RNA
total. El proceso de hibridacin molecular con una sonda marcada con digoxigenina
del gen de la cpsida de ToCV, la extraccin de RNA total con Trizol Reagent
(Sigma) y el proceso de RT-PCR con los iniciadores MA380 (+) y MA381(-)
especficos del mismo gen, se realiz siguiendo los protocolos descritos en el
apartado 1.2.2 de esta memoria. Los productos de RT-PCR se separaron mediante
electroforesis en geles de agarosa al 1% en tampn TAE y se visualizaron mediante
tincin con bromuro de etidio. El DNA amplificado se purific para eliminar los
84
Captulo 2
nucletidos e iniciadores no incorporados aadiendo 10U de exonucleasa I

(Fermentas) y 2U de fosfatasa alcalina de gamba (Roche) por cada 5 l de PCR.
Una vez purificados se secuenciaron en un secuenciador ABI 3730xl DNA Analyzer
(Applied Biosystems) (Secugen, Espaa) con los mismos iniciadores empleados
para su amplificacin.
2.2.3. Inoculacin de ToCV en plantas de patata mediante Bemisia tabaci
La inoculacin de ToCV por transmisin mediante B. tabaci se realiz
utilizando el biotipo Q que es actualmente el mayoritario en Espaa (Simn et al.,
2001; nuestros resultados sin publicar) y se utilizaron plantas de patata de la
variedad Safrane (Gopex) que es la variedad principalmente utilizada en los cultivos
de la zona donde se detectaron inicialmente 3 plantas infectadas (apartado 2.3.1).
Para la obtencin de individuos virulferos, los insectos se mantuvieron durante un
perodo de adquisicin de 48 h en plantas de tomate infectadas con el aislado PL1-2
de ToCV. Se inocularon 20 plantas de patata mediante 40 insectos por planta
confinados en una caja pinza, durante un periodo de inoculacin de 48 h (NavasCastillo et al., 2000) (Fig. 2.1). Como controles negativos de estas inoculaciones se
emplearon plantas de patata obtenidas siguiendo el mismo procedimiento descrito,
pero utilizando adultos de B. tabaci libres de virus. Se realizaron dos experimentos
independientes de inoculacin, en diferentes pocas y estados de desarrollo de las
plantas.
Tras la inoculacin, las plantas se pulverizaron con un insecticida adulticida
(Confidor 20 LS, imidacloprid 20%) y un insecticida larvicida (Atominal 10 EC,
piriproxifen 10%). Las plantas de patata se analizaron mediante hibridacin
molecular a los 15, 30 y 45 das despus de la inoculacin y las que resultaron
positivas para ToCV se mantuvieron en condiciones controladas de invernadero
hasta la produccin de tubrculos.
85
Captulo 2
2.2.4. Deteccin de ToCV en tubrculos de patata mediante hibridacin

molecular
Los tubrculos producidos por las plantas de patata inoculadas mediante B.
tabaci y las plantas control se recogieron a los 100 das despus de la inoculacin.
En los dos ensayos se analizaron 25 y 40 tubrculos respectivamente, mediante
hibridacin molecular de improntas de cortes transversales de yemas, utilizando el
mismo protocolo que para cortes transversales de peciolo de hoja descrito en el
apartado 1.2.2 de esta memoria.
Parte de los tubrculos infectados se plantaron para obtener nuevas plantas
que se analizaron mediante hibridacin molecular de improntas de cortes
transversales de peciolo (Fig. 2.1).
2.2.5. Inoculacin de plantas de tomate con ToCV a partir de plantas de patata
Plantas de patata infectadas con ToCV, procedentes de tubrculos infectados,
se utilizaron como fuente de inculo en ensayos de transmisin a plantas de tomate
sanas mediante B. tabaci (biotipo Q) (Fig. 2.1). Para la obtencin de individuos
virulferos, los insectos se mantuvieron durante un perodo de adquisicin de 48
horas en plantas de patata (cv. Safrane) infectadas con ToCV. Se inocularon 15
plantas de tomate (cv. Moneymaker) mediante 40 adultos de B. tabaci virulferos
por planta confinados en caja pinza durante un periodo de inoculacin de 48 horas.
Tras las inoculaciones, las plantas se pulverizaron con un insecticida adulticida
(Confidor 20 LS, imidacloprid 20%) y un insecticida larvicida (Atominal 10 EC,
piriproxifen 10%). Las plantas de tomate se analizaron a los 15 das despus de la
inoculacin mediante hibridacin molecular de improntas de cortes transversales de
peciolo.
86
Captulo 2
B. tabaci
tomate
patata
tubrculo
patata
ToCV
B. tabaci
Figura 2.1. Representacin esquemtica de las transmisiones de ToCV realizadas en condiciones

controladas entre plantas de patata y tomate mediante B. tabaci. La deteccin de ToCV se realiz
mediante hibridacin molecular de improntas de peciolo de tomate y patata e improntas de yemas
de tubrculos de patata.
2.3. RESULTADOS
2.3.1. Infeccin natural de ToCV en patata
Las tres plantas de patata muestreadas en la provincia de Mlaga en 2006
resultaron positivas para ToCV mediante hibridacin molecular de cortes
transversales de peciolo y RT-PCR (Fig. 2.2). La secuenciacin de los productos de
PCR obtenidos de dos de estas muestras confirm la presencia de ToCV, con una
secuencia 99% idntica a la regin del gen de la protena de la cpsida del aislado
espaol AT80/99 (Lozano et al., 2006b).
87
Captulo 2
M 1
500 pb
250 pb
436 pb
Figura 2.2. Deteccin de ToCV mediante RT-PCR con iniciadores especficos del gen de la
protena de la cpsida que amplifican un fragmento de 436 nucletidos, realizada sobre extractos de
RNA total de dos plantas de patata recogidas en campo (2 y 3). 1: planta de tomate sana usada como
control negativo. 4: planta de tomate infectada con ToCV usada como control positivo. M:
marcador de peso molecular.
2.3.2. Infeccin de plantas de patata inoculadas con ToCV mediante Bemisia

tabaci
En los dos ensayos de inoculacin de plantas de patata llevados a cabo a
partir de plantas de tomate infectadas por ToCV mediante B. tabaci, se logr su
infeccin (5 de 20 y 19 de 20 plantas, respectivamente; Tabla 2.1). El diagnstico se
llev a cabo mediante hibridacin molecular de improntas de secciones transversales
de peciolo (Fig. 2.3). La diferencia en el porcentaje de infeccin obtenido en ambos
ensayos puede deberse al distinto estado de desarrollo de las plantas en el momento
de la inoculacin (19 y 14 das despus de la plantacin de los tubrculos,
respectivamente). Adems, aunque los ensayos se realizaron en un invernadero de
vidrio con condiciones de temperatura controlada, se efectuaron en pocas diferentes
del ao, invierno y primavera, respectivamente.
88
Captulo 2
Tabla 2.1. Infeccin por ToCV (nmero de muestras infectadas por nmero total de muestras
analizadas en cada ensayo) en los distintos ensayos de transmisin. La deteccin se realiz
mediante hibridacin molecular de improntas de cortes transversales de peciolo de hoja de patata y
tomate e improntas de cortes transversales de yema de tubrculo de patata, usando una sonda del
gen de la cpsida de ToCV marcada con digoxigenina. Se realizaron dos ensayos independientes.
Material de
partida
Medio de
transmisin
Material
analizado
N muestras infectadas/ N total de muestras

Ensayo n1
tomate
B. tabaci
patata
Ensayo n2
patata (hoja)
5/20
19/20
yema de
tubrculo
6/25a
19/40b
patata
tubrculo
patata (hoja)
15/15c
23/28d
patata
B. tabaci
tomate (hoja)
6/15
a: 25 tubrculos analizados, 5 por planta infectada.

b: 40 tubrculos analizados, 2 por planta inoculada.
c: 15 plantas de patata analizadas, desarrolladas a partir de 6 tubrculos infectados.
d: 28 plantas de patata analizadas, desarrolladas a partir de 28 tubrculos infectados.
C- C+
Figura 2.3. Deteccin de ToCV en plantas de patata (n=20) mediante hibridacin molecular de
improntas de secciones transversales de peciolo de hoja (dos improntas por muestra) a los 45 das
despus de su inoculacin con ToCV usando plantas de tomate como fuente de inculo y B. tabaci
como vector (ensayo n2). Se us una sonda del gen de la cpsida de ToCV marcada con
digoxigenina. La primera fila muestra plantas de patata sanas (n=5). C: controles positivo (+) y
negativo (-) de impresiones de cortes transversales de peciolo de plantas de tomate.
89
Captulo 2
Las plantas de patata infectadas experimentalmente se mantuvieron bajo

condiciones controladas de invernadero hasta la recoleccin de los tubrculos (Fig.
2.4). En ningn momento se observaron sntomas asociados a ToCV en las plantas
de patata infectadas.
Figura 2.4. Plantas de patata mantenidas en invernadero 100 das despus de la inoculacin con
ToCV mediante B. tabaci a partir de plantas de tomate infectadas.
2.3.3. Presencia de ToCV en tubrculos de patata y en las plantas desarrolladas

a partir de ellos
La hibridacin molecular de improntas de cortes transversales de yemas de
tubrculos procedentes de plantas de patata infectadas experimentalmente con ToCV
puso de manifiesto su infeccin por el virus. En los dos ensayos de inoculacin de
ToCV en patata se detect la presencia de ToCV en 6 y 19 yemas de tubrculos, de
un total de 25 y 40 tubrculos analizados respectivamente (se analiz una yema por
tubrculo) (Tabla 2.1 y Fig. 2.5).
90
Captulo 2
C+
C-
C+
C-
Figura 2.5. Presencia de ToCV en tubrculos obtenidos a partir de plantas de patata infectadas
mediante la transmisin del virus con B. tabaci. El virus se detect mediante hibridacin molecular
de improntas de cortes transversales de yemas de tubrculos de patata con una sonda del gen de la
cpsida de ToCV marcada con digoxigenina. A y B corresponden a dos ensayos de inoculacin de
ToCV. A: 25 tubrculos provenientes de 5 plantas de patata (1-5). B: 40 tubrculos provenientes de
20 plantas de patata. C: controles postitivo (+) y negativo (-) de extracto de RNA (A) e impresiones
de cortes transversales de peciolo de plantas de tomate (B).
91
Captulo 2
Posteriormente, el 100% y 82% de las plantas de patata desarrolladas a partir

de tubrculos infectados en el primer y segundo ensayo de inoculacin,
respectivamente, mediante hibridacin molecular de cortes transversales de hojas
resultaron positivas para ToCV (Tabla 2.1 y Fig. 2.6).
CC+
Figura 2.6. Deteccin de ToCV en plantas de patata (n=15) procedentes de 6 tubrculos infectados
(ensayo n1), mediante hibridacin molecular de improntas de secciones transversales de peciolo de
hoja (dos improntas por muestra). Se us una sonda del gen de la cpsida de ToCV marcada con
digoxigenina. En la primera fila se muestran plantas de patata sanas (n=5). C: controles positivos
(+) y negativos (-) de impresiones de cortes transversales de peciolo de plantas de tomate.
2.3.4. Infeccin de ToCV en plantas de tomate inoculadas a partir de plantas de

patata
Para analizar si las plantas de patata infectadas podan servir como fuente de
inculo de ToCV para la infeccin de plantas de tomate, se llev a cabo la
inoculacin de 15 plantas de tomate, mediante B. tabaci, a partir de plantas de patata
infectadas experimentalmente. Seis de estas plantas resultaron positivas tras su
anlisis mediante hibridacin molecular de cortes transversales de peciolo (Tabla 2.1
y Fig. 2.7).
92
Captulo 2
C+
C-
Figura 2.7. Deteccin de ToCV en plantas de tomate inoculadas (n=15) mediante B. tabaci a partir
de plantas de patata infectadas. La deteccin se realiz mediante hibridacin molecular de
improntas de secciones transversales de peciolo de hoja (dos improntas por muestra) con una sonda
del gen de la cpsida de ToCV marcada con digoxigenina. C: controles positivos (+) y negativos (-)
de impresiones de cortes transversales de peciolo de plantas de tomate.
2.4. DISCUSIN
En las ltimas dcadas se ha puesto de manifiesto la emergencia de
numerosas enfermedades virales producidas por begomovirus y crinivirus asociada
en parte al aumento de las poblaciones de la mosca blanca B. tabaci en numerosas
regiones de todo el mundo (Wisler et al., 1998a; Moriones y Navas-Castillo, 2000;
Morales, 2006, 2007). Dado que este fenmeno de emergencia afecta de manera
notable a cultivos de enorme importancia econmica, es importante conocer la gama
de huspedes de estos virus, tanto cultivos como malas hierbas, para as permitir
desarrollar prcticas eficientes del manejo de los mismos. La gama de huspedes de
ToCV es bastante amplia, incluyendo cultivos importantes a nivel mundial como
tomate (Wisler et al., 1998b) y pimiento (Lozano et al., 2004), plantas ornamentales
(Tsai et al., 2004) y malas hierbas como S. nigrum y D. stramonium (Louro et al.,
2000b; Font et al., 2004).
En este trabajo se confirma que la patata es un husped experimental de
ToCV y se describe por primera vez la infeccin natural de plantas de este cultivo.
93
Captulo 2
La confirmacin de la patata como husped de ToCV se ha llevado a cabo mediante

la transmisin a plantas de patata mediante B. tabaci biotipo Q en condiciones
controladas. Sin embargo en un estudio sobre la gama de huspedes de ToCV
llevado a cabo por Morris et al. (2006) mediante inoculacin con B. tabaci en
condiciones experimentales de plantas de patata no se obtuvieron resultados
positivos. A su vez, en el presente trabajo, en los tubrculos procedentes de plantas
de patata infectadas se ha detectado la presencia de ToCV mediante la tcnica de
hibridacin molecular de improntas de cortes transversales de yemas de tubrculos.
Asimismo las plantas de patata desarrolladas a partir de los tubrculos infectados
resultaron positivas para ToCV y, mediante la transmisin por B. tabaci, se
determin que pueden actuar como fuente de inculo para la infeccin de plantas de
tomate.
La infecciones virales en patata son particularmente importantes dada la
reproduccin vegetativa de este cultivo. Por lo tanto, los tubrculos que se utilizan
como semilla tienen que producirse en condiciones de estricto control sanitario, lo
que encarece el coste del material de propagacin. Por este motivo, los resultados
obtenidos en este trabajo describiendo un nuevo virus que afecta a un cultivo de
enorme importancia econmica en todo el mundo, es relevante.
Existen varios sistemas para la certificacin de semillas de patata, como es la
combinacin de la visualizacin de sntomas y los anlisis serolgicos.
Normalmente el procedimiento que se sigue para obtener semilla de patata sana es
analizar las hojas que brotan de las yemas de tubrculos (de Bokx y van der Want,
1987). Sin embargo, estos mtodos llevan tiempo, son caros y normalmente no se
pueden utilizar en tubrculos latentes (Huttinga, 1996). Consecuentemente, varios
protocolos de RT-PCR se han desarrollado para la deteccin individual de virus en
tubrculos de patata (Singh y Singh, 1997, 1998). Sin embargo, esta tcnica tambin
es cara y lenta. Por ello, se han desarrollado tcnicas que reducen el coste e
incrementan la eficiencia de identificacin de virus en patata, como la RT-PCR
94
Captulo 2
mltiple para detectar virus como potato yellow vein virus (PYVV), tomato
infectious chlorosis virus (TICV) y tobacco rattle virus (TRV) en hoja (Wei et al.,
2009), y potato leafroll virus (PLRV), potato virus A (PVA), potato virus X (PVX),
potato virus Y (PVY) y otros, en tubrculo (Nie y Singh, 2000, 2001; Agindotan et
al., 2007; Mortimer-Jones et al., 2009). Asimismo, se ha descrito la tcnica de
hibridacin molecular de preparaciones en dot blot de cidos nucleicos extrados de
tubrculo mediante sondas marcadas con digoxigenina para la deteccin de virus
como PVY (Singh y Singh, 1995) o PLRV (Loebenstein et al., 1997).
En este trabajo, adems de realizar la deteccin de ToCV en hoja de patata
mediante las tcnicas de RT-PCR e hibridacin molecular de improntas de cortes
transversales de peciolo, se ha realizado la deteccin del virus mediante hibridacin
molecular de improntas de secciones transversales de yemas de tubrculos. Sin
embargo, no se detect la presencia viral en todas las yemas de los tubrculos
infectados, ya que de un total de 40 tubrculos analizados 19 resultaron positivos
para ToCV, en cambio, el nmero de plantas de patata infectadas desarrolladas a
partir del total de tubrculos, teniendo en cuenta que se sembr una yema distinta de
cada uno de ellos, fue de 23. Una posible explicacin puede ser que al igual que se
describe para otros virus que infectan patata, como PLRV, PVY y potato mop-top
virus (PMTV) (Singh y Singh, 1996; Sokmen et al., 1998; Nie y Singh, 2001), exista
una distribucin desigual de ToCV en el tubrculo.
Un factor importante a tener en cuenta como consecuencia de los resultados
obtenidos en este trabajo, es la posible influencia de las infecciones de patata en la
epidemiologa de la enfermedad producida por ToCV. Por una parte, las plantas de
patata infectadas con este virus pueden servir como fuente de inculo para la
transmisin mediante B. tabaci a plantas de tomate. Adems, debido al uso del
tubrculo como material de propagacin y al trasiego de este material por todo el
mundo, existe la posibilidad de introducir patgenos en regiones donde no existan
previamente, como puede suceder con ToCV.
95
Captulo 2
La patata es un cultivo de clima templado-fro, siendo las temperaturas de

entre 13 y 18 C las ms favorables. Por otra parte, B. tabaci causa importantes
prdidas en muchos cultivos comerciales de zonas tropicales, subtropicales y
templadas, como el Mediterrneo (Jones, 2003; Morales, 2007), aumentando por
tanto la incidencia de enfermedades virales en algunos cultivos. Debido al
calentamiento global que parece estar teniendo lugar desde el comienzo del siglo
XX y que puede causar alteraciones en el clima de muchas reas del planeta, existe
un gran inters en el desarrollo de estudios sobre la influencia del cambio climtico
en los vectores de enfermedades de plantas (Scherm, 2004; Garret et al., 2006). El
cambio climtico puede causar efectos en la susceptibilidad de los huspedes a la
infeccin viral y puede afectar a la distribucin, abundancia y actividad de los
vectores virales (Canto et al., 2009; Jones, 2009). Pequeos cambios en la media de
temperatura podran ser suficientes para dar lugar a considerables cambios en la
distribucin y abundancia de vectores virales de plantas (Jones, 2009). Una de las
mayores causas de emergencia de enfermedades virales a nuevas reas es la
introduccin de cambios en las poblaciones de los vectores, los cuales pueden estar
asociados a alteraciones en las variables climticas (Anderson et al., 2004). En las
ltimas dos dcadas se ha observado una dispersin de enfermedades causadas por
el complejo de especies tomato yellow leaf curl virus (TYLCVs) hacia el oeste de la
cuenca mediterrnea vinculada con la expansin de B. tabaci hacia esas zonas de
clima templado (Moriones y Navas-Castillo, 2000). Por tanto, esta especie de mosca
blanca, como consecuencia de cambios en su distribucin geogrfica debidos al
cambio climtico, podra invadir nuevas reas llegando a ser un problema para
nuevos cultivos. La posible infeccin por ToCV de la patata en ciertas regiones
podra ser un ejemplo de este fenmeno.
El cultivo de patata en la provincia de Mlaga es extratemprano y por tanto se
cultiva en invierno. Por ello, esta zona no es un escenario probable para la infeccin
de este cultivo con ToCV, ya que B. tabaci se desarrolla en esta poca del ao
96
Captulo 2
fundamentalmente en invernadero. Esto se confirma con la observacin de la

ausencia de plantas de patata infectadas con ToCV tras la realizacin de muestreos
en cultivos comerciales en esta regin (nuestros datos no publicados). Sin embargo,
otras regiones del mundo pueden ser escenarios adecuados para ponerse en contacto
B. tabaci o T. vaporariorum con tomate y patata. Por ejemplo, existen regiones de
Estados Unidos, como Florida y California o zonas de China e India donde ambos
cultivos coexisten y B. tabaci est ampliamente distribuida (Wisler et al., 1998a;
Jones, 2003; Morales, 2007). En regiones de las tierras altas de los Andes de
Colombia, Ecuador y Per, como se ha observado al estudiar la incidencia de potato
yellow vein virus (Morales et al., 2005; Salazar et al., 2000), T. vaporariorum puede
subir a gran altitud (Morales, 2007) y servir de puente entre cultivos de patata y
cultivos de tomate presentes a ms baja altitud, que podran ser fuente de inculo de
ToCV u otros virus transmitidos por esta especie de mosca blanca.
97
CAPTULO 3
ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENTICA DEL RNA1 DE
TOMATO CHLOROSIS VIRUS EN TOMATE Y PIMIENTO:
POSIBLE
IMPLICACIN
ADAPTACIN AL HUSPED
DE
FENMENOS
DE
Captulo 3
3. ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENTICA DEL RNA1 DE

TOMATO CHLOROSIS VIRUS EN TOMATE Y PIMIENTO:
POSIBLE IMPLICACIN DE FENMENOS DE ADAPTACIN AL
HUSPED
3.1. ANTECEDENTES
Los estudios de diversidad gentica de las poblaciones de virus y otros
patgenos de plantas son esenciales para el desarrollo de estrategias de control
eficientes y duraderas.
En el caso de ToCV, se ha estudiado la variabilidad gentica de poblaciones
naturales de distintas zonas de la cuenca del Mediterrneo desde dos aproximaciones
distintas. Por una parte, se ha llevado a cabo el estudio de la diversidad gentica y el
anlisis filogentico a partir de la secuencia nucleotdica consenso de las regiones
codificantes ORF1a y ORF1b, y del extremo 5-UTR del RNA1 de distintos aislados
virales procedentes de tomate y pimiento, as como las regiones genmicas
pertenecientes a los genes Hsp70h, CP y CPm del RNA2 (Lozano, 2007). Adems,
se ha estudiado la variabilidad gentica de las poblaciones virales dentro de aislados
procedentes de tomate, determinando su estructura en cuasiespecie (Lozano et al.,
2009). En ambos trabajos se han identificado dos tipos de variantes del RNA1 de
ToCV denominadas I y II, distinguibles por diferencias nucleotdicas y
aminoacdicas en las regiones genmicas analizadas. Se han encontrado indicios de
un posible fenmeno de adaptacin al husped por parte de las regiones codificantes
del RNA1. As, todos los aislados de ToCV procedentes de pimiento posean un
RNA1 de tipo I y presentaban adems nucletidos exclusivos en las posiciones
342C, 370C y 7046T, los dos primeros localizados en la regin correspondiente al
ORF1a y el tercero en la regin RdRp (Lozano, 2007). Asimismo, se ha puesto de
manifiesto la presencia en uno de los aislados de tomate de una molcula
101
Captulo 3
posiblemente recombinante entre las dos variantes del RNA1 que estaban presentes
en dicho aislado (Lozano et al., 2009).
Con el objetivo de realizar un estudio ms extenso sobre la posible adaptacin
de ToCV al husped, en este trabajo se amplia el estudio de la variabilidad gentica
existente en las regiones codificantes ORF1a y ORF1b (RdRp), as como en la
regin 5-UTR del RNA1 de ToCV (Lozano, 2007) a una mayor coleccin de
aislados obtenidos de tomate y pimiento procedentes de cultivos comerciales de las
principales zonas productoras de sudeste peninsular espaol (Murcia, Almera y
Mlaga) y de huspedes alternativos (Datura stramonium, Solanum nigrum y
patata). Por otro lado, se ha llevado a cabo el anlisis de la secuencia nucleotdica de
un aislado de ToCV tras sucesivos pases en tomate y pimiento.
3.2.1. Material vegetal
La poblacin de ToCV analizada consisti en 87 aislados procedentes de
plantas de cultivos comerciales de tomate y pimiento, as como de D. stramonium, S.
nigrum y patata. Se recogieron 47 aislados de tomate en muestreos realizados
durante los aos 2006 a 2008 en Mlaga, Almera y Murcia, y 29 aislados de
pimiento que se recogieron en la provincia de Almera en 2006 y en Mlaga desde
2006 a 2008. Adems, se incluyen 6 aislados de D. stramonium, 2 de S. nigrum y 3
de patata.
Los aislados se obtuvieron a partir de una nica hoja de una planta infectada
por ToCV. Estos aislados se identificaron con el cdigo AT, un nmero de orden y
el ao de muestreo, excepto las muestras de pimiento del ao 2006 de Mlaga.
En el anlisis llevado a cabo en este trabajo sobre la variabilidad gentica y
filogenia de ToCV (apartado 3.2.8), se incluyen los aislados de tomate de 2003 y
2004 y de pimiento de 1999 y 2005 analizados previamente (Lozano, 2007)
102
Captulo 3
siguiendo la misma metodologa descrita en este captulo. En la tabla 3.1 se presenta

la denominacin de todos los aislados de ToCV analizados as como los datos sobre
su fecha de recoleccin y procedencia.
103
Captulo 3
Tabla 3.1. Aislados de ToCV analizados en este trabajo. MA, Marruecos; PT, Portugal.
Husped
tomate
Periodo del cultivo

2003
2004
104
Aislado
AT03/03
AT04/03
AT05/03
AT07/03
AT16/03
AT17/03
AT18/03
AT31/03
AT83/03
AT97703
AT120/03
AT138/03
AT147/03
AT178/03
AT187/03
AT219/03
AT220/03
AT01/04
AT04/04
AT05/04
AT08/04
AT176/04
AT204/04
AT214/04
AT248/04
AT260/04
AT308/04
AT350/04
AT379/04
AT17/04
AT41/04
AT80/04
AT112/04
AT433/04
AT444/04
AT459/04
AT481/04
Procedencia geogrfica
Gran Canaria
Gran Canaria
Gran Canaria
Gran Canaria
Agadir (MA)
Agadir (MA)
Agadir (MA)
Almera
Almera
Almera
Almera
Murcia
Murcia
Murcia
Murcia
Algarve (PT)
Algarve (PT)
Gran Canaria
Gran Canaria
Gran Canaria
Gran Canaria
Almera
Almera
Almera
Almera
Murcia
Murcia
Murcia
Murcia
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Algarve (PT)
Algarve (PT)
Algarve (PT)
Algarve (PT)
Captulo 3
Tabla 3.1. Aislados de ToCV analizados en este trabajo. (continuacin).
Husped
tomate
Perodo del cultivo

2006/2007
2007/2008
Aislado
AT189/06
AT199/06
AT209/06
AT219/06
AT248/06
AT254/06
AT264/06
AT265/06
AT89/06
AT92/06
AT102/06
AT106/06
AT126/06
AT136/06
AT146/06
AT152/06
AT158/06
AT4/08
AT5/08
AT7/08
AT8/08
AT9/08
AT11/08
AT12/08
AT13/08
AT32/08
AT43/08
AT47/08
AT63/08
AT66/08
AT74/08
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Almera
Almera
Almera
Almera
Almera
Murcia
Murcia
Murcia
Murcia
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Almera
Almera
Almera
Murcia
Murcia
Murcia
105
Captulo 3
Husped
tomate
Perodo del cultivo

2008/2009
pimiento
1999
2005
2006/2007
106
Aislado
AT1/09
AT2/09
AT6/09
AT11/09
AT13/09
AT18/09
AT19/09
AT24/09
AT40/09
AT44/09
AT52/09
AT60/09
AT89/09
AT90/09
AT93/09
AT103/09
TY356/99
TY363/99
TY365/99
TY370/99
AT345/05
AT346/05
AT347/05
AT349/05
5-26
7-23
7-29
10B1
10B7
7-37
9-15
9-16
AT88/06
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Almera
Almera
Almera
Murcia
Murcia
Murcia
Murcia
Almera
Almera
Almera
Almera
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Almera
Captulo 3
Husped
pimiento
Perodo del cultivo

2007/2008
2008/2009
Solanum nigrum
2006
Datura stramonium
2006
patata
2007
2006
Aislado
AT2/07
AT4/07
AT6/07
AT10/07
AT11/07
AT17/07
AT18/07
AT19/07
AT20/07
AT1/07
AT132/08
AT133/08
AT134/08
AT135/08
AT144/08
AT145/08
AT152/08
AT153/08
AT155/08
AT159/08
AT24/06
AT31/06
AT10/06
AT11/06
AT16/06
AT17/06
AT18/06
AT21/07
AT37/06
Pat1
Pat2
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
Mlaga
107
Captulo 3
3.2.2. Diagnstico de ToCV

El diagnstico de ToCV en las muestras recogidas se llev a cabo mediante
hibridacin molecular. Para ello, se realizaron improntas de cortes transversales del
peciolo de cada una de las muestras y se hibridaron con una sonda marcada con
digoxigenina que reconoca especficamente la regin del gen que codifica la
protena de la cpsida de ToCV, como se describe en el apartado 1.2.2. Una vez
obtenidos los resultados de hibridacin, se seleccionaron al azar, siempre que fue
posible, entre cuatro y diez aislados infectados por ToCV de cada regin geogrfica
para su posterior anlisis.
3.2.3. Extraccin de RNA total
A partir de los aislados seleccionados se obtuvieron extractos de RNA total
(ver apartado 1.2.2) que se utilizaron para sintetizar y amplificar DNAs
complementarios (cDNAs) al RNA de las regiones del genoma de ToCV que se
describen a continuacin.
3.2.4. Regiones del genoma de ToCV analizadas
Las tres regiones genmicas seleccionadas para analizar la diversidad
gentica de ToCV, pertenecientes al RNA1 del virus, fueron i) la regin 5-UTR (no
codificante) completa, ii) el extremo 5 del ORF1a y iii) parte del gen que codifica la
RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRp) (Fig. 3.1).
108
Captulo 3
RNA1
0
1000
3000
2000
4000
5000
6000
ORF1a
5
PRO
MTR
7000
ORF1b
HEL
8000
ORF2 ORF3
p6
RdRp
8594
p22
Figura 3.1. Representacin esquemtica del RNA1 de ToCV en el que se indican en azul las
regiones analizadas: 5-UTR, ORF1a y ORF1b (RdRp). El RNA est representado por una lnea con
los ORFs indicados por rectngulos, cuya localizacin sobre, por encima o por debajo de la lnea
indica el marco de lectura utilizado.
3.2.5. Diseo de los iniciadores empleados en la sntesis y amplificacin de

cDNAs mediante RT-PCR
Los iniciadores utilizados en la sntesis y amplificacin de cDNAs de las
regiones del RNA1 analizadas se disearon en zonas conservadas a partir de
alineamientos de las secuencias completas del RNA1 de los aislados de Estados
Unidos (GenBank AY903447; Wintermantel et al., 2005), Espaa (DQ983480;
Lozano et al., 2007) y Grecia (EU284745; Kataya et al., 2008) (Tabla 3.2).
En el iniciador MA512 se introdujo una degeneracin en la posicin 20
debido a que nuestros datos preliminares mostraban que entre los aislados espaoles
exista variacin en la base encontrada en dicha posicin, pudiendo ser T o C (Tabla
3.2).
109
Captulo 3
Tabla 3.2. Iniciadores empleados para la sntesis y amplificacin mediante RT-PCR de los cDNAs
del RNA1 de ToCV. Y: C+T. La posicin nucleotdica de los iniciadores corresponde a la secuencia
del aislado espaol AT80/99 (DQ983480; Lozano et al., 2007).
Regin genmica (nt)
Iniciador
Secuencia (5-3)
Posicin (nt)
5-UTR-ORF1a (714)
MA512 (+)
gaaatagtattcgtgtgatyac
1-22
MA463 (-)
tggtccgtgtaaccatctattc
714-693
MA396 (+)
tggtcgaacagtttgagagc
6664-6683
MA397 (-)
tgaactcgaattgggacaga
7426-7407
ORF1b (763)
3.2.6. Sntesis y amplificacin de cDNAs del RNA1 de ToCV mediante RT-PCR

La sntesis de cDNAs del RNA genmico se llev a cabo mediante
transcripcin reversa con los iniciadores de sentido negativo diseados en cada
regin genmica y utilizando como molde extractos de RNA total de los distintos
aislados. La reaccin de transcripcin reversa se llev a cabo en un volumen final de
20 l que contena 0,5 M de iniciador de sentido negativo, 2 l de extracto de RNA
total (desnaturalizado previamente por tratamiento a 70 C durante 5 min), tampn
de transcriptasa reversa AMV 1x (Promega), 20 U de inhibidor de RNasas (RNase
OUT, Invitrogen), 1 mM de dNTPs y 10 U de transcriptasa reversa AMV
(Promega). La mezcla se incub a 42 C durante 45 min seguido de 5 min a 94 C.
Tras la reaccin de sntesis de la primera cadena, el cDNA obtenido se amplific
mediante PCR en un volumen final de 50 l, para lo que se utilizaron 5 l de cDNA,
tampn de DNA polimerasa Expand High Fidelity 1x (Roche), 0,3 M de cada uno
de los iniciadores correspondientes, 0,2 mM de dNTPs y 2,5 U de DNA polimerasa
Expand High Fidelity (Roche). El programa de PCR empleado consisti en un ciclo
de desnaturalizacin a 94 C durante 2 min, seguido de 10 ciclos de
desnaturalizacin a 94 C durante 15 s, hibridacin de los iniciadores a 47 C
110
Captulo 3
durante 30 s y extensin a 72 C durante 45 s, ms 20 ciclos de desnaturalizacin a

94 C durante 15 s, hibridacin de los iniciadores a 47 C durante 30 s y extensin a
72 C durante 45 s, incrementando este ltimo paso en 5 s cada ciclo, ms una
extensin final a 72 C durante 7 min.
3.2.7. Secuenciacin de los productos de amplificacin
Los fragmentos de DNA amplificados para cada una de las regiones
genmicas de cada aislado se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al
1% en tampn TAE y se visualizaron por tincin con bromuro de etidio. Los
productos de PCR se analizaron por secuenciacin directa en un secuenciador ABI
3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems) (Macrogen, Corea del Sur) con los
mismos iniciadores empleados para su amplificacin, de manera que se obtuvieron
las secuencias en ambos sentidos y a partir de stas se gener la secuencia consenso
de cada regin genmica para cada aislado.
3.2.8. Anlisis de las secuencias nucleotdicas
Los alineamientos de las secuencias nucleotdicas obtenidas se llevaron a
cabo utilizando el programa CLUSTALX (Thompson et al., 1997) y a partir de ellos
se realizaron los anlisis filogenticos mediante los mtodos del vecino ms
prximo (neighbour joining) y mxima parsimonia incluidos en el programa
MEGA4 (Tamura et al., 2007). La fiabilidad de los agrupamientos entre los aislados
en los rboles generados se evalu mediante el mtodo bootstrap considerando 1000
rplicas (Nei y Kumar, 2000). Los anlisis de diversidad gentica se realizaron con
el programa MEGA4 a partir de los alineamientos generados por CLUSTALX. Las
diversidades nucleotdicas medias intra e interpoblacionales se calcularon a partir de
las estimas de las distancias genticas entre pares de aislados (Nei y Kumar, 2000).
La diversidad intrapoblacional se define como el nmero medio de sustituciones
nucleotdicas entre dos aislados elegidos al azar en una poblacin X y se estima
segn la ecuacin:
111
Captulo 3
dX = (q/q-1) xixjdij
donde q es el nmero de secuencias diferentes en la poblacin X, xi y xj son las
frecuencias medias en dicha poblacin de las secuencias i y j, respectivamente, y dij
es una estima del nmero de sustituciones nucleotdicas por posicin entre las
secuencias i y j.
La diversidad nucleotdica media neta entre las poblaciones X e Y se estim
mediante la ecuacin:
dA= xiyjdij -1/2 (dX + dY)
donde xi es la frecuencia media de la secuencia i en la muestra de la subpoblacin X,
yj es la frecuencia media de la secuencia j en la muestra de la subpoblacin Y y dij es
el nmero medio de sustituciones nucleotdicas por posicin entre la secuencia tipo i
de la poblacin X y la secuencia tipo j de la poblacin Y (Nei y Kumar, 2000). El
error estndar para cada estima de diversidad nucleotdica se calcul mediante el
mtodo bootstrap considerando 1000 rplicas disponible en el programa MEGA4
(Nei y Kumar, 2000). La significacin de la diversidad nucleotdica se estim
mediante la prueba t-Stutent (Sokal y Rolf, 1981).
Las evidencias filogenticas de recombinacin se detectaron mediante el
mtodo Neighbor-Net utilizando el programa SplitsTree4 (Huson y Bryant, 2006) y
se verificaron estadsticamente usando el test PHI de homoplasia (Bruen et al.,
2006).
3.2.9. Anlisis de la secuencia nucleotdica del aislado MM8 de ToCV
procedente de pimiento en tomate y pimiento
A partir de extracciones de RNA total de 3 plantas de tomate y 16 de
pimiento positivas para ToCV por hibridacin molecular, cuya procedencia se
describe posteriormente, se realiz la sntesis del fragmento de cDNA
112
Captulo 3
correspondiente a la regin 5-UTR completa y el extremo 5 del ORF1a del RNA1

de ToCV mediante RT-PCR segn el protocolo descrito en el apartado 3.2.6.
Posteriormente, se procedi a la secuenciacin de los productos de amplificacin y
su anlisis mediante el alineamiento de las secuencias nucleotdicas obtenidas
utilizando el programa CLUSTALX. En este anlisis se incluyeron las siguientes
plantas:
i. Una planta de pimiento infectada con ToCV de forma natural recogida en un
cultivo comercial de la provincia de Mlaga en el ao 2005 (aislado MM8) (ver
captulo 1, apartado 1.3.1) (Fig. 3.2.A).
ii. Tres plantas de tomate inoculadas con el aislado MM8 a partir de la planta
anterior mediante B. tabaci (ver captulo 1, apartado 1.3.2). El aislado MM8 se
mantuvo en tomate en condiciones controladas mediante esqueje y transmisiones
peridicas con B. tabaci desde 2005 hasta la actualidad. El anlisis de la secuencia
viral se realiz de una planta del ao 2007 y de dos plantas del ao 2009 (Fig.
3.2.B).
iii. Quince plantas de pimiento inoculadas con el aislado MM8 mediante B. tabaci a
partir de las plantas de tomate de 2009 mencionadas anteriormente (ver captulo 1,
apartado 1.3.4). El anlisis de la secuencia viral presente en estas plantas se realiz a
los 150 das despus de su inoculacin (Fig. 3.2.C).
113
Captulo 3
PIMIENTO
MM8
(aislado de ToCV infectando plantas de pimiento de forma natural)
2005
(1 planta)
B. tabaci (2005)
TOMATE
2007 (1 planta)
2009 (2 plantas)
Esquejes y B. tabaci
(2005-2009)
B. tabaci (2009)
C
PIMIENTO
2009 (15 plantas)
Figura 3.2. Representacin esquemtica de las inoculaciones de ToCV en distintos huspedes

realizadas bajo condiciones controladas a partir de un aislado de ToCV infectando pimiento de
forma natural (MM8). En cada cuadro se muestra el husped y nmero de plantas en las que se ha
analizado la secuencia nucleotdica de un fragmento de cDNA correspondiente a la regin 5-UTR
y el extremo 5 del ORF1a del RNA1 de ToCV y la fecha del anlisis. Entre cada cuadro se indica
el mtodo utilizado en la inoculacin (esquejes o B. tabaci) y la fecha o perodo de tiempo en que se
realiz.
114
Captulo 3
3.3. RESULTADOS
3.3.1. Variabilidad nucleotdica en el RNA1 de ToCV
Los fragmentos de DNA amplificados mediante RT-PCR mostraron el
tamao esperado en todos los casos y no se obtuvo amplificacin a partir de
extractos de plantas no infectadas utilizados como control. En las secuencias
consenso obtenidas para cada fragmento a partir de cada uno de los aislados se
descart la regin correspondiente a los iniciadores, as como el nmero mnimo de
nucletidos necesario para respetar la pauta de lectura en cada uno de los
fragmentos. El total de nucletidos analizados por aislado fue de 1393, lo que
representa aproximadamente el 16% del RNA1 de ToCV.
En los alineamientos generados a partir de las secuencias obtenidas para cada
regin genmica se detectaron una serie de mutaciones puntuales o posiciones
polimrficas, algunas de las cuales se encontraban presentes en un solo aislado
mientras que otras eran compartidas por un nmero variable de ellos.
El nmero de posiciones polimrficas identificadas en los alineamientos de
las secuencias obtenidas para cada fragmento se muestra en la tabla 3.3. La zona del
ORF1a fue la que present mayor nmero de posiciones variables (60 cambios
nucleotdicos frente a los 31 y 48 del extremo 5-UTR y regin RdRp,
respectivamente). La mayor parte de los cambios nucleotdicos de la regin RdRp
no se traducen en cambios aminoacdicos, en contraste con el ORF1a que presenta
slo alrededor del 50% de cambios nucleotdicos sinnimos.
En las tres regiones del RNA1 analizadas se identificaron 36 cambios
nucleotdicos, que eran compartidos por 56 aislados de distintas zonas geogrficas,
ao y husped y no presentes en el resto, obtenindose de este modo resultados
similares a los descritos anteriormente en los que se sugiere la existencia de dos
tipos distintos o variantes de RNA1 (I y II) (Lozano, 2007). El tipo de RNA1
115
Captulo 3
mayoritario, compuesto por 76 aislados, es el tipo I, mientras que el tipo II est

constituido por los 56 aislados restantes.
Tabla 3.3. Posiciones nucleotdicas polimrficas identificadas en las regiones genmicas analizadas
del RNA 1 de ToCV. nt: nmero de nucletidos; PV: nmero de posiciones variables (porcentaje);
sinnimos: nmero de posiciones variables que no provocan cambio aminoacdico; no sinnimos:
nmero de posiciones variables que provocan cambio de aminocido.
Regin genmica
nt
PV (%)
sinnimos no sinnimos
5- UTR
279
31 (11,1)
ORF1a
391
60 (15,3)
31
29
RdRp
723
48 (6,6)
44
3.3.2. Anlisis filogentico de las regiones genmicas analizadas

Las relaciones filogenticas entre los distintos aislados se establecieron
mediante los mtodos del vecino ms prximo y mxima parsimonia a partir de los
alineamientos de las distintas regiones genmicas, tanto para cada una de ellas de
manera independiente como para las secuencias concatenadas resultantes de la unin
de los fragmentos del genoma del RNA1 de ToCV analizados.
Las topologas de los rboles filogenticos deducidas tanto para las
secuencias concatenadas de las regiones genmicas (Fig. 3.3), como para las
regiones genmicas de manera independiente (Figs. 3.4, 3.5 y 3.6) fueron similares
utilizando ambos mtodos (vecino ms prximo y mxima parsimonia). En estos
anlisis se incluyeron como referencia las secuencias homlogas del RNA1 del
aislado espaol de ToCV AT80/99 (Lozano et al., 2007), el estadounidense
procedente de Florida (Wintermantel et al., 2005) y el griego (Kataya et al., 2008).
116
Captulo 3
En este anlisis se observ claramente la distribucin de los aislados en dos

grupos, apoyados por valores de bootstrap del 100%, que coincidan con los
determinados por los alineamientos de las secuencias nucleotdicas, por lo que se les
denomin grupo I y grupo II, de acuerdo con el tipo de RNA1 que presentaban los
aislados que se incluan en ellos. En todas las regiones geogrficas, excepto en
Agadir (3 muestras analizadas), y en todos los aos de recoleccin de muestras, se
encontraron aislados con RNA1 de ambos tipos. El RNA1 del aislado AT80/99 es
de tipo I, mientras que el de los aislados de Florida y Grecia es de tipo II.
117
Captulo 3
RNA1
Pimiento
Tomate
Patata
Datura stramonium
Solanum nigrum
66 AT15508
TY36399
AT15208
AT14508
AT13508
915
AT1107
71 AT1707
AT1907
AT1807
729
10B7
AT1006
AT1106
AT15908
AT14408
AT607
63
AT13308
TY37099
AT209*
AT2007
TY35699
AT1007
AT8806
96 AT34605
AT34505
TY36599
56 AT2107
56
AT18906
50
AT207
58
AT13208
723
AT407
AT1806
52 AT15308
AT13408
916
50
737
60 69 AT107
AT34705
83 AT34905
10B1
AT1308
AT126 06
AT15806
AT18703
AT14703
94 AT1606
526*
AT1706
AT30804
AT13803
AT17803
62 AT24804
82
AT9703
AT6608
56 AT3103
72 AT20404
AT8303
AT6009
AT37904
AT26004
AT14606
66
94 AT10606
AT35004
98
AT8099
AT22003
AT45904
AT804
62
AT403
AT504
92 AT503
AT303
AT104
66 AT703
AT13606
AT19906
AT404
AT21903
AT44404
73 AT43304
93
AT48104
100 69
Florida
Grecia
AT8906
AT1803
AT1703
AT21404
AT1603
AT1809
AT8909
AT8004
AT9309
AT508
AT5209
AT4308
AT20906
AT109
AT4104
AT2406
AT1109
AT708
AT908
AT4409
AT24806
AT3106
AT808
AT9206
AT3706
AT6308
AT26506
AT1208
AT15206
AT12003
AT26406
AT25406
AT17604
AT1704
AT1909
AT10309
AT21906
AT2409
AT408
AT4708
AT10206
AT9009
AT7408
66 Pat2
Pat1
AT1309
AT3208
AT609
AT11204
AT1108
AT4009
Tipo I
Tipo II
0.002
Figura 3.3. rbol filogentico deducido mediante el mtodo del vecino ms prximo a partir de los
alineamientos realizados con CLUSTALX de las secuencias concatenadas del extremo 5-UTR,
ORF1a y RdRp del RNA1 de la poblacin de ToCV analizada. En los nodos que preceden a cada
agrupamiento se indican los valores de bootstrap mayores del 50%. La barra de escala horizontal
indica 0,002 cambios por posicin nucleotdica. En negrita se indican los aislados de ToCV de
Espaa (AT80/99), Florida y Grecia que se han secuenciado completamente. Con un crculo se
indica la posible molcula recombinante entre RNA1 tipo I y II.
118
Captulo 3
5UTR
66 915
AT1107
AT13408
AT12606
AT18703
AT6608
AT34705
TY37099
AT1007
AT9703
AT15806
AT1308
AT107
AT1907
AT17803
AT6009
AT22003
AT14408
916
737
AT1706
AT2007
AT13606
AT15908
AT13308
AT14703
AT1707
AT26004
AT14606
AT35004
87 AT10606
AT37904
AT1807
AT34505
10B1
TY35699
AT45904
AT209
AT1806
AT34605
AT1006
AT24804
729
AT607
AT34905
10B7
AT1606
51 AT1106
526
AT13508
AT14508
TY36399
AT15208
AT15508
AT30804
AT8806
AT8099
AT15308
AT407
AT13803
57
53
99
AT404
60
Pimiento
Tomate
Patata
Datura stramonium
Solanum nigrum
TY36599
76
AT20404
AT207
AT19906
AT2107
AT3103
AT13208 723
AT18906
AT8303
AT44404
AT21903
AT48104
AT43304
AT1703
AT21404
AT8909
Grecia
AT1603
AT1803
AT1108
AT2406
Pat2
AT808
AT5209
AT908
AT17604
AT2409
AT4409
AT1909
AT1208
61
AT408
AT609
AT20906
AT6308
AT4104
AT1809
AT1109
AT10309
AT24806
AT26406
AT4308
AT1704
Pat1
AT11204
AT3706
AT26506
AT4708
AT8004
AT12003
AT708
AT4009
AT25406
AT9206
AT508
AT3106
AT1309
AT21906
AT15206
AT7408
AT8906
AT109
Tipo I
AT804
AT504
AT403
AT503
59 AT703
AT104
AT303
Florida
AT9309
Tipo II
AT3208
AT9009
AT10206
0.005
alineamientos realizados con CLUSTALX de las secuencias de la regin del extremo 5-UTR de la
poblacin de ToCV analizada. En los nodos que preceden a cada agrupamiento se indican los
valores de bootstrap mayores del 50%. La barra de escala horizontal indica 0,005 cambios por
posicin nucleotdica. En negrita se indican los aislados de ToCV de Espaa (AT80/99), Florida y
Grecia que se han secuenciado completamente. Con un crculo se indica la posible molcula
recombinante entre RNA1 tipo I y II.
119
Captulo 3
ORF1a
100
Pimiento
Tomate
Patata
Datura stramonium
Solanum nigrum
915
AT15208
AT14508
AT13508
TY36399
AT15508
AT1107
AT1707
AT1907
AT1807
51 729
10B7
AT1006
AT2007
TY36599
TY35699
AT209
63 AT34605
AT34505
AT8806
AT1106
AT15908
AT607
TY37099
723
AT13308
AT1007
AT14408
AT407
AT13208
AT15308
916
AT1806
737
AT13408
AT107
AT34705
AT34905
10B1
AT1308
AT2107
AT207
62 AT1606
526
AT19906
80 AT18906
AT13606
AT35004
AT30804
AT26004
AT17803
AT14606
AT10606
AT1706
AT6009
AT15806
AT12606
AT18703
AT8303
AT45904
AT20404
AT3103
AT14703
AT804
AT403
AT22003
AT703
AT104
AT303
AT503
AT8099
AT504
AT6608
59 AT24804
AT9703
AT13803
AT37904
AT8906
AT8004
63 Grecia
AT1809
AT8909
AT508
60
AT24806
AT15206
AT1704
AT3106
AT2406
AT1603
AT908
AT12003
AT9309
AT6308
AT21404
AT808
AT3208
AT48104
AT1208
AT1909
AT43304
AT2409
AT10309
AT20906
AT17604
AT26506
AT10206
AT1703
AT4308
AT109
AT4409
AT708
AT4104
AT21906
AT1109
AT9206
AT1309
AT25406
AT26406
AT9009
AT3706
AT1803
AT5209
AT408
AT7408
AT21903
AT4708
62 Pat2
Pat1
AT11204
AT4009
AT609
AT404
AT1108
Florida
62 AT44404
Tipo I
Tipo II
0.005
alineamientos realizados con CLUSTALX de las secuencias de la regin del extremo 5-UTR de la
posicin nucleotdica. En negrita se indican los aislados de ToCV de Espaa (AT80/99), Florida y
Grecia que se han secuenciado completamente. Con un crculo se indica la posible molcula
120
Captulo 3
RdRp
52
AT2107
62 AT207
AT18906
723
AT13208
AT2007
AT15308
AT1806
AT1907
AT14508
TY37099
88 AT34605
AT34505
TY35699
AT34905
AT1106
AT407
AT1007
AT34705
65 AT15508
TY36399
AT15208
TY36599
10B7
916
737
68
72 AT107
AT1807
AT1107
AT8806
AT209
AT1006
AT14408
AT13508
10B1
AT1308
729 64
AT1707
AT13408
915
AT607
AT13308
65 AT15908
AT17803
AT12606
AT30804
AT13803
64 AT9703 AT6608
AT24804
AT14703
AT1706
AT6009
67 AT20404
AT8303
AT37904
AT3103
66 AT1606
526
AT15806
AT14606
AT35004
64 AT10606
AT26004
AT18703
AT303
AT503
AT403
52
AT504
AT45904
AT703
AT104
AT804
AT22003
AT13606
87
60
99
Pimiento
Tomate
Patata
Datura stramonium
Solanum nigrum
Tipo I
AT8099
AT44404
AT43304
AT48104
AT21903
Grecia
Florida
AT508
AT20906
AT8909
AT109
AT21906
AT609
Pat2
AT404
AT3706
Pat1
AT2409
AT3106
AT15206
AT24806
AT908
AT8906
AT10309
AT26506
AT1703
AT4409
AT6308
AT1909
AT1109
AT408
AT4308
AT17604
AT10206
AT26406
AT9009
AT9309
AT8004
AT808
AT4104
AT708
AT4708
AT1208
AT2406
AT12003
AT5209
AT7408
AT1809
AT1704
AT9206
AT25406
AT1108
AT3208
AT1603
AT21404
AT1309
AT19906
AT4009
AT11204AT1803
Tipo II
0.002
alineamientos realizados con CLUSTALX de las secuencias de la regin de la RdRp de la
posicin nucleotdica. En negrita se indican los aislados de ToCV de Espaa (AT80/99), de Florida
y de Grecia que se han secuenciado completamente. Con un crculo se indica la posible molcula
121
Captulo 3
En este estudio se ha detectado la presencia de una molcula de RNA1

posiblemente recombinante (AT199/06, Fig. 3.3). La posicin intermedia en el rbol
filogentico realizado mediante concatenacin de las secuencias de las regiones
genmicas analizadas se debe a que la regin del extremo 5-UTR y ORF1a es tipo I
mientras que la regin RdRp es de tipo II. Por ese motivo en los rboles
filogenticos
generados
partir
del
extremo
5-UTR
el
ORF1a
independientemente, el aislado AT199/06 aparece junto a los aislados con RNA1 de

tipo I (Figs. 3.4 y 3.5) y en el rbol filogentico de la regin de la RdRp aparece
junto a los de tipo II (Fig. 3.6). El anlisis de redes filogenticas apoy la presencia
de recombinacin en esta molcula, como se sugiere por la presencia de estructuras
reticulares en vez de bifurcaciones (Fig. 3.7) y evidencia estadstica de
inconsistencia filogentica en este aislado (p=0,035; PHI test).
/
Tipo II
Tipo I
0.001
Figura 3.7. Red filogentica generada mediante el mtodo Neighbor-Net usando el programa
SplitsTree4 a partir de los alineamientos realizados con CLUSTALX de las secuencias
concatenadas del extremo 5-UTR, ORF1a y RdRp del RNA1 de la poblacin de ToCV analizada.
La formacin de redes reticulares entre varios aislados en forma de estructura de caja en vez de
bifurcacin sugiere la presencia de recombinaciones. AT199/06, posible molcula recombinante
entre RNA1 tipo I y II. Se indican los aislados de ToCV de Espaa (AT80/99), Florida y Grecia que
se han secuenciado completamente. En verde se indican los aislados de ToCV de pimiento y en rojo
de tomate
122
Captulo 3
3.3.3. Influencia del husped en la estructura genmica de la poblacin de

ToCV
El anlisis filogentico de todos los aislados de tomate y pimiento
procedentes del sudeste peninsular espaol, Portugal y Marruecos puso de
manifiesto una evidente asociacin entre el tipo de RNA1 y el husped. As, en
tomate se encuentran los dos tipos de RNA1, I y II, mientras que todos los aislados
de pimiento son de tipo I y la gran mayora se agrupan en el mismo cluster (Figs.
3.3, 3.4, 3.5 y 3.6).
Esta agrupacin se debe a la existencia de tres cambios nucleotdicos, T342C,
T370C y C7046T, prcticamente exclusivos de los aislados de pimiento. Los dos
primeros cambios se encuentran localizados en la regin correspondiente al ORF1a
y el tercero en la regin RdRp. De estas tres sustituciones nucleotdicas slo la
primera genera un cambio de aminocido (F14S). Sin embargo, existen algunas
excepciones, ya que se observaron 3 aislados de pimiento en los que alguno de estos
nucletidos (AT2/07 y 10B-1) o los tres (5-26), son los caractersticos de los
aislados de tomate. Tambin se encontraron 3 aislados de tomate que presentan
alguno o todos los cambios nucleotdicos tpicos de los aislados de pimiento
(AT13/08, AT189/06 y AT2/09) (Fig. 3.3).
Con el objetivo de determinar si la adaptacin al husped podra estar
determinando una estructuracin de la poblacin de ToCV, se calcularon los valores
de diversidad nucleotdica dentro y entre las subpoblaciones de aislados,
considerando como tales a cada conjunto de aislados procedentes de un mismo
husped, tomate o pimiento, y a partir de las secuencias concatenadas de las distintas
regiones analizadas dentro del genoma del RNA1.
123
Captulo 3
Tabla 3.4. Diversidad nucleotdica intra e interpoblacional estimada a partir de los alineamientos de
las secuencias concatenadas de las regiones del RNA 1 de ToCV analizadas para cada aislado. Las
subpoblaciones de aislados se establecieron en funcin del husped del que se obtuvieron. En la
diagonal se muestran los valores de diversidad intrapoblacional y por encima de la diagonal el valor
de diversidad interpoblacional. n, nmero de aislados incluidos en la subpoblacin indicada. El
error estndar se indica entre parntesis. Nivel de significacin: *** P < 0,001.
Husped
Tomate (n=84)
Pimiento (n=37)
Tomate
0,0167 (0,0024)***
0,0126 (0,0021)***
Pimiento
0,0029 (0,0006)***
El valor de diversidad neta interpoblacional determin que exista

diferenciacin entre las subpoblaciones determinadas por el husped. Los valores de
diversidad intrapoblacional estimados para las regiones del RNA1 analizadas son
mayores para el conjunto de aislados procedentes de tomate, lo que estara
determinado por la presencia nicamente de RNA1 tipo I entre los aislados de
pimiento, mientras que en los aislados de tomate se encontraron los tipos I y II.
Con respecto a los huspedes alternativos de ToCV analizados en este
estudio, los 6 aislados procedentes de D. stramonium son de tipo I y los 2 aislados
procedentes de S. nigrum y 3 de patata son de tipo II (Fig. 3.3).
3.3.4. Implicacin de fenmenos de adaptacin al husped en la variabilidad del
RNA1 de ToCV
El anlisis nucleotdico del aislado MM8 de ToCV procedente de pimiento y
mantenido en tomate (mediante transmisin con B. tabaci o esqueje) desde 2005
hasta la actualidad, ha mostrado la existencia de cambios en la secuencia
nucleotdica viral asociados al husped en el que se mantena.
124
Captulo 3
La secuencia nucleotdica del aislado MM8 de ToCV original que infectaba

pimiento de forma natural y analizada en 2005 present los tres cambios
nucleotdicos mencionados anteriormente como caractersticos de los aislados de
pimiento. En el anlisis nucleotdico de una planta de tomate inoculada a partir de
pimiento, llevado a cabo en 2007, se observ la conservacin de estos tres cambios
nucleotdicos. Sin embargo, las plantas de tomate infectadas con este aislado
analizadas en 2009 presentaron una sustitucin nucleotdica en una de las dos
posiciones variables de la regin del ORF1a, encontrndose una timina (nucletido
caracterstico de los aislados de tomate) en vez de una citosina (nucletido
caracterstico de los aislados de pimiento). En las plantas de pimiento analizadas 150
das despus de su inoculacin mediante B. tabaci a partir de las plantas de tomate
infectadas con el aislado MM8 y analizadas en 2009, se observ una reversin en la
posicin nucleotdica mencionada de timina a citosina (Fig. 3.8). Este nucletido es
el nico de los tres descritos que caracterizan a los aislados de pimiento que
determina un cambio aminoacdico, F14S.
125
Captulo 3
RNA1
0
1000
3000
2000
4000
5000
6000
ORF1a
5
PRO
B. tabaci y
esquejes
B. tabaci
8594
8000
ORF2 ORF3
p6
RdRp
p22
C7046T
T342C T370C
ORF1b
HEL
MTR
7000
AT80/99
*
340
*
360
: TTGTTTCGTTTAACGTAGATTTTACTGAAAAGAAAATAAA : 360
MM8/2005
: .....................C.................. : 360
MM8/2007
MM8/2009_1
MM8/2009_2
/
PI/2009_1
PI/2009_2
PI/2009_3
PI/2009_4
PI/2009_5
PI/2009_6
PI/2009_7
PI/2009_8
PI/2009_9
PI/2009_10
PI/2009_11
PI/2009_12
PI/2009_13
PI/2009_14
PI/2009_15
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Figura 3.8. A: Representacin esquemtica del RNA1 de ToCV en el que se indican los cambios
nucleotdicos que caracterizan a los aislados de pimiento en el ORF1a y ORF1b (RdRp). B:
Alineamiento de la secuencia nucleotdica de un fragmento del ORF1a de las plantas infectadas con
un aislado de ToCV procedente de pimiento (MM8/2005) y mantenido en tomate mediante esquejes
y transmisiones a travs de B. tabaci (MM8/2007 y MM8/2009). Los nucletidos idnticos se
indican por puntos. Se incluye el aislado espaol AT80/99 (DQ983480) como ejemplo de aislado de
tomate. PI: plantas de pimiento inoculadas mediante B. tabaci con el aislado de pimiento MM8. En
rojo se indican las secuencias procedentes de tomate y en verde las de pimiento.
126
Captulo 3
3.4. DISCUSIN
El estudio de la epidemiologa y variacin gentica de las poblaciones de los
patgenos es esencial para comprender los factores que determinan su evolucin, ya
que pueden proporcionar informacin para el desarrollo de estrategias de control
eficientes y estables contra ellos, e incluso prevenir el desarrollo de nuevas
enfermedades (Schneider y Roossinck, 2001; Garca-Arenal et al., 2003; Jridi et al.,
2006). La alta tasa de mutacin caracterstica de los virus de RNA debida a la
ausencia de actividad correctora de sus RNAs replicasas, junto con el corto tiempo
de replicacin, favorece su rpida adaptacin a situaciones cambiantes. En general,
se ha observado una alta variabilidad gentica en todos los virus de RNA y su
potencial para la rpida evolucin se reconoce cada vez ms como la base para su
ubiquidad y adaptabilidad (Domingo et al., 1996; Domingo y Holland, 1997).
Este trabajo constituye uno de los escasos estudios sobre la variabilidad
gentica de poblaciones naturales de miembros del gnero Crinivirus, que se
restringen fundamentalmente a trabajos sobre cucurbit yellow stunting disorder virus
(CYSDV) (Rubio et al., 1999, 2001a; Marco y Aranda, 2005). En el caso de ToCV,
recientemente se ha llevado a cabo un estudio sobre variabilidad gentica dentro de
aislados obtenidos de poblaciones naturales, habindose determinado su estructura
en cuasiespecie (Lozano et al., 2009).
En este trabajo se ha analizado la variabilidad gentica a partir de las
secuencias consenso (producto de PCR) de 121 aislados de ToCV de tomate y
pimiento, procedentes de cultivos comerciales de las principales zonas productoras
de Espaa, Portugal y Marruecos y 11 aislados procedentes de los huspedes
alternativos D. stramonium, S. nigrum y patata. Las tres regiones genmicas
analizadas (el extremo 5-UTR, parte del ORF1a y RdRp), implicadas en la
replicacin del genoma viral, abarcan aproximadamente el 16% del RNA1.
127
Captulo 3
En la poblacin de ToCV analizada se han identificado dos tipos de RNA1, a

los que se ha denominado tipo I y tipo II, determinados por las diferencias tanto a
nivel nucleotdico como aminoacdico que presentaban. Las diferencias encontradas
entre estos dos tipos de RNA1 son 36 posiciones nucleotdicas polimrficas de los
1393 nucletidos analizados, que generan 6 cambios aminoacdicos. En todas las
regiones geogrficas analizadas en este trabajo y en todos los aos de muestreo se
han encontrado aislados con los dos tipos de RNA1, con la excepcin de Agadir,
donde slo se detect el tipo II en el limitado nmero de aislados analizados (3
muestras). Esta diferenciacin del RNA1 de ToCV en dos tipos ya se ha descrito al
analizar la variabilidad existente en el gen de la protena RdRp de un nmero de
aislados espaoles de este virus (Lozano et al., 2009). Adems, el trabajo
mencionado puso de manifiesto que la frecuencia de mutacin y valores de
diversidad para la regin RdRp (localizada en el RNA1) es ms alta que la
encontrada en las regiones Hsp70h, CP y CPm (localizadas en el RNA2). Una
posible explicacin es la especializacin del RNA1 en el mecanismo de replicacin
viral ya que codifica las protenas esenciales en este proceso, como son la RdRp y la
protena codificada por el ORF1a integrada por los dominios proteasa,
metiltransferasa y helicasa. De este modo, el RNA1 puede acumular un elevado
nmero de mutaciones ya que sufre mayor nmero de replicaciones que el RNA2
puesto que es capaz de replicarse autnomamente en ausencia de ste, que necesita
la presencia previa en la misma clula del RNA1 para replicarse.
En la mayora de los estudios de diversidad llevados a cabo con otros
miembros de la familia Closteroviridae se ha observado la existencia de distintos
tipos o variantes de la(s) molcula(s) que constituye(n) su genoma. En CYSDV se
ha propuesto la existencia de dos grupos de aislados, a los que se ha denominado
Oriental (East) y Occidental (West); en el primero de ellos se incluyen aislados
de Espaa, Estados Unidos, Lbano, Jordania y Turqua, mientras que en el segundo
todos los aislados incluidos proceden de Arabia Saud (Rubio et al., 2001a). Los
128
Captulo 3
resultados obtenidos con el RNA1 de ToCV no apoyan la existencia de una

estructuracin geogrfica en las poblaciones analizadas. En el closterovirus CTV se
han descrito tres tipos virales en funcin de la identidad nucleotdica de la secuencia
del extremo 5-UTR de su genoma, representados por el aislado de origen
estadounidense T36, el aislado israel VT y el aislado espaol T385 (Lpez et al.,
1998; Aylln et al., 2001). En el ampelovirus grapevine leafroll associated virus 1
(GLRaV-1) tras el anlisis de la secuencia del ORF Hsp70h dentro de aislados
procedentes de la Repblica Checa y Eslovaquia se han identificado dos tipos virales
diferentes e infecciones mixtas de ambos con alta frecuencia (Kominek et al., 2005).
Aunque los iniciadores utilizados para la amplificacin de las distintas zonas
genmicas analizadas se disearon en regiones conservadas en todos los aislados de
ToCV cuya secuencia completa se conoce [AT80/99 de Espaa (Lozano et al.,
2007), un aislado de Florida (Wintermantel et al., 2005) y otro de Grecia (Kataya et
al 2008)], que adems representan los tipos I y II del RNA1, no puede descartarse
que la variabilidad real de las poblaciones de ToCV analizadas pueda ser mayor que
la descrita en este trabajo, debido a la especificidad de dichos iniciadores.
Por otra parte, la amplificacin mediante la transcriptasa reversa y la DNA
polimerasa podra contribuir a una sobreestimacin de la diversidad debido a los
errores introducidos al copiar la molcula molde. La tasa media de error de la
transcriptasa reversa AMV es de aproximadamente 10-4, mientras que la de la DNA
polimerasa Expand High Fidelity es de 4,8x10-6, pudindose considerar la
contribucin de esta ltima despreciable (Barnes, 1994). Las posibles sustituciones
nucleotdicas artefactuales se minimizaron dado que se analizaron secuencias
consenso para cada aislado, de manera que un error introducido durante la copia de
cualquier molcula representar una minora respecto al conjunto de productos de
amplificacin (Smith et al., 1997).
129
Captulo 3
En el presente trabajo, se ha detectado la presencia de un posible

recombinante entre las dos variantes del RNA1 de ToCV. Aunque se ha descrito
otro caso de recombinacin dentro de un aislado de ToCV de tomate (Lozano et al.,
2009), parece ser que este fenmeno es bastante poco frecuente en este crinivirus.
En el closterovirus CTV, sin embargo, se ha encontrado una gran proporcin de
molculas recombinantes (17,6 %) en plantas infectadas con tres genotipos
predominantes (Weng et al., 2007). Se han descrito procesos de recombinacin no
homloga como la causa de la generacin de RNAs defectivos, as como procesos
de recombinacin homloga en aislados naturales de CTV (Aylln et al., 1999a;
Vives et al., 2005; Weng et al., 2007). La baja frecuencia de molculas
recombinantes en el caso de ToCV podra ser indicativa de una fuerte seleccin
negativa contra ellas (Lozano et al., 2009). En el caso de la molcula recombinante
de ToCV encontrada en el trabajo mencionado, la mayora de las mutaciones
localizadas en la secuencia de tipo II resultaron en cambios sinnimos, lo que
sugiere que esta particular variante podra haber escapado del proceso de seleccin
(Lozano et al., 2009). Sin embargo, la recombinacin en virus de RNA se ha
propuesto como un proceso ventajoso ya que puede ayudar a mantener la diversidad
genmica y compensar la acumulacin de mutaciones deletreas (Nagy, 2008). En
CTV, que es uno de los virus de RNA de plantas con genomas de mayor tamao, se
ha sugerido que la recombinacin podra actuar como un mecanismo de
compensancin de la acumulacin de posibles mutaciones deletreas producidas en
episodios de cuello de botella como los sufridos tras la transmisin por pulgn
(Rubio et al., 2001b). Los procesos de recombinacin pueden dar lugar, adems, a la
emergencia de nuevos aislados virales e incluso nuevas especies (Padidam et al.,
1999), con novedosas propiedades, como puede ser la capacidad de superacin de
resistencias genticas, la ampliacin de la gama de huspedes (Monci et al., 2002;
Garca-Arenal y McDonald, 2003; Ndunguru et al., 2005; Garca-Andrs et al.,
2006) o cambios en la virulencia (Gibbs et al., 2001). Por lo tanto, el estudio de los
fenmenos de recombinacin y del mecanismo por el que se generan es fundamental
130
Captulo 3
a la hora de establecer medidas de control eficaces y duraderas de las enfermedades

virales.
Fenmenos de adaptacin al husped podran estar involucrados en las
diferencias observadas en el RNA1 de aislados de ToCV obtenidos de tomate y
pimiento. En primer lugar, todos los aislados de pimiento posean RNA1 tipo I,
mientras en tomate se encontraron aislados con RNA1 de ambos tipos, I y II. Por
otra parte, el conjunto de los aislados de pimiento analizados, adems de presentar
todos los cambios nucleotdicos caractersticos del RNA1 tipo I, mostraban tres
variaciones nucleotdicas prcticamente exclusivas de esta especie, dos en el ORF1a
(T342C y T370C) y uno en el gen que codifica la protena RdRp (C7046T). Una
observacin adicional que sugiere la existencia de fenmenos de adaptacin al
husped como determinantes de la variabilidad observada en el RNA1 de ToCV,
proviene del anlisis de los cambios nucleotdicos en el ORF1a de un aislado de
pimiento (MM8) despus de pases sucesivos por tomate. Este aislado, obtenido y
caracterizado inicialmente en una planta de pimiento infectada de forma natural,
mostraba los tres cambios nucleotdicos caractersticos de este husped. Tras su
mantenimiento durante un periodo de tiempo (4 aos) en tomate, tuvo lugar la
sustitucin de uno de estos nucletidos (citosina) por el nucletido presente en los
aislados de tomate (timina). Posteriormente, tras el pase del aislado presente en
tomate de nuevo a pimiento, se observ la reversin (en 5 meses) al nucletido
caracterstico de los aislados de pimiento (citosina). Por tanto, es verosmil que este
cambio nucleotdico (T342C), que es el nico de los tres exclusivos de pimiento que
da lugar a un cambio aminoacdico, est implicado en fenmenos de adaptacin al
husped. La regin ORF1a est implicada en la replicacin del genoma de ToCV,
por lo que la sustitucin nucleotdica observada podra ser consecuencia de la
replicacin preferencial de cada una de las variantes gnicas en cada uno de los
huspedes, tomate o pimiento. En este estudio se ha analizado la secuencia consenso
a partir del producto de PCR amplificado, por lo que no puede discernirse entre las
131
Captulo 3
dos posibilidades plausibles: haberse producido una mutacin que posteriormente

revirti, o una seleccin de variantes presentes en la cuasiespecie de ToCV (Lozano
et al., 2009) debido al cambio de husped.
Existen datos que indican variaciones de las poblaciones de CTV despus de
cambios en el husped o transmisin mediante pulgones (Albiach-Mart et al.,
2000a; Aylln et al., 1999b, 2006; Sentandreu et al., 2006; Nolasco et al., 2008).
Esta alteracin en la composicin de las poblaciones de CTV podra contribuir al
incremento de su diversidad gentica y biolgica y constituir as un factor
importante en su evolucin (Aylln et al., 1999b, 2006). Adems, estos cambios en
el genoma a veces van acompaados de diferencias en la patologa del virus
(Albiach-Mart et al., 2000a; Brlansky et al., 2003). Este fenmeno puede apoyar las
observaciones previas en las que las caractersticas de patogenicidad parecen
asociarse con la acumulacin de secuencias especficas en varias regiones del
genoma (Aylln et al., 1999b, 2001; Sambade et al., 2002, 2003).
Nuestros resultados sugieren una posible adaptacin de ToCV al husped ya
que los aislados virales con los tres cambios nucleotdicos caractersticos de
pimiento parecen presentar un mayor fitness en este husped, sin embargo no se
excluye la posibilidad que un aislado de este tipo se multiplique en tomate y
viceversa.
Existen ejemplos de virus de plantas en los que se ha mostrado que cambios
nucleotdicos en el genoma confieren una posible ventaja para su adaptacin a
distintos huspedes, como se ha descrito para el RNA satlite de cucumber mosaic
virus (Moriones et al., 1991). Un caso bien documentado de variacin gnica de un
virus de plantas asociada a fenmenos de adaptacin al husped es el caso de
pelargonium flower break virus, en el que aparecen 30 cambios nucleotdicos en una
regin de 1428 nucletidos atribuidos a la adaptacin especfica del virus a
Chenopodium quinoa. Los resultados de este estudio indican que las presiones
132
Captulo 3
selectivas ejercidas sobre el husped juegan un papel crtico en el desarrollo de las

poblaciones de este virus (Rico et al., 2006). Asimismo, se ha observado que un
nico cambio en un codn de un gen codificante de una protena de movimiento en
bromovirus confiere la posibilidad de infeccin sistmica en un nuevo husped,
sugiriendo que esta zona del gen est relacionada con interacciones cruciales con el
husped (Fujita et al., 1996). En el caso de hibiscus chlorotic ringspot virus, se han
descrito 8 variaciones aminoacdicas en la protena de la cpsida (CP) despus de
pases sucesivos en C. quinoa que pueden deberse a fenmenos de seleccin positiva
asociada al husped (Liang et al., 2002). Al menos tres de esos cambios causaron
avirulencia en Hibiscus cannabinus (Liang et al., 2002), un fenmeno relacionado
con una reduccin de la actividad supresora del silenciamiento gnico de la protena
CP como consecuencia de mutaciones en el gen que la codifica (Meng et al., 2006).
Otros casos de cambios en el genoma de virus de plantas que determinan su
adaptacin a un nuevo husped incluyen a turnip mosaic virus (Tan et al., 2005),
plum pox virus (Wallis et al., 2007) y tobacco etch virus (Agudelo-Romero et al.,
2008).
La informacin generada sobre la variabilidad de las poblaciones de ToCV es
relevante para el establecimiento y desarrollo de programas de mejora que tengan
como objetivo la bsqueda de resistencia gentica eficaz y duradera frente a la
enfermedad causada por este virus. Por otra parte, la disponibilidad de un sistema de
gentica reversa basado en clones infectivos de ToCV permitir demostrar la posible
implicacin de fenmenos de adaptacin al husped en la generacin de variabilidad
del virus as como permitir la identificacin de los determinantes moleculares
implicados.
133
CAPTULO 4
DESARROLLO DE UN SISTEMA DE CLONES INFECTIVOS
DE TOMATO CHLOROSIS VIRUS
Captulo 4
4. DESARROLLO DE UN SISTEMA DE CLONES INFECTIVOS DE

TOMATO CHLOROSIS VIRUS
4.1. ANTECEDENTES
La posibilidad de examinar el fenotipo viral tras la realizacin de mutaciones
especficas mediante la utilizacin de un sistema de gentica reversa revolucion el
estudio de los virus de plantas con genoma de RNA. Los primeros resultados
exitosos mediante la inoculacin de transcritos obtenidos in vitro a partir de clones
de cDNA se llevaron a cabo con brome mosaic virus (BMV) en plantas de cebada
(Ahlquist et al., 1984) y posteriormente con TMV en plantas de juda y N. tabacum
(Dawson et al., 1986).
Los miembros de la familia Closteroviridae poseen los genomas de mayor
tamao y complejidad de los virus de RNA de cadena positiva de plantas. Esto
determina que la obtencin de clones infectivos de estos virus sea un proceso
dificultoso, y por tanto, a veces son necesarias complejas estrategias de ligacin para
obtener el cDNA completo (Satyanarayana et al., 1999). Adems pueden surgir
problemas de toxicidad del cDNA clonado en E. coli (Satyanarayana et al., 2003) y
dificultades en la inoculacin de protoplastos con transcritos de gran tamao
(Satyanarayana et al., 1999). Hasta el momento, se ha logrado la construccin de
clones de cDNA completos e infectivos de slo cuatro especies de esta familia, tres
del gnero Closterovirus, BYV (Peremyslov et al., 1998), CTV (Satyanarayana et
al., 1999) y GLRaV-2 (Liu et al., 2009) y uno del gnero Crinivirus, LIYV
(Klaassen et al., 1996). En el caso de CTV, BYV y LIYV, la infectividad se logr en
primer lugar mediante la inoculacin de transcritos generados in vitro utilizando
promotores de RNA polimerasas de bacterifagos (SP6, T3) en protoplastos de N.
benthamiana o N. tabacum.
En BYV, la inoculacin de transcritos obtenidos in vitro en protoplastos de N.
tabacum y anlisis mutacionales ha permitido la identificacin de los genes
137
Captulo 4
esenciales para la replicacin del RNA genmico (Peremyslov et al., 1998), la

expresin gnica (Hagiwara et al., 1999) y los relacionados con el movimiento y
encapsidacin viral (Medina et al., 1999; Peremyslov et al., 1999; Alzhanova et al.,
2000, 2001; Napuli et al., 2003).
En el caso de CTV la obtencin y manipulacin de diversos minireplicones
en los que se suprimieron o mutaron distintas regiones genmicas codificantes o
UTRs ha permitido avanzar en el conocimiento de la replicacin y regulacin gnica
(Satyanarayana et al., 1999, 2002a, b; Gowda et al., 2001, 2003a), ensamblaje del
virin (Satyanarayana et al., 2000, 2004; Gowda et al., 2003b) y movimiento viral
(Satyanarayana et al., 2008). Ha sido necesario la amplificacin mediante pases
sucesivos a nuevos lotes de protoplastos para obtener cantidades suficientes de
viriones para la inoculacin mecnica de ctricos (Satyanarayana et al., 2001).
En el caso de LIYV, especie tipo del gnero Crinivirus, los estudios con
clones infectivos han permitido determinar que el RNA1 es capaz de replicarse en
protoplastos de N. benthamiana en ausencia del RNA2 (Klaassen et al., 1996). Sin
embargo, slo se forman viriones de LIYV en protoplastos inoculados con ambos
RNAs (Medina et al., 1998). Por otra parte, se ha observado la acumulacin
asincrnica de los RNA1 y RNA2 virales (Yeh et al., 2000). Mediante anlisis
mutacionales en el RNA1 y/o RNA2 se confirm que las protenas esenciales en la
replicacin se encuentran en el RNA1 (Yeh et al., 2000; Wang et al., 2009b) y que
la replicacin de esta molcula tiene lugar preferencialmente en cis (Wang et al.,
2009b). Se ha desarrollado un sistema para la transmisin de los viriones de LIYV
generados a partir de inoculacin de transcritos obtenidos in vitro en protoplastos de
N. tabacum a plantas de lechuga mediante transmisin por B. tabaci (Ng y Falk,
2006a).
Tambin se han desarrollado sistemas basados en clones de cDNA que
permiten la generacin de transcritos in vivo mediante agroinoculacin de BYV
138
Captulo 4
(Prokhnevsky et al., 2002), CTV (Gowda et al., 2004; Ambrs et al., 2006, 2008),
GLRaV-2 (Liu et al., 2009) y LIYV (Wang et al., 2009a).
En este trabajo se ha iniciado el desarrollo de un sistema gentico de ToCV,
para lo cual se han generado clones completos de cDNA a partir del RNA1 y RNA2
del aislado espaol AT80/99. El anlisis de la infectividad se ha realizado mediante
la inoculacin de transcritos obtenidos in vitro en protoplastos de N. benthamiana.
4.2.1. Aislado viral
El aislado de ToCV utilizado en este estudio, AT80/99, proviene de una
planta de tomate infectada de forma natural recolectada en Mlaga en 1999 cuyo
genoma se ha secuenciado completamente (Lozano et al., 2006b, 2007). Este aislado
se mantiene en plantas de tomate cv. Moneymaker en la Estacin Experimental La
Mayora (CSIC) alternando la multiplicacin por esquejes con transmisiones
peridicas mediante B. tabaci biotipo Q en cmaras de cultivo (25 C da, 20 C
noche, 16 h de fotoperodo a 250 mol m-2 s-1 y 70% HR).
4.2.2. Extraccin de RNA de doble cadena
El RNA de doble cadena (dsRNA), generado como intermediario replicativo
del genoma de ToCV, se purific mediante cromatografa con celulosa CF-11,
siguiendo el protocolo descrito por Valverde et al. (1986). Para ello, se trituraron 10
g de hojas de plantas de tomate infectadas con el aislado AT80/99 en nitrgeno
lquido, tras lo que se le aadieron 12 ml de 2xSTE (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA,
0,1 M NaCl), 1,71 ml de SDS 10% y 15,5 ml de fenol saturado con STE, se mezcl
durante 20 min en un agitador orbital a 20 C y se centrifug durante 10 min a 9000
g a la misma temperatura. La fase acuosa se ajust a una concentracin final de 16%
de etanol. La mezcla obtenida se pas a travs de prefiltros de fibra de vidrio
(Millipore). El dsRNA se purific mediante cromatografa utilizando columnas con
139
Captulo 4
2,5 g de celulosa CF-11 (Whatman) estabilizada con STE 16% etanol. El dsRNA
fijado en la celulosa se eluy con 10 ml de STE y se precipit con 0,5 ml de acetato
sdico 3 M pH 5,5 y 3 volmenes de etanol absoluto incubndose durante 3 h a -20
C, tras lo que se centrifug a 0 C durante 30 min a 10000 g. El precipitado se
resuspendi en 400 l de STE y se someti a una segunda precipitacin aadiendo
40 l de acetato sdico 3 M pH 5,5 y 1 ml de etanol absoluto. Tras una incubacin
durante 3 h a -20 C y centrifugacin durante 30 min a 4 C y 15000 g, el precipitado
se resuspendi en 20 l de H2O-DMPC.
4.2.3. Sntesis y amplificacin de DNAs complementarios (cDNAs) a los RNAs
genmicos de ToCV
4.2.3.1. Sntesis y amplificacin de cDNAs del RNA1
La sntesis del cDNA correspondiente a la longitud total del RNA1 de ToCV
se realiz mediante la amplificacin por RT-PCR de tres fragmentos solapantes que
cubran su totalidad, flanqueados por enzimas de restriccin para facilitar el
ensamblado y utilizando iniciadores diseados a partir de la secuencia del RNA1 del
aislado espaol AT80/99 (GenBank DQ983480).
La reaccin de RT se llev a cabo en un volumen final de 20 l, mezclndose
el iniciador antisentido a una concentracin 0,75 M, 5 l de una dilucin 1/10 de la
preparacin de dsRNA y 4 l de H2O-DMPC. Esta mezcla se incub a 65 C durante
10 min, se enfri en hielo, se aadi el tampn de Expand RT 1x (Roche), 1 mM de
dNTPs, 10 mM de DTT, 20 U de inhibidor de RNasas RNase OUT (Invitrogen) y 50
U de transcriptasa reversa Expand RT (Roche) y se incub a 43 C durante 60 min.
Tras la reaccin de sntesis de la primera cadena, el cDNA obtenido se

amplific mediante PCR en un volumen final de 50 l, para lo que se utilizaron 5 l
de cDNA, tampn de DNA polimerasa Expand High Fidelity 1x (Roche), 0,3 M de
140
Captulo 4
cada uno de los iniciadores de la pareja correspondiente, 0,2 mM de dNTPs y 2,5 U

de DNA polimerasa Expand High Fidelity (Roche).
Los programas de PCR empleados para cada pareja de iniciadores
dependieron de su temperatura de hibridacin y el tamao del fragmento
amplificado. En la tabla 4.1 se muestra la informacin correspondiente a cada uno
de los iniciadores utilizados para la sntesis y amplificacin del cDNA del RNA1 de
ToCV. Para los iniciadores MA543/MA560 se utiliz el siguiente programa de
amplificacin: i) un ciclo de desnaturalizacin a 95 C durante 5 min, ii) 5 ciclos de
desnaturalizacin a 94 C durante 15 s, hibridacin a 48 C durante 30 s y una
extensin del cDNA a 68 C durante 8 min, iii) 5 ciclos de desnaturalizacin a 94 C
durante 15 s, hibridacin de los iniciadores a 70 C durante 30 s y una extensin del
cDNA a 68 C durante 8 min, iv) 20 ciclos de desnaturalizacin a 94 C durante 15
s, hibridacin de los iniciadores a 70 C durante 30 s y una extensin del cDNA a 68
C durante 8 min, incrementando este ltimo paso en 5 s cada ciclo y v) una
extensin final a 68 C durante 7 min. El programa empleado para los iniciadores
MA557/MA559 consisti en i) un ciclo de 95 C durante 5 min, ii) 10 ciclos de
durante 30 s y una extensin a 68 C durante 8 min, iii) 20 ciclos de
durante 30 s y una extensin del cDNA a 68 C durante 8 min, incrementando este
ltimo paso en 5 s cada ciclo y v) una extensin final a 68 C durante 7 min. Con los
iniciadores MA562/MA544 se utiliz i) un ciclo de desnaturalizacin a 95 C
durante 5 min, ii) 5 ciclos de desnaturalizacin a 94 C durante 15 s, hibridacin a
48 C durante 30 s y una extensin del cDNA a 68 C durante 8 min, iii) 5 ciclos de
durante 30 s y una extensin del cDNA a 68 C durante 8 min, iv) 20 ciclos de
141
Captulo 4
durante 30 s y una extensin del cDNA a 68 C durante 8 min, incrementando este

ltimo paso en 5 s cada ciclo y v) una extensin final a 68 C durante 7 min.
Tabla 4.1. Iniciadores empleados para la obtencin de cDNAs del RNA1 de ToCV ordenados por
parejas segn su localizacin respecto al extremo 5. En negrita se muestra la secuencia
correspondiente al promotor de la RNA polimerasa SP6, las secuencias diana de los enzimas de
restriccin utilizados en la estrategia de clonacin se muestran subrayados y en cursiva la secuencia
correspondiente al RNA1 del aislado AT80/99 de ToCV.
Regin
genmica
Posicin
(nt)
ACATGCATGCATTTAGGTGACACTATAG
AAATAGTATTCGTGTGATTAC
5UTR
1-22
MA560 (-)
GACAGAAGAGCTCGTGCCATCTGTTTCAGAG
TCATATCATAAACC
ORF1a
2146-2190
MA557 (+)
GGCACGAGCTCTTCTGTCACATAAGG
ORF1a
2173-2198
MA559 (-)
GCTGAATGCATTGTTGACTCCTTCCTTC
ORF1a
5365-5392
MA562 (+)
GTCAACAATGCATTCAGCTTAGTGATGAC
ORF1a
5375-5403
MA544 (-)
CGGGATCCGACCTATTTATTTATATACTAG
3UTR
8572-8594
Iniciador
MA543 (+)
Secuencia (5-3)
Tamao del
fragmento
amplificado
(pb)
2217
3220
3226
El iniciador MA543 (Tabla 4.1) incluye, adems de 22 nucletidos del

extremo 5 terminal de la secuencia del RNA1 del aislado de ToCV AT80/99, la
secuencia del promotor de la RNA polimerasa SP6 y la secuencia del sitio de corte
del enzima de restriccin SphI ms cuatro nucletidos en el extremo 5 para facilitar
la digestin por el enzima. El iniciador MA544 (Tabla 4.1) contiene 23 nucletidos
del extremo 3 terminal del RNA1 de ToCV y la secuencia del sitio de corte del
enzima de restriccin BamHI ms dos nucletidos extra para facilitar la digestin.
Los iniciadores MA560 y MA557 contienen la secuencia de reconocimiento del
142
Captulo 4
enzima de restriccin SacI y los iniciadores MA559 y MA562 la secuencia de

reconocimiento del enzima de restriccin NsiI. Las secuencias de SacI y NsiI
reconocen un solo sitio de restriccin en la secuencia del RNA1 de ToCV.
En la figura 4.1 se muestra la estrategia de sntesis de cDNAs empleada para
la obtencin del cDNA completo del RNA1 de ToCV.
RNA1
1000
2000
3000
4000
5000
6000
ORF1a
5
MA543
SphI
SP6
PRO
7000
ORF1b
MTR
HEL
SacI
NsiI
8594
8000
ORF2 ORF3
p6
RdRp
p22
MA560
SacI
MA557
SacI
MA559
NsiI
MA562
NsiI
MA544
BamHI
Figura 4.1. Representacin esquemtica de la estrategia utilizada para la sntesis de cDNAs del
RNA1 del aislado AT80/99 de ToCV para la obtencin del clon completo de dicho RNA. Las
flechas representan los iniciadores empleados as como su orientacin. Las lneas horizontales
corresponden a los fragmentos amplificados.
4.2.3.2. Sntesis y amplificacin de cDNAs del RNA2

La generacin del cDNA correspondiente a la longitud total del RNA2 de
ToCV se realiz mediante RT-PCR en dos fragmentos solapantes que cubran su
totalidad, flanqueados por enzimas de restriccin para facilitar el ensamblado y con
143
Captulo 4
la utilizacin de iniciadores diseados a partir de la secuencia del RNA2 del aislado

espaol AT80/99 (GenBank DQ136146).
La reaccin RT se llev a cabo en un volumen final de 20 l, mezclndose el
iniciador antisentido a una concentracin 0,5 M, 2 l de dsRNA, 0,5 mM de
dNTPs y 9 l de H2O-DMPC. Esta mezcla se incub a 85 C durante 5 min, se
enfri en hielo y se aadi el tampn de SuperscriptIII RT 1x (Invitrogen), 5 mM de
DTT, 40 U de inhibidor de RNasas RNase OUT (Invitrogen) y 200 U de
transcriptasa reversa SuperscriptIII (Invitrogen) y se incub a 55 C durante 60 min
y posteriormente a 70 C durante 15 min para desactivar el enzima. Finalmente, se
aadieron 2 U de RNasa H (Invitrogen) y se incub a 37 C durante 20 min.
Tras la reaccin de sntesis de la primera cadena, el cDNA obtenido se
amplific mediante PCR en un volumen final de 50 l, para lo que se utilizaron 5 l
de cDNA, tampn de DNA polimerasa Expand High Fidelity 1x (Roche), 0,3 M de
cada uno de los iniciadores de la pareja correspondiente, 0,2 mM de dNTPs y 2,5 U
de DNA polimerasa Expand High Fidelity (Roche).
Los programas de PCR empleados para cada pareja de iniciadores
dependieron de su temperatura de hibridacin y el tamao del fragmento
amplificado. En la tabla 4.2 se muestra la informacin correspondiente a cada uno
de los iniciadores utilizados para la sntesis y amplificacin del cDNA del RNA2 de
ToCV. Para la amplificacin con los iniciadores MA581/MA649 se utiliz el
siguiente programa: i) un ciclo de desnaturalizacin a 94 C durante 5 min, ii) 5
ciclos de desnaturalizacin a 94 C durante 15 s, hibridacin a 59 C durante 30 s y
una extensin del cDNA a 68 C durante 8 min, iii) 5 ciclos de desnaturalizacin a
94 C durante 15 s, hibridacin de los iniciadores a 76 C durante 30 s y una
extensin del cDNA a 68 C durante 8 min, iv) 20 ciclos de desnaturalizacin a 94
C durante 15 s, hibridacin de los iniciadores a 76 C durante 30 s y una extensin
del cDNA a 68 C durante 8 min, incrementando este ltimo paso en 5 s cada ciclo y
144
Captulo 4
v) una extensin final a 68 C durante 10 min. El programa empleado para los

iniciadores MA650/MA597 consisti en i) un ciclo de 94 C durante 5 min, ii) 5
ciclos de desnaturalizacin a 94 C durante 15 s, hibridacin a 62 C durante 30 s y
una extensin del cDNA a 68 C durante 8 min, iii) 5 ciclos de desnaturalizacin a
94 C durante 15 s, hibridacin de los iniciadores a 73 C durante 30 s y una
extensin del cDNA a 68 C durante 8 min, iv) 20 ciclos de desnaturalizacin a 94
C durante 15 s, hibridacin de los iniciadores a 73 C durante 30 s y una extensin
del cDNA a 68 C durante 8 min, incrementando este ltimo paso en 5 s cada ciclo y
v) una extensin final a 68 C durante 10 min.
Tabla 4.2. Iniciadores empleados para la obtencin de cDNAs del RNA2 de ToCV ordenados por
parejas segn su localizacin respecto al extremo 5. En negrita se muestra la secuencia
correspondiente al promotor de la RNA polimerasa SP6, las secuencias diana de los enzimas de
restriccin utilizados en la estrategia de clonacin se muestran subrayados y en cursiva la secuencia
correspondiente al RNA2 del aislado AT80/99 de ToCV.
Iniciador
MA581 (+)
Secuencia 5-3
Regin
genmica
ACATGCATGCATTTAGGTGACACTATAG
AAATACAAGTCCAGGTGTTTCC
5UTR
Posicin
(nt)
Tamao del
fragmento
amplificado
(pb)
1-23
4376
MA649 (-)
GCATCGTTCTCCATTATTTCCTTAAACCAAAG
CTTCTAAAAGATTCAAAAC
p9 y CP
4299-4349
MA650 (+)
GGAGTTTAATCCTCAAAGAGCTAAACTGGAC
ATTGAATTGTCTGAAGTG
p9
4234-4282
TCCCCCCGGGACCTATTTATTTATATACTAAA
TCTACC
3UTR
MA597 (-)
4020
8216-8244
El iniciador MA581 (Tabla 4.2) incluye, adems de 23 nucletidos del

extremo 5 terminal de la secuencia del RNA2 del aislado de ToCV AT80/99, la
secuencia del promotor de la RNA polimerasa SP6 y la secuencia del sitio de corte
145
Captulo 4
del enzima de restriccin SphI ms cuatro nucletidos en el extremo 5 para facilitar

la digestin por el enzima. El iniciador MA597 (Tabla 4.2) contiene 29 nucletidos
del extremo 3 del RNA2 de ToCV y la secuencia del sitio de corte del enzima de
restriccin XmaI ms cuatro nucletidos extra para facilitar la digestin. El iniciador
MA649 contiene la secuencia de reconocimiento del enzima de restriccin HindIII,
la cual reconoce un solo sitio de restriccin en la secuencia del RNA2 de ToCV.
En la figura 4.2 se muestra la estrategia de sntesis de cDNAs empleada para
la obtencin del cDNA completo del RNA2 de ToCV.
RNA2
0
2000
1000
ORF4
p4
3000
ORF5
ORF6
Hsp70
p8
5000
4000
ORF7
ORF8 ORF9
p9
p59
6000
ORF10
7000
8000 8244
ORF11 ORF12
CP
CPm
p27
p7
HindIII
MA581
SphI
SP6
MA649
HindIII
MA650
MA597
XmaI
Figura 4.2. Representacin esquemtica de la estrategia utilizada para la sntesis de cDNAs del
RNA2 del aislado AT80/99 de ToCV para la obtencin del clon completo de dicho RNA. Las
flechas representan los iniciadores empleados as como su orientacin. Las lneas horizontales
corresponden a los fragmentos amplificados.
146
Captulo 4
4.2.4. Obtencin de clones de los RNA1 y RNA2 completos de ToCV

4.2.4.1. Construccin de un clon completo del RNA1 de ToCV
Los fragmentos de cDNA amplificados correspondientes al RNA1 de ToCV
(apartado 4.2.3.1) se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa 1 % en
tampn TAE, se visualizaron por tincin con bromuro de etidio y se purificaron
utilizando el sistema High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Posteriormente, se digirieron con los enzimas de
restriccin flanqueantes. El DNA amplificado con los iniciadores MA543/MA560
(fragmento 1) se digiri con los enzimas de restriccin SphI y SacI. Ambas
digestiones se realizaron consecutivamente con extraccin con fenol/cloroformo y
precipitacin etanlica entre ellas. En ambas reacciones se digirieron 80 l de DNA
con 40 U de enzima en un volumen final de 100 l a 37 C durante 16 horas. El
fragmento de DNA amplificado con los iniciadores MA557/MA559 (fragmento 2)
se digiri con los enzimas SacI y NsiI siguiendo un procedimiento similar al descrito
anteriormente. El DNA amplificado con los iniciadores MA562/MA544 (fragmento
3) se digiri en una sola reaccin con los enzimas NsiI y BamHI con 20 U de cada
una de ellas en un volumen final de 100 l a 37 C durante 16 horas.
Tras una extraccin con fenol/cloroformo y precipitacin etanlica los tres
fragmentos se ligaron al vector pUC18 previamente digerido con los enzimas SphI y
BamHI y desfosforilado con fosfatasa alcalina de gamba (Roche) durante 1 hora a
37 C. La ligacin se llev a cabo utilizando 50 ng de plsmido, 90 ng del fragmento
1 y 160 ng de cada uno de los fragmentos 2 y 3 con 1 U de DNA ligasa T4 (Roche)
en un volumen final de 30 l durante 16 horas a 14 C. El producto de ligacin se
precipit con N-butanol y se resuspendi en 4 l de H2O. A continuacin se realiz
la transformacin por electroporacin de clulas competentes de Escherichia coli
SURE que se cultivaron en placas de medio LB con ampicilina, tetraciclina y
kanamicina. Se analizaron 24 clones mediante la digestin con SphI y BamHI para
147
Captulo 4
comprobar la presencia del inserto de cDNA correspondiente a la totalidad del

RNA1 de ToCV.
En los clones que presentaron el patrn de restriccin previsto se
secuenciaron ambos extremos del inserto y las zonas de unin de los tres fragmentos
de cDNA ligados con un secuenciador ABI 3730xl DNA Analyzer (Secugen,
Espaa).
4.2.4.2. Construccin de un clon completo del RNA2 de ToCV
Los fragmentos de cDNA amplificados del RNA2 de ToCV, con los
iniciadores MA581/MA649 y MA650/MA597, respectivamente, se separaron
mediante electroforesis en gel de agarosa 0,8 % en tampn TAE y se visualizaron
por tincin con bromuro de etidio. Se purificaron con el sistema DNA Gel Extraction
Kit (Millipore) y se ligaron en el plsmido pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las
recomendaciones del fabricante. Los productos de ligacin se precipitaron con Nbutanol y se resuspendieron en 4 l de H2O. A continuacin se realiz la
transformacin por electroporacin de clulas competentes de E. coli DH5 que se
cultivaron en placas de medio LB con ampicilina. Se analizaron varios clones de
cada uno de los fragmentos mediante la digestin con NotI y NcoI, respectivamente,
para comprobar la presencia del inserto de cDNA correspondiente a la longitud de
cada uno de los fragmentos.
Un clon correspondiente a cada uno de los fragmentos amplificados del
RNA2 de ToCV si digiri con los enzimas de restriccin que los flanquean,
SphI/HindIII y HindIII/XmaI, respectivamente. En ambos casos se realiz la
digestin en dos pasos con una extraccin con fenol/cloroformo y precipitacin
etanlica entre ellos. Los fragmentos de cDNA digeridos se separaron mediante
electroforesis en gel de agarosa 0,8 % en tampn TAE, se visualizaron por tincin
en bromuro de etidio y se purificaron con el sistema DNA Gel Extraction Kit
(Millipore). A continuacin se realiz la ligacin en el vector pUC18 previamente
148
Captulo 4
digerido con SphI y XmaI y desfosforilado con fosfatasa alcalina de gamba (Roche)
durante 1 hora a 37 C. La ligacin se llev a cabo utilizando 50 ng de plsmido y
200 ng de cada uno de los fragmentos con 1 U de T4 DNA ligasa (Roche) en un
volumen final de 30 l durante 16 horas a 16 C. El producto de ligacin se
transform por choque trmico en clulas competentes de E. coli XL10-Gold
Ultracompetent Cells (Stratagene) que se cultivaron en placas de medio LB con
ampicilina, tetraciclina y cloranfenicol, siguiendo las recomendaciones del
fabricante. Se analizaron 144 clones y mediante la digestin con HindIII se
comprob la presencia del inserto correspondiente al RNA2 completo de ToCV.
En los clones que presentaron un patrn adecuado se secuenciaron los
extremos del inserto y la zona de unin de los dos fragmentos de cDNA del RNA2
de ToCV con un secuenciador ABI 3730xl DNA Analyzer (Secugen, Espaa).
Debido a la presencia de una mutacin en la secuencia del promotor de la RNA
polimerasa SP6 en el clon portador del cDNA del RNA2 completo de ToCV en
pUC18 (pToCV229), se llev a cabo en dicho clon el intercambio del fragmento de
cDNA del RNA2 amplificado con los iniciadores MA581 y MA649 por otro
fragmento del mismo producto de PCR clonado en pGEM-T Easy (clon pToCV189).
Para ello, se realiz la digestin de pToCV229 y pToCV189 con los enzimas de
restriccin SphI y HindIII que liberaran los insertos de inters. Estos fragmentos se
separaron mediante electroforesis en gel de agarosa 0,8 % en tampn TAE, se
visualizaron por tincin en bromuro de etidio y se purificaron con el sistema DNA
Gel Extraction Kit (Millipore). A continuacin, se ligaron con T4 DNA ligasa T4
(Roche) y se transformaron en clulas competentes E. coli XL10-Gold
Ultracompetent Cells (STRATAGENE). Los clones de inters correspondientes al
genoma completo del RNA2 de ToCV se comprobaron mediante la digestin con
HindIII.
149
Captulo 4
Posteriormente, en los clones que presentaron un patrn adecuado se

secuenciaron los extremos del inserto y la zona de unin de los dos fragmentos de
cDNA del RNA2 de ToCV.
4.2.5. Transcripcin in vitro del RNA1 y RNA2 de ToCV
El clon correspondiente al RNA1 de ToCV se linealiz mediante la digestin
con BamHI y se utiliz como molde en la reaccin de transcripcin in vitro con la
RNA polimerasa SP6 en presencia de anlogo de cap [m7G(5)ppp(5)G]. La
reaccin de transcripcin se llev a cabo en un volumen final de 100 l con 500 ng
de DNA, tampn de transcripcin 1x de la RNA polimerasa SP6 (Roche), rNTPs
(0,5 mM ATP, CTP y UTP y 0,05 mM GTP), 10 mM DTT, 0,5 mM anlogo de cap
(Promega), 60 U de inhibidor de RNasas RNase OUT (Invitrogen) y 120 U de RNA
polimerasa SP6 (Roche). La mezcla se mantuvo 2 horas a 37 C, iniciando la
reaccin con 60 U de RNA polimerasa SP6 y aadiendo 60 U adicionales despus
de 60 min. La presencia de transcritos se comprob mediante electroforesis en gel de
agarosa al 1%.
La transcripcin in vitro de dos clones correspondientes al RNA2 completo
de ToCV linealizados con XmaI se realiz siguiendo el proceso descrito
anteriormente. Posteriormente, los transcritos obtenidos de ambos RNAs se
utilizaron para inocular protoplastos de N. benthamiana.
4.2.6. Aislamiento, cultivo e inoculacin de protoplastos de mesfilo de hoja de
Nicotiana benthamiana
El aislamiento e inoculacin de protoplastos de N. benthamiana se realiz
fundamentalmente siguiendo el protocolo descrito por Navas-Castillo et al. (1997).
Se parti de plantas mantenidas en cmara de cultivo con un fotoperiodo de 16 horas
de luz a 25 C y 8 horas de oscuridad a 18 C. Hojas jvenes totalmente expandidas
se esterilizaron con una solucin de hipoclorito sdico al 10% ms 1 ml de Tween-
150
Captulo 4
20 por litro durante 5 minutos. Las hojas se lavaron tres veces con agua destilada
estril. Una vez desinfectadas, se realizaron cortes transversales sobre el envs de la
hoja, desde el nervio central hacia el borde, dejando ambos intactos y con una
distancia entre cortes de 1-2 mm. Las hojas cortadas se mantuvieron (haz hacia
arriba) en placas de Petri de 15 cm de dimetro conteniendo 25 ml de tampn MMC
(13% manitol, 5 mM MES, 10 mM CaCl2, pH 5,8) durante 30 min a temperatura
ambiente. Transcurrido este tiempo se cambi el tampn MMC por 25 ml de
solucin enzimtica por placa [0,5 g Cellulase Onozuka R-10 (Duchefa Biochemie),
0,25 g Macerase pectinase (Calbiochem) y 100 ml de tampn MMC, pH 5,8]. La
solucin enzimtica se clarific previamente mediante centrifugacin durante 10
min a 9000 g y el sobrenadante se esteriliz mediante filtracin a travs de filtros de
45 m de tamao de poro (Filtropur). Las placas se sellaron con parafilm y se
incubaron en oscuridad durante aproximadamente 18 horas a una temperatura entre
25 y 28 C.
A continuacin, para ayudar a liberar los protoplastos, las placas se agitaron
suavemente de forma manual. La suspensin de protoplastos se recogi de las placas
y se distribuy en tubos de 50 ml y se centrifug a 110 g durante 4 min a
temperatura ambiente, tras lo cual se elimin el sobrenadante y se resuspendi
suavemente el precipitado en 12 ml de tampn MMC. Se llev a cabo una nueva
centrifugacin durante 4 min a 110 g y el precipitado se resuspendi en 6 ml de
tampn MMC. A continuacin, los protoplastos se depositaron sobre un colchn de
7 ml de sacarosa al 20,5% en tubos de 15 ml. Tras una centrifugacin de 250 g
durante 15 min, se recogieron los protoplastos que se depositaron en la parte
superior del colchn de sacarosa. La cuantificacin de los protoplastos obtenidos se
llev a cabo mediante conteo en un hemocitmetro.
La inoculacin de transcritos obtenidos in vitro del RNA1 y RNA2 de ToCV
se realiz mediante polietilenglicol (PEG). Para ello, se mezclaron suavemente entre
5 y 10 g de RNA transcrito con 106 protoplastos y 500 l de solucin de PEG (30%
151
Captulo 4
PEG 8000, 3 mM CaCl2, 400 mM D-manitol). Tras mantener la mezcla 20 s a

temperatura ambiente se mezcl con 5 ml de medio MMC y se mantuvo 5 min a
temperatura ambiente. La suspensin de protoplastos se centrifug a 90 g durante 4
min y al precipitado se aadieron 4 ml de medio de cultivo Aoki y Takebe [13%
manitol, 5 mM MES, 1x sales de Aoki y Takebe (2 mM KH2PO4, 10 mM KNO3, 10
mM MgSO4, 10 M KI, 10 M CuSO4, 100 mM CaCl2), pH 5.8] esterilizado por
filtracin. Posteriormente se retir el sobrenadante, se aadieron 2 ml de medio de
cultivo Aoki y Takebe y finalmente se pas a placas de Petri de 35 mm de dimetro
tapizadas con 13% D-manitol y 1% agarosa. Las placas se incubaron en una cmara
de cultivo con luz constante (600-800 mol m-2 s-1) a 25 C. Tras la incubacin, los
protoplastos se recogieron mediante centrifugacin a 2000 g durante 1 min a 4 C.
El precipitado conteniendo los protoplastos se congel inmediatamente a -80 C para
su posterior extraccin de RNA.
Como control, en los experimentos se utilizaron protoplastos sin inocular
sometidos al mismo proceso descrito anteriormente.
4.2.7. Extraccin de RNA total de protoplastos de Nicotiana benthamiana
Para la purificacin de RNA, 106 protoplastos de N. benthamiana inoculados
con transcritos obtenidos in vitro se trataron con 600 l de 0,1 N NaCl, 2% SDS, 10
mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 9,0. Tras una centrifugacin durante 1 min a
11000 g, el sobrenadante se purific dos veces con 500 l de fenol/cloroformo. A
continuacin, tras recoger 425 l de la fase acuosa, el RNA se precipit con 50 l de
acetato sdico 3 M pH 5 y 1 ml de etanol absoluto incubndose durante 30 min a -80
C. Finalmente, tras la centrifugacin durante 15 min a 4 C y 11000 g, el
precipitado se resuspendi en 20 l de H2O-DMPC.
152
Captulo 4
4.2.8. Sntesis de sondas marcadas con digoxigenina

Las sondas utilizada para la deteccin del RNA1 de ToCV se obtuvieron por
transcripcin in vitro de un cDNA de 582 pb clonado en pGEM-T Easy
correspondiente al gen que codifica la protena p22 (nt 7662-8243 del aislado
AT80/99), situada en el extremo 3 del RNA1 de ToCV. Se gener una sonda de
polaridad negativa utilizando RNA polimerasa SP6 y el clon linealizado con NcoI y
una sonda de polaridad positiva con RNA polimerasa T7 y el clon linealizado con
SpeI.
La sonda utilizada para la deteccin del RNA2 de ToCV, de polaridad
negativa, se obtuvo por transcripcin in vitro con RNA polimerasa T7 de un cDNA
de 632 pb clonado en pGEM-T Easy complementario al extremo 3 del RNA2 de
ToCV (nt 7613-8244 del aislado AT80/99) y linealizado con SpeI.
Las reacciones de transcripcin in vitro se realizaron en un volumen final de
50 l, con 0,3 g del DNA linealizado, tampn de transcripcin 1x (Roche), la
mezcla de rNTPs Dig RNA labeling Mix 1x (10mM ATP, CTP, GTP; 6,5 mM UTP;
3,5 mM DIG-11-UTP) (Roche), 10 mM de DTT, 30 U de inhibidor de RNasas
RNase OUT (Invitrogen) y 40 U de la RNA polimerasa correspondiente. La mezcla
se incub a 37 C durante 1,5 horas.
4.2.9. Anlisis mediante northern blot
Para el anlisis por northern blot se desnaturaliz el RNA total obtenido a
partir de los protoplastos inoculados durante 10 min a 65 C en 2 volmenes del
tampn de carga (formamida 62%, formaldehdo 3,4%, MOPS 1x, 50 g/ml de
bromuro de etidio y azul de bromofenol) y se enfri en hielo. El RNA
desnaturalizado se separ mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% con
tampn MOPS 1x y formaldehdo 2%. La electroforesis se llev a cabo a 50 V
durante 4 horas. Los cidos nucleicos se transfirieron a una membrana de nailon
153
Captulo 4
cargada positivamente (Roche) mediante la aplicacin de vaco (VacuGene XL,

HealthCare) y se fijaron con un tratamiento de luz ultravioleta (Crosslinker RPN
2500, Amersham Life Science). La membrana se hibrid con la sonda
correspondiente descrita en el apartado anterior, siguiendo el protocolo de
hibridacin molecular descrito en el apartado 1.2.2.
La cuantificacin del RNA genmico se expres en funcin de la densidad
ptica de las bandas obtenidas usando el sistema de anlisis de imgenes VersaDoc
Imaging Systems (BIO-RAD). Para cuantificar la cantidad relativa de cadenas de
polaridad negativa comparada con el RNA genmico, de polaridad positiva, en cada
anlisis se incluy una preparacin de dsRNA extrado de plantas de tomate
infectadas con ToCV, que debe contener cantidades similares de RNA de cada
polaridad. El anlisis de los datos se llev a cabo usando el programa estadstico
SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, USA). La comparacin de cantidad de cadenas
positivas y negativas del RNA1 de ToCV se realiz con la prueba t-Student con un
nivel de significacin del 5 %.
4.3. RESULTADOS
4.3.1. Obtencin de clones de cDNA del RNA1 de ToCV
La clonacin del cDNA del RNA1 de ToCV se realiz mediante la ligacin
simultnea en pUC18 de tres productos de PCR solapantes purificados y digeridos
con los enzimas de restriccin de corte nico que los flanquean y que cubren su
totalidad (Fig. 4.3). Tras la clonacin del producto de la cudruple ligacin en
clulas electrocompetentes de E. coli SURE, se obtuvieron 7 clones, de un total de
24, que tras la digestin con SphI y BamHI liberaron del plsmido pUC18 un inserto
del tamao esperado (aprox. 8600 pb) compatible con la secuencia completa del
RNA1 de ToCV (8594 nt) colocada bajo el control del promotor de la RNA
polimerasa SP6 (Fig. 4.4). Tras comprobar mediante secuenciacin la integridad
nucleotdica de las zonas correspondientes a los extremos de los fragmentos ligados,
154
Captulo 4
se seleccion uno de estos clones (pToCV227) para realizar la inoculacin de

protoplastos de N. benthamiana con transcritos obtenidos in vitro.
155
Captulo 4
MA543/MA560
2500 pb
2000 pb
MA562/MA544
MA557/MA559
2217 pb
4000 pb
3000 pb
4000 pb
3000 pb
3220 pb
3226 pb
RNA1
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
ORF1a
5
PRO
ORF1b
MTR
HEL
SacI
NsiI
SacI
SphI SP6
7000
8000
ORF2 ORF3
p6
RdRp
8594
p22
NsiI
NsiI
SacI
BamHI
BamHI
SphI
pUC18
Promotor SP6
SphI
pUC18
+
RNA1
E. coli SURE
BamHI
Figura 4.3. A: Electroforesis de los tres productos de RT-PCR solapantes de cDNA que cubren el
RNA1 completo de ToCV, obtenidos a partir de dsRNA de una planta de tomate infectada con el
aislado espaol AT80/99. Se muestran los iniciadores empleados en la reaccin de RT-PCR, as
como el tamao de los fragmentos amplificados. B: Representacin esquemtica del proceso de
clonacin del genoma completo del RNA1 de ToCV. Se muestra la organizacin genmica del
RNA1 de ToCV y el esquema de la obtencin de clones de cDNA mediante el proceso de ligacin
en pUC18 de los tres productos de RT-PCR digeridos con los enzimas de restriccin de corte nico
que los flanquean.
156
Captulo 4
pUC18
+
RNA1
Promotor SP6
SphI
BamHI
Digestin
SphI/BamHI
Clon
1
12
13
pToCV227
14
15
18
22 24
RNA1 + Promotor de RNA

polimerasa SP6 (8611 pb)
pUC18 (2686 pb)
Figura 4.4. Comprobacin de la integridad del inserto de cDNA correspondiente al RNA1

completo de ToCV mediante la digestin con SphI y BamHI, cuyo producto son dos fragmentos de
DNA (indicados por flechas) correspondientes al cDNA complementario al RNA1 de ToCV ms la
secuencia del promotor de la RNA polimerasa SP6 y el plsmido pUC18. Se destacan mediante un
cuadro azul los clones que presentaron el patrn esperado. En rojo se indica el clon elegido
(pToCV227) para su transcripcin in vitro y posterior inoculacin de protoplastos de N.
benthamiana.
157
Captulo 4
4.3.2. Obtencin de clones de cDNA del RNA2 de ToCV

Los fragmentos de cDNA solapantes (2A y 2B) en los que se amplific el
RNA2 de ToCV se clonaron independientemente en el plsmido pGEM-T Easy (Fig.
4.5). Se comprob la integridad de cada uno de los insertos (4376 y 4020 pb) en una
serie de clones mediante la digestin con NotI y NcoI, respectivamente. De esta
forma se obtuvieron clones con el patrn de restriccin esperado, dos fragmentos de
4376 y 3015 pb en los clones que contenan el fragmento 2A y dos fragmentos de
5020 y 2033 pb para los clones con el fragmento 2B. Finalmente se eligieron dos
clones con el cDNA correspondiente a cada uno de los fragmentos en los que se
amplific el RNA2 de ToCV (pToCV190 y pToCV193) (Fig. 4.6).
158
Captulo 4
A
MA650/MA597
MA581/MA649
5000 pb
4000 pb
5000 pb
4000 pb
4376 pb
4020 pb
RNA2
0
ORF4
2000
1000
3000
ORF5
ORF6
Hsp70
p8
p4
5000
4000
ORF7
ORF8 ORF9
p9
p59
6000
ORF10
7000
8000 8244
ORF11 ORF12
CP
CPm
p27
p7
HindIII
MA581
SphI SP6
MA649
HindIII
2A
MA650
MA597
XmaI
2B
LIGACIN EN pGEM-T Easy
SphI
HindIII
HindIII
XmaI
Figura 4.5. A: Electroforesis de los dos productos de RT-PCR solapantes de cDNA que cubren el
RNA2 completo de ToCV obtenidos a partir de dsRNA de una planta de tomate infectada con el
aislado espaol AT80/99. Se indican los iniciadores empleados en la reaccin de RT-PCR y el
tamao del fragmento amplificado. B: Representacin esquemtica de la clonacin en pGEM-T
Easy de cada uno de los productos de PCR.
159
Captulo 4
pToCV190 pToCV193
1 2 3 4 5 6
NotI
4376 pb
3015 pb
5020 pb
NcoI
2033 pb
Figura 4.6. Comprobacin de la integridad del inserto de cDNA correspondiente a los productos de
PCR solapantes 2A y 2B complementarios al RNA2 de ToCV en varios clones mediante la
digestin con NotI y NcoI, respectivamente, cuyo producto son dos fragmentos de DNA (indicados
por flechas). Los clones pToCV190 y pToCV193 se eligieron para su posterior utilizacin en el
proceso de clonacin del cDNA completo del RNA2 de ToCV.
Para obtener clones de cDNA correspondientes al genoma del RNA2

completo de ToCV se realiz la ligacin del cDNA de los clones pToCV190 y
pToCV193 liberado tras la digestin con SphI/HindIII y HindIII/XmaI,
respectivamente, en pUC18 (Fig. 4.7.B). La digestin con estos enzimas liber dos
insertos correspondientes a los dos fragmentos de cDNA amplificados inicialmente a
partir del RNA2 de ToCV (2A y 2B) y digeridos con los enzimas que los flanquean,
de unos 4345 y 3930 pb, respectivamente, y el plsmido pGEM-T Easy (Fig. 4.7.A).
Tras la ligacin en pUC18 de los cDNAs liberados de pGEM-T Easy, se
comprob la integridad de los clones obtenidos mediante la digestin con HindIII,
tras lo cual, se identificaron dos clones (pToCV228 y pToCV229) que presentaron
el patrn esperado de dos bandas de 6611 y 4336 pb, que corresponde al cDNA
completo complementario al genoma del RNA2 de ToCV colocado bajo la accin
del promotor de la RNA polimerasa SP6 (Fig. 4.8).
160
Captulo 4
2A
5000 pb
4000 pb
3000 pb
2B
B
Promotor SP6
SphI
pToCV190
pToCV193
HindIII
Digestin HindIII/XmaI
Digestin SphI/HindIII
SphI SP6
XmaI
HindIII
HindIII
2A
2B
XmaI
HindIII
XmaI
SphI
pUC18
Promotor SP6
SphI
pUC18
+
RNA2
E. coli X-Gold
XmaI
Figura 4.7. A: Electroforesis de los clones de cada uno de los fragmentos solapantes de cDNA en
que se ha amplificado el RNA2 de ToCV (2A y 2B). 1: clon pToCV190 sin digerir; 2: clon
pToCV190 digerido con SphI y HindIII; 3: clon pToCV193 sin digerir; 4: clon pToCV193 digerido
con HindIII y XmaI; M: marcador de peso molecular. B: Representacin esquemtica del proceso
de clonacin del genoma completo del RNA2 de ToCV mediante la ligacin en pUC18 de dos
fragmentos de cDNA solapantes que cubren el RNA2 en su totalidad y procedentes cada uno de un
clon, digeridos con los enzimas de restriccin de corte nico que los flanquean.
161
Captulo 4
HindIII
pUC18
+
RNA2
Promotor SP6
SphI
XmaI
HindIII
Clon
3
M 1
Clon
2 3
4
6611 pb
4336 pb
pToCV229
pToCV228
Figura 4.8. Comprobacin en varios clones de la integridad del inserto de cDNA correspondiente al
RNA2 completo de ToCV mediante la digestin con HindIII, cuyo producto son dos fragmentos de
DNA (indicados por flechas). Se destacan en rojo los clones que presentaron el patrn de restriccin
esperado.
Tras la secuenciacin nucleotdica de las zonas correspondientes a los

extremos de los fragmentos ligados se comprob que los clones pToCV228 y
pToCV229 contenan una mutacin en la secuencia del promotor de la RNA
polimerasa SP6 (TG), debido a que el clon pToCV190 utilizado para crear estos
clones presentaba dicha mutacin (Fig. 4.9.A). Por ello, se llev a cabo el
intercambio del fragmento mutado (2A) del clon pToCV229 por otro fragmento
(2A) clonado en pGEM-T Easy (clon pToCV189) que no presentaba dicha mutacin
162
Captulo 4
(Fig. 4.9.B). La integridad de los clones obtenidos se determin mediante digestin

con HindIII y secuenciacin de las regiones correspondientes al promotor de la RNA
polimerasa SP6 y a los extremos de los fragmentos ligados. Des este modo, se
seleccionaron dos clones que presentaron el patrn de restriccin esperado y
ausencia de mutacin (pToCV230 y pToCV231) para su posterior transcripcin in
vitro e inoculacin en protoplastos de N. benthamiana.
163
Captulo 4
Promotor de la RNA
polimerasa SP6
RNA2 ToCV
B
Promotor SP6 *
SphI
pGEMT-Easy
+
2A
HindIII
HindIII
pToCV190
Promotor SP6 *
SphI
pGEMT-Easy
+
2B
XmaI
pToCV193
pUC18
+
RNA2
XmaI
pToCV229
Promotor SP6
SphI
pGEMT-Easy
+
2A
pToCV189
Promotor SP6
SphI
pUC18
+
RNA2
XmaI
HindIII
pToCV230
pToCV231
Figura 4.9. A: Alineamiento nucleotdico en el que se muestra la secuencia del promotor de la

RNA polimerasa SP6 con una mutacin en los clones pToCV228, pToCV229 (pUC18 + RNA2) y
pToCV190 (pGEM-T Easy + 2A) y el clon pToCV189 (pGEM-T Easy + 2A) que no contiene dicha
mutacin B: Esquema de la construccin de clones con la secuencia nucleotdica del promotor de la
RNA polimerasa SP6 ntegra (pToCV230 y pToCV231), mediante el intercambio del inserto del
clon pToCV229 que contiene la mutacin por el inserto del clon pToCV189. El asterisco indica la
posicin de la mutacin en la secuencia del promotor de la RNA polimerasa SP6.
164
Captulo 4
4.3.3. Anlisis de los transcritos obtenidos in vitro correspondientes al RNA1 y

RNA2 de ToCV
Los transcritos obtenidos in vitro, incorporando anlogo de cap, del RNA1 de
ToCV se obtuvieron a partir del clon pToCV227 linealizado con BamHI (Fig.
4.10.A). Al linealizar el clon se obtiene un fragmento de DNA de 11297 pb
correspondiente al RNA1 completo de ToCV con la secuencia del promotor de la
RNA polimerasa SP6 en el extremo 5 y la secuencia del plsmido pUC18.
Utilizando RNA polimerasa SP6 se obtuvo un transcrito de 8598 nt (Fig. 4.10.B). La
estrategia de clonacin se dise para que en el extremo 5 del transcrito del RNA1
no existiera ningn nucletido adicional no perteneciente a la secuencia viral ya que
el primer y tercer nucletido del extremo 5 de la secuencia del RNA1 de ToCV
corresponden con el inicio de la transcripcin por parte de la RNA polimerasa SP6 y
con el nucletido crtico en este proceso, respectivamente (Fig. 4.10.C). En el
extremo 3 del transcrito existen cuatro nucletidos adicionales procedentes de la
secuencia reconocida por BamHI, enzima utilizado en la estrategia de clonacin
(Fig. 4.10.C).
165
Captulo 4
B
M
M
DNA (11297 pb)
DNA (11297 pb)

RNA (8598 nt)
C
pToCV227
RNA1 ToCV
Promotor de la RNA
SphI
polimerasa SP6
BamHI
ACATGCATGCATTTAGGTGACACTATAGAAATA..TAGGTCGGATC
ToCV
Transcripcin
Figura 4.10. A: Linealizacin del clon pToCV227 correspondiente al RNA1 de ToCV (flecha) y
produccin de transcritos in vitro mediante la RNA polimerasa SP6 (punta de flecha) (B). C:
Secuencia del extremo 5 y 3 del genoma del RNA1 de ToCV unido a la secuencia del promotor de
la RNA polimerasa SP6 (rosa) del clon pToCV227. En cursiva se muestra la secuencia del extremo
5 y 3 del RNA1 del aislado espaol AT80/99 de ToCV. La flecha indica el comienzo de la
transcripcin obtenida in vitro. GATC son los cuatro nucletidos no virales (procedentes del sitio de
corte de BamHI) en el extremo 3 del transcrito. M: Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder
(GeneCraft).
166
Captulo 4
Los transcritos generados in vitro, incorporando anlogo de cap, del RNA2 de

ToCV se obtuvieron a partir de los clones pToCV230 y pToCV231 linealizados con
XmaI (Fig. 4.11.A). Al linealizar cada clon se obtiene un fragmento de DNA de
10947 pb correspondiente al RNA2 completo de ToCV ms la secuencia del
promotor de la RNA polimerasa SP6 unida al extremo 5 y la secuencia del
plsmido pUC18. Mediante la RNA polimerasa SP6 se obtiene un transcrito in vitro
de 8248 nt (Fig. 4.11.B). Al igual que ocurre con el RNA1 de ToCV, la estrategia de
clonacin se dise para que en el extremo 5 del transcrito obtenido in vitro del
RNA2 no exista ningn nucletido adicional no perteneciente a la secuencia viral ya
que el primer y tercer nucletido del extremo 5 de la secuencia del RNA2 de ToCV
corresponden con el inicio de la transcripcin por parte de la RNA polimerasa SP6 y
con el nucletido crtico en este proceso, respectivamente. Sin embargo, en el
extremo 3 del transcrito existen cuatro nucletidos adicionales procedentes de la
secuencia de XmaI utilizada en la estrategia de clonacin (Fig. 4.11.C).
167
Captulo 4
A
M
M
DNA (10947 pb)
DNA (11297 pb)

RNA (8248 nt)
C
Promotor de la RNA
pToCV230 y pToCV231
SphI
XmaI
polimerasa SP6
RNA2 ToCV
ACATGCATGCATTTAGGTGACACTATAGAAATA..ATAGGTCCCGG
ToCV
Transcripcin
Figura 4.11. A: Linealizacin de dos clones (pToCV230 y pToCV231) portadores del cDNA
completo correspondiente al RNA2 de ToCV (flecha) y produccin de transcritos in vitro mediante
la RNA polimerasa SP6 (punta de flecha) (B). C: Secuencia del extremo 5 y 3 del genoma del
RNA2 de ToCV unido a la secuencia del promotor de la RNA polimerasa SP6 (rosa) de los clones
pToCV230 y pToCV231. En cursiva se muestra la secuencia del extremo 5 y 3 del RNA2 del
aislado espaol AT80/99 de ToCV. La flecha indica el comienzo de la transcripcin. CCGG son los
cuatro nucletidos no virales (procedentes del sitio de corte de XmaI) en el extremo 3 del
transcrito. M: Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder (GeneCraft).
168
Captulo 4
En relacin al clon de cDNA del RNA2 de ToCV con la mutacin

mencionada (TG) en el promotor de la RNA polimerasa SP6 (pToCV229)
(apartado 4.3.2.) se observ un menor rendimiento en la transcripcin obtenida in
vitro en relacin a los clones pToCV230 y pToCV231, no portadores de dicha
mutacin (Fig. 4.12). Por tanto, para la inoculacin de ToCV en protoplastos de N.
benthamiana se utilizaron los transcritos obtenidos in vitro a partir de los dos clones
del RNA2 anteriormente mencionados y el clon pToCV227 del RNA1 de ToCV.
M
3
DNA (11297 pb)
RNA (8248 nt)
Figura 4.12. Producto de la transcripcin obtenida in vitro (punta de flecha) a partir de clones de
cDNA correspondientes al RNA2 genmico de ToCV linealizados (flecha). 1: clon pToCV229 con
una mutacin en la secuencia nucleotdica del promotor de la RNA polimerasa SP6 (TG). 2 y 3:
clones pToCV230 y pToCV231 sin la mutacin. M: Marcador de peso molecular 1Kb DNA ladder
(GeneCraft).
169
Captulo 4
4.3.4. Anlisis de la replicacin de transcritos obtenidos in vitro del RNA1 y

RNA2 de ToCV en protoplastos de Nicotiana benthamiana
Dado que no se ha logrado transmitir ToCV mecnicamente a ninguna planta
husped, no se intent la inoculacin mecnica de los transcritos en plantas, sino que
se us un sistema de protoplastos de N. benthamiana para los estudios de replicacin
viral.
Mediante anlisis por northern blot de extractos de RNA de protoplastos de
N. benthamiana (Fig. 4.13.A) inoculados con transcritos obtenidos in vitro del
RNA1 completo de ToCV incorporando anlogo de cap, se detect la replicacin
tanto de las cadenas positivas como negativas de dicho RNA a partir de las 24 horas
tras la inoculacin. Tanto en las preparaciones de RNA provenientes de protoplastos
utilizados
como
control
sin
inocular
como
de
protoplastos
analizados
inmediatamente despus de la inoculacin, no se detect acumulacin viral (Fig.

4.13.B). Tanto el RNA de polaridad positiva como negativa presentaron un patrn
temporal similar y, aunque la acumulacin de cadenas positivas es ligeramente
mayor que las cadenas negativas al segundo y tercer da del anlisis, como se puso
de manifiesto al cuantificar el RNA mediante la densidad ptica de las bandas
obtenidas en el northern blot, estas diferencias no son estadsticamente significativas
(Fig. 4.14).
170
Captulo 4
Protoplastos sin
inocular
0
24
48
72
RNA1
pToCV227
5 g/milln prot.
24
48
72
10 g/milln prot.
24
48 72
x dsRNA
Sonda p22 (-)
dsRNA
Sonda p22 (+)
Figura 4.13. A: Protoplastos aislados de mesfilo de hojas de N. benthamiana. B: Anlisis tipo

northern blot de RNA total desnaturalizado extrado de protoplastos de N. benthamiana inoculados
con transcritos obtenidos in vitro del RNA1 de ToCV. Se utiliz una sonda de RNA marcada con
digoxigenina de polaridad negativa y positiva complementaria al gen que codifica la protena p22
del extremo 3 del RNA1. El anlisis del RNA extrado de protoplastos se realiz a las 0, 24, 48 y
72 horas tras la inoculacin. Como control positivo se utiliz RNA de doble cadena (dsRNA) de
una planta de tomate infectada con ToCV. Como control negativo se utilizaron protoplastos sin
inocular sometidos a las mismas condiciones que el resto. Con una flecha se indica el RNA1.
171
Captulo 4
Unidades relativas
100
80
60
RNA1 (+)
RNA1 (-)
40
20
0
0
Das despus de inoculacin
Figura 4.14. Evolucin de la acumulacin del RNA1 genmico y complementario de ToCV en

protoplastos de N. benthamiana inoculados con transcritos obtenidos in vitro, expresada mediante la
cuantificacin de las bandas obtenidas en funcin de la densidad ptica tras el anlisis northern blot
utilizando una sonda de polaridad positiva y negativa complementaria al gen que codifica la
protena p22 del RNA1 de ToCV.
La inoculacin de los transcritos obtenidos in vitro de los clones pToCV230 y

pToCV231 del RNA2 se realiz junto con transcritos del clon pToCV227 del RNA1
de ToCV. A su vez, en el mismo ensayo, se realiz la inoculacin nicamente del
RNA1. En el anlisis mediante northern blot utilizando la sonda de polaridad
negativa complementaria al gen que codifica la protena p22 del RNA1 de ToCV se
observ acumulacin del RNA1 genmico, tanto al inocularse slo como con los
clones del RNA2 (Fig. 4.15.A). Sin embargo, mediante hibridacin molecular con
una sonda complementaria al extremo 3 del RNA2 no se pudo detectar la presencia
de dicho RNA de ToCV (Fig. 4.15.B). En la figura 4.15 se muestran nicamente los
resultados obtenidos con la utilizacin del clon pToCV231 del RNA2 de ToCV ya
que los resultados del clon pToCV230 son similares.
172
Captulo 4
Protoplastos
sin inocular
RNA1
pToCV227
24
48
24
RNA1
+
RNA2
(pToCV231)
48
24
48 dsRNA
RNA1
4700
Sonda extremo 3
RNA1 (p22)
(-)
2600
1700
1000
Protoplastos
sin inocular
RNA1
+
RNA2
(pToCV231)
24
48
24
48 dsRNA
RNA2
sg p59
4700
Sonda extremo 3
RNA2
(-)
sg p9
sg CP
sg CPm
2600
1700
1000
Figura 4.15. Anlisis tipo northern blot del RNA total desnaturalizado extrado de protoplastos de
N. benthamiana inoculados nicamente con transcritos del RNA1 (clon pToCV227) o junto a
trancritos del RNA2 (clon pToCV231) de ToCV obtenidos in vitro. Se utilizaron sondas de RNA
marcadas con digoxigenina de polaridad negativa y complementarias al gen que codifica la protena
p22 en el extremo 3 del RNA1 (A) y al extremo 3 del RNA2 de ToCV (B). El anlisis del RNA de
los protoplastos se realiz a las 0, 24 y 48 horas tras la inoculacin. Como control positivo se utiliz
RNA de doble cadena (dsRNA) de una planta de tomate infectada con ToCV. Como control
negativo se utilizaron protoplastos sin inocular sometidos a las mismas condiciones que el resto. Se
indican con flechas el RNA1 y RNA2 genmico y los posibles subgenmicos (sg) del RNA2 de
ToCV. A la izquierda se indica el tamao (nt) y posicin del marcador de RNA.
173
Captulo 4
4.4. DISCUSIN
La disponibilidad de clones infectivos de un virus es una poderosa
herramienta molecular para el estudio de diversos aspectos de su biologa, como son
su gama de huspedes o la sintomatologa que produce y es imprescindible para el
anlisis funcional de los genes virales ya que permite determinar su papel en
patognesis, transmisin, etc.
Aunque la capacidad para realizar copias de cDNA a partir de RNA de gran
tamao se ha incrementado debido al desarrollo de DNA polimerasas con alta
procesividad y fidelidad, la obtencin de clones de cDNA de gran tamao es an
problemtica. Los virus pertenecientes a la familia Closteroviridae son los virus de
RNA de mayor tamao que infectan a plantas, por lo que la construccin y
obtencin de clones infectivos es un proceso dificultoso. La fidelidad de las
transcriptasas reversas y las DNA polimerasas decrece proporcionalmente a la
longitud del RNA (Lai, 2000) y por tanto a veces son necesarias complejas
estrategias de ligacin para obtener el cDNA completo (Satyanarayana et al., 1999)
y pueden surgir problemas de toxicidad del cDNA clonado en E. coli
(Satyanarayana et al., 2003). Dentro de esta familia, que comprende un gran nmero
de especies virales, se ha llevado a cabo la construccin de clones infectivos de
cDNA completos que se replican en protoplastos mediante inoculacin de transcritos
obtenidos in vitro de tres especies, dos del gnero Closterovirus, BYV y CTV
(Peremyslov et al., 1998; Satyanarayana et al., 1999) y uno del gnero Crinivirus,
LIYV (Klaassen et al., 1996). En el caso de CTV, que posee un genoma de casi 20
Kb, Satyanarayana et al. (1999) establecieron un sistema gentico mucho ms
simple y manipulable mediante la delecin de aproximadamente el 40% del extremo
3 del genoma que se replicaba autnomamente en protoplastos.
ToCV, como todos los crinivirus descritos hasta el momento, est limitado al
floema de la planta husped y no se puede transmitir a plantas mediante inoculacin
174
Captulo 4
mecnica, sino mediante las especies de mosca blanca B. tabaci, T. vaporariorum y

T. abutilonea de manera semipersistente (Wisler et al., 1998b). Por ello, en este
trabajo se ha utilizado un sistema de protoplastos de N. benthamiana para los
estudios de replicacin viral. Adems, un problema que dificulta la elaboracin de
un sistema gentico basado en clones infectivos de ToCV es la necesidad de la
incorporacin en una misma clula de las dos molculas de RNA que componen su
genoma para poder ocasionar una infeccin similar a la producida por el virus.
Debido a la complejidad del proceso de obtencin de clones agroinfectivos en
los closterovirus CTV, BYV y LIYV (Prokhnevsky et al., 2002; Ambrs et al.,
2008; Wang et al., 2009a), los protoplastos pueden ofrecer una buena alternativa
inicial para el establecimiento de un sistema gentico basado en la inoculacin de
transcritos obtenidos in vitro. Mediante anlisis mutacionales se puede avanzar en el
conocimiento de las distintas estrategias de replicacin, expresin gnica y
encapsidacin como se ha realizado en CTV, BYV y LIYV. Adems se pueden
realizar estudios de citopatologa de las infecciones virales como se ha llevado a
cabo en el caso del crinivirus LIYV, en los que se han observado los cuerpos de
inclusin, los viriones y los depsitos de plasmalema que se forman en protoplastos
de mesfilo de N. benthamina al ser inoculados con trancritos del RNA1 y RNA2
(Medina et al., 1998).
Hasta el momento, la funcin de diversas protenas codificadas por distintos
ORFs de ToCV es desconocida o se deduce por comparacin de su secuencia con la
de otros virus de la misma familia. Por lo tanto, la disponibilidad de clones
infectivos del RNA1 y RNA2 de ToCV sera una poderosa herramienta para realizar
un anlisis funcional de los genes virales.
En este trabajo se ha realizado la construccin de clones completos de cDNA
a partir del RNA1 y RNA2 del aislado espaol de ToCV AT80/99 (Lozano et al.,
2006b, 2007). El anlisis de la infectividad se ha realizado mediante la inoculacin
175
Captulo 4
de transcritos obtenidos in vitro de estos clones en protoplastos de N. benthamiana.

La sntesis del clon de RNA1 de ToCV se realiz usando una estrategia de clonaje
poblacional que maximiza la probabilidad de obtener clones de cDNA
biolgicamente activos (Yu y Wong, 1998), ya que se efectu la ligacin simultnea
de los tres productos de RT-PCR solapantes directamente en pUC18 y no se realiz
paso a paso a partir de un clon determinado. Sin embargo, para la construccin de
los clones de RNA2 de ToCV no se pudo utilizar esta estrategia ya que, tras
reiterados intentos, no fue posible efectuar la ligacin directa en pUC18 de los
productos de RT-PCR.
En este trabajo se ha obtenido un clon infectivo del RNA1 de ToCV que se
replica eficientemente en protoplastos de N. benthamiana a partir de las 24 h
despus de la inoculacin de sus transcritos obtenidos in vitro. Al igual que en el
caso de LIYV (Klaassen et al., 1996), el RNA1 de ToCV puede replicarse en
ausencia del RNA2, como era de esperar por el anlisis de secuencias que muestra
que los RNA1 de ambas especies poseen los genes que codifican las protenas
implicadas en la replicacin viral.
En el caso de CTV, tras la inoculacin viral en protoplastos de N.
benthamiana, a tiempo 0 se obtuvieron bandas correspondientes al RNA genmico
inicialmente introducido en protoplastos, a las 24 horas decreca la intensidad de las
bandas sugiriendo que gran cantidad del RNA se degradaba y despus se detectaba
un incremento de dicho RNA hasta un mximo entre 3 y 5 das despus de la
inoculacin (Navas-Castillo et al., 1997). En el caso de ToCV no se ha detectado
RNA1 en los protoplastos analizados inmediatamente despus de la inoculacin con
los transcritos, ya que su acumulacin se observ a partir de las 24 horas hasta los 3
das despus de la inoculacin. Esto puede deberse a un bajo nmero de protoplastos
infectados tras la inoculacin. El RNA1 genmico de ToCV, de polaridad positiva, y
el complementario, de polaridad negativa, presentaron un patrn similar de
acumulacin, tanto temporal como en cantidad. Sin embargo los experimentos de
176
Captulo 4
inoculacin de protoplastos con viriones de CTV (Navas-Castillo et al., 1997) y

BYV (He et al., 1996) mostraron una acumulacin del RNA de polaridad negativa
de hasta diez veces menos que el RNA genmico de polaridad positiva. En el caso
de LIYV, el RNA1 de polaridad positiva y negativa mostraron un patrn temporal
diferente, ya que las cadenas negativas presentaron la mxima acumulacin a las 24
h despus de la inoculacin viral, mientras que la acumulacin del RNA1 de
polaridad positiva aument progresivamente hasta las 72 horas tras la inoculacin
(Yeh et al., 2000).
En este estudio no se pudo detectar replicacin de los transcritos obtenidos in
vitro del RNA2 de ToCV al ser inoculados en protoplastos de N. benthamiana junto
al RNA1. Esto puede ser debido a que los clones que hemos analizado no sean
infectivos o a la incapacidad de deteccin como consecuencia del bajo nmero de
clulas infectadas con el RNA1 y por tanto de clulas infectadas con ambas
molculas. En este ltimo caso, habra que optimizar el protocolo de inoculacin de
transcritos obtenidos in vitro para conseguir un mayor porcentaje de clulas
doblemente infectadas. Ya que, debe necesitarse una acumulacin previa del RNA1
y de las protenas que codifica, tal y como se ha descrito en LIYV (Yeh et al., 2000;
Wang et al., 2009b).
El sistema de protoplastos puede ofrecer una buena alternativa inicial para el
establecimiento de un sistema gentico de ToCV basado en la inoculacin de
transcritos obtenidos in vitro, como ha ocurrido en el caso de otros closterovirus. Sin
embargo, ya que ToCV no se transmite mecnicamente, sino a travs de la mosca
blanca (Wisler et al., 1998b; Karasev, 2000), hay que buscar alternativas para poder
llevar a cabo su inoculacin en planta. Para ello, existe la opcin utilizada con LIYV
de transmisin mediante alimentacin artificial de B. tabaci en una purificacin de
viriones generados en protoplastos inoculados con transcritos del virus obtenidos in
vitro (Ng y FalK, 2006a). Este sistema presenta algunas limitaciones como la
obtencin de suficientes viriones a partir de los protoplastos para la posterior
177
Captulo 4
transmisin por el insecto vector (Wang et al., 2009a). Una alternativa que evitara
los problemas que conlleva la utilizacin de protoplastos, o la transmisin a travs
de vectores es la agroinoculacin de clones infectivos directamente en planta
(Grimsley et al., 1986). Hasta el momento, dentro de la familia Closteroviridae se
han desarrollado clones agroinfectivos de BYV (Prokhnevsky et al., 2002; Chiba et
al., 2006), CTV (Gowda et al., 2004; Ambrs et al., 2006, 2008) y recientemente de
LIYV (Wang et al., 2009a) y GLRa-V (Liu et al., 2009) en plantas de N.
benthamiana.
En el proceso de elaboracin de clones infectivos de ToCV se han producido
diversos problemas como ha sido la inestabilidad del cDNA en E. coli, posiblemente
como consecuencia de toxicidad provocada por determinadas secuencias virales. En
ocasiones se puede mejorar la estabilidad de cDNAs virales en bacterias mediante el
cambio de cepa bacteriana o la utilizacin de un plsmido con un nmero reducido
de copias por clula (Boyer y Haenni, 1994). En el caso de la clonacin del RNA1
de ToCV, la utilizacin de la cepa SURE de E. coli en sustitucin de DH5 solvent
los problemas de inestabilidad en la bacteria. La introduccin de mutaciones que
modifican la pauta de lectura en las regiones que presuntamente codifican protenas
txicas, puede reducir dicha toxicidad, tal y como se ha observado con clones de
CTV (Satyanarayana et al., 2003). Tambin se puede impedir la expresin de la
protena txica mediante la insercin de uno o ms intrones en distintas regiones del
cDNA. En el caso de CTV, para reducir la toxicidad que produce la zona 5 terminal
en E. coli se ha insertado un intrn de patata en dicha zona y se ha utilizado un
vector hbrido de plsmido binario y tipo BAC (Ambrs et al., 2006).
Existen importantes cuestiones que necesitan ser resueltas sobre cmo ToCV
usa su extensa informacin gentica para producir infeccin en distintas plantas
husped con el propsito de desarrollar medidas efectivas de control en cultivos tan
importantes como el tomate. El desarrollo de un sistema eficiente de gentica
reversa de ToCV podr permitir la creacin de mutantes que harn posible la
178
Captulo 4
caracterizacion de los determinantes moleculares que controlan su replicacin,

movimiento, interaccin con factores celulares que desencadenan la enfermedad, as
como su transmisin por las distintas especies de mosca blanca que actan como sus
vectores naturales.
179
CONCLUSIONES
Conclusiones
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este trabajo permiten establecer las siguientes
conclusiones:
1. Las infecciones por ToCV en pimiento no estn distribuidas
uniformemente en el rea estudiada en el sudeste peninsular espaol. Los
muestreos sistemticos llevados a cabo en cultivos de tomate y pimiento en las
provincias de Mlaga, Almera y Murcia desde 2006 a 2008 han puesto de
manifiesto que las infecciones en pimiento slo son importantes en la provincia de
Mlaga, mientras que la incidencia en tomate es elevada en las tres provincias.
2. Existen diferencias de susceptibilidad varietal a la infeccin por ToCV
en pimiento, como ha sido demostrado mediante ensayos de inoculacin en
condiciones controladas mediante la mosca blanca Bemisia tabaci.
3. ToCV es patgeno en pimiento. Las plantas infectadas en condiciones
controladas presentaron una apreciable reduccin de altura y sntomas de amarilleo
internervial en hojas de altura media y basales, las cuales adems se apreciaban
ligeramente engrosadas, enrolladas longitudinalmente y quebradizas al tacto.
Adems, se observ una reduccin significativa de la produccin como
consecuencia de un menor nmero y tamao de frutos.
4. La patata es un husped tanto experimental como natural de ToCV. Se
ha detectado la presencia de ToCV en los tubrculos de plantas infectadas y en las
plantas desarrolladas a partir de ellos. Las plantas de patata, a su vez, pueden actuar
como fuente de inculo del virus para plantas de tomate mediante la transmisin por
B. tabaci.
5. La confirmacin de la existencia de dos variantes virales de ToCV,
distinguibles por diferencias nucleotdicas en el RNA 1, as como la existencia de
una subpoblacin de aislados presente fundamentalmente en pimiento, junto con los
183
Conclusiones
datos experimentales de cambios nucleotdicos asociados a cambios en el husped

(tomate y pimiento), dan peso a la hiptesis de que fenmenos de adaptacin al
husped estn asociados con la variabilidad gentica de las poblaciones de
ToCV presentes en Espaa.
6. La replicacin del RNA 1 de ToCV en protoplastos de Nicotiana
benthamiana a partir de un clon de cDNA permite prever la disponibilidad de un
sistema gentico de ToCV para el estudio de aspectos bsicos de la biologa del
virus, como su replicacin, movimiento en la planta y transmisin por su insecto
vector.
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Huspedes alternativos

de tomato chlorosis virus: epidemiologa,

Isabel Mara Fortes Cuenca

Huspedes alternativos de tomato chlorosis virus:

Isabel Mara Fortes Cuenca

Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterrnea La Mayora

Don Jess Navas Castillo, Doctor en Ciencias Biolgicas, Investigador Cientfico

Fdo. Dr. Jess Navas Castillo

D. Jos Becerra Ratia, Director del Departamento de Biologa Celular, Gentica y

Autoriza la presentacin de la Tesis Doctoral titulada Huspedes alternativos de

Mlaga, junio de 2010

Fdo. Jos Becerra Ratia

Este trabajo se ha llevado a cabo en el Laboratorio de Virologa de la Estacin

LLegar a la meta no es vencer, lo importante es el camino y en l,

destacar la significativa reduccin de produccin en las plantas infectadas como

Nicotiana benthamiana. Hasta el momento, los experimentos llevados a cabo han

beet yellows virus

cromosomas artificiales bacterianos

CAPTULO 1. INFECCIONES DE TOMATO CHLOROSIS VIRUS EN

CAPTULO 2. LA PATATA (SOLANUM TUBEROSUM), UN NUEVO

CAPTULO 3. ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENTICA DEL RNA1 DE

3.2.5. Diseo de los iniciadores empleados en la sntesis y amplificacin

INFECTIVOS DE TOMATO CHLOROSIS VIRUS

4.2.5. Transcripcin in vitro del RNA1 y RNA2 de ToCV.. 150

El tomate es uno de los principales cultivos hortcolas en extensin y

de virus emergentes que constituyen una amenaza reciente para el cultivo de la

patata, alcachofa, lechuga y varias especies ornamentales como petunia y especies

tamao del RNA genmico y la incapacidad de ser transmitidos mecnicamente, ha

sus miembros son transmitidos mediante inoculacin mecnica, aunque con

En el genoma de los closterovirus se distinguen dos bloques principales de

probablemente se expresa mediante el desplazamiento de la pauta de lectura del

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2004; Alzhanova et al., 2007). Se ha propuesto que la cola del virin es un

Las secuencias de los extremos 5-UTR estn implicadas en distintos

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codificados por el genoma viral tambin contribuyen al fenotipo de la enfermedad al

EL VIRUS DEL AMARILLEO DEL TOMATE (TOMATO CHLOROSIS

Figura 3. Representacin esquemtica de la organizacin genmica de la secuencia nucleotdica del

Transmisin de ToCV por vectores

parecen estar siendo desplazadas progresivamente por las de B. tabaci en distintas

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lo que unido a la sintomatologa observada y a la presencia en zonas prximas de

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En el caso de CTV, mediante la delecin de los 10 genes del extremo 3, se

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