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Aplicaes da RMN em Bioqumica

Roberto Kopke Salinas


IQ USP

Novembro/07

Equilibrio trmico

T1 = spin-lattice relaxation time

M z (t ) = M eq (1 e

(t t on )
T1

Ilustrao: Spin Dynamics, M. H. Levitt, John Wiley & Sons Ltd, 2001, England.

Modelo vetorial

Vetor magnetizao

Ilustrao: Nuclear Magnetic Resonance, PJ Hore, Oxford University Press, Oxford.

Referencial girante

Sist. Coord. do laboratrio

Referencial girante wref

Um spin com frequencia de Larmor 0 precessa, no refencial girante,


com uma frequencia igual ao seu offset = 0 ref.
Ilustrao: Multidimensional NMR in Liquids, FJM van de Ven, VHC Publishers, Inc, 1995, UK.

No referencial girante o campo esttico B0 reduzido.

Sistema de
coordenadas do
laboratorio

Referencial girante

Ilustrao: Multidimensional NMR in Liquids, FJM van de Ven, VHC Publishers, Inc, 1995, UK.

Campo efetivo
B1 est oscilando com
frequncia ref

Condio de ressonncia
B=0, e Beff=B1

Off-resonance

Beff = B12 + B 2

eff = 12 + 2
Ilustrao: Multidimensional NMR in Liquids, FJM van de Ven, VHC Publishers, Inc, 1995, UK.

Pulsos de RF

= B1 p = 1 p

, fase

Offset e frequncia do transmissor

ref

= 0 - ref ~ 30 ppm ~ 3.7 kHz (13C)


Hard pulse: B1 >> mx

(2)B1 >> 3.7 kHz

90 <<
1/41(Hz)=
67us

Experimento de um pulso

Deteco sensvel a fase

S(t) = Mycos(t) + isen(t) = exp(it)


S(t) = exp(it) exp(-t/T2)

Precesso da magnetizao sob influncia


do deslocamento qumico
My

t
My cos(t) + Mx sen(t)

Formalismo do produto de operadores


*Descriao simples dos experimentos de RMN para spins fracamente acoplados
*Descrio dos blocos bsicos
*Analogia com o modelo vetorial
*Vlido apenas para spin 1/2
Iz : polarizao, associado com Mz, e com o sistema em equilbrio trmico
Ix, Iy : single quantum coherences, associados com magnetizao transversal Mx e My, e transies entre os estados e .

Single quantum coherences: estados de spin associados com transies entre

os estados e (mz = +/- 1).


Observveis: Ix e Iy

Equilbrio trmico

Depois de um pulso x

Ilustrao: Nuclear Magnetic Resonance, PJ Hore, Oxford University Press, Oxford.

Para um sistema de um spin


Iz, Ix, Iy, E
Em qualquer momento o estado do sistema pode ser representado por uma
matriz de densidade (t) que contem contribuies de todos os operadores
de spin que compoem o sistema
(t) = a(t)Ix + b(t) Iy + c(t) Iz
Como (t) evolui com o tempo em funo de um dado hamiltoniano?

d (t )
= i H , (0)
dt

(t ) = eiHt (0)eiHt = (0) cos t + [ (0), H ]sent

Experimento de um pulso, e precesso sob influncia do


deslocamento qumico
(t ) = eiHt (0)eiHt = (0) cos t + [ (0), H ]sent

Evoluo sob ao do deslocamento qumico

pulso

(0)

I
Iz

Mz

2 x

(t ) = Iy

My

ngulo

tI z

(t ) = Iy cos(t ) + Ixsen(t )

My cos(t) + Mx sen(t)

Evoluo sob ao de um pulso

Ix
Iy
Iz

Iy
Iy
Iy

Ix cos() Iz sen()
Iy
Iz cos() + Ix sen()

Sistema de dois spins

Matriz de densidade possui 16 elementos (4x4)

O espao de operadores composto pelos


produtos de Ix, Iy, Iz, E e Sx, Sy, Sz, E
Iz, Sz = polarizao
2IzSz = longitudinal 2-spin order
Ix, Iy, Sx, Sy = transverse single quantum coherence
2IxSz, 2IySz = transverse I single quantum antiphase coherence
2IzSx, 2IzSy = trasnverse S single quantum antiphase coherence
2IxSx, 2IySy, 2IxSy, 2IySx = zero e double quantum coherences

Evoluo do acoplamento escalar

Jt
(2 I z S z )
2

-x

Ix
2IySz

(Jt/2)2IzSz
(Jt/2)2IzSz

Ix cos(Jt/2) + 2IySz sen(Jt/2)


2IySz cos(Jt/2) - Ix sen(Jt/2)
t = 1/2J
In-phase coherence

Anti-phase coherence

Transferencia de coherence
Acoplamento escalar capaz de criar ou aniquilar operadores, criando
interaes com outros ncleos.

Iy
1/4J

(Jt/2)2IzSz

Iy cos(Jt/2) +/- 2IxSz sen(Jt/2)

1/4J

2IxSz

2IzSy

/2 (Ix)

2IzSz

(Jt/2) 2IzSz

/2 (Sy)

2IzSy

2IzSy cos(Jt/2)
+/- Sx sen(Jt/2)

Deteco

S(t) = exp(it)cos(Jt/2)exp(-t/T2)

S(t) = exp(it)sen(Jt/2)exp(-t/T2)

FT

FT

Para um CH2 existe um acoplamento ativo e um passivo:


S(t) = exp(iIt)sen(Jt/2)cos(Jt/2)exp(-t/T2)

E para um CH3 dois passivos e um ativo:


S(t) = exp(iIt)sen(Jt/2)cos2(Jt/2)exp(-t/T2)

Corolrio
Deslocamento qumico e acoplamento escalar agem simultaneamente,
mas podem ser tratados sequencialmente (acoplamento fraco)
Pulsos limitam os perodos de precesso livre
Apenas Ix e Iy so observveis
Coherences do tipo Ix,ySz ou IzSx,y no so observveis mas evoluem
para termos observveis

HSQC

Dimenso indireta

Dimenso de aquisio

Introduo da dimenso indireta

Adquirir N espectros 1D
incrementando t1
2HzNx cos(Nt1) - 2HzNy sen(Nt1)

Interferograma

Interferograma

t1 = 0

S(t2)cos(Nt1)

T1 = 2t

S(2, t1)

15N

(ppm)

S(t1, t2)

1H

(ppm)

S(2, 1)

Motivao para estudar RMN de biomolculas

~14 % das estruturas de protenas,


DNA ou complexos depositadas no
PDB so resolvidas por RMN em
soluo

Com a grande quantidade de


genomas sequenciados, o estudo de
interaes adquire maior relevncia

Estrutura, funo e dinmica

Estruturas obtidas por RMN em soluo permitiram compreender


detalhadamente como o repressor reconhece o DNA.
A alta mobilidade do headpiece est intimamente ligada capacidade de
associar-se e dissociar-se do DNA.

Escalas de tempo de diferentes movimentos em BPTI

Fonte: K. Wuthrich (Nobel Lecture)

Interaes
Different exchange regime occurs
From the point of view of the protein
87

Fast

L21R:CDA
115

65

75
Intermediate

1:0

Slow

1:1
1:2
1:3

Different exchange regimes occur


lower ligand affinity of L21R with respect to the wt

We need to complete the assignment and study the behaviour of each residue

RMN de protenas
T2 passa a ser importante:
Menor T2 em relao a
molculas pequenas

Maior largura de linha


( ~ 8 Hz para uma protena de 10 kDa, assumindo TauC = 5ns)

RMN de protenas

*Maior complexidade

espectral (nmero de picos)

*Supresso do sinal da
gua (~55000 vezes
maior)

Bom shimming
Espectro obtido a
600 MHz

Boa disperso de picos HN, protena de 80 aminocidos

15N

(ppm)

O espectro de 15N HSQC

1H

(ppm)

2D NOESY

O espectro 2D NOESY

Determinao da estrutura de uma protena por RMN

1. Identificao das ressonncias


2. Coleta de informaes estruturais
3. Clculo da estrutura

Enriquecimento com

15N

e 13C

Isotope

Spin

Abundancia
natural/%

/rad.s-1.T-1

1H

~100

267.5x106

12C

~98.9

13C

~1.1

67.3x106

14N

~99.6

19.34x106

15N

~0.37

-27.1x106

Marcao isotpica com 15N e 13C: HNCA

H
C

HN

H C H
C
Aminocido i-1

H C H
C
Aminocido i

3D HNCA

1024 pontos digitalizados em t3


NS x 64 x 64 scans
64 incrementos em t2
64 incrementos em t1
Um interferograma de 1024 x 64 x 64 pontos

S(t1, t2, t3)

FT (t1, t2, t3)

1. MBF1 is a co-activator of transcription and is found in


different eukaryotic organisms from yeast to human
MBF: multiprotein bridging factor
MBF1
?

TBP

Specific site

TATA

Transcription
machinery

Sequence analysis predicts that


TrMBF1 has two domains

MBF domain

HTH domain

MBF1 C-terminal domain was


shown to be involved in
binding to TBP

2. The aim was to solve the structure of the C-terminal domain

CTD-TrMBF1

15N

(ppm)

NTD-TrMBF1

1H

(ppm)

The assignments were based on the analysis of CBCA(CO)NH, HNCACB, HNCA, HN(CO)CA, HNCO, HN(CA)CO, 15N TOCSYHSQC, [H]CCH-TOCSY, H[C]CH-TOCSY, HCC(CO)NH-TOCSY

Estrutura e dinmica

Validao da estrutura

Recentes avanos em metodologia e aplicao


Aquisio rpida: 15N HSQC em 65 segundos

Non-linear sampling, SofastHMQC, BestHNCA/HNCO, Projection


reconstruction, etc

Sensibilidade e tempo de aquisio

Novos experimentos baseados em deteco de 13C

Aquisio de dois espectros simultaneamente com


deteco em dois canais

Aquisio de dois espectros simultaneamente com deteco em dois canais

FIM