INTRODUCCIÓN

Desde el punto de vista de la expresión genética, los operones bacterianos se pueden dividir
en dos grandes tipos:

• operones de expresión constitutiva (es decir, aquellos que se transcriben

permanentemente, independientemente de las condiciones ambientales). Por
ejemplo, operones para las ADN- y ARN-polimerasas;operones para las proteínas
de las c. t. e.; operones para las proteínas ribosómicas, etc.
• operones cuya expresión está regulada en función de las condiciones ambientales.
Dentro de esta categoría, se distinguen a su vez: operones de expresión inducible;
operones de expresión reprimible

En principio, por su modo la regulación puede ser de dos tipos :

• Inducción: síntesis de ciertos enzimas debida a la presencia en el medio de

sustratos metabolizables adecuados, o en términos más generales, por la existencia
de determinados estímulos ambientales (no necesariamente de tipo nutricional).
Ejemplo típico: la producción de β -galactosidasa es inducible en determinadas
bacterias cuando en el medio aparece un azúcar de tipo β -galactósido (como la
lactosa)
• Represión: desconexión rápida de la ruta biosintética de un determinado
compuesto, cuando éste aparece aportado en el medio de la bacteria. Ejemplo típico:
si E. coli crece en ausencia de triptófano (Trp), la ruta para su biosíntesis está
funcionando hasta que ese aa. aparezca en el medio. La represión no siempre tiene
que ver con estímulos nutricionales: se pueden desconectar genes para evitar que su
expresión interfiera con otros procesos que ya están en curso en la célula.

En resumen, y en relación con el modo de expresión genética que subyace a sustancias

relacionadas con el metabolismo, la norma general es que:

• la inducción permite el ajuste rápido para el uso de sustratos metabolizables;

• la represión permite el ajuste para la síntesis de una sustancia que interviene como
intermediario metabólico.

TIPOS DE MECANISMOS DE REGULACIÓN GENÉTICA

Casi cada uno de los niveles de los que depende la expresión de información genética
puede estar sometido en principio a algún tipo de regulación, aunque el más frecuente es
sobre la transcripción.

1) Nivel transcripcional

a) A nivel del inicio de la transcripción

 sustitución del factor σ de la ARN-polimerasa

  por interacción de proteínas regulatorias sobre secuencias de
ADN cercanas al promotor:

i) fenómenos de inducción génica

ii) fenómenos de represión génica

b) Terminación prematura de la transcripción: fenómenos de atenuación de

la transcripción.

c) Procesamiento de ARN (casos muy raros en procariotas)

2) Nivel traduccional. Ejemplos:

a) regulación de la síntesis de las proteínas ribosómicas.

b) regulación por ARN antiparalelo, que interfiere con la traducción del

ARNm

3) Nivel postraduccional. Aquí ya no estamos ante mecanismos puramente de regulación

genética. Algunos ejemplos: degradación de proteínas y modificación covalente de
proteínas (p. ej., fosforilación). Regulación alostérica por retroalimentación (feed-back) de
la actividad de las proteínas enzimáticas.

4) Sistemas globales de regulación

Cuando varios operones están regulados coordinadamente por un mismo tipo de estímulos,
constituyen una red de regulación que se suele denominar con el nombre de regulón (p. ej.,
el regulón de los operones spo de la esporulación en las especies del género Bacillus).

Casi todos los productos de genes bacterianos están regulados en al menos uno de estos
niveles, y a menudo lo están en varios niveles al mismo tiempo.

Como veremos enseguida, muchos de estos mecanismos se disparan en el interior celular

debido a pequeñas moléculas que informan a la bacteria de un determinado cambio
ambiental.

2. REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN
2.1. REGULACIÓN DEL INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN

2.1.1. REGULACIÓN POR SUBUNIDADES σ ALTERNATIVAS

Se trata de una estrategia muy directa y sencilla, en la que la subunidad σ "stándard" de la

célula vegetativa normal se ve desplazada y sustituida por otro(s) tipo(s) de σ diferentes
(codificadas por genes distintos). La holoenzima de la ARN polimerasa con la nueva σ
reconoce ahora e inicia la transcripción a partir de un tipo distinto de promotor. Esto hace
que se transcriban operones que hasta entonces permanecían "silenciosos" (sin expresión).

Veamos algunos ejemplos:

• Uno de los casos mejor estudiados se da en las especies del gén. Bacillus, durante el
proceso de la esporulación: Durante el crecimiento vegetativo, B. subtilis posee una
holoenzima típica α 2β β '+ σ 43 (= σ A), que reconoce los promotores del tipo que
estudiamos en el capítulo anterior. Al iniciarse la esporulación, se sintetiza una
nueva σ que desplaza a la σ A (vegetativa). Ahora, la holoenzima reconoce los
promotores de algunos operones spo (que estaban inactivos durante el crecimiento
vegetativo), que codifican funciones requeridas durante las primeras fases de la
esporulación. Algunos de los genes que ahora se expresan corresponden a otras
subunidades σ distintas de las dos citadas. En una fase más avanzada de la
esporulación, una nueva "generación" de σ (entre ellas la σ 29) desplaza a la
segunda. Ahora la holoenzima correspondiente reconoce nuevos grupos de operones
que codifican proteínas requeridas en fases más tardías de la esporulación. Cada
nueva holoenzima reconoce un tipo distinto y característico de promotor (con
secuencias de nucleótidos peculiares), que no puede ser reconocido por las otras
versiones de la ARN polimerasa dotadas de subunidades σ diferentes.
• La respuesta al choque por calor ("heat-shock") en E. coli: Si E. coli se somete a
una agresión de altas temperaturas, se produce la inducción de unos 17 genes (genes
de la respuesta al calor), cuyos productos tienden a evitar ciertos daños ocasionados
por este agente. Esta respuesta está mediada por una nueva subunidad σ (llamada
σ 32) que desplaza a la σ 70 de la célula normal. La nueva holoenzima reconoce a
los genes de la respuesta al calor, todos los cuales poseen un promotor con una
región -10 totalmente diferente a la que vimos en el capítulo anterior: C C C A T N
T
• Cuando las enterobacterias sufren hambre de N (por ejemplo, no existe NH3), una
nueva subunidad σ (llamada σ N o σ 54) desplaza a la σ 70, y entonces la
holoenzima reconoce promotores distintos, correspondientes a operones cuyos
productos permiten utilizar otras fuentes de N más raras.

2.1.2. REGULACIÓN DEL INICIO DE TRANSCRIPCIÓN POR PROTEÍNAS

REGULADORAS

Como ya apuntamos, podemos encontrar dos tipos de fenómenos:

• inducción: el desencadenante del ajuste se denomina inductor;

• represión: el desencadenante del ajuste se denomina correpresor.
En general, los desencadenantes de la respuesta se llaman efectores, y suelen ser moléculas
de pequeño tamaño. Si estamos tratando con respuestas adaptativas metabólicas, podemos
hacer la siguiente generalización:

• El inductor suele ser el sustrato de una ruta catabólica, o una molécula muy
semejante al sustrato natural.
• El correpresor suele ser el producto de una ruta biosintética, o una molécula
parecida.

El funcionamiento de estas moléculas en su papel de efectores no depende de su interacción

metabólica en la ruta correspondiente. Lo que hacen los efectores es interactuar con
proteínas reguladoras específicas para cada sistema (de cada operón o de cada grupo de
operones). Y, a su vez, las proteínas reguladoras interactúan con una zona del operón
cercana al promotor Es frecuente que muchas proteínas reguladoras compartan un dominio
tridimensional característico denominado hélice-giro-hélice, que las capacita para
reconocer determinadas secuencias del ADN.

Tanto la inducción como la represión génicas de funciones pueden deberse a su vez a:

• controles positivos;
• controles negativos.

Así pues, en la regulación del sistema tenemos varios tipos de elementos:

a. efectores: pequeñas moléculas que informan del ambiente exterior;

b. un elemento regulatorio que actúa en trans (a distancia): un gen regulador que
codifica una proteína cuya única función consiste en controlar la expresión (a nivel
de inicio de transcripción) de un operón de genes estructurales.
c. genes estructurales (normalmente agrupados en operones, donde los genes se
contranscriben en forma de ARNm policistrónico). Estos genes pueden codificar
proteínas estructurales, o proteínas enzimáticas o simplemente transcribirse a ARNr
o ARNt.

La función controladora de la proteína reguladora se ejerce por su interacción con

secuencias específicas al comienzo del operón, cerca del promotor. Estas secuencias son,
pues, elementos que actúan en cis dentro del circuito regulatorio: esto significa que su
efecto depende de que estén ligadas genéticamente con los genes estructurales que van a ser
sometidos a control genético. Son secuencias que no codifican productos difusibles que
pudieran actuar a distancia.

¿Cómo se puede distinguir y discriminar entre las funciones de un regulador que actúa en
trans (a distancia) de una secuencia en cis? Esto se puede lograr a partir de la observación
de los efectos fenotípicos de sus respectivas mutaciones y de los tests de complementación
(aunque las bacterias son haploides, se pueden realizar ensayos de complementación
genética en diploides parciales por medio de algún sistema de transferencia genética, como
por ejemplo el uso de conjugación con factores F-primas (F'):
 1. La mutación inactivante de un gen regulador tiene efectos recesivos en trans y
pleiotrópicos, que varían según que el control sea de tipo positivo o negativo:
a. en el caso de control negativo, la mutación tiene efectos constitutivos;
b. en el caso de control positivo, la mutación tiene efectos ininducibles.
2. La mutación de un operador tiene efectos dominantes en cis.
3. Por otro lado, la inactivación mutacional de un gen estructural simplemente priva a
la célula de la función correspondiente.

Comparemos ahora las regulaciones genéticas de tipo positivo y negativo:

1. Control negativo:el sistema se expresa a menos que sea desconectado por la acción
de una proteína reguladora, a la que se denomina represor. Dentro de este control
podemos distinguir, a su vez:
a. Control negativo con efectos inductores (ej: en el operón lac): el represor,
per se es activo, pero se inactiva en presencia del inductor.
b. Control negativo con efectos represores (ej: en el operón trp):el represor,
per se es inactivo (aporrepresor), pero en presencia del correpresor se activa
(adquiere su capacidad funcional), y es entonces cuando reprime al operón
estructural.
2. Control positivo: los genes estructurales no se transcriben (o en todo caso lo hacen
a un nivel basal bajo) a no ser que exista una proteína reguladora activa llamada
apoinductor o activador. También aquí puede haber dos categorías:
a. Control positivo por inducción: la proteína activadora, por sí misma es
inactiva, pero queda activada cuando se le une el inductor.
b. Control positivo por represión: la proteína activadora, per se, es activa,
pero se inactiva cuando se le une el correpresor.

Obsérvese, pues, que el estado activo del operón varía según que se trate de un sistema
inducible o reprimible:

• en los sistemas inducibles, el estado activo es el inducido;

• en los sistemas reprimibles, el estado activo es el desreprimido.

2.1.2.1. EJEMPLO DE CONTROL NEGATIVO E INDUCIBLE: Regulación del

operón lac de E. coli

Iniciamos ahora el estudio de los controles genéticos en un sistema paradigmático: el

operón lac (metabolismo de la lactosa) del colibacilo (Escherichia coli), que históricamente
fue el primero en investigarse (por Jacob y Monod, años 50, y que les hizo ganar el premio
Nobel en 1965). En este epígrafe abordaremos el comportamiento de este operón bajo
regulación negativa (incorporando detalles ulteriores al trabajo de Jacob y Monod). Más
adelante (2.1.2.3), veremos que el operón lac también posee un control positivo.

El operón lac, está constituido por:

tres genes estructurales:

 o Gen lacZ: codifica la ß-galactosidasa (tetrámero de un polipéptido de 116
kDa);
o Gen lacY: determina la ß-galactósido permeasa (46 KdA); proteína de
membrana que realiza el simporte de H+ y lactosa.
o GenlacA: determina ß-galactósido acetilasa, prescindible y de papel
desconocido.

un promotor para la unión de la holoenzima de la ARN polimerasa

un elemento regulador en cis: el operador, parcialmente superpuesto con el

promotor

y está controlado por el producto de un gen situado cerca del operón (pero que no forma
parte de él; este es el elemento regulatorio en trans): el gen lacI, que codifica un represor
que por sí mismo es activo como tal. El polipéptido de 38 kDa producido por este gen se
agrega espontáneamente formando tetrámeros, que son la forma funcional del represor.

Veamos el funcionamiento del sistema:

• Mientras en el medio no exista lactosa, el tetrámero del represor presenta una alta
afinidad de unión hacia las secuencias del operador, y así impide que la ARN
polimerasa reconozca y se una al promotor; por lo tanto, no existe apenas
transcripción del operón de la lactosa. La actividad de unión al operador reside en el
extremo N-terminal, que presenta un diseño característica en hélice-bucle-hélice. El
operador al que se une presenta una secuencia palindrómica imperfecta.
• Si en el medio existe lactosa (u otro azúcar de tipo ß-galactósido) como única fuente
de C, dicho azúcar actúa como inductor del operón: se une a una zona de las
subunidades del tetrámero del represor (codificado por lacI), con lo que se produce
un cambio conformacional alostérico del represor; con ello disminuye la afinidad
del tetrámero hacia la secuencia del operador, por lo que ahora la ARN polimerasa
puede iniciar la transcripción. El represor inactivo "emigra" a zonas inespecíficas y
aleatorias del ADN, distintas del operador.

Algunas ideas adicionales

• En realidad el inductor natural no es exactamente la lactosa, sino el isómero

alolactosa, que se origina nada más entrar aquella a la célula.
• En el laboratorio se suelen denominar los llamados inductores gratuitos: se trata de
moléculas artificiales (aunque β -galactósidos) que si bien pueden interaccionar
con el represor, no pueden ser metabolizadas (a diferencia de la lactosa). Un
ejemplo es el llamado IPTG (isopropil-β -D-tiogalactósido).
• Se ha visto que el operón lac tiene de hecho tres secuencias de tipo operador. La
denominada O1 es la "clásica", parcialmente superpuesta con el promotor, pero
también hay que contar con la O2, centrada hacia la coordenada +440 del ARNm, y
la O3, bastante aguas arriba respecto del promotor (centrada hacia -82). Se ha
propuesto que los tetrámeros del represor reconocen simultáneamente dos de estas
 secuencias, obligando al ADN a curvarse de modo pronunciado, evitando así que
pueda actuar la ARN-polimerasa.
• En Ingeniería genética se suele usar a menudo componente del operón lac. Por
ejemplo, se puede recurrir al promotor lac (bien sea en su versión silvestre o en
algún mutante) para lograr la expresión de ciertos genes. Uno de los usos más
extendidos es el del gen lacZ, determinante de la β -galactosidasa. Cuando las
células de Escherichia coli silvestres respecto de lacZ crecen en presencia del X-gal
(un galactósido artificial), las colonias tiene un aspecto azul, debido a que la β
-galactosidasa transforma dicho X-gal en una sustancia de color azul. Pero si el gen
lacZ está inactivado (p. ej., porque tenga una delección o una inserción), las
colonias son de color blanco.

Este tipo de dispositivo regulador es propio de rutas catabólicas, donde el principio de

economía debe garantizar que las enzimas de la ruta sólo se induzcan en presencia del
sustrato adecuado.

Como ya apuntamos más arriba, varios operones distintos pueden estar sometidos al mismo
tipo de regulación por un determinado estímulo ambiental, constituyendo una unidad de
regulación denominada regulón. Por lo tanto un mismo tipo de proteínas represoras (y en
general, un mismo tipo de proteínas reguladoras) pueden interactuar sobre operadores
correspondientes a diferentes operones, situados en lugares muy distintos del cromosoma.
Cada tipo de molécula reguladura (ya sea represor o -en el caso de la regulación positiva-
ya sea activador) reconoce un tipo de secuencia característica en el ADN, situada por lo
general cerca del promotor. Los operadores pueden estar situados de forma distinta en
relación con los correspondientes promotores sobre los que influyen:

• en posición 3' respecto del promotor;

• en posición 5' respecto del promotor;
• superpuestos parcialmente con el promotor;
• incluso algunos forman parte de la región inicial de ADN que se llega a transcribir.

Algunos operones, como el gal de Escherichia coli poseen dos promotores, dos operadores,
y están sometidos a dos proteínas represoras diferentes

2.1.2.2. EJEMPLO DE CONTROL NEGATIVO Y REPRIMIBLE: el caso del operón

trp de E. coli

La regulación negativa y reprimible es muy apropiada y económica para "desconectar" la

transcripción de los genes de rutas biosintéticas de intermediarios metabólicos (como
aminoácidos, bases nitrogenadas y vitaminas) cuando los productos finales de estas rutas
están disponibles a la bacteria a partir del medio de crecimiento. En estos sistemas, a
diferencia de la regulación de operones catabólicos, la proteína reguladora es inactiva en sí
misma, por lo que recibe el nombre de aporrepresor. El efector que desencadena la
represión se denomina correpresor, y suele ser la sustancia del medio equivalente al
producto final de la ruta biosintética. La unión del correpresor con el aporrepresor genera
un complejo denominado represor activo.
El operón trp ded Escherichia coli está compuesto por:

• Cinco genes estructurales en la secuencia trpEDCBA. Codifican cinco polipéptidos que a su vez
constituyen tres enzimas implicadas en el paso de corísmico a triptófano.
• Promotor
• Operador (superpuesto al promotor).

A la zona del operador se pueden unir dímeros del elemento regulatorio en trans: un represor codificado
por el gen trpR (que está lejos del operón estructural).

Entre el promotor y el inicio del primer gen estructural existe una zona regulatoria compleja (líder más
atenuador) que interviene en un tipo de regulación distinta que estudiaremos más adelante. Como ya
dijimos, son muy frecuentes los sistemas genéticos sometidos a varios niveles de regulación. La
biosíntesis del triptófano posee tres niveles distintos:

• inhibición metabólica feed-back (alostérica) de los enzimas por parte del producto final de la ruta (el
triptófano);
• el triptófano procedente del medio actúa como correpresor que activa al apo-represor, originalmente
inactivo, producido por el gen regulador (trpR);
• atenuación (que veremos más adelante), consistente en la terminación prematura de la transcripción
a nivel de la secuencia líder del ARNm.

Así pues, en esta apartado consideraremos sólo el funcionamiento del sistema trp en cuanto al
mecanismo de represión-desrepresión:

• En un medio pobre en aminoácido triptófano: el gen trpR se expresa: se sintetiza el aporrepresor

inactivo, por lo que la ARN polimerasa puede transcribir el operón de genes estructurales (trpEDCBA).
Hay síntesis de las enzimas del operón a sus niveles desreprimidos.
• En un medio rico en triptófano: el gen trpR se expresa igualmente: se sintetiza aporrepresor inactivo,
pero al unirse a dos moléculas de triptófano que la bacteria ha captado del medio se produce un cambio
de conformación que genera el represor activo (aporrepresor + correpresor): ahora reconoce y se une a la
secuencia del "operador" (que está solapado con el promotor). Así se impide la transcripción del operón,
aunque no totalmente. Esto da lugar al nivel de expresión basal o reprimido (que en el caso de este
operón representa 1/60 del nivel desreprimido).

Además, en medio rico en triptófano, el gen regulador trpR se ve reprimido por su propio producto
(aporrepresor + triptófano). Estamos ante un ejemplo de regulación autógena: el nivel de represor está
autocontrolado:

• Si existe demasiado represor, se impide la síntesis de más represor;

• Si existe poco represor se posibilita la transcripción del gen trpR.

2.1.2.3. CONTROLES POSITIVOS

Algunos operones bacterianos poseen promotores tales que no pueden ser usados eficientemente por la
ARN polimerasa de forma directa para el inicio de la transcripción, sino que además, requieren
proteínas auxiliares activadoras. Es decir, la transcripción de estos operones no ocurre (o en todo caso
ocurre a un nivel basal bajo), a no ser que la proteína activadora se una a zonas del ADN cercanas al
promotor (normalmente al lado 5' respecto del promotor). Este tipo de promotores carecen de las
secuencias típicas -35 y -10 a las que ya hemos aludido anteriormente

Como ejemplo de regulación positiva del inicio de transcripción estudiaremos la que existe en el operón
lac de E. coli:

Para comenzar, recordemos el comportamiento de una población de esta bacteria cuando en su medio de
cultivo existen dos fuentes de carbono: glucosa y lactosa. Como ya sabemos, se da un crecimiento en
dos fases llamado crecimiento diáuxico: durante una primera fase, las bacterias aprovechan solamente la
fuente más rica de carbono (la glucosa), creciendo de modo exponencial durante unas cuantas
generaciones, hasta que agotan esta glucosa. A continuación se entra en una corta fase de tipo
estacionario, que conduce a una nueva fase de crecimiento exponencial (aunque con un coeficiente µ
menor que el de la fase exponencial anterior) debido a que en ésta las bacterias han pasado a metabolizar
la lactosa. Mientras exista glucosa en el medio de cultivo, no se degrada la lactosa, debido al fenómeno
conocido como "represión catabólica": el catabolismo de la glucosa "impide" de alguna manera que se
expresen los genes del operón de la lactosa. Pero una vez que la glucosa se agota, el operón lac se activa
y se expresa: se sintetizan las enzimas que permiten metabolizar la lactosa. La fase estacionaria
representa el tiempo que tardan las bacterias en "conectar" y expresar los genes del catabolismo de la
lactosa.

El nombre de "represión catabólica" se puso en un momento en el que se desconocía la base molecular

de su funcionamiento. A pesar de que sigamos usando este nombre por motivos históricos, hoy sabemos
que este fenómeno es la manifestación de un proceso de regulación genética positiva. A continuación
pasamos a describirlo a nivel molecular (consultar esquema): En breves palabras, lo que ocurre es que
en presencia de una fuente rica de carbono (como es la glucosa) el mecanismo de regulación positiva del
operón lac se inactiva. Por contra, en ausencia de glucosa y en presencia de la lactosa, este mecanismo
es funcional, lo que permite la estimulación del inicio de la transcripción del operón.

Elementos del circuito regulatorio:

• gen crp: codifica la proteína regulatoria: sintetiza un polipéptido que forma

espontáneamente dímeros, constituyendo la denominada proteína relacionada con la represión catabólica
(CRP), también conocida como proteína que une AMPc (CAP). Tal como es sintetizada por el gen crp,
la proteína CAP es inactiva (apoinductor inactivo). Pero cuando la bacteria posee niveles adecuados de
AMPc (que actúa como inductor), éste se une a la CAP, lo que conduce a que el dímero cambie de
conformación: en esta nueva configuración el complejo CAP-AMPc reconoce una secuencia
palindrómica cercana al promotor del operón lac (hacia su lado 5'), y actúa como activador del inicio de
transcripción de este operón.
• gen cya: codifica la adenilato-ciclasa, enzima que convierte el ATP en AMPc.
• operón lac: a la descripción que ya dimos, solamente añadir que a la izquierda (o sea, al
lado 5'o "aguas arriba") del promotor existe una secuencia palindrómica característica, que como
acabamos de ver es el lugar de reconocimiento del complejo activador CAP-AMPc.

Veamos, pues, el funcionamiento del circuito regulatorio:

Ante todo, hay que tener presente que el nivel intracelular de AMPc está en relación inversa con la
velocidad de crecimiento de la bacteria. A su vez, la velocidad de crecimiento está en relación directa
con la "riqueza" de la fuente de C.

• En presencia de glucosa (fuente rica de C): como se recordará, en Enterobacterias la

glucosa es transportada por el sistema de fosfotransferasa (sistema PTSGLC, un ejemplo típico de
transporte activo acoplado a translocación de grupos). Como es sabido, en este sistema hay dos enzimas
específicas del azúcar a nivel de membrana, que reciben secuencialmente el fosfato (P), que a su vez
será transferido a la glucosa, que de esta forma entra al citoplasma. Mientras exista glucosa, el sistema
PTSGLC estará funcionando, de modo que apenas habrá nivel de E-IIAGLC fosforilada, porque
rápidamente el fosfato es transferido a la glucosa en su tránsito por la membrana (bajo E-II GLC~P). Ello
supone una señal que inhibe a la enzima adenilato-ciclasa. Esto supone que en presencia de glucosa, los
niveles de AMPc son bajos. Por lo tanto, el apoinductor CAP, aunque se está sintetizando, permanece
inactivo, ya que al no haber apenas AMPc no puede cambiar de conformación. Esta es la base molecular
del fenómeno de "represión catabólica": obsérvese que en realidad no es una auténtica represión, sino
que se trata de la no activación de la proteína activadora, debida en última instancia al catabolismo de la
glucosa. Además, la presencia de E-IIA sin fosforilar inhibe directamente a la β -galactósido permeasa
que pueda haber en la membrana, por lo que tampoco la lactosa externa puede entrar a la célula.
• En ausencia de glucosa: el sistema PTSGLC no está transportando glucosa, por lo que ahora
sí hay altos niveles de E-IIAGLC (y bajos de la versión fosforilada). El sistema ahora no envía la señal
inhibidora de la actividad adenil-ciclasa : se sintetizan niveles elevados de AMPc. Ëste se une a los
dímeros de CAP (=CRP); el concomitante cambio de conformación permite al complejo CAP-AMPc
reconocer su secuencia-diana palindrómica cerca del promotor de lac. En esta interacción con su
secuencia-diana, la CAP obliga al ADN a curvarse unos 90o Ahora la CAP interacciona con las
subunidades α de la ARN polimerasa, de modo que ahora sí puede efectuar el inicio de la transcripción
con gran eficiencia. Así pues, hemos completado el estudio de la regulación del operón lac. En
resumidas cuentas, cabe resaltar que se trata de un operón sometido a dos tipos de controles del inicio de
la transcripción:

• regulación negativa, con inducción en presencia de lactosa

• regulación positiva, por activación

Por lo tanto, el operón lac, para que pueda transcribirse a pleno rendimiento requiere que se cumplan
dos condiciones simultáneamente:

1. No debe haber en el medio una fuente más rica de azúcar, como la glucosa (que libera la
"represión catabólica" por el mecanismo de regulación positiva a través de CAP)
2. Debe existir el inductor exógeno (la lactosa), que inactiva el mecanismo de regulación
negativa.

En Enterobacterias, lo que acabamos de describir para el operón lac lo podemos hacer extensivo a otros
operones correspondientes al catabolismo de otras fuentes de C más pobres que la glucosa. Es decir,
mientras exista glucosa en el ambiente de la bacteria, ésta será usada en primer lugar, de modo que
mientras se metaboliza está operando el fenómeno de "represión catabólica". Pero una vez agotada, y
suponiendo que exista una fuente alternativa de C, ésta pasará a ser usada, merced a la activación
genética mediada por el complejo CAP-AMPc.
Ejemplos de otros operones controlados positivamente por CAP-AMPc:

• operón ara (del catabolismo de la arabinosa);

• operón gal (del catabolismo de la galactosa);
• operón mal (del catabolismos de la maltosa).

Este conjunto de operones diferentes que están regulados por la proteína CAP se denomina regulón
CAP.

En otras bacterias el fenómeno de represión catabólica no depende de AMPc-CAP, sino que la

regulación positiva de operones catabólicos de azúcares distintos de la glucosa está mediada por
proteínas activadoras diferentes.

Concluiremos nuestro estudio de los controles genéticos del inicio de la transcripción aludiendo
brevemente a algunas de las variantes que podemos encontrar en los modelos de operones bacterianos:

• operones con más de un promotor o/y operador, cada uno de los cuales funciona en
respuesta a un tipo de estímulo o situación ambiental diferente, mediatizado a su vez por distintos tipos
de proteínas reguladoras.
• operones con promotores internos, situados dentro de la porción transcribible, y que
responden a una regulación diferente del promotor principal (colocado al inicio del operón).
• operones con terminadores de transcripción en las regiones intercistrónicas. Permiten
"dosificar" la proporción relativa de los productos codificados por cada gen del operón, cuando esta
dosis no tiene por qué ser equimolecular.
• pares de operones que se transcriben en sentidos opuestos entre sí, y que usan un mismo
promotor divergente.
• proteínas reguladoras que pueden actuar como activadoras o como represoras, dependiendo
de las condiciones ambientales. Ejemplo: el regulón mal (del catabolismo de la maltosa) consta de
cuatro operones que están controlados por el producto del gen malT. En ausencia de maltosa, el
producto actúa como represor de los operones mal. En presencia de maltosa, la proteína MalT cambia de
conformación y se convierte en activador de la transcripción de esos operones.

No podemos olvidar aquí un tipo de operones transcribibles por holoenzimas de la ARN-polimerasa con
subunidades σ alternativas a la "estándar" σ 70 que requieren para su transcripción eficiente la
colaboración de proteínas activadoras especiales que reconocen secuencias de ADN situadas a bastante
distancia aguas arriba respecto del respectivo promotor. Por ejemplo, en muchas bacterias Gram-
negativas hay operones con un tipo de promotor especial (cuyas secuencias conservadas, centradas em
-24 y -12 son diferentes a las citadas hasta ahora) reconocido sólo por la versión de la ARN-polimerasa
provista de la subunidad σ 54. Pues bien, para la transcripción de este tipo de operones (llamados ntr) se
requiere la concurrencia de la proteína reguladora NtrC fosforilada, que reconoce una secuencia
palindrómica a unas 100 pb aguas arriba del promotor. Al parecer, la unión de oligómeros de NtrC~P a
sus secuencias de reconociemiento hace que el ADN se curve, de modo que esas NtrC~P hacen contacto
con la ARN-polimerasa, y tras gastar ATP ayudan en el inicio de la transcripción.
2.2. REGULACIÓN POR ATENUACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN.

La atenuación es un mecanismo de control que se da en ciertos operones de rutas biosintéticas (sobre

todo de aminoácidos), por el cual una onda de transcripción recién iniciada puede terminar
prematuramente en una zona denominada atenuador, antes de alcanzar al primer gen estructural de ese
operón.

A nivel de ADN, el atenuador está situado entre el promotor y el inicio del primer gen estructural,
dentro de la porción que a nivel de ARN representa al "líder".

La atenuación se produce por un control ejercido por la traducción, que a su vez responde al nivel
intracelular del ARNt cargado con el aminoácido de la ruta biosintética en cuestión:

• si existe suficiente nivel de ese aa-ARNt, habrá atenuación de la transcripción;

• si no existe suficiente de ese aa-ARNt, no habrá atenuación, y por lo tanto la transcripción
continuará hasta el final.

La presencia o ausencia del aa-ARNt concreto determina si el ribosoma puede traducir, o no, una zona
temprana del ARNm (dentro de la porción del líder): si el ribosoma puede traducir esa zona (porque
existe nivel de ese aa-ARNt), el avance del ribosoma detrás de la ARN polimerasa impide ciertos
emparejamientos intracatenarios dentro del ARNm naciente, pero permite otros emparejamientos
alternativos de modo que se forma una estructura secundaria de tipo terminador simple (independiente
de ρ ). Por lo tanto la ARN- polimerasa se atranca en esta horquilla y finalmente se separa,
deteniéndose así la transcripción antes de que la onda de transcripción haya alcanzado al primer gen
estructural.

Mecanismo molecular de la atenuación: lo estudiaremos con el caso del operón de la biosíntesis del
triptófano (trp), el primero en investigarse (por Yanofsky).

Primeras evidencias sobre el mecanismo de la atenuación del operón trp:

• Ya hemos visto que el operón trp está sometido a una regulación negativa por represión.
Pero se comprobó que esta no debía ser la única manera de regulación, ya que las mutaciones
inactivadoras del gen trpR (del represor) aún dejaban un cierto nivel de espresión del operón estructural
en ausencia de triptófano).
• Por otro lado se comprobó que las mutaciones en el gen del ARNtTrp y en el de la Trp-
ARNt-sintetasa, así como en los genes cuyos productos intervienen en la modificación del ARNtTrp
incrementan la expresión del operón trp. Se podía colegir que el operón trp tiene otra regulación
dependiente de la detección de los niveles de Trp unido al correspondiente ARNTrp.
• Dicha nueva regulación no se ejerce sobre las clásicas zonas reguladoras del operón
(promotor, operador), sino sobre una secuencia de ADN (a la que se llamó atenuador) situada entre el
final del promotor y el inicio del primer gen estructural del operón trp. Ello se dedujo porque la
delección de dicha zona suprimía en cis este nivel de regulación dependiente del ARNtTrp.
• Los dobles mutantes inactivados para el gen trpR y para el atenuador sí mostraban ya
expresión constitutiva del operón trp en presencia de triptófano en el medio.
Descripción del operón trp (consultar figura):observar la zona del promotor-operador (sobre la que ya
vimos en un apartado anterior que se ejerce un mecanismo de control negativo por represión); observar
la secuencia líder, al comienzo del ARNm, antes de la porción codificadora del primer gen (trpE). Este
líder consta de 162 bases, y en su interior alberga una corta región con capacidad potencial de ser
traducida por ribosomas: nótese que el péptido que se sintetizaría a partir de esta porción es rico en trp,
es decir, tiene una alta proporción del mismo aminoácido objeto de la síntesis dependiente del operón
trp.

Como ya dijimos antes, la clave de la regulación estriba precisamente en el líder (incluyendo la porción
del péptido rico en triptófano). La porción de ARNm correspondiente al péptido del lider forma parte de
una zona que puede adoptar estructuras secundarias distintas y alternativas, debido a la posibilidad de
establecer emparejamientos intracatenarios:

• bien se emparejan la zona 1:2 y la 3:4;

• o bien se empareja la 2:3, quedando la 1 y la 4 sin emparejar.

Pues bien, la estructura en horquilla formada por el emparejamiento de 3:4 constituye un típico
terminador de la transcripción independiente de ρ .

Pasemos, pues, al funcionamiento del mecanismo de atenuación:

• Si existe suficiente triptófano en el medio: la bacteria capta triptófano, y sintetiza el

triptofanil-ARNt (ARNttrp); habrá "pool" suficiente de este ARNttrp como para poder ser usado
normalmente en la síntesis de proteínas. La ARN polimerasa va transcribiendo el operón trp, y detrás de
ella los ribosomas comienzan a cubrir la zona del péptido dentro de líder del ARNm. Tras traducir la
porción 1 del líder, el ribosoma cubre enseguida y traduce la porción 2. Mientras tanto, la ARN-
polimerasa acaba de transcribir las porciones 3 y 4. La porción 3 se empareja espontáneamente con la 4.
(Obsérvese que a la porción 3 no le queda más remedio, ya que la porción 2, con la que teóricamente
también puede emparejarse no está disponible, ya que está "oculta" -cubierta- por el ribosoma).
Consecuencia: al formarse la horquilla 3:4, seguida por la ristra de uracilos (U), se constituye un típico
terminador de transcripción independiente de ρ : se termina prematuramente la transcripción (antes de
que la onda de transcripción haya alcanzado al primer gen estructural, trpE): este es precisamente el
fenómeno de atenuación.

NOTA: recuérdese que, aparte de la atenuación, el operón trp está sometido a control por represión.
Estas dos regulaciones pueden superponerse, y cada una supone una disminución del nivel basal de
transcripción de ese operón en ausencia de control:

o la atenuación hace bajar 10 veces el nivel basal;

o la represión hace bajar 60 veces el nivel basal;

o las dos juntas, obviamente, suponen una reducción de 600 veces sobre el nivel
basal.
• Si el triptófano es limitante en el medio: la bacteria dispondrá de pocos ARNt cargados on
el aminoácido triptófano (o sea, el "pool" intracelular de ARNttrp estará a bajos niveles). El ribosoma, al
llegar a los codones de triptófano dentro de la porción codificadora del líder, se quedará "atrancado",
debido a que no encuentra el ARNttrp que introduzca el triptófano frente a dos codones seguidos para ese
aminoácido. El ribosoma se queda, pues, detenido en la porción 1. Mientras tanto, la ARN polimerasa
"le va sacando ventaja" al ribosoma, de modo que transcribe la porción 2, luego la porción 3... pero
antes de terminar con la porción 4, la 2 y la 3 se emparejan entre sí (de modo que es ahora la 4 la que se
queda sin emparejarse). Esto implica que ya no se puede formar la estructura secundaria 3:4 seguida de
varios U: por lo tanto, no hay terminación de la transcripción, sino que ésta continúa y abarca a todo el
operón trp, y finalmente se sintetizan las enzimas biosintéticas que conducirán a la síntesis del
aminoácido triptófano.

Otros casos de atenuación:

La atenuación es un sistema de control genético de una amplia variedad de operones biosintéticos,

especialmente de aminoácidos. Otros ejemplos descubiertos después del sistema trp:

• operón his: síntesis de histidina;

• operón phe: síntesis de fenilalanina;
• operón leu: síntesis de leucina;
• operón thr: síntesis de treonina;
• operón ilv: síntesis de isoleucina y de valina.

Algunos de estos operones (como el his) sólo poseen atenuación como mecanismo de control, mientras
que otros gozan, además de regulación por represión.

Los ARNm de cada uno de estos operones posee en su inicio una porción líder más o menos larga, pero
con las características que ya hemos visto:

• contiene un marco de lectura abierta (ORF=open reading frame) con capacidad potencial
de codificar un péptido rico en el aminoácido que la ruta correspondiente debe sintetizar. Por ejemplo:
La ORF del líder del operón his codifica un péptido de 17 aa., de los cuales 7 son histidina. La ORF del
líder del operón leu codifica un péptido de 28 aa., de los cuales 4 son leucinas.
• el líder del ARNm puede formar estructuras secundarias alternativas, incluyendo un
atenuador (es decir, una estructura en horquilla seguida de ristra de uracilos, que actúa como un
poderoso terminador prematuro de la transcripción).

En resumen: La atenuación es un mecanismo que permite detectar los bajos niveles intracelulares del
aminoácido en cuestión (bajo la forma de aminoacil-ARNt), los cuales dependen a su vez de bajos
niveles del aminoácido en el medio, de modo que la bacteria responde a las necesidades inmediatas de
ese aminoácido (que se requiere para la síntesis proteica). El mecanismo estriba en la capacidad o
incapacidad del ribosoma para atravesar la región líder, lo que a su vez determina la formación de
estructuras secundarias alternativas en el líder. Como se puede constatar, la atenuación es un mecanismo
que depende totalmente del estrecho acoplamiento que existe en bacterias entre transcripción y
traducción.

2.3. PROCESAMIENTO DE ARN EN BACTERIAS

Como ya sabemos, en eubacterias, a diferencia de eucariotas, no existen mecanismos de regulación

genética por procesamiento (maduración) de ARN primarios. La única excepción la constituye el hecho
de que los ARN ribosómicos y ARN transferentes se sintetizan a partir de ARN precursores que son
madurados de forma específica hasta dar las moléculas funcionales respectivas. Pero aquí no estamos
propiamente ante un sistema de control genético para adaptación al medio, sino que se trata de un
mecanismo constitutivo.

3. REGULACIÓN GENÉTICA A NIVEL DE TRADUCCIÓN

Un primer caso de regulación traduccional lo constituye el simple hecho de que distintos ARNm
(correspondientes a operones diferentes) presentan diferentes eficiencias a la hora de su unión a los
ribosomas. Ello condiciona que el conjunto de los mensajeros de una misma bacteria exhiba amplios
rangos de tasas de traducción (con diferencias de hasta 3 órdenes de magnitud -unas miles de veces-
entre unos y otros).

Pero aparte de ese mecanismo general e inespecífico, existen dos sistemas "refinados" para regular la
expresión a nivel de la traducción:

1. por proteínas que "ocultan" el sitio de unión inicial del ARNm al ribosoma (o sea,
enmascarando la región de inicio de la traducción, que incluye la secuencia de Shine-Dalgarno);
2. por un ARN regulador antiparalelo que forma un híbrido de ARN de cadena doble con la
porción 5' del mensajero, con lo cual igualmente deja inservible la secuencia de Shine-Dalgarno.

Veamos un ejemplo de cada uno de estos mecanismos:

3.1. REGULACIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS RIBOSÓMICAS

Los ribosomas bacterianos son estructuras supramoleculares complejas formadas por dos subunidades
(30S y 50S), a base del ensamblaje de proteinas ribosómicas (proteínas S de la subunidad pequeña y
proteínas L de la subunidad grande) y ARN ribosómicos. La cantidad de ribosomas de una célula
depende de la tasa de crecimiento: en un medio pobre o con limitación de algún nutriente la cantidad es
menor (p. ej., 20.000) que en un medio rico (p. ej., 70.000). Aunque las proteínas ribosómicas y los
ARNr se sintetizan independientemente, la regulación de la síntesis de las proteínas ribosómicas está
acoplada al nivel de ARNr libres, por un mecanismo en el que si el nivel de los ARNr libres es bajo
(porque casi todos esos ARNr ya se han unido a las correspondientes proteínas ribosómicas) alguna de
las proteínas ribosómicas "en exceso" se une a su propio ARNm, impidiendo la ulterior traducción de
éste. Los genes de:
• las distintas proteínas ribosómicas (proteínas S y proteínas L);
• los factores de elongación (EFTu, EFG);
• las subunidades de la ARN polimerasa (ß, ß', etc)

se disponen formando varios operones (dispersos en distintos loci del cromosoma bacteriano). Todos
estos operones de genes codificadores de productos implicadas en la biosíntesis de proteínas están
sujetos a una regulación autogénica a nivel de traducción.

La base de esta regulación consiste en lo siguiente:

• en cada uno de estos operones una de las proteínas codificadas (que es siempre una
proteína ribosómica) actúa a su vez como inhibidora de la traducción de (al menos una parte) del ARNm
del operón que la codifica (regulación autogénica).
• En cada caso esta proteína, en su papel de proteína ribosómica, se une directamente, y con
gran afinidad, a un ARNr específico, reconociendo una estructura secundaria concreta de éste. (Esto
forma parte del proceso normal de ensamblaje de los ribosomas a partir de los distintos tipos de ARNr y
de proteínas ribosómicas).
• Ahora bien, si la bacteria se encuentra en una situación en la que ya no existe ARNr libre
como tal, sino que todo el ARNr está ya participando de ribosomas ensamblados, la proteína
ribosómica-reguladora se une ahora a una región del ARNm propio (que la codifica a ella y a otras
proteínas ribosómicas). ¿Por qué se une y cuál es el efecto?

La proteína ribosómica-reguladora, al no encontrar la estructura secundaria del ARNr se une ahora a una
estructura secundaria muy similar en el propio ARNm, ocultando la secuencia de Shine-Dalgarno. Por lo
tanto, no hay traducción del propio tipo de mensajero: el efecto neto es que desciende el nivel de
proteínas ribosómicas en respuesta a una escasez de ARNr.

Significado biológico de esta regulación:

• El uso de proteínas ribosómicas que se unen a ARNm como reguladores negativos

autógenos de la traducción supone un mecanismo que garantiza la estrecha relación molar entre síntesis
de proteínas ribosómicas y ARNr. Esto implica que no exista un exceso de proteínas ribosómicas en
relación con el ARNr, o sea, se logra que se sinteticen la cantidad justa de proteínas ribosómicas que
puedan ensamblarse con los respectivos ARNr.
• De esta manera se consigue que el nivel de proteínas ribosómicas se corresponda
armónicamente con la velocidad de crecimiento de la bacteria, la cual influye sobre el nivel del ARNr.
3.2. REGULACIÓN DE LA TRADUCCIÓN POR MEDIO DE ARN ANTISENTIDO

Todos los sistemas de regulación que hemos estudiado hasta ahora se basan en la existencia de
elementos reguladores en trans (o sea, difusibles y actuantes "a distancia") que son siempre proteínas.
Fue una sorpresa el que a mediados de los años de 1980 se descubrieran sistemas de regulación
dependientes no de proteínas, sino de ARN reguladores en trans. La base es la siguiente: la transcripción
del "gen regulador" genera un ARN no traducible a proteína, cuya secuencia es complementaria de la
región 5' del ARNm del gen a regular: ambos forman un híbrido de ARN de cadena doble (c.d.) por el
que queda enmascarada la secuencia de Shine-Dalgarno del ARNm: el ARNr 16S del ribosoma no
puede reconocer al ARNm y no puede traducirse el mensajero.
4. REGULACIÓN POSTRADUCCIONAL
Todos los mecanismos que acabamos de describir están encaminados a alterar la concentración de
un(os) determinado(s) producto(s) génico(s) ante un cambio ambiental. La combinación de dichos
mecanismos permite que la síntesis de las macromoléculas resulte económica (evitándose su producción
en circunstancias en las que no hace falta o es superflua). Sin embargo, estos mecanismos tienen
limitaciones intrínsecas:

• los mecanismos genéticos no pueden dar un ajuste fino a lo largo de una misma ruta
metabólica.
• las proteínas tienen una vida media relativamente larga. Ello implica que pueden seguir
actuando aun cuando los genes respectivos que las sintetizaron estén "silenciosos". Es decir,
teóricamente, las proteínas podrían seguir actuando incluso en situaciones en las que ya no hacen falta
(o incluso podrían ser contraproducentes), hasta que estas proteínas se diluyeran debido al crecimiento
(multiplicación celular).

Para encarar precisamente estos problemas, la evolución ha desarrollado mecanismos postraduccionales

que permiten los necesarios ajustes finos. Los principales tipos son los siguientes:

• Degradación de proteínas.
• Modificación química de enzimas.
• Regulación feed-back de la actividad enzimática (alosterismo).

El último tipo de regulación entra dentro de la categoría de procesos de tipo metabólico y enzimático
que se estudian ampliamente en la asignatura de Bioquímica, por lo que aquí no insistiremos más en
ellos.

4.1. REGULACIÓN POR DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS

La concentración de cada tipo de proteína depende esencialmente de:

• la tasa de su síntesis por los ribosomas;

• la tasa de su degradación.

Las bacterias, a diferencia de los organismos superiores, tienen una baja tasa de "turnover" (reemplazo)
de proteínas. Es decir, las vidas medias de las proteínas bacterianas son relativamente largas.

Sin embargo, existen circunstancias especiales en las que es esencial "desembarazarse" de ciertas
proteínas de forma rápida y efectiva, para adaptarse a un cambio ambiental. Para estos casos, las
bacterias disponen de mecanismos de degradación rápida de proteínas:

• Durante situaciones de hambre de aminoácidos se pone en marcha un mecanismo de

regulación global llamado respuesta estricta en el que, entre otras cosas, se da una degradación de
proteínas. (Lo estudiaremos más adelante).
• Degradación de proteínas defectuosas (anormales y mutantes). Para ello existen unas
proteasas especiales, de las cuales la más importante es la proteasa Lon, cuya actividad depende de la
hidrólisis de ATP. Esta proteasa Lon reconoce proteínas defectuosas (con desnaturalización parcial), y
las rompe en péptidos cortos, los cuales son luego digeridos por peptidasas, para dar aminoácidos.
• Una situación especial la constituye la esporulación de Bacillus. Como se recordará, la
esporulación requiere la síntesis de nuevas proteínas para la espora, y una serie de grandes cambios para
la célula-madre. Para lograr esto, se inducen una serie de proteasas que degradan una buena parte de las
proteínas de la célula-madre (vegetativa). Los aminoácidos derivados de esta degradación son
reutilizados para la síntesis de nuevas enzimas necesarias para la producción de la endospora.

4.2. MODIFICACIÓN QUÍMICA DE ENZIMAS

En eucariotas es muy frecuente la estrategia de modificar la actividad de enzimas (y en general de

proteínas) por unión covalente de un radical químico. Por ejemplo, muchos procesos están regulados por
proteín-quinasas de distintos tipos, que fosforilan a otras proteínas, lo cual permite la modulación de su
actividad biológica.

Hasta hace pocos años se creía que las bacterias no poseían este tipo de control, pero recientemente
están surgiendo numerosos ejemplos de importantes sistemas de regulación con implicación de actividad
proteín-quinasa. De hecho se ha descubierto que numerosas bacterias poseen juegos de parejas de
proteínas, agrupables en dos tipos de "familias" (conservadas evolutivamente en distintos grupos
bacterianos). Sin embargo, aquí estamos ante un sistema en el que una vez que las proteínas se
fosforilan, se ponen en marcha mecanismos reguladores de otro tipo, por lo que vamos a estudiarlo a
continuación en un epígrafe aparte.

5. SISTEMAS DE REGULACIÓN DE DOS COMPONENTES:

SENSORES Y REGULADORES DE RESPUESTA
Recientemente se ha descubierto que muchas bacterias poseen un tipo de mecanismo para detectar las
variaciones de su medio ambiente y regular concomitantemente la transcripción de ciertos operones.
Esta clase de regulación se basa en pares de proteínas, en los que el primer miembro detecta el cambio
ambiental (sensor), de modo que "transmite" esa información al segundo miembro, que es el responsable
de la regulación dentro de la célula. Los distintos sensores, a pesar de que cada uno detecta un estímulo
diferente, conservan entre sí al menos parte de su secuencia, y lo mismo ocurre con los reguladores de
respuesta, por lo que se habla de dos familias de proteínas (cada una con un probable origen evolutivo
común):

1. Familia de histidín-proteín-quinasas (HPK): Este tipo de proteínas son las sensoras de

algún tipo de estímulo ambiental. Muchas de ellas son autofosforilables, pero su función esencial es la
de fosforilar (usando el P en situación γ del ATP) al correspondiente 2º miembro de la pareja. Los
distintos sensores suelen tener en común su porción carboxiterminal, denominada dominio transmisor
(que incluye la histidina fosforilable). Los sensores suelen ser proteínas integrales de membrana
citoplásmica. Cada sensor tiene un dominio aminoterminal característico, inmerso en el espacio
periplásmico, y de este modo "detectan" algún estímulo procedente del ambiente. Al hacerlo, parece que
cambian de conformación, de modo que el dominio transmisor intracitoplásmico se autofosforila y luego
fosforila al correspondiente regulador de respuesta.
2. Familia de reguladores de respuesta (RR): cada regulador de respuesta, tras ser
fosforilado en cierto aspártico por su correspondiente HPK, ejerce algún efecto regulatorio.
Normalmente, los RR fosforilados actúan como activadores de la transcripción de ciertos operones. Los
distintos reguladores comparten un mismo tipo de dominio aminoterminal, denominado dominio
receptor, que incluye el aspártico que recibe el fosfato del sensor correspondiente. Los reguladores que
actúan como activadores de transcripción suelen incluir un dominio carboxiterminal a base del típico
motivo hélice-giro-hélice, capaz de interactuar con ciertas secuencias de ADN.

6. MECANISMOS REGULATORIOS GLOBALES

Para finalizar este recorrido por los principales tipos de mecanismos de regulación de la expresión
génica en bacterias, vamos a referirnos brevemente a algunos ejemplos de grandes sistemas de operones
que se ven sometidos a una regulación coordinadada común, encaminada a la superviviencia de la
bacteria en determinadas circunstancias ambientales extremas o a realizar grandes ajustes metabólicos
para adaptarse a cambios bruscos en las condiciones nutricionales.

6.1. El regulón de operones SOS:

Como ya vimos en el capítulo de "Influencia de los agentes físicos sobre las bacterias", en determinados
procariotas existe un sistema inducible de reparación a los daños severos al ADN ocasionados por
agentes como la luz UV o las sustancias alquilantes. Los genes SOS se desreprimen según el siguiente
esquema:

Cuando el ADN de la bacteria está seriamente dañado, existen zonas de ADN de cadena sencilla sin
reparar. Esto constituye una señal por la que la proteína RecA (que está en este momento a una
concentración basal relativamente baja) se modifica y se convierte en una proteasa muy específica
(RecA).

La RecA rompe a la proteína LexA, que estaba reprimiendo una serie de operones, incluyendo a recA,
uvrABC, umuDC, etc. Por lo tanto, estos genes se expresan ahora a alto nivel:

• la expresión de uvrABC induce mejora de reparación por escisión resíntesis;

• la expresión de recA mejora reparación por recombinación;
• la expresión de umuDC favorece una síntesis "de emergencia" de ADN, por la que se
introducen frecuentes errores: hay aumento de la mutagénesis;
• se altera la regulación del crecimiento y división celular: las células se hacen filamentosas,
muy largas, con formas anómalas.

Todos estos cambios, a pesar de las alteraciones que provocan en las células, suponen la salvaguardia,
en última instancia de su viabilidad. Cuando las circunstancias agresivas (UV) desaparezcan, el mismo
circuito regulario se encarga de que las células vuelvan rápidamente a su metabolismo normal.
6.2. Respuesta al choque por calor ("heat-shock")

La llamada respuesta al choque por calor es un mecanismo adaptativo compartido por prácticamente
todos los seres vivos, consistente en el aumento rápido de la síntesis de una serie de proteínas
(denonimadas proteínas Hsp) ante la elevación brusca de la temperatura por encima de la óptima, con un
ulterior descenso lento a sus niveles basales. A pesar de que esta respuesta se descubrió precisamente
ante aumentos de temperatura, se sabe ahora que en realidad se induce ante otros tipos de agresiones o
estrés ambientales (como por ejemplo, presencia de etanol u otros solventes orgánicos en el medio, o
daño al ADN). Las proteínas Hsp protegen a las células del daño que les causaría una posterior
elevación adicional de la temperatura. Obviamente, este sistema parece que constituye un mecanismo
adaptativo de protección que, una vez que detecta incrementos anómalos de temperatura, prepara a la
bacteria para soportar períodos relativamente largos a temperaturas por encima de la óptima de
crecimiento.

En Escherichia coli la mayor parte de los 30 genes codificadores de proteínas Hsp forman un regulón, y
los correspondientes operones son transcritos por la versión de la ARN-polimerasa provista de la
subunidad σ 32.

La mayor parte de las proteínas Hsp se expresan a niveles basales durante el crecimiento normal, pero
tras la agresión ambiental, aumentan abruptamente y luego vuelven lentamente al nivel normal (aun
cuando p. ej., la temperatura siga alta). Algunas de las Hsp son proteínas celadoras que intervienen en el
plegamiento adecuado de otras proteínas. Entre estas celadoras se encuentran GroE, DnaK, DnaJ y
GrpE. Otras Hsp son proteasas (como la Lon) que degradan proteínas demasiado anómalas. Estos
papeles de las proteínas Hsp explican por qué la respuesta al choque por calor es transitoria:

• Inmediatamente después de la agresión ambiental, las proteínas, al no tener las

concentraciones de sales y otros componentes adecuados a su estabilidad, tienden a desnaturalizarse. La
respuesta adaptativa viene enseguida, aumentando los niveles de proteínas celadoras (que ayudan a
replegarse a las proteínas defectuosas, parcialmente desnaturalizadas) y de proteasas (que eliminan
proteínas inútiles desnaturalizadas).
• Pero una vez que ha pasado un tiempo, el medio interno de la célula ya se ha adaptado a
las nuevas condiciones, por lo que ya no hace falta un nivel tan alto de Hsp, por lo que la respuesta va
remitiendo.

Los operones del regulón del choque por calor se transcriben a partir de promotores especiales (con su
propia secuencia consenso) cuando son reconocidos por la holoenzima de la ARN-polimerasa con la
subunidad σ 32. Durante el crecimiento en condiciones normales, hay muy pocas moléculas de σ 32 en la
célula, pero cuando sube la temperatura de 30 a 42 ºC, los niveles suben 15 veces, de modo que aumenta
la transcripción de los genes del choque térmico. Al parecer, esos niveles de σ 32 vienen regulados
postraduccionalmente por alguna de las propias chaperonas.

El modelo actual dice lo siguiente:

• en condiciones normales las proteínas celadoras (chaperonas) DnaK, DnaJ y GrpE se unen
a polipéptidos nacientes ayudándoles a plegarse adecuadamente. Una de ellas (probablemente DnaK) se
une también a la poca σ 32, de modo que ésta no sólo no puede ayudar al inicio de transcripción de los
operones Hsp, sino que además queda inestabilizada y es más susceptible de ataque por proteasas.
• Cuando hay un choque por calor, al cambiar bruscamente las condiciones del medio
celular, las proteínas en general tienden a desnaturalizarse, por lo que en un primer momento las
chaperonas se dedican a intentar replegar correctamente el mayor número de proteínas. Esto significa
que ahora la DnaK tiende preferentemente a unirse a proteínas diferentes del factor σ 32. Por lo tanto, la
σ 32 intacta se va acumulando en la célula e incrementa su actividad, y se puede producir el aumento de
expresión de los operones Hsp, incluyendo el mismo dnaK. Esto explica igualmente el fenómeno ya
comentado de que la expresión de las Hsp va volviendo poco a poco a su nivel basal: cuando se ha
acumulado una buena cantidad de DnaK suficiente para ayudar a replegarse a las proteínas celulares, y
cuando ha dado tiempo a que las condiciones internas se ajusten a las condiciones del estrés ambiental,
vuelve a haber DnaK "libre" como para volver a unirse a la σ 32, de modo que lentamente se vuelve al
nivel normal de transcripción de los genes de las proteínas del choque térmico.

6.3. La regulación de la síntesis de ARNr y ARNt

6.3.1. Respuesta estricta

En la naturaleza, las bacterias pasan a menudo períodos de hambre, especialmente por carencia de
aminoácidos, de modo que este suministro de aminoácidos sería insuficiente para mantener la síntesis
proteica. La respuesta estricta es un mecanismo de adaptación rápida de las actividades celulares al
pasar la bacteria bruscamente de un medio rico a otro pobre en aminoácidos, o cuando se agota la fuente
de C. Consiste en un mecanismo de ahorro para aguantar y sobrevivir a "los malos tiempos": la bacteria
ahorra sus recursos y se implica en el menor número de actividades, hasta que no mejoren las
condiciones.

Como veremos, el ajuste se realiza por medio de una rápida respuesta al nivel general de aa-ARNt
(ARN transferentes aminoacilados).

Descripción de la respuesta estricta desde un punto de vista fisiológico:

En esta situación se puede observar una variedad de cambios metabólicos:

1. Reducción masiva en la síntesis de ARN estable (o sea, de ARNr y ARNt); esto hace que
el nivel de ARN total baje a un 5-10% del normal.
2. Al bajar el nivel de ARNr, se produce un descenso en la traducción de los ARNm
correspondientes a las proteínas ribosómicas. Por lo tanto, baja la síntesis de proteínas ribosómicas, y
disminuye la concentración de ribosomas.
3. Se produce un descenso de una 3 veces en la síntesis de ARNm total. Algunos mensajeros
son muy "vulnerables" y prácticamente desaparecen.
4. Aumenta la tasa de degradación de proteínas, por protesas especiales.
5. Se dan grandes ajustes metabólicos: baja la síntesis de hidratos de C, de lípidos, de
nucleótidos y el transporte de nutrientes, pero proporcionalmente aumenta la síntesis de aminoácidos.

Como resumen de todo lo anterior, se puede concluir que esta respuesta va encaminada a: impedir por
un lado acumulación de la maquinaria de traducción (ribosomas, ARNt) que no sería útil en ausencia de
un aporte exógeno de aminoácidos; aumentar la producción de aminoácidos, tanto por degradación de
proteínas como por nueva síntesis.

Pero una vez que la célula produce los suficientes aminoácidos para las nuevas condiciones, finaliza la
respuesta estricta y la célula vuelve a sus patrones habituales de expresión genética, aunque por supuesto
adaptados al nuevo medio (aquí entrarían en operación algunos de los sistemas habituales de regulación
de la transcripción ya estudiados).

Base molecular de la respuesta estricta:

1. Cuando la bacteria queda deprivada en su medio de algún aminoácido (supongamos ahora

que se trata del triptófano) va a haber poco ARNt cargado con ese aminoácido (en el ejemplo, poco
ARNtTrp). Por lo tanto (y recordando algo del mecanismo de síntesis de proteínas), ese ARNt descargado
no podrá unirse al factor de elongación EF-Tu, y no podrá entrar al sitio A del ribosoma.
2. Por consiguiente, cuando el ribosoma llegue a un codón para ese aminoácido (en nuestro
ejemplo del triptófano podría ser el codón UUU), al no encontrar el ARNt cargado correspondiente, el
ribosoma se detendrá.
3. Si la detención del ribosoma se prolonga, un ARNt descargado termina por acceder al sitio
A, aun cuando lo haga en ausencia del factor EF-Tu.
4. Esta entrada "ilegítima" del ARNt descargado estimula la actuación de una proteína
llamada RelA que se asocia al ribosoma. La proteína Rel A cataliza la producción de un extraño
nucleósido de guanosina provisto de 4 fosfatos, a partir del GDP:
5. (5') ppG + ATP --------------------> (5') ppGpp (3') + AMP
6. Por lo tanto, la célula va acumulando ppGpp, que es el que va a regular los operones de los
ARNr y ARNt. El mecanismo exacto de la regulación aún no se conoce en detalle, pero parece que
incluye la acción directa sobre los promotores de esos operones así como sobre la ARN-polimerasa,
bloqueando el inicio de transcripción. Igualmente parece que inhibe la tasa de elongación de otros
operones.

6.3.2. Regulación por la tasa del crecimiento

Como ya dijimos, una bacteria tiene más ribosomas (y ARNt) en un medio rico que en un medio pobre.
No se conoce exactamente cómo se realiza este control de la tasa de crecimiento sobre la síntesis de
ARN estables, pero al parecer, cuando la bacteria pasa a un medio pobre, algunos de los ribosomas "en
paro" (es decir, que no están traduciendo ARNm) inhiben de algún modo la síntesis de ARNr y ARNt, y
por lo tanto la célula tenderá a producir sólo la cantidad de ribosomas que necesita en esas condiciones
nutricionales. Hay indicios de que este efecto se logra de nuevo a través del ppGpp, aunque en este caso
su síntesis no depende del gen relA, sino de otro gen denominado spoT.
VARIACIONES BACTERIANAS ASOCIADAS A CAMBIOS
EN EL GENOTIPO
Los diversos cambios morfológicos, estructurales y funcionales ocurridos a lo largo de la evolución de
los seres vivos tienen como base los cambios en los genotipos, que esencialmente pueden ser de dos
tipos:

• mutaciones. pesar de que el mecanismo de la herencia genética es fiel y tiende a la

conservación, esta fidelidad no es absoluta e inflexible. Las mutaciones son cambios bruscos ocurridos
en el genotipo, y que son transmitidos a las generaciones siguientes.
• recombinaciones subsiguientes a intercambio genético.En la mayoría de los eucariotas,
pueden ocurrir recombinaciones entre genotipos individuales de una misma población. En los
fenómenos de sexualidad se origina una variedad casi infinita de nuevas ordenaciones o genotipos, sin
necesidad del aporte de nuevas mutaciones. Ello suministra una materia prima sobre la que puede actuar
la selección, de modo que las poblaciones pueden ir evolucionando con el paso del tiempo, en función
de presiones ambientales.

¿Qué ocurre en bacterias?

• Los procariotas son organismos con tiempos cortos de generación: se reproducen

rápidamente y pueden dar origen en poco tiempo a grandes poblaciones. Por supuesto, experimentan
fenómenos de mutación, por lo que las poblaciones pueden acumular gran número de mutaciones.
Estudiaremos la mutación (y los modos posibles de su eliminación) en el presente capítulo.
• Pero la mutación no es el único tipo de variación genotípica en bacterias. Aunque los
procariotas carecen de fenómenos de sexualidad auténtica, existen variaciones genéticas asociadas a la
adquisición por una bacteria de parte del material genético de otra bacteria o de un bacteriófago.
Los posibles mecanismos de transferencia de información genética entre bacterias son:
• transformación
• transducción
• conjugación

1.INTRODUCCIÓN A LAS VARIACIONES HEREDITARIAS NO ASOCIADAS A

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO

Definiciones iniciales:

Desde un mero punto de vista fenotípico, mutación es la aparición brusca y espontánea de una
variación fenotípica de un individuo, la cual se transmite hereditariamente a la progenie.Pero tras el
descubrimiento del ADN como material de la herencia, podemos plasmar una definición más ajustada,
desde el punto de vista genotípico:

• Mutación es cualquier alteración de la secuencia de bases de un segmento de ADN

correspondiente a un gen o a un locus (sea éste transcribible o no), aun cuando esta alteración no se
refleje en forma de cambio fenotípico observable o detectable.
• Alelo es cada una de las distintas versiones en que puede presentarse un gen.

alelo silvestre: "forma" (secuencia) de un gen en las bacterias aisladas de su hábitat natural (estirpes
silvestres). En la naturaleza es muy frecuente la existencia de polimorfismo:existen diversos alelos
silvestres diferentes para un mismo locus.

alelos mutantes: las distintas "formas" (secuencias) que resultan de mutaciones del alelo silvestre.

• Mutaciones espontáneas: son resultado de la actividad normal de la célula, o de sus

interacciones con su medio natural. La mayoría aparecen por errores en los procesos de replicación,
reparación o recombinación del ADN. (O sea, para abreviar, serían aquellas mutaciones no provocadas
de forma experimental).

• Mutaciones inducidas: aquellas provocadas por previa alteración experimental del ADN,
bien sea directamente, o indirectamente, por agentes físicos o químicos denominados mutágenos.

2. MUTACIONES ESPONTÁNEAS.

Los principales tipos son:

1. Mutaciones puntuales: sustituciones de pares de bases. Pueden ser:

a. transiciones: suponen cambio de una pareja Pu:Py  Pu:Py;
b. transversiones: cambio de una pareja Pu:Py  Py:Pu.
2. Mutaciones por desplazamiento de la pauta (=fase o marco) de lectura ["frameshift"].
Se deben a:
a. eliminación de uno o un corto número de nucleótidos;
b. incorporación de uno o un corto número de nucleótidos.
3. Grandes delecciones (o borraduras).
4. Inversiones
5. Traslocaciones.
6. Duplicaciones en tándem
7. Mutaciones insercionales ocasionadas por elementos genéticos transponibles.

Los estudiaremos a continuación, insistiendo sobre todo en su base molecular.

2.1 MUTACIONES PUNTUALES

Las transiciones suponen cambios de una pareja purina: pirimida a otra purina:pirimidina:

A:T   G:C

Las transversiones suponen el cambio de un par purina:pirimidina a una pirimida:purina (o viceversa):

A:T   T.A

G:C   C:G
2.1.1 BASE MOLECULAR DE LAS MUTACIONES PUNTUALES

Base molecular de las transiciones

Se deben, en esencia, a la ocurrencia espontánea, durante la replicación, de formas raras tautoméricas de

las bases nitrogenadas. Los desplazamientos tautoméricos del protón cambian las propiedades de
formación de puentes de H, de tal modo que:

Por lo tanto, los emparejamientos propiciados por las formas tautoméricas serían:

A* : C

C* : A

T* : G

G* : T

1. Base molecular de las transversiones

(Modelo de Topal & Fresco:observen en el gráfico los emparejamientos de las formas sin y anti)

El modelo predice que la frecuencia de mutaciones puntuales en un par de bases dependerá de:

• constante de equilibrio (k) de tautomerización del par de bases (unos 10-4 - 10-5);
• frecuencia de dNTPs en forma sin. (G sin aparece con frec. de 10-1, A , con 5·10-2).

De este modo, teóricamente deberían darse las siguientes frecuencias de mutaciones puntuales:

• frec. prevista de transiciones: 10-4 - 10-5

• frec. prevista de transversiones: 10-5 - 10-6 (para la G) y 5·10-6 - 5·10-7 (para la A)

Sin embargo, en la realidad, las frecuencias observadas son mucho más bajas (del orden de 10-10).
Esto implica que debe de existir un sistema que corrija los emparejamientos erróneos: como ya sabemos,
las ADN polimerasas poseen una capacidad correctora de pruebas ("editing"): cada paso de
elongación es seguido inmediatamente por una comprobación del emparejamiento. Si este
emparejamiento es erróneo, la polimerasa usa su actividad exonucleasa 3' 5' para elimininar la base
mal emparejada, y a continuación vuelve a polimerizar en el mismo lugar (por su actividad polimerasa
5' 3').

Ejemplo: Durante la replicación puede ocurrir que la citosina pase a su forma imino, que se empareja
con la adenina:

1. C  Cimino : A (la A es incorporada por la ADN polimerasa)

2. Ahora la Cimino vuelve rápidamente a su forma normal, con lo que queda…
3. C : A (este emparejamiento anómalo es detectado por la polimerasa)
4. La actividad exonucleasa 3' 5' elimina la A recién incorporada
5. Vuelve a intervenir la actividad polimerasa 5' 3', que incorpora G
6. El resultado final es el emparejamiento correcto C  G

De esta forma, la tasa real de transiciones a partir de una C es aproximadamente equivalente al cuadrado
de la correspondiente cte. (k) de tautomerización.

Parece ser que en la naturaleza existe una selección natural que propicia una frecuencia baja, pero no
nula, de errores durante la replicación. El significado biológico es que de esta forma se combina una
alta tasa de fidelidad en la replicación, pero con suficiente flexibilidad (oportunidad de errores) como
para generar innovaciones sobre las que pueda actuar la presión selectiva, lo cual permite evolución.

Puntos calientes de mutación ("hot-spots"): son puntos o zonas dentro del genomio donde se
concentran mutaciones con una frecuencia mayor que la esperada si se distribuyeran al azar.

Ejemplo: véase el histograma de frecuencias que muestra el número de mutaciones puntuales en las
distintas pares de bases del gen lacI. Observar que hay una zona especialmente "caliente" cerca de la
coordenada 200, donde la probabilidad de encontrar mutaciones es muy superior a la del resto de la
secuencia.

Explicación: algunas bases, dentro de un determinado contexto de secuencia, son modificadas

químicamente por acción de alguna enzima (normalmente una metilasa), y ello provoca una mayor
susceptibilidad a la aparición de mutaciones puntuales:

La citosina (C), dentro del contexto de secuencia siguiente:

CCAGG

GGTCC

es metilada por una metilasa específica (que reconoce precisamente a esas dos citosinas dentro de esa
secuencia), para dar 5-metilcitosina. La 5-metil citosina experimenta espontáneamente una
desaminación oxidativa, que la convierte en timina, de manera que se produce finalmente una transición:

C:G  5-metil-C:G  T:G (emparejamiento anómalo) T:A

2.1.2 CONSECUENCIAS POSIBLES DE UNA MUTACIÓN PUNTUAL

Si la mutación afecta a una región en 5' que actúa en cis:

Determinadas mutaciones puntuales en el promotor impiden que la ARN polimerasa se una a esta
secuencia; entonces el promotor queda inactivado y no se produce la expresión de los genes del operón.

En otros casos los efectos son diferentes. Por ejemplo: se recordará que el promotor del operón lac tiene
una secuencia -10 atípica, que obliga a que la expresión a alto nivel requiera el concurso de la proteína
CAP activa. Pues bien, por medio de mutaciones puntuales se puede lograr que esa secuencia atípica
adquiera las características de las secuencias -10 típicas (a base de TATA, o similar). En este caso, el
efecto de estas mutaciones es que el operón lac se vuelve independiente de la proteína CAP para su
expresión eficiente: el operón se hará independiente de la represión catabólica.

En los operones sometidos a control negativo, determinadas mutaciones en el operador provocan una
menor afinidad de la proteína reguladora (del represor). El efecto es el de crear una expresión
constitutiva (es decir, el operón se expresa incluso en presencia del represor activo, debido a que éste
no reconoce al operador mutante).

Si la mutación afecta a una zona codificadora: se produce la alteración de un codón. Las

consecuencias de la alteración pueden ser muy variadas:

1. Si la nueva tripleta (codón) codifica el mismo aa. que la antigua (debido a la sinonimia o
"degeneración" del código genético, que afecta sobre todo a la tercera base del codón) se origina una
mutación neutra, que es "silenciosa" (no hay ningún cambio en el fenotipo).
2. Si la nueva tripleta codifica un aa. diferente del original, tenemos varias posibilidades:
a. mutaciones de sentido erróneo o alterado ("missense"):
i. si el nuevo aa. es de un tipo químico similar al antiguo, puede cumplir
una función semejante en la proteína mutante, por lo que el fenotipo sería también una mutación
silenciosa por sustitución de aa.
ii. En otros casos el nuevo aa. provoca una inestabilidad estructural, que
puede reflejarse en que la proteína sea termosensible o criosensible, o más susceptible a efectores
alostéricos. La proteína termosensible es funcional a temperaturas moderadas, pero se inactiva a
temperaturas relativamente altas, a las cuales la correspondiente proteína silvestre es activa.La
proteína criosensible es funcional a temperaturas moderadas, pero se inactiva a temperaturas
relativamente bajas, a las cuales la proteína silvestre es activa. La proteína más susceptibles a
efectores alostéricos es aquella que se inhibe por efectores de forma más acusada. En esta
categoría entran también las proteínas con actividad residual.
iii. Por otro lado, podemos encontrar proteínas que pierden su actividad
biológica debido a que la sustitución del aa. provoca la alteración de la estructura secundaria y
terciaria de la proteína: por ejemplo, la aparición por mutación de una prolina en mitad de una α
-hélice destruye esta estructura, y puede originar inactivación de la función.
iv. La alteración del centro activo suele provocar inactivación total o
parcial. NOTA: Aquí se plantea la siguiente pregunta: si la mutación inactiva totalmente la
capacidad funcional de la proteína, ¿cómo podemos reconocer que esa proteína alterada está
presente en la célula? La proteína se puede identificar por medio de anticuerpos (Ac) obtenidos
frente a la proteína silvestre. Si ponemos en contacto estos Ac con un extracto de las células
mutantes, se producirá una reacción antígeno-anticuerpo. Las proteínas inactivas caracterizadas de
esta manera se suelen denominar como "CRM" iniciales de "cross-reactive material" (material que
da reacción cruzada respecto de la proteína silvestre).
b. mutaciones "sin sentido" ("nonsense"), o sea, aquellas que cambian un codón
original a una de las tres tripletas que significan "señal de parada" de la traducción:U A G (codón
"ámbar"), U A A (codón "ocre"), U G A (codón "ópalo"). Obviamente, el efecto de estas mutaciones sin
sentido es producir la detención de la lectura del ARNm por parte de los ribosomas. Por lo tanto se
produce una proteína truncada, que suele ser inactiva.
Como ya vimos en el capítulo anterior, si la mutación sin sentido se produce en un gen de un operón
policistrónico, y si esa mutación cae cerca de una zona del ARNm capaz de formar estructuras
secundarias en horquilla, aparte del efecto de mutación sobre el gen afectado, se detectará un fenómeno
de polaridad, debido a que el acoplamiento transcripción-traducción provoca la no transcripción de la
región situada más allá (en sentido 3') de la zona de la horquilla. O sea, no habrá transcripción de los
genes distales del operón.

2.2 MUTACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA FASE

(=DEL MARCO O PAUTA) DE LECTURA
["FRAMESHIFTS"]
Se pueden originar por pérdida o ganancia de un pequeño nº de nucleótidos (que no sea 3 o múltiplo de
3)

Base molecular: Suelen ocurrir en zonas del ADN con secuencias repetitivas. En este tipo de
secuencias, durante la replicación o la recombinación, se pueden producir malos alineamientos por
desplazamiento de una o varias copias de la secuencia repetitiva.

Ejemplo:

GTCCGTCCGTCCGTCC

CAGGCAGGCAGGCACC

Se produce un cambio total en el sentido del mensaje genético, a partir del sitio de la mutación se
sintetiza una proteína inactiva, a menudo truncada (debido a que al cambiar la pauta de lectura, pueden
aparecer tripletas sin sentido).

Si la pérdida es de 3 nucleótidos (o múltiplo de 3), y la pequeña delección no afecta a una zona

importante de la proteína, se puede producir un producto que aún tenga actividad biológica.

2.3 GRANDES DELECCIONES (O BORRADURAS):

Suponen la eliminación de cientos e incluso miles de nucleótidos.

Base molecular: Formación de grandes bucles intracatenarios, con posterior escisión de dichos
bucles. Normalmente en los extremos del material que se va a delecionar existen secuencias de ADN
que son repeticiones directas una de otra, lo que facilita algún fenómeno de recombinación que lleva a la
eliminación del material (bucle) intercalado entre esas secuencias.

Consecuencias: Mutación irreversible e inactivadora total de uno o varios genes.

2.4 INVERSIONES:
 Cambio de orientación de un segmento de ADN. En muchos casos se deben a
emparejamiento y ulterir recombinación entre secuencias inversamente repetidas en
los extremos del material que sufre la inversión.

Consecuencias: En muchos casos no hay consecuencias fenotípicas, ya que

simplemente se ha invertido el orden de los genes del segmento invertido en
relación al resto del genoma. A diferencia de las deleciones, las inversiones suelen
revertir, precisamente por un nuevo proceso de recombinación entre las secuencias
inversamente repetidas.

2.5 TRANSLOCACIONES:

Traslado de un segmento a otro lugar del genomio.

2.6 DUPLICACIONES EN TÁNDEM

Se trata de la aparición de una copia de una zona de ADN a continuación de la

localización del original. Suelen deberse al emparejamiento y recombinación entre
secuencias similares en dos moléculas de ADN (en realidad, en este evento, de las
dos moléculas de ADN, una se queda con una duplicación mientras que la otra se
queda con una delección).

Si el segmento duplicado es grande y lleva varios genes, no suele conducir a

inactivación génica (ya que aunque en la juntura de la duplicación puede haber una
mezcla de dos genes truncados, sigue habiendo copias silvestres de dichos genes en
el mutante).

Una de las propiedades más características de las duplicaciones en tándem es su

inestabilidad, ya que revierten con gran frecuencia por nueva recombinación dentro
del segmento duplicado.

A pesar de esto, las duplicaciones parecen haber jugado un papel importante en la

evolución. Tras una duplicación que se haya estabilizado, hay dos copias de uno o
varios genes, de modo que una de las copias de cada pareja puede lentamente ir
evolucionando e incluso adquirir una nueva función.

2.7 MUTACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS GENÉTICOS

TRANSPONIBLES

La inserción de una secuencia de inserción (IS) o de un transposón (Tn) en de un

gen origina la inactivación insercional, debida a:
 o desplazamientos de la pauta de lectura, que como antes indicamos, generan
frecuentes señales de fin de traducción;
o terminación de transcripción dependiente de Rho, con efectos polares
(debido a que las IS llevan frecuentes señales de terminación compleja de la
transcripción, dependiente de ρ ).

Una vez que ha ocurrido una inserción de una IS o de un Tn, pueden producirse
ulteriores delecciones secundarias de todo o de parte del elemento transponible, y a
veces también delecciones del material genético adyacente (fenómenos de escisión
imprecisa del IS o Tn).

Por otro lado, dadas dos secuencias IS del mismo tipo, situadas a cierta distancia
una de la otra, por fenómenos de recombinación propiciados por dichas IS se
pueden producir:

o inversiones del material intercalado entre ambias copias del IS;

o translocaciones del material intercalado entre esas secuencias de inserción.

3. CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES

Para caracterizar genéticamente una mutación (es decir, para conocer qué tipo de
mutación es) se recurre normalmente a pruebas de reversión de cada mutante.

o Las mutaciones puntuales pueden revertir o ser suprimidas por una 2ª

mutación (ver más adelante, en este mismo capítulo).
o Igual ocurre con algunas mutaciones de desfase de la pauta de lectura.
o Las inserciones sólo pueden revertir por una delección exacta del material
insertado.
o Las delecciones no pueden revertir.
o Por otro lado, las mutaciones generadas por elementos genéticos
transponibles no aumentan su frecuencia por tratamiento con agentes
mutagénicos, mientras que el resto sí lo hacen.

4. DEMOSTRACIÓN DE LA ESPONTANEIDAD DE LAS MUTACIONES

BACTERIANAS

Uno de los rasgos característicos de las mutaciones es su espontaneidad: surgen al azar,

independientemente de las condiciones ambientales. El efecto del medio ambiente es
seleccionar o no las mutaciones (es decir, favorecer o no el crecimiento diferencial del
fenotipo mutante). De todas formas, más adelante veremos que el medio ambiente puede
alterar la tasa global de aparación de mutaciones.

Durante mucho tiempo se estuvo discutiendo la posibilidad de que las bacterias tuvieran
algún tipo de herencia lamarckiana de caracteres adquiridos (de hecho, hasta mediados del
siglo XX muchos científicos pensaban que las bacterias seguían un tipo de herencia distinta
a la de los organismos superiores, en la que las adaptaciones a cambios del medio se podían
transmitir a la descendencia, al modo lamarckiano). Esta visión "antropomórfica" de un
proceso de evolución "guiada" llevó a proponer que, por ejemplo, al poner un antibiótico
(Ab) en un medio de cultivo, era el antibiótico el que "inducía" la aparición de mutaciones.
Aparentemente, la observación apoyaba esta postura: si se colocaba un cultivo bacteriano
sensible al antibiótico en presencia de ese antibiótico, al cabo de cierto tiempo, todas las
células del cultivo son resistentes al antibiótico.

Todos estaban de acuerdo en que la mayoría de la población bacteriana inicial moría al

exponerse al agente selectivo (el antibiótico en este ejemplo, o un fago en otros
experimentos), y que el cultivo resistente final procedía del crecimiento de una pequeña
proporción de células resistentes al agente. La disputa estribaba precisamente en cómo
interpretar estos datos de observación. Veamos las posturas contrapuestas:

• Hipótesis lamarckiana: cada célula del cultivo inicial tiene una probabilidad
pequeña, pero finita, de sobrevivir al agente selectivo. Una vez que algunas células
logran sobrevivir transmiten este rasgo a su descendencia.
• Hipótesis darwiniana (denominada "de las mutaciones preexistentes"): ciertas
bacterias del cultivo inicial son ya resistentes al agente antes de ser expuestas a él.
El agente sólo actúa seleccionando las células resistentes y eliminando a las demás
(sensibles).

La polémica fue ganada por los darwinianos ((por supuesto!), debido a unos elegantísimos
y sencillos diseños experimentales:

El primer "golpe de gracia" lo dio la prueba de las fluctuaciones de Salvador Luria y

Max Delbrück (1943): Si las mutaciones a la resistencia surgieran espontáneamente antes
de exponer las bacterias al agente, entonces diversos cultivos en paralelo en medio líquido
deberían de tener su primera mutación a tiempos distintos. Cuando recogiéramos los
cultivos al final del tiempo del experimento y contáramos las bacterias resistentes, cada
cultivo en paralelo debería dar números variables de resistentes. Veamos el experimento:

• cultivo inicial de una bacteria sensible a la estreptomicina (StrS).

• Inoculamos muchos tubos en paralelo, con el mismo n1 de bacterias en cada uno;
los tubos se incuban hasta la fase estacionaria,y se estudian al mismo tiempo final.

de (n-1) tubos sembrar alícuotas de 109 del tubo restante, sembrar muchas alícuotas de 109
bacterias en placas+estreptomicina bact. en placas+estreptomicina

Recuento de colonias StrR recuento de colonias StrR

Resultado: resultado:

Amplias fluctuaciones de colonias derivadas números similares de colonias en las placas derivadas
de los distintos tubos: del mismo tubo:

30, 10, 40, 45, 183, 12, 173, 23, 173, 23, 57, 46, 56, 52, 48, 65, 44, 49, 51, 56, 48
63

Media (x) = 62 media (x) = 51,4

Varianza (v) = 3498 varianza (v) = 6,33

Razonamiento y conclusiones del experimento:

1. en ningún momento los cultivos líquidos estuvieron expuestos al antibiótico;

2. todos los cultivos crecieron en idénticas condiciones (tiempo, temperatura, etc.);
3. conclusión: las oscilaciones (fluctuaciones) entre diversos tubos se explican porque
en cada uno de ellos debieron surgir mutaciónes espontáneamente a tiempos
distintos, de modo que los tubos en los que el primer mutante apareció
tempranamente generaron mayor número de colonias resistentes (cada colonia se
establece por una célula descendiente de algún mutante inicial).

Poco más tarde, esta conclusión se afianzó con otro experimento "clásico": Prueba de la
réplica en placa (Lederberg, 1952).

1. Supongamos una cepa silvestre de E. coli, que es sensible a la estreptomicina

(StrS).Sembramos masivamente (p. ej. 108 células) en una placa matriz de un medio
sin estreptomicina. Se incuba la placa en estufa a la temperatura adecuada (37oC).
Obtendremos un crecimiento que origina un césped continuo de bacterias (por
crecimiento confluyente).
2. Se hace una réplica con un tampón estéril de terciopelo desde la placa matriz a una
placa de medio con estreptomicina. Incubamos en estufa. Se observa que en esta
placa ha habido un crecimiento de una o unas pocas colonias StrR (cada colonia
procede de una célula individual).
3. Ahora volvemos a la placa matriz (sin Str) y delimitamos la zona aproximada
"gemela" de aquella que en la placa con Str ha dado la colonia StrR. Cortamos un
cuadradito de agar que incluya esa zona, y recuperamos las células (resuspendiendo
en solución salina estéril).
4. A partir de esa suspensión inoculamos 104 células en una nueva placa matriz sin Str,
y dejamos que crezcan. Veremos una multitud de pequeñas colonias casi
confluyentes.
5. Repetimos la réplica desde esta 2ª placa matriz a una nueva placa con Str. Tras
incubar veremos un número de colonias StrR mayor que en la 1ª réplica.
6. Volvemos a la 2ª placa matriz y repetimos la operación: escogemos un cuadradito
que corresponda a una de las colonias de la placa de réplica, lo cortamos,
resuspendemos las células y sembramos una 3ª placa matriz (sin Str), pero ahora el
nº de bacterias que inoculamos es de unas 100. Incubamos esta placa matriz, y
observaremos unas 100 colonias perfectamente separadas unas de otras.
 7. Realizamos una 3ª réplica con el tampón de terciopelo a una 3ª placa con Str. Tras
incubar obtenemos un número de colonias más elevado que en la 2ª réplica, y
además, este número se aproxima al de las colonias de la placa matriz
correspondiente.
8. Reiterando este proceso se logra finalmente que todas las colonias de la placa matriz
se correspondan con las colonias de la placa de réplica correspondiente: es decir, al
final, todas las células son StrR.

Conclusión: Observen que en el experimento hemos realizado una selección indirecta de

las bacterias StrR: siempre vamos tomando células de la placa matriz (que no tiene presión
selectiva del antibiótico) y las pasamos a una placa selectiva, donde sólo crecen los StrR. La
conclusión es clara: las pocas colonias mutantes StrR detectadas en la 1ª placa de réplica
procedieron de un mismo n1 de células StrR que ya estaban presentes en la 1ª placa matriz,
antes del contacto con el antibiótico. La reiteración del proceso de selección indirecta va
"estrechando el cerco" a las células resistentes, de manera que al final logramos una placa
matriz donde todas las células son resistentes, descendientes de la primera colonia StrR que
detectamos en la primera fase de réplica.

Pero después de todo ¿existen mutaciones adaptativas en bacterias?

A finales de los años 80 ciertos experimentos sugirieron la existencia de ciertas mutaciones

que parecían ser adaptativas, surgiendo "después" de ser sometidas a determinadas
condiciones de cultivo. Para tratar este polémico asunto, véase el documento sobre
mutaciones adaptativas, que incluye un modelo reciente.

5. TASA DE MUTACIÓN

En una población bacteriana se define la tasa de mutación (T) para un determinado fenotipo
como la probabilidad de que una célula mute a ese fenotipo en un determinado intervalo de
tiempo. Luria y Delbrück (1943) escogieron como intervalo de tiempo unitario el
correspondiente a un ciclo celular (o sea, a una generación), que es el tiempo necesario para
completar una ronda de división celular. Por lo tanto:

T = m / d, donde m es el nº de mutaciones surgidas en un tiempo t, y d es el nº de

divisiones ocurridas en ese tiempo t.

Si expresamos d en función del número de células: T= m / (N-N0)

NOTA 1: La tasa T de mutación espontánea es constante para cada división celular a distintas tasas de
crecimiento

En la expresión anterior hay que introducir un factor de corrección, ya que en el momento de determinar el
número de células (N), las bacterias se encuentran en distintas etapas del siguiente ciclo celular, de modo que
el promedio real de divisiones es mayor que N en un factor equivalente a 1/ln 2. Resulta, entonces:

T= m·ln2 /(N-N0) = 0,69·m / (N-N0)

A pesar de lo sencillo de esta fórmula, el cálculo en la práctica de la tasa de mutación no es tan fácil como
ésta parece dar a entender. Ello se debe a que el parámetro m mide el número de eventos de mutación en un
lapso de tiempo, que no equivale al número de bacterias mutantes medidas. Por lo tanto, y a pesar de lo fácil
que suele ser cuantificar el número de mutantes, en el experimento, en ese cantidad medida se incluyen los
descendientes de eventos más o menos antiguos de mutación a lo largo de ese experimento. Para calcular m
hay que recurrir a ciertos métodos estadísticos.

Por ejemplo, se puede combinar un experimento de tipo de Luria y Delbrück con la distribución de Poisson.
Imaginemos que sembramos 20 tubos independientes con la misma cantidad inicial de bacterias sensibles a la
estreptomicina e incubamos el mismo tiempo en las mismas condiciones, de modo que la N-N0 sea 5.6X108;
imaginemos que en esa prueba de las fluctuaciones en 11 de los 20 tubos no han surgido mutantes resistentes
al antibiótico. De acuerdo con la aproximación de Poisson a la distribución normal, la probabilidad de tener
cero (0) mutaciones en un cultivo sería:

P0 = m0·e-m/0!

Aplicando esto a nuestro ejemplo:

P0 = 11/20 = 1·e-m/1

Y por lo tanto, podemos despejar y resolver el valor de m = -ln11/20 = 0.59. Ahora podemos calcular la tasa
de mutación:

T = 0.6·0.59/5.6X108 = 7.3·10-9

NOTA2: Obsérvese que hemos definido la tasa de mutación respecto de un fenotipo. Esto significa que
aquellos fenotipos que dependan de varios genes tendrán tasas de mutación superiores a las de aquellos que
dependan de un solo gen. Por ejemplo, la tasa de mutación hacia auxotrofía para la histidina o el triptófano
(cuya biosíntesis depende de varios genes) está en torno a 10-7, mientras que la tasa de mutación a resistencia
a estreptomicina (que, como se recordará, depende de la alteración del gen de la proteína ribosómica S12) es
de sólo 1010 o 1011.

6. REVERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS

Las variaciones fenotípicas producidas por las mutaciones no-silenciosas son

transmisibles a la descendencia. Es decir, una vez producido el cambio, éste es
permanente, pero no necesariamente irreversible (como ya dijimos, solamente
las grandes delecciones son irreversibles).

La reversibilidad de las mutaciones suele deberse a una segunda mutación que

restaura el fenotipo original. Esta 2ª mutación puede ser de dos tipos principales, y
varios subtipos:

• Reversión (en sentido estricto), que restaura el genotipo original. Esto equivale a
una retromutación ("back-mutation").
• Supresión: la 2ª mutación suprime los efectos de la 1ª pero no restaura el
genotipo original. Por lo tanto, tras la mutación supresora, la célula queda con dos
mutaciones. La supresión se clasifica a su vez en:
a. Supresión indirecta: no se corrige el producto del primer gen, pero la 2ª
mutación anula las consecuencias fenotípicas. Ejemplos:
 i.Se abre una nueva vía para la síntesis del producto afectado por la 1ª
mutación.
ii. El producto mutado de la 2ª mutación puede sustituir al producto de
la primera.
iii. Se provoca un cambio en el medio intracelular, que hace que el
producto alterado de la primera mutación vuelva a ser funcional.
b. Supresión directa: la 2ª mutación corrige el producto del primer gen
mutado. Puede ser de dos tipos principales:
i. Supresión intragénica: la 2ª mutación ocurre en el mismo gen
donde ocurrió la primera.
ii. Supresión intergénica (= extragénica): la mutación supresora afecta
a otro gen, que suele ser uno de los genes implicados en la
maquinaria de traducción del ARNm: ARNt y proteínas
ribosómicas.

6.1 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS

INTRAGÉNICAS

• Introducción de un desfase de signo opuesto al de la primera mutación 

restauración de la pauta de lectura alterada por una previa mutación de desfase de
lectura ("frameshift"). La única zona alterada tras la mutación supresora sería la que
queda entre ella y la 10 mutación. Si esta zona es corta y no es esencial para la
actividad biológica, se puede restablecer el fenotipo primitivo.
• Supresiones en el mismo codón que quedó afectado por la 1ª mutación, de modo
que se codifica un aminoácido distinto del silvestre y distinto del aa. del primer
mutante, pero que restaura la funcionalidad de la proteína. A este tipo de supresión
se la denomina también pseudorreversión.
• Mutación puntual compensatoria en un sitio distante respecto de la primera
mutación: la 2ª mutación compensa a la 1ª, de modo que se restaura la estructura
tridimensional y/o el centro activo de la proteína.

6.2 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS

INTERGÉNICAS

• Por ARNt mutantes (= ARNt supresores)

•
a. supresores de mutaciones que introducen codones de parada de lectura (o
sea, de codones "sin sentido, nonsense"): son ARNt mutados en el
anticodón, de modo que este anticodón mutado puede emparejarse con
alguno de los tres tipos de codones "sin sentido", insertando ahora los aa.
correspondientes que transportan; por lo tanto, impiden la terminación
prematura de la traducción. Ejemplos: El codón sin sentido UAG ("ámbar")
 puede ser suprimido por versiones mutantes (supresoras) de los siguientes
ARNt:
Tipo de ARNt supresor Normalmente reconoce a
ARNtSer UCG
ARNtG ln CAG
ARNtTyr UC
ARNtLys AAG
b. (La letra sombreada indica la base que cambia en la mutación supresora).
c. El codón sin sentido U A A ("ocre") puede ser suprimido por una versión
mutante de ARNtGlyGAA
d. Existen supresores más raros que suprimen mutaciones de sentido erróneo
("missense"): Ejemplo: El ARNtGly cuyo anticodón es UCU, por mutación
se convierte en un ARNt supresor cuyo anticodón es UCC, que entonces
reconoce al codón AGA (de la Arg). Por lo tanto, este supresor inserta Gly
frente a cada codón AGA.
e. supresores de desfases de lectura de +1 nucleótido: son ARNt mutantes
que tienen un anticodón con 4 nucleótidos, en lugar de los 3
habituales.Ejemplo: Existe un ARNtPhe que tiene un anticodón que reconoce
la secuencia UUUC.
• Por proteínas ribosómicas mutantes: Los ribosomas derivados de la alteración
por mutación de determinadas proteínas adquieren zonas de conformación
cambiada, de modo que reconocen tripletas de forma errónea. Al introducir
aminoácidos cambiados en codones que a su vez proceden de mutaciones, pueden
restaurar la funcionalidad de algunas proteínas mutantes.Ejemplos:
a. mutaciones ram, que afectan a las proteínas S4 y S5 de la subunidad 30S del
ribosoma, de modo que éste puede suprimir una gran variedad de
mutaciones sin sentido y por desfases. (El nombre de ram corresponde a las
iniciales de ribosomas ambiguos).
b. Mutaciones StrR: tienen afectada la proteína S12 del ribosoma. Hacen que
las mutaciones sin sentido sean menos defectuosas ("leaky" = débiles).

6.3 EFICACIA DE LAS MUTACIONES SUPRESORAS POR ARNt

MUTANTES

Cada supresor tiene una eficacia característica de supresión, que se refleja en la

proporción de cadenas polipeptídicas mutantes que son terminadas de forma normal
(en lugar de quedarse truncadas). Esta eficacia depende, esencialmente de:

o la concentración del ARNt supresor en la célula;

o afinidad del ARNt supresor hacia la aminoacil-ARNt-sintetasa;
o afinidad del aa-ARNt por el ribosoma, en competencia con los factores de
terminación de traducción que reconocen el mismo codón "sin sentido" (de
parada de lectura).
 La mutación supresora, por sí misma disminuye la velocidad de crecimiento de la
bacteria, debido a que, aparte de sucapacidad supresora, introduce errores de lectura
en los ARNm normales.

Los supresores han de ser, por fuerza, poco eficientes, como para no hacer que la
célula muera por introducción de demasiados errores en la lectura de los ARNm
normales (es decir, la mayor parte de las veces, los supresores introducen el
aminoácido correcto). Pero por otro lado, han de ser suficientemente eficicientes
como para poder introducir aminoácidos en codones mutantes con la frecuencia
adecuada para suprimir la mutación primaria. Normalmente, los supresores típicos
suprimen 5-10% de las veces. Es decir, la mayoría de las veces se introduce el aa.
correcto frente al codón correcto.

7. AGENTES MUTAGÉNICOS E INDUCCIÓN DE

MUTACIONES
Anteriormente comentamos que el medio ambiente no induce mutaciones concretas
(p. ej., el antibiótico no provoca la aparición de los mutantes resistentes). Ahora
bien, lo que sí pueden hacer determinadas condiciones ambientales es elevar la tasa
global de aparición de mutaciones.

Determinados agentes ambientales físicos o químicos pueden dañar el ADN o

interferir con la maquinaria replicativa, de modo que provocan una mayor
frecuencia de aparición de mutaciones (y en este sentido hablamos de
"mutaciones inducidas"). A dichos agentes se les llama mutágenos o agentes
mutagénicos. Así pues, en última instancia, los mutágenos causan alguna alteración
en el ADN que

o bien no puede ser reparada convenientemente,

o o bien es un daño tan extenso que sobrepasa la capacidad de los mecanismos
celulares normales de reparación (consultar el tema de "Mecanismos de
Reparación de los daños al ADN").

• AGENTES FÍSICOS

RADIACIÓN UV

Es el mutágeno físico más empleado en el laboratorio para obtener mutaciones en

las bacterias. Como ya estudiamos en su momento, su efecto principal es originar
dímeros de pirimidina intracatenarios (con creación de una anillo ciclobutano entre
dos Py consecutivas). Las proporciones de lesiones son las siguientes:

o 50% T-T
 o 40% T-C
o 10% C-C

Las mutaciones aparecen principalmente como consecuencia del mecanismo

posreplicativo de reparación propenso a error (o sea, el sistema SOS). Con menor
frecuencia la luz UV ocasiona hidratación de la C, lo que da origen a transiciones.

RAYOS X Y RADIACIONES IONIZANTES

Tienen mayor poder de penetración que los rayos UV, pero son de difícil manejo,
por lo que se emplean poco en bacterias. Los rayos X ocasionan daños reparables
por el sistema SOS.

Las radiaciones ionizantes (p. ej., rayos γ ) provocan labilizaciones en el ADN,

que terminan en roturas en las hebras del ADN (por ataque al enlace fosfodiéster),
que finalmente pueden conducir a delecciones.

• AGENTES QUÍMICOS

Se pueden agrupar en varias categorías:

1. Análogos de bases, que se incorporan durante la replicación del ADN.

2. Agentes hidroxilantes o desaminantes de las bases nitrogenadas.
3. Agentes alquilantes.
4. Agentes intercalantes, que se introducen en la doble hélice del ADN, entre
pares de bases consecutivas.
5. Bloqueadores del emparejamiento de las bases.

• ANÁLOGOS DE BASES

Son sustancias con una estructura en anillo similar a las bases naturales de los
ácidos nucleicos, pero con propiedades químicas diferentes. Como ejemplos
tenemos:

o 5-bromouracilo (5-BrU)
o 2-aminopurina (2AP).

Estas moléculas entran a las células y son convertidas a los correspondientes

"dNTP", de modo que su estructura les permite ser incorporados durante la
replicación del ADN.

1) El 5-BrU es análogo de la T. Propicia transiciones T:A  G:C debido a que

experimenta frecuentes cambios tautoméricos desde su forma ceto a su forma enol:

BUceto:A BUenol:G
 Si partimos de una pareja A=T y en la 1ª ronda de replicación la ADN-polimerasa
introducen un BUceto frente a la adenina, los acontecimientos hasta llegar a la
mutación se pueden resumir así:

A:T  (la primera replicación incorpora BU)  A:BUceto  (tautomerización y 2ª

replicación)  G:BUenol  (3ª replicación)  G:C

2) La 2-AP es un análogo de la A. Provoca transiciones A:T C:G debido a sus

frecuentes tautomerizaciones (APamino  APimino). Veamos el proceso:

A:T  (primera replicación)  APamino:T  (tautemerización y 2ª replicación) 

APimino:C  (3ª replicación)  G:C

AGENTES DESAMINANTES O HIDROXILANTES

Alteran las Pu o las Py, de modo que:

o causan errores en el emparejamiento, o bien

o labilizan las bases, de modo que éstas espontáneamente se modifican
químicamente con gran frecuencia.

1) Ácido nitroso: provoca una desaminación oxidativa de A y C, lo que origina

transiciones

sobre C  dU, que se empareja con la A.

sobre A (6-aminopurina)  hipoxantina (HX) (6-oxopurina), que en su forma ceto

se empareja con la citosina:

A:T  HXceto:C  G:C

El nitroso también desamina oxidativamente a la G, pero en este caso no hay

mutación:

G  xantina, que al igual que la G, se empareja con la C.

2) Hidroxilamina (NH2OH): actúa específicamente sobre la citosina, añadiéndole

un hidroxilo a su grupo -NH2:

• AGENTES ALQUILANTES
 Introducen radicales alquílicos en una cadena (los alquilantes monofuncionales) o
en las dos cadenas (los bifuncionales) del ADN, produciendo efectos letales y
mutagénicos.

o Los efectos letales fueron estudiados en el capítulo 19 ("Acción de los

agentes químicos").
o Los efectos mutagénicos dependen sobre todo de la reacción con el O6 de la
G.

Algunos agentes alquilantes empleados en laboratorio:

o gas mostaza: mostazas nitrogenadas y sulfuradas, como por ejemplo:

o Cl-CH2-CH2-S-CH2-CH2-Cl : di-(2-cloroetil)-sulfuro.
o etil-etano-sulfonato (EES): CH3-CH2-SO2-O-CH2-CH3
o etil-metano-sulfonato (EMS): CH3-SO2-O-CH2-CH3
o nitrosoguanidina (NTG), que es la N-metil, N'-nitro, N-nitrosoguanidina:

Todos estos agentes, excepto la NTG, actúan tanto in vivo como in vitro. La NTG
sólo actúa in vivo, ya que su efecto lo ejerce sobre la horquilla de replicación del
ADN. La NTG es uno de los mutágenos más potentes que se conocen, pero es un
agente "sucio", en el sentido de que genera varias mutaciones en la misma célula.
Induce reparación SOS propensa a error, dando origen a transiciones, transversiones
y desfases del marco original del lectura.

Como hemos dicho, estos agentes originan un daño premutagénico principal

consistente en alquilación del O6 de la G. Ello provoca una gran distorsión en la
doble hélice, que posteriormente se plasma en transiciones del tipo G:C  A:T.

Sin embargo, muchas bacterias poseen un sistema específico para reparar las
lesiones de la O6-alquil-guanina, que funciona de la siguiente manera:

1. La bacteria posee una O6-alquil-glucosilasa, que rompe el enlace N-glucosídico

entre la O6-alquil-guanina y la desoxirribosa. Esto provoca la creación de un sitio apurínico
(sitio AP).
2. El sitio AP es reconocido por una endonucleasa correctora (apurinasa),
que rompe el enlace fosfodiéster del lado 5' del sitio apurínico.
3. Se produce una reparación por escisión-resíntesis de un pequeño n1 de
nucleótidos, pero si el daño es muy grande se produce una situación SOS
que tiende a ser reparada por el sistema propenso a error ya estudiado, lo
que provoca introducción de errores, que conducen a transiciones y
transversiones.

• SUSTANCIAS INTERCALANTES
 Se introducen entre los pares de bases del ADN, dando origen a pérdida o
ganancia de nucleótidos (o sea, generan mutaciones de cambio de la pauta de
lectura del mensaje genético).

Estas sustancias son moléculas planares con 3 o 4 anillos conjugados, que presentan
un cierto parecido con los pares de bases del ADN, pero no se pueden incorporar
covalentemente al esqueleto de éste, sino que se intercalan entre dos pares de bases
consecutivas, con lo que provocan distorsiones de la doble hélice.

Algunos ejemplos:

o derivados de la acridina, como el naranja de acridina

o bromuro de etidio (ver nota)
o derivados de la flavina (como la proflavina).

Estabilizan emparejamientos erróneos durante la replicación y la recombinación del

ADN, dando origen a desplazamientos de la pauta de lectura.

Aplicaciones: Algunos se están ensayando en cuanto a su capacidad de inhibir

tumores cancerígenos, o como antivirásicos, o contra el protozoo causante de la
malaria.

 AGENTES QUE BLOQUEAN TOTALMENTE EL EMPAREJAMIENTO DE

BASES

Este grupo incluye potentes carcinógenos como:

o benzo-a-pireno
o aflatoxina-B1.

Modifican purinas, provocando grandes lesiones en el ADN, que inducen el sistema

SOS de reparación, lo que finalmente implica reparación propensa a error.

8. LAS BACTERIAS COMO INDICADORAS DE SUSTANCIAS

MUTAGÉNICAS Y POTENCIALMENTE CARCINOGÉNICAS

Uno de los más claros indicios de que el cáncer surge a menudo como consecuencia
de fenómenos mutagénicos es que la mayoría de los carcinógenos son también
mutágenos.

Ames y sus colaboradores desarrollaron, a finales de los años 70, una prueba rápida,
sencilla y económica por la que se pueden ensayar compuestos como posibles
carcinógenos. Su base consiste precisamente en ver si son mutágenos frente a
bacterias (es decir, se comprueba si tras el tratamiento de un cultivo bacteriano con
la sustancia en cuestión, aumenta la tasa de aparición de mutantes.

TEST DE AMES:

Usa una serie de cepas his- de Salmonella typhimurium, muy bien caracterizadas a
nivel genético-molecular.

1. Una suspensión de la bacteria se siembra masivamente (unas 108) en placas

Petri que llevan un medio mímino (MM) -por lo tanto, sin aminoácidos- .
2. A continuación, en el centro de la placa se coloca un pequeño disco de papel
de filtro impregnado con la sustancia que se desea ensayar. Acto seguido, las
placas se incuban en estufa a la temperatura óptima de crecimiento de la
bacteria (37oC).
3. Las placas se sacan de la estufa (a las 24 h., por ejemplo) y se cuentan las
colonias surgidas en cada placa, comparándolas con las colonias de una
placa control que no llevaba la sustancia. Las colonias habrán surgido por el
crecimiento de bacterias que hayan experimentado reversiones
(=retromutaciones). Cada reversión en el alelo original his-- restituye el
fenotipo silvestre His+, y por lo tanto capacita a la bacteria a crecer y
dividirse en el medio mínimo.

Si la prueba da resultado positivo (o sea, la sustancia induce altas tasas de mutación

sobre la bacteria), es muy probable que el compuesto ensayado sea también
carcinógeno, por lo que habrá que continuar estudiándolo a estos niveles. (El 90%
de los compuestos que dan positivo en el Test de Ames se ha demostrado que son
carcinógenos).

Ulteriores mejoras en el test de Ames:

En los últimos años esta prueba ha sido modificada para mejorarla o adaptarla a
situaciones especiales. Veamos algunas de estas modificaciones:

o uso de cepas de Salmonella defectivas en reparación (uvrA--, uvrB--, uvrC--,

etc). En estas cepas, cualquier daño al ADN no puede ser corregido con total
eficiencia. Esto hace que estas cepas sean más sensibles frente a sustancias
con menor potencial carcinogénico.
o Muchos agentes son mutágenos en humanos sólo tras su "activación"
metabólica por el hígado, pero son inactivas por sí mismas. Para detectar a
estas sustancias, el test de Ames puede modificarse incorporando un extracto
microsomal estéril (fracción libre de células de hígado animal o de cultivos
de tejidos). El extracto microsomal posee oxigenasas que originan epóxidos
a partir de la sustancia a ensayar, y a su vez son estos derivados de tipo
epóxido los que verifican la acción mutagénica.
o Algunas sustancias a ensayar no entran eficientemente a la bacteria debido al
efecto de barrera de la membrana externa de la pared celular. Para solventar
 esto, se recurre a emplear mutantes LPS-- de Salmonella (o sea, mutantes
alterados en el lipopolisacárido, LPS), que facilitan la entrada de moléculas
hidrofóbicas.

9. ALGUNOS MUTANTES BACTERIANOS

EMPLEADOS EN LABORATORIO
9.1 ALGUNOS CONCEPTOS BASICOS

En este apartado pretendemos realizar una sencilla sinopsis de algunos tipos de

mutaciones que se utilizan con frecuencia en los laboratorios de investigación.
Previamente repasaremos algunos conceptos y términos que son igualmente de uso
común en muchos estudios de genética:

Dependiendo de que la mutación genética se manifieste o no a nivel fenotípico, y

según el grado de afectación fenotípica, podemos clasificar las mutaciones de la
siguiente manera:

o mutaciones silenciosas (o neutras), si no hay efecto fenotípico;

o mutaciones que implican alteración del fenotipo silvestre:
 letales: si ocasionan la muerte o pérdida de viabilidad del
microorganismo;
 condicionalmente letales: si bajo determinadas condiciones el
mutante pierde la viabilidad, pero bajo otras la mantiene.
 mutaciones de alteración fenotípica que suponen la pérdida o la
merma de alguna función que no sea esencial para la viabilidad del
organismo. Dentro de ellos están los mutantes condicionales (su
fenotipo alterado se manifiesta en determinadas circunstancias).

Las mutaciones condicionales (incluidas las condicionalmente letales) son muy

útiles para estudiar aquellos genes esenciales para la bacteria. En estos mutantes hay
que distinguir dos tipos de condiciones:

o condiciones restrictivas (también llamadas no-permisivas): son aquellas

condiciones ambientales bajo las cuales el mutante pierde la viabilidad, o su
fenotipo se ve alterado, debido a que el producto afectado por la mutación
pierde su actividad biológica.
o condiciones permisivas: son aquellas bajo las cuales el producto del gen
mutado es aún funcional.

Algunos ejemplos de mutantes condicionales muy empleados en genética:

o mutantes sensibles al calor (termosensibles). Se suelen denominar con las

siglas ts. El producto del gen mutado es más sensible al calor que el
producto silvestre
 o mutantes de biosíntesis sensible al calor;
o mutantes sensibles al frío (criosensibles)
o mutantes sensibles a efectores alostéricos
o mutantes suprimibles por supresores extragénicos (por ejemplo, por ARNt
supresores, mutantes);
o mutantes dependientes de estreptomicina (consultar "antibióticos
aminoglucósidos", del cap. 20);
o mutantes estabilizados osmóticamente (sólo son estables en altas
concentraciones de sales).

En principio, y "por definición", es imposible obtener mutantes letales estrictos de

genes esenciales para la viabilidad de la bacteria (p. ej., en genes de la ADN-
polimerasa, ARN-polimerasa, ADN-ligasa, etc.), pero sí es posible conseguir
mutantes condicionalmente letales, especialmente los termosensibles. Por ejemplo,
si tras un tratamiento mutagénico sembramos células de Escherichia coli en placas y
las cultivamos a 30ºC, y luego hacemos réplicas en placas que se incuban a 42ºC,
las colonias "ausentes" en estas últimas nos señalan correspondientes colonias de la
placa matriz candidatas a mutantes termosensibles.

Otro tipo de mutantes condicionales muy empleados en bacterias son aquellos con
mutaciones sin sentido. Como se recordará, cuando el ribosoma llega al codón sin
sentido, se detiene la traducción ulterior. Sin embargo, si esa bacteria tiene
simultáneamente una segunda mutación de tipo supresor extragénico, a saber, un
ARNt mutante adecuado, se puede restablecer el fenotipo silvestre (al menos
parcialmente).

9.2 TIPOS Y EJEMPLOS DE MUTANTES EMPLEADOS EN

LABORATORIO

• MUTACIONES QUE AFECTAN A RASGOS MORFOLÓGICOS DE LAS

COLONIAS:

Los rasgos culturales de las bacterias son muy fáciles de ver en los cultivos en
placas de Petri, por lo que igualmente es fácil detectar cambios en los aspectos de
las colonias que pudieran deberse a mutaciones. Antes de nada, vamos a describir
brevemente tres tipos de colonias que pueden darse en una misma especie:

o colonias S (lisas): son circulares, de borde liso o continuo; convexas obtusas

(plano-convexas); superficie lisa y brillante; se dispersan fácilmente en agua,
dando suspensiones homogéneas.
o colonias M (mucosas): son parecidas a las S, pero son convexas más
agudas; textura mucosa (al cogerlas con asa de siembra, se arrastra un
"moco").
 o colonias R (rugosas): a menudo presentan un borde ondulado o festoneado;
son planas; textura rugosa, y aspecto mate (no brillante); no se dispersan
bien en agua, dando grumos más o menos gruesos.

Pues bien, en muchas especies bacterianas se pueden estudiar fenómenos de

disociación de tipos de colonias en cultivos, debido a mutaciones que alteran
moléculas de las envueltas (p. ej., de la membrana externa de las bacterias Gram-
negativas, de la cápsula, etc.). Veamos algunos ejemplos:

o En algunas bacterias se puede observar una disociación M  S, que se suele

deber a la pérdida de la capacidad de sintetizar cápsula.
o En algunas bacterias Gram-positivas la disociación S  R se debe a pérdida
de la cápsula.
o En bacterias Gram-negativas, las disociación S  R se debe a menudo a la
pérdida de la capacidad de sintetizar las cadenas laterales polisacarídicas del
LPS (antígeno somático "O").

Muchas de estas disociaciones tienen bastante interés clínico, ya que en bacterias

patógenas, el fenotipo mutado (sobre todo el rugoso) implica la pérdida de
propiedades de virulencia y de especificidad antigénica.

• MUTACIONES QUE AFECTAN A REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

En estudios de genética bacteriana (p. ej., a la hora de elaborar mapas genéticos), es

muy habitual recurrir al empleo de mutantes auxotróficos (es decir, mutantes
afectados en algún gen de alguna ruta biosintética -de aminoácidos, bases
nitrogenadas, vitaminas-). Por supuesto, estos mutantes presentan interés por sí
mismos, ya que su estudio permite "diseccionar" la base genética de las vías
metabólicas.

Veamos a continuación un par de maneras de aislar y seleccionar mutantantes

bacterianos auxotrofos:

1) Aislamiento de auxotrofos (sin enriquecimiento):

cultivo original à tratar con mutágeno à lavarà siembra placas de medio mínimo
(MM)+ suplementos nutricionales à réplica a MM

Se comparan las colonias de la placa-matriz (medio con suplementos nutricionales)

con las colonias que hayan aparecido en la placa de réplica (carente de
suplementos). La ausencia de colonia en la placa de réplica en una posición en la
que existe colonia en la placa-matriz incica que la colonia de la placa matriz que no
tiene "gemela" en la réplica es un mutante auxotrófico.

Una vez que sabemos que una colonia es un mutante auxotrófico, hay que
determinar qué requerimiento nutricional le hace falta (es decir, qué compuesto o
 compuestos no puede sintetizar debido a la mutación). Para ello se realiza una
sencilla prueba en placas de Petri, denominada auxonograma.

Sin embargo, aun cuando tratemos a un cultivo con un agente mutagénico, la

frecuencia de aparición de un determinado fenotipo mutante es relativamente baja.
Esto significa que en el experimento anterior, tendríamos que sembrar y replicar
numerosas placas con grandes números de colonias, con objeto de alcanzar el
umbral de probabilidad para detectar mutaciones auxotróficas. Para solventar este
inconveniente, se suele recurrir a una modificación del método anterior basada en
enriquecer en mutantes auxotrofos el cultivo tratado con el mutágeno:

2) Enriquecimiento por penicilina para el aislamiento de mutantes auxotróficos

(resumen de un protocolo):

• cultivo original (bacteria silvestre, prototrofa)

• tratamiento con el mutágeno
• mezcla de bacterias muertas (p. ej., el 90% del cultivo inicial) y
• bacterias vivas, entre ellas unos pocos mutantes de diversos tipos
• el cultivo se transfiere a un medio líquido rico,
• para permitir la recuperación y la expresión fenotípica (lag fenotípico)
• incubar unas cuantas horas
• el cultivo se lava y se pasa a un medio líquido mínimo
• añadir penicilina e incubar
• la penicilina mata a los prototrofos, pero los auxotrofos no mueren, porque no
crecen en MM (muerte selectiva de los parentales prototrofos)
• plaquear en medio sólido rico
• hacer réplica a medio sólido mímino
• identificar los auxotrofos (no crecen en MM)
• recuperar los auxotrofos de las placas de medio rico, y caracterizarlos (hacer
auxonograma)

MUTANTES RESISTENTES A DROGAS Y A FAGOS

Los mutantes resistentes a antibióticos surgen por varios tipos de mecanismos, entre
los que se encuentran:

o alteración de algún gen que codifica una diana (sitio de unión) del
antibiótico;
o alteración de algún gen responsable de permeabilidad al antibiótico.

Los mutantes resistentes a fagos surgen esencialmente por alteración de receptores

de la superficie celular, sobre los que se adsorben los fagos.

Ambos tipos de mutantes son de muy amplio uso para "marcar" cepas bacterianas
en experimentos de genética (especialmente los que implican algún proceso de
transferencia de material genético desde una estirpe donadora a otra receptora).
 Estos marcadores genéticos permiten seleccionar directamente la cepa que los porte
añadiendo al medio de cultivo el correspondiente agente selectivo (antibiótico o
fago), que obviamente mata o inhibe el crecimiento de las cepas sensibles.

• MUTANTES AFECTADOS EN EL USO DE AZÚCARES U OTRAS

FUENTES DE C Y ENERGÍA

Estos mutantes pierden la capacidad de metabolizar determinados sustratos, pero

pueden recurrir a otros alternativos. Para aislar estos mutantes se puede recurrir en
muchos casos al uso de medios diferenciales que incorporan indicadores de pH, que
cambian de color en función del uso o no del sustrato en cuestión.

Por ejemplo: si quisiéramos aislar mutantes Lac-- de E. coli, sembraríamos en Agar

Mac Conckey. Los mutantes Lac-- dan colonias transparentes, mientras que el
fenotipo silvestre Lac+ da colonias rojas opacas con un precipitado alrededor de
sales biliares (recordar el uso de este medio en las prácticas).

0. VARIACIONES BACTERIANAS POR CURACIÓN

DE PLÁSMIDOS
Como ya sabemos, los plásmidos son material genético extracromosómico que se replican
independientemente del cromosoma (replicones autónomos), y que no son indispensables para la
viabilidad de la bacteria que los posee. Hay plásmidos crípticos que no dan ningún fenotipo detectable
(función desconocida), pero existen muchos plásmidos que codifican funciones como resistencia a
antibióticos o a metales pesados, virulencia a plantas o animales, capacidad de fijar nitrógeno
atmosférico, etc.

Como es lógico, el material genético plasmídico es susceptible de experimentar mutaciones. Pero la

posesión de plásmidos por muchas bacterias puede condicionar otro tipo de variaciones genotípicas
heredables: la curación, consistente en la pérdida del plásmido, lo que acarrea obviamente la pérdida
concomitante de las funciones y fenotipos codificado por aquel, sin que se afecte la viabilidad de la
bacteria.

Métodos de curación de plásmidos:

o Sometimiento del cultivo bacteriano a altas temperaturas (cercanas a la temperatura

máxima);
o Tratamiento del cultivo con agentes químicos que se intercalan en el ADN,
interfiriendo con la replicación, estabilidad o reparto del plásmido a las células hijas (bromuro de etido,
naranja de acridina, etc.).

INTRODUCCIÓN A LAS VARIACIONES POR

CAMBIOS EN EL GENOTIPO ASOCIADAS CON
TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO
En la introducción al capítulo 23 ya realizamos un encuadre general de los distintos tipos de
variaciones genotípicas, distinguiendo las que no implican transferencia de material
genético (mutación y curación) de las que derivan de transferencia de ADN entre bacterias.
A partir de ahora nos vamos a ocupar de estas últimas.

Rasgos generales de la transferencia genética en bacterias:

• La transferencia es unidireccional, es decir, tiene una determinada

polaridad, existiendo células donadoras y células receptoras.
• La transferencia del genomio de una célula a otra no suele ser total, sino
parcial.
• Parte del material genético, una vez introducido en la célula receptora,
sufre inmediatamente un fenómeno de recombinación con el genomio
de la receptora. El resto del material de la donadora o no se replica, o se
ve destruido.
• Como se puede deducir, tras los procesos de transferencia genética
bacteriana, no surge una diploidía total (como es el caso en eucariotas),
sino una diploidía parcial, que recibe el nombre de merodiploidía. Las
células bacterianas diploides parciales reciben la denominación de
merodiploides o merozigotos. Además, la merodiploidía suele ser
transitoria.

Este tipo de intercambio genético unidireccional, con diploidía transitoria parcial, se

denomina meromixia, para distinguirlo de la reproducción sexual de eucariotas.

• El genomio de la célula receptora se suele denominar endogenote.

• La porción de genomio de la cél. donadora que se transfiere se llama
exogenote.

Los procesos de transferencia genética en bacterias son de tres grandes tipos, más una
variante adicional de uno de ellos:

• TRANSFORMACIÓN: captación y asimilación de ADN libre (desnudo), a

partir del medio, por parte de una célula receptora (lo estudiaremos en
el cap. 25).
• TRANSDUCCIÓN: el material genético es transportado desde la cél.
donadora a la receptora por medio de un virus bacteriano (o sea, un
bacteriófago o simplemente, fago), que actúa como vector (ver cap. 26).
• CONJUGACIÓN: transferencia directa de material genético, promovida
por un plásmido, desde una célula donadora a otra receptora, por medio
de contactos íntimos entre ambas (puentes de unión). Una variante de la
conjugación es la SEXDUCCIÓN: en ella, un trozo definido de mat.
genético de la donadora es transferido como parte de un plásmido
conjugativo (cap. 27).

Pero antes de abordar estos sistemas de transferencia genética, en este capítulo vamos a
considerar el destino posible del material genético transferido por estos procesos. Dejando
aparte la posibilidad de que el material transferido sea por sí mismo un replicón, y por lo
tanto, al llegar a la célula receptora pueda replicarse y mantenerse por sí mismo, el
exogenote puede sufrir dos destinos muy distintos:

• Por un lado, puede verse implicado en un tipo de proceso de

recombinación genética, que lo "incorpora" de alguna forma al
endogenote (lo veremos en la primera parte del cap. 24).
• Por otro lado, el exogenote puede ser "reconocido como extraño" por
parte de la célula receptora, en cuyo caso será destruido.
RECOMBINACIÓN

2.1 CONCEPTOS GENERALES

La recombinación es el proceso por el que la información genética se ve redistribuida, tras

la transferencia del exogenote al endogenote. La recombinación permite "barajar" grandes
conjuntos de genes, suministrando una fuente de variación y selección para la evolución,
más rápida que la mutación.

En bacterias encontramos los siguientes tipos principales de recombinación:

1. Recombinación general u homóloga

2. Recombinación específica (no-homóloga), en la que a su vez
distinguimos:
a. Rec. específica legítima, conservativa;
b. Rec. específica "ilegítima", propiciada por elementos genéticos
transponibles.

A continuación, y antes de abordar cada tipo de recombinación, daremos las definiciones

generales de cada uno de estos procesos recombinativos:

Recombinación general u homóloga

• Puede ocurrir en cualquier lugar del genomio, por emparejamiento entre

pares de secuencias que presenten una homología suficientemente
extensa.
• Depende de la intervención de un equipo enzimático característico, en el
que la proteína RecA (o equivalente) es central en el proceso.

Recombinación específica legítima (conservativa)

• Requiere cortas secuencias de homología entre el exogenote y el

endogenote (por eso se llama también "específica de sitio"), que son
reconocidas por proteínas específicas.
• Es independiente de RecA.
• Este tipo de recombinación es típica de la integración de genomios de
fagos en sitios concretos del genomio de bacterias hospedadoras.

Recombinación específica ilegítima: fenómenos de transposición

 • No depende de homologías (ni siquiera cortas) entre el exogenote (en
este caso, un elemento genético transponible, como IS o Tn) y el
endogenote.
• También es independiente de RecA.
• El elemento transponible codifica una enzima (genéricamente se les
denomina transposasas) que reconoce secuencias específicas
inversamente repetidas en los extremos del propio elemento, lo cual se
requiere para el proceso de transposición.
• Muchos elementos transponibles (pero no todos) poseen un mecanismo
replicativo de transposición: es decir, al transponerse dejan una copia
de sí mismos en el sitio original, y generan una copia nueva en el sitio a
donde se transponen (recombinación específica duplicativa).

2.2 RECOMBINACIÓN GENERAL U HOMÓLOGA

Anteriormente ya definimos sus características generales. A continuación vamos a describir

un modelo molecular de esta recombinación, basado en el clásico de Meselson y Radding,
modificado con los últimos avances. No se olvide que estamos ante un modelo, es decir,
una propuesta hipotética para explicar un conjunto de datos experimentales. No todos los
puntos de este modelo están totalmente aclarados o demostrados:

Supongamos que tenemos un exogenote y un endogenote, ambos consistentes en dobles

hélices. En los modelos de recombinación, al exogenote se le suele denominar como ADN
donador, y al endogenote como ADN receptor.

1. Iniciación de la recombinación: La recombinación homóloga

comienza con una incisión endonucleotídica en una de las cadenas de la
doble hélice donadora. La responsable de este proceso es la nucleasa
RecBCD (=nucleasa V), que actúa de la siguiente manera: se une
aleatoriamente al ADN del donador, y se va moviendo por la doble hélice
hasta que encuentra una secuencia característica denominada χ (letra
griega "chi"), que es un "punto caliente recombinativo":

5' GCTGGTGG 3'

3' CGACCACC 5'

Una vez reconocida la secuencia, la nucleasa RecBCD corta a 4-6 bases a la derecha
(lado 3') de la cadena superior (tal como las hemos escrito arriba). Entonces, esta
misma proteína, actuando ahora como una helicasa, va desenrollando la cadena
cortada, haciendo que se desplace una zona de ADN de cadena sencilla (ADN c.s.)
con su extremo 3’ libre

2. El hueco que ha dejado la porción desplazada de la cadena cortada del

donador es rellenado mediante síntesis reparativa de ADN.
3. La zona de cadena sencilla desplazada del ADN donador es recubierta
por subunidades de la proteína RecA (a razón de un monómero de
 RecA por cada 5-10 bases). De este modo, esa cadena sencilla adopta
una configuración helicoidal extendida.
4. Asimilación o sinapsis: Este es el momento clave de actuación de la
RecA. De alguna manera, la RecA unida al ADN c.s. del donador facilita
el encuentro de éste con la parte de doble hélice complementaria del
receptor, de modo que en principio se forma una triple hélice. A
continuación, con la hidrólisis de ATP, la RecA facilita que la cadena del
donador desplace a la cadena homóloga del receptor, y por lo tanto se
empareje con la complementaria de ese receptor. En este proceso, la
porción de cadena del receptor homóloga del donador se ve desplazada,
originándose la llamada "estructura en D".

• Es importante resaltar que este proceso propiciado por RecA depende de

que el donador y el receptor presenten gran homología de secuencia
(del 100 al 95%), y de que estos segmentos de homología tengan más
de 100 bases de longitud.
• Observar que esta sinapsis implica la formación de una porción de
heterodúplex en la doble hélice receptora: hay una zona en la que
cada cadena procede de un ADN c.d. parental distinto (donador y
receptor).

1. Se supone que la cadena recién desplazada del ADN receptor (estructura

en D) es digerida por nucleasas.
2. Unión covalente de los extremos originados en las dos cadenas
homólogas. Esto da como resultado un entrecruzamiento simple por
el que las dos dobles hélices se encuentran "atadas". La estructura
global resultante se denomina estructura de Holliday.
3. Migración de las ramas: al punto de cruce de la estructura de Holliday
se une un complejo formado por las proteínas RuvA y RuvB, que con
hidrólisis de ATP logran el desplazamiento del punto de cruce de
Hollyday: de esta forma se va agrandando la porción de heterodúplex en
ambas dobles hélices.
4. Isomerización: para visualizarla fácilmente, imaginar que rotamos los
dos segmentos de uno de los ADN c.d. 180o respecto del punto de
entrecruzamiento, para generar una estructura plana que es isómera de
la anterior ("estructura en X").
5. Resolución de esta estructura: este paso está catalizado por la
proteína RuvC, que corta y empallama entre sí dos de las cadenas
entrecruzadas en la juntura de Hollyday. El resultado de la resolución
puede variar según que se corten y empalmen las cadenas que antes no
participaron en el entrecruzamiento, o que vuelvan a ser éstas las
implicadas en esta segunda operación de corte y sellado:
a. Si los cortes y empalmes afectan a las cadenas de ADN que antes
no participaron en en el entrecruzamiento, el resultado será dos
moléculas recombinantes recíprocas, donde cada una de las 4
cadenas son recombinantes (ha habido intercambio de
marcadores entre donador y receptor)
b. Si los cortes y empalmes afectan a las mismas cadenas que ya
habían participado en el primer entrecruzamiento, el resultado
 consistirá en dos dobles hélices que presentan solamente sendas
porciones de ADN heterodúplex.

Este modelo, como dijimos es aplicable a bacterias. Sin embargo, dejando aparte los
aspectos enzimáticos (proteínas Rec y Ruv), los aspectos mecánicos (principalmente los
requerimientos de grandes zonas de homología, sinapsis, estructuras de Holliday,
formación de heterodúpex, etc.) son aplicables también a los organismos superiores (quizá
el alumno haya estudiado o estudiará un modelo parecido en la asignatura de Genética). De
todas formas, hay que volver a insistir en una notable diferencia entre la recombinación
homóloga de las bacterias y la de los organismos superiores de reproducción sexual: en las
bacterias la recombinación afecta a porciones relativamente pequeñas del genoma donador,
mientras que en los eucariotas cada cromosoma completo se empareja con el homólogo (si
bien sólo se producen unos pocos entrecruzamientos).

2.3RECOMBINACIÓN ESPECÍFICA DE SITIO CONSERVATIVA

Caracteres generales:

• Es independiente de RecA (u otras enzimas de rec. homóloga).

• Es independiente de grandes regiones de homología entre exo- y
endogenote.
• El proceso está catalizado por enzimas específicas llamadas en general
"recombinasas", que tienen un mecanismo de acción similar al de
las topoisomerasas de tipo I.
• No hay replicación de ADN durante el evento de recombinación
específica de sitio, por lo que también se la llama "conservativa".

Estudiaremos dos ejemplos de esta clase de recombinación: el clásico caso de la integración

del genomio del fago λ en un punto concreto del cromosoma de E. coli, y la variación de
fase flagelar por inversión de un segmento de ADN de Salmonella typhimurium.

2.3.1 INTEGRACIÓN DEL GENOMIO DEL FAGO λ EN EL CROMOSOMA DE

E. COLI

Introducción al concepto de fago moderado (avance de lo que veremos en la sección de

Virología):

• Ciclo lítico (vegetativo) y ciclo lisogénico.

• En el estado lisogénico, el ADN de λ se integra en el cromosoma de E.
coli, y mantiene todas sus funciones líticas "desconectadas". En esta
situación se le llama profago, y se comporta como una porción "normal"
del genomio de su hopedador. Eventualmente, el profago puede
inducirse, es decir, sus funciones líticas se activan: el profago se escinde
del cromosoma bacteriano, se circulariza y conecta todos los genes cuya
expresión conducirá a la producción de muchas partículas del virus, que
terminan lisando la célula, y liberándose para reiniciar el proceso.
• Observen las diferencias en el mapa del ADN del fago: cuando se
encuentra dentro de la partícula del virus (ADN c.d. lineal: A.....attP....R),
 pero al entrar a la bacteria, se circulariza. Como profago también es
lineal, pero con un orden distinto al de la partícula del fago antes de la
infección (......A R........).

El paso del ADN del fago desde su forma circular (vegetativa) a la forma de profago (ciclo
lisogénico) se debe a un fenómeno de recombinación específica de sitio, en el que están
implicadas las secuencias attP (del fago) y attB (de la bacteria). La zona attB está situada
entre los operones gal y bio del cromosoma de E. coli.

Cada una de las zonas att está compuesta de una secuencia central (núcleo, "O"), de 15 p.b.,
y de dos regiones adyacentes, llamadas brazos. Los núcleos de attP y de attB son
exactamente idénticos, mientras que los 4 brazos (los dos del fago, P y P', y los dos de la
bacteria, B y B') son diferentes del núcleo y diferentes entre sí.

El evento de integración se puede representar así:

attP X attB  attL + attR

Si atendemos a la nomenclatura a base de núcleos y brazos, tenemos:

POP' X BOB'  BOP' + POB'

Este proceso requiere la actuación de dos tipos de proteínas:

• Int: la integrasa, codificada por el gen int del fago λ .

• IHF (=factor de integración del hospedador), codificado por dos
genes de la bacteria (himA, himD).

La escisión es, desde el punto de vista "mecánico", la inversa de la reacción anterior para
regenerar el ADN circular del fago, mediante la recombinación específica:

attL X attR  attP + attB

(BOP' X POB'  POP' + BOB')

Ahora bien, para esta reacción hace falta, aparte de las proteínas Int e IHF, una segunda
proteína producida por λ : proteína Xis (llamada también escisionasa). La razón de una
proteína adicional para revertir el proceso de la integración cobra su sentido si pensamos en
que la combinación de brazos que rodea a los núcleos es distinta en la integración y en la
escisión. La proteína Xis confiere la "especificidad" para reconocer las secuencias attL y
attR. Por lo demás el proceso de escisión implica un mecanismo similar al de la integración
(que es lo que vamos a estudiar a continuación).

Aspectos moleculares de la integración del fago λ

Se reconocen cortas secuencias de homología entre el ADN del fago y de la bacteria:
concretamente las zonas homólogas "O" tienen solamente 15 p.b.

Se producen cortes específicos en cada una de las cadenas, en posiciones equivalentes,

de modo que quedan extremos protuberantes 5' con 7 nucleótidos en cadena sencilla.

La reacción de la integrasa se parece a la de las topoisomerasas de tipo I: rompe una cadena

de ADN en cada uno de los sitios att, manteniendo fijos los extremos recién cortados. La
cadena intacta de cada sitio att pasa a través del hueco abierto. A continuación, el extremo
3' de un sitio att es unido al extremo 5' del otro sitio att. La operación que acabamos de
describir se repite con las otras cadenas que antes habían quedado intactas. Al igual que las
topoisomerasas de tipo I, la integrasa no requiere ATP, ya que la energía del enlace
fosfodiéster cortado se conserva en forma de enlace covalente entre el extremo recién
cortado y la propia enzima. Esta "energía" es la que luego se emplea en la operación de
empalme (creación de un nuevo enlace fosfodiéster).

El proceso que hemos descrito ocurre por medio de una gran partícula formada por muchas
unidades de Int y de IHF (unas 70 copias de IHF y de 20-40 de Int). Esta partícula
reconoce primero el sitio attP (del fago), siempre que el ADN esté superenrollado
negativamente. El ADN del fago de la zona attP se arrolla alrededor de la partícula
multiproteica, a la manera en la que se empaqueta el ADN en los nucleosomas. Por esta
razón, a esta partícula que lleva arrollado el ADN del fago se la denomina intasoma. Una
vez que el attP ha establecido los contactos específicos con las proteínas Int e IHF del
intasoma, éste "captura" a la secuencia attB de la bacteria, haciendo que ambas att queden
perfectamente alineadas para proceder a la recombinación específica.

2.3.2 INVERSIÓN DE SEGMENTOS DE ADN POR RECOMBINACIÓN

ESPECÍFICA CONSERVATIVA

(Nota aclaratoria: lo que vamos a describir a continuación es un proceso de

recombinación específica dentro de un mismo genomio. O sea, aquí no podemos
hablar estrictamente de exogenote ni endogenote, ya que no hay un fenómeno
previo de transferencia de ADN. Sin embargo, lo estudiamos en esta sección, ya
que el mecanismo es del mismo tipo que el que acabamos de ver para la
integración del fago λ ). Además esta inversión sirve como mecanismo de
adaptación al medio, ya que permite la regulación de ciertos genes bajo
determinadas condiciones.

Desde hace tiempo se venía observando que ciertas propiedades de algunas bacterias
cambian su fenotipo con una frecuencia varios órdenes de magnitud superior a la tasa de
mutación espontánea. Además, se da la circunstancia de que estos cambios son también
reversibles. Algunos ejemplos:

• antigenicidad flagelar;
• antigenicidad de pelos (fimbrias adhesivas);
• adhesividad;
• virulencia de ciertas cepas patógenas, etc.
Se ha visto que muchos de estos fenómenos de inestabilidad fenotípica reversible se deben
a un mecanismo de recombinación específica de sitio, por el que un segmento definido de
ADN cambia su orientación (o sea, se invierte respecto de su polaridad anterior). Uno de
los casos mejor estudiados es el de la transición de fase flagelar en Salmonella
typhimurium:

Dado un clon original homogéneo respecto del tipo de flagelina, al cabo de poco tiempo de
crecimiento, se puede observar que se han producido dos subpoblaciones diferenciadas
respecto del tipo de flagelina:

• subpoblación con flagelos a base de flagelina H1;

• subpoblación con flagelos a base de flagelina H2.

Cada flagelina se produce por un gen distinto.

La transición desde un tipo de flagelina al otro se da con alta frecuencia (aprox. 10--3, frente
a sólo 10--7 para la frecuencia de mutación espontánea). Veamos cómo ocurre:

El segmento invertible contiene el gen hin (que deriva su nombre de H-inversion), el cual
codifica una recombinasa específica ("invertasa"), que reconoce los terminales
inversamente repetidos (IR) de 14 pb que limitan a dicho segmento. El efecto de la
enzima es aproximar entre sí a los dos IR, para luego efectuar los cortes y empalmes
específicos, actuando como una topoisomerasa de tipo I.

Otros ejemplos de inversión específica de segmentos:

• En ciertos fagos existe un segmento invertible de ADN, de modo que en

cierta orientación el fago infecta a determinadas especies y cepas
bacterianas, mientras que la otra orientación le suministra al fago la
capacidad de infectar otras cepas e incluso especies distintas (ello se
debe a que en cada orientación el segmento induce la síntesis de tipos
distintos de fibras para adsorberse sobre distintas bacterias) . Por
ejemplo, el fago Mu: posee el segmento "G", invertible por el producto
del gen gin; ello le permite cambiar de bacteria hospedadora (puede
cambiar de Escherichia coli a Citrobacter); el fago P1: posee el segmento
"C", invertible por el producto del gen cin. Los genes hin, gin, cin y otros
están relacionados evolutivamente entre sí y con otros genes
codificadores de recombinasas específicas, incluyendo las resolvasas de
algunos transposones (las resolvasas serán estudiadas en el apartado
sobre los elementos genéticos transponibles).
• La síntesis de fimbrias adhesivas de ciertas cepas patógenas de
Escherichia coli viene regulada por una secuencia invertible.

Significado evolutivo del mecanismo de inversión específica de ADN:

• Permite cambios adaptativos rápidos y reversibles ante posibles

cambios rápidos en determinadas condiciones del medio ambiente que
son importantes dentro del nicho ecológico de la bacteria.
 • Algunas bacterias patógenas usan este sistema para escapar al sistema
inmunitario del hospedador al que parasitan. Por ejemplo, la variación
de fase de fimbrias en Neisseria: en algunas especies patógenas de
este género (gonoco, p. ej.) existen varios genes de pilina, cada uno
capaz de codificar una pilina antigénicamente distinta de las demás.
Cada clon de la bacteria transcribe en cada momento solamente uno de
estos genes, permaneciendo los demás silenciosos. Pero con una
elevada frecuencia (10--3) se producen recombinaciones específicas entre
una copia silenciosa y la versión que hasta el momento estaba activa.
Esto hace que a partir de ahora sea la nueva versión la que se exprese:
da origen a una nueva pilina, para la que el sistema inmune del
hospedador no tiene anticuerpos, lo que da una ventaja a la bacteria en
su capacidad de patogenia.

2.4 RECOMBINACIÓN ESPECÍFICA "ILEGÍTIMA": PROPICIADA

POR ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES

2.4.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS ELEMENTOS GENÉTICOS

MÓVILES Y DE LA TRANSPOSICIÓN EN LAS BACTERIAS

Los elementos genéticos transponibles "saltan" de un lugar a otro de los genomas por un
mecanismo de recombinación no homóloga "ilegítima", es decir, que no depende de
homologías entre el elemento y la zona de genomio a la que este elemento va a
transponerse (esta última se suele denominar secuencia diana).

En general, las enzimas que catalizan ese proceso se denominan transposasas. La

transposasa corta el ADN "donador" en los extremos del elemento transponible, y luego los
inserta en el ADN diana, aunque los detalles varían entre las distintas clases de elementos
móviles. La mayor parte de los elementos transponibles permanecen unidos durante el
evento de transposición a ADN contiguo (es decir, nunca llegar a estar "libres", sino
permanecen ligados por alguna de sus cadenas al ADN donador o al ADN diana).

Muchos elementos transponibles bacterianos tienen un mecanismo replicativo: la

transposición se realiza por un tipo especial de replicación del elemento transponible, de
modo que queda una copia del mismo en la posición original, mientras otra copia se inserta
en una nueva posición, bien sea del mismo replicón, bien sea de otro replicón distinto del
original y presente en la misma célula (p. ej., un plásmido). Por ello se habla en estos casos
de recombinación ilegítima duplicativa. Pero también hay elementos transponibles que
siguen un modelo no duplicativo, a veces llamado de "cortar y pegar", porque el elemento
se escinde de su localización original y se inserta en una nueva.

Todos los elementos genéticos transponibles poseen terminales inversamente repetidos

(IR), es decir, la secuencia de un extremo en una cadena, leída en sentido 5’ 3’ es
idéntica (o casi) a la secuencia del otro extremo de la otra cadena, también leída en su
sentido 5’ 3’.
Un rasgo general de la transposición es que una vez acabada ésta, el elemento móvil
aparece "emparedado" entre copias directas de la secuencia diana. Ello se debe a que la
transposición implica la duplicación de dicha secuencia. Las secuencias diana suelen ser de
pocos pares de bases, y aunque dicha secuencia no suele ser específica (varía de un evento
a otro de transposición del mismo elemento), cada elemento transponible suele conllevar la
duplicación de secuencias de una longitud determinada (algunos elementos tienen dianas de
4 pb., mientras otros las tienen de 9 pb, etc.).

Aunque el lugar de la transposición no tiene especificidad de secuencia diana, tampoco es

un fenómeno aleatorio. Se sabe que algunos transposones prefieren insertarse en sitios con
determinadas propiedades de ADN, como grado de superenrollamiento, de metalición, o
susceptibilidad a la transcripción.

2.4.2 TIPOS DE ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES EN BACTERIAS:

Secuencias de inserción (IS):

• Son elementos pequeños (del orden de 1000 pb., o menos), dotadas en

sus extremos de terminales inversamente repetidos (IR), de unos 15 a
25 pb.
• Normalmente sólo poseen un gen, que codifica la transposasa. Por lo
tanto, a diferencia de los transposones, no confieren fenotipo
seleccionable.
• En los genomios de muchas bacterias existen varias copias de cada tipo
de IS. Por ejemplo, en Escherichia coli K12 existen unas 6 copias de IS1,
7 de IS2, etc. Los plásmidos, especialmente los conjugativos suelen ser
ricos en IS (un ejemplo de esto lo veremos en el tema 27, cuando
hablemos del plásmido F de E. coli).
• La frecuencia de transposición varía según el tipo de IS, pero en general
oscila entre 10--3 y 10--4 por división celular. La inserción de una IS en un
gen concreto ocurre a una frecuencia de 10--5 y 10--7, es decir, del orden
de la frecuencia de mutaciones espontáneas puntuales. La reversión de
la inserción (por escisión exacta de la IS) es menos frecuente: 10--6 a 10--
10
por generación.

Transposones (Tn):

Son elementos de mayor tamaño que los IS (desde casi 3.000 pb hasta más de 20.000 pb).
Poseen al menos un gen para la transposasa y un gen responsable de alguna función no
relacionada con la transposición: concretamente, muchos transposones portan genes cuya
expresión da fenotipos fácilmente seleccionables o detectables (p. ej.: resistencia a
antibióticos o a metales pesados). Estos genes marcadores son muy útiles, ya que facilitan
grandemente el estudio de estos transposones en laboratorio.

Dentro de los transposones bacterianos podemos distinguir dos subtipos principales:

• Transposones compuestos, cuyos extremos son dos secuencias de

inserción idénticas o casi idénticas. Dentro de esta clase, algunos
 poseen las dos copias de IS en la misma orientación, mientras que otros
las poseen en orientaciones opuestas; sin embargo, como a su vez las IS
poseen cortos terminales inversamente repetidos (IR), todos los
transposones citados tienen este tipo de secuencias IR. Se comportan
como las respectivas IS, que son las responsables de la transposición.
Precisamente, la transposición depende de una o de ambas copias de la
IS. En su mecanismo de transposición pueden dar, como productos
finales, cointegrados de replicones y transposiciones. Ejemplos:

Tn10: formado por dos IS10 casi idénticas, que "emparedan"

a un gen de resistencia a la tetraciclina (TetR).

Tn5: dos copias casi idénticas de IS50 (de hecho, sólo

difieren en un nucleótido), que "emparedan" un gen de
resistencia a kanamicina (KmR) y un gen de resistencia a la
estreptomicina (StrR).

Tn9: dos copias idénticas y en la misma orientación de la IS1,

enmarcando a un gen de resistencia a cloramfenicol (CmR).

• Transposones no compuestos: carecen de IS, y sus extremos son dos

cortas secuencias inversamente repetidas (IR). Llevan en su porción
central un gen para la transposasa, y a veces también un gen para la
resolvasa y/o para la regulación de la transposición. Suelen dar sólo
transposiciones, siendo los cointegrados únicamente una fase transitoria
que actúan como intermediarios del mecanismo de transposición. Los
cointegrados se deshacen (se "resuelven") por una resolvasa codificada
por el mismo transposón. Existen muchos ejemplos de este tipo, que se
pueden agrupar en "familias" que presentan un origen evolutivo común:
Citaremos la denominada familia de TnA, que incluye Tn1 (AmpR), Tn3
(AmpR), Tn1000, etc. Los miembros de una misma familia comparten el
mismo tipo de sistema de transposa/resolvasa, pero cada miembro
puede contener genes de resistencia (u otros) totalmente diferentes,
que han debido de aquirir independientemente a lo largo de la
evolución. Una clave de cómo han podido adquirirlos la da una categoría
especial de transposones, llamada integrones.

Integrones (In):

Los integrones son un nuevo tipo de elementos transponibles dotados de terminales

inversamente repetidos (y a menudo con marcadores de resistencia a antibióticos o a
metales pesados) que se caracterizan por poseer un gen codificador de una integrasa. Se
transponen como una IS o un Tn, pero además, la integrasa les ha capacitado
evolutivamente para realizar una recombinación específica de sitio (al estilo de la Int del
fago λ ) por la que han incorporado a su estructura algún gen procedente de otro elemento
genético. Los integronenes pueden a su vez formar parte de transposones mayores (p. ej., el
Tn21 es un gran transposón que codifica múltiples resistencias a antibióticos, y dentro de él
se encuentra el integrón In2, que contiene su propio gen int (integrasa), que se sitúa al lado
de un gen de resistencia a estreptomicina "capturado" (por recombinación específica) de
otro elemento genético (se ignora de dónde).

2.4.3 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA TRANSPOSICION:

• Las transposasas reconocen los terminales inversamente repetidos del

transposón, y cortan en los extremos (en este sentido se dice que la
transposición es específica, pero sólo respecto de las secuencias del
elemento transponible).
• Por otro lado, las transposasas cortan también en una secuencia diana
más o menos aleatoria del sitio a donde se van a transponer
(inespecificidad respecto del "endogenote", por lo que se llama a esta
recombinación "ilegítima"). Los cortes son en ambas cadenas, pero en
situaciones ligeramente separadas entre sí en las dos cadenas.
Posteriormente hay empalmes entre las cadenas cortadas del Tn y de la
diana.
• La transposición duplicativa implica la replicación de la corta secuencia
diana (dependiendo del transposón puede ser de 4 hasta 12 pb.) y la
replicación del propio transposón (por ello se habla de recombinación
ilegítima duplicativa).
• Al final de una transposición duplicativa encontramos una copia del Tn
en el sitio original, y otra copia en el sitio receptor, limitada por sendas
repeticiones directas de la corta secuencia diana (como acabamos de
decir, una de estas repeticiones surge por replicación durante el proceso
de la transposición).

Veamos un poco más en detalle el mecanismo de transposición de un transposón típico, el

Tn3

Breve descripción del Tn3: es un transposón de una 5 kb., cuyos extremos son terminales
inversamente repetidos de 38pb. Posee 3 genes, de los cuales dos están implicados en la
transposición:

• tnpA: codifica la transposasa (enzima de recombinac. "ilegítima", propia

de este Tn).
• tnpR: codifica la resolvasa (enzima de tipo recombinasa específica de
sitio-conservativa, parecida a las que hemos estudiado en el apartado
2.3). Como veremos, la resolvasa actúa también como reguladora de la
transposición).
• bla: codifica una β -lactamasa (responsable del rasgo fenotípico AmpR
de resistencia a la ampicilina conferido por este transposón).
• Observar que, además, existe una secuencia no codificadora, llamada
res (=IRS), que como veremos, interviene durante la fase de resolución
de los cointegrados.

Modelo de transposición de Tn3: ocurre en dos etapas:

1. Formación de un cointegrado entre el replicón donador y el replicón

receptor, reacción que depende de la transposasa. En más detalle:
 a. la transposasa reconoce los terminales IR del Tn3, y realiza dos
cortes, uno en cada cadena, pero cada corte en un extremo
distinto;
b. la transposasa corta en el ADN diana, en cada cadena, en
posiciones separadas por unos pocos nucleótidos;
c. cada extremo protuberante de la secuencia diana se une a un
terminal cortado del Tn3. Observar que en este momento
tenemos una estructura en X, pero con "mellas" de cadena
sencilla a ambos lados del Tn, correspondientes cada zona de
cadena sencilla a una de las hebras de la corta secuencia diana.
d. El extremo 3' que hay delante de cada mella sirve ahora como
cebador para un proceso de síntesis reparativa de ADN. Así pues,
a partir de cada "mella" surge una horquilla de replicación, que
avanza hacia el interior del transposón, hasta llegar al otro
extremo. cuando cada onda replicativa llega hasta el extremo
opuesto, se detiene, y vuelve a intervenir una actividad ligasa que
sella las cadenas.
e. El resultado final es un cointegrado, en el que los dos
replicones originales están unidos a través de dos copias
"directas" (en la misma orientación) del transposón.
2. Resolución del cointegrado: la resolvasa específica del transposón
reconoce las dos secuencias res (una por cada copia del Tn3), y realiza
una reacción de recombinación específica conservativa, análoga a la
reacción de escisión del fago λ . El resultado de esta acción es que se
regenera el replicón donador, con una copia del Tn3, y aparece una
nueva copia del Tn3 en el replicón receptor, limitada por dos
copias en la misma orientación de la secuencia diana. Observar
que cada copia del transposón es en realidad un "mosaico": debido al
fenómeno de resolución, cada cadena de cada copia consta de una
porción de ADN de nueva síntesis, generada en el paso de formación de
cointegrado. Es decir, no existe una copia "vieja" en el lugar original y
una copia "nueva" en el nuevo, sino que las dos copias tienen partes
parentales y de nueva síntesis en cada cadena.

2.4.4 REGULACION DE LA TRANSPOSICION Y POSIBLE SIGNIFICADO

EVOLUTIVO

Muchos transposones, una vez que se han integrado en un replicón, no pueden insertarse de
nuevo en ese mismo replicón, sino que han de hacerlo en otra molécula de ADN. Esto se
debe a que poseen mecanismos que impiden que el elemento transponible sature de
inserciones una misma molécula de ADN. Ejemplos:

• la proteína codificada por el gen tnpR del Tn3, además de actuar como
resolvasa, interviene como represor del gen tnpA (que codifica la
resolvasa), y de su propio gen.
• Algunos transposones, como Tn10, sólo se transponen inmediantamente
después de que haya pasado por ellos la horquilla de replicación. En esta
situación transitoria, el ADN del elemento se encuentra hemimetilado, y
 al parecer es esta condición la que activa el promotor de su transposasa
así como a sus terminales.

En general, los transposones se pueden considerar como ejemplos de lo que se ha dado en

llamar "ADN egoísta": porciones de material genético cuyo aparente único "objetivo" es
perpetuarse en la célula por medio de su capacidad de crear copias transponibles de sí
mismo, aunque no estén sometidos a presión selectiva directa por parte del medio
ambiente. Sin embargo, si los transposones fueran demasiado egoístas, podrían llegar a
"saturar" de sus copias al genomio "hospedador", llegando a inactivarlo. Parece ser que la
evolución ha llegado a una especie de "solución de compromiso" entre la tendencia del
transposón de "moverse" ilimitadamente (lo cual provocaría inactivación insercional de
numerosos genes), y la necesidad de conservar la integridad de las funciones de la bacteria.
Esto se traduce precisamente en la existencia de distintos mecanismos que limitan el
número de inserciones de un mismo elemento transponible dentro de un determinado
replicón.

2.4.5 CONSECUENCIAS GENÉTICAS DE LA TRANSPOSICION

Los transposones y secuencias de inserción causan una amplia gama de alteraciones

genéticas que pueden a su vez ser fuente de variabilidad genética sobre la que pueden
actuar las fuerzas selectivas del ambiente, para "alimentar" los procesos evolutivos.

Veamos algunas de las alteraciones genéticas propiciadas por elementos genéticos móviles:

1. La más obvia e inmediata es la inactivación insercional de un gen

donde se hayan transpuesto: rompen la continuidad del gen, generando
mutaciones que inactivan la función de dicho gen. Si el gen forma parte
de un operón policistrónico, la mutación tiene efectos polares sobre la
transcripción de los genes distales del operón, debido a que el elemento
transponible suministra de zonas susceptibles de generar horquillas en
el ARNm que actúan como terminadores de transcripción dependientes
de ρ . La inserción de un elemento transponible en un gen u otra zona
de material genético se representa indicando el nombre del transposón,
seguido de ::, y finalizando con el nombre del gen o de la zona de ADN.
Ejemplo, si una copia de IS1 se ha insertado en el gen lacZ, esto se
representa como IS1::lacZ.
2. Algunas secuencias IS (p. ej., IS2, IS3), y algunos transposones (como
Tn5 y Tn10) en una de sus orientaciones, pueden activar la expresión de
genes adyacentes al sitio de integración. Esto se debe a que estos
elementos transponibles poseen potentes promotores que propician
transcripción "hacia fuera" respecto del propio elemento.
3. Algunos transposones e IS sufren escisiones anómalas que "arrastran"
consigo material genético adyacente: esto provoca grandes
delecciones en los replicones donde previamente se habían insertado.
4. Los Tn e IS pueden actuar como regiones portátiles de homología:
a. por ejemplo, dos transposones idénticos, situados en lugares
diferentes del cromosoma, pueden recombinarse por medio de
la enzima RecA de la recombinación general, dando lugar a
 inversiones del material intercalado (situado entre los dos
elementos).
b. Otro caso: dos transposones idénticos, cada uno situado en un
replicón distinto, pueden recombinarse por RecA, dando fusión
de replicones. Precisamente esta es la base de la producción de
cepas Hfr a partir de las cepas F+: como veremos en el tema de
conjugación, tanto el plásmido F como el cromosoma poseen
copias de determinadas IS; dichas copias son reconocidas con
cierta frecuencia por el sistema de recombinación homóloga, que
las recombina (recombinación con un solo crossing-over), lo cual
lleva a la fusión del plásmido F con el cromosoma bacteriano.
5. Producción evolutiva de transposones complejos a partir de IS o
de transposones más sencillos. Imaginen un gen que codifique una
resistencia a algún antibiótico; supongamos que un determinado IS se
inserta en las cercanías de este gen. Pasado el tiempo, puede ocurrir
que otra copia de esa secuencia IS se inserte cerca de ese gen, pero por
el otro flanco. Observen que ahora tenemos un transposón compuesto
(de los que tienen extremos que son IS). Este nuevo transposón se
comporta como una unidad, usando las funciones de transposición de
uno de los IS. Esta es precisamente una de las bases genéticas que
explican la aparición y diseminación de cepas bacterianas resistentes a
antibióticos: desde que el hombre inauguró la era de los quimioterápicos
a mediados de este siglo, estamos asistiendo a un auténtico proceso de
evolución rápida de transposones complejos, algunos de los cuales
portan varios genes de resistencia (frente a varios antibióticos). Los
transposones pueden "pasar" a gran variedad de replicones, incluyendo
plásmidos conjugativos, que van diseminando al transposón por gran
variedad de cepas bacterianas, incluidas patógenas. Como se puede
imaginar, esto constituye un problema de primer orden, ya que puede
limitar e incluso impedir una adecuada terapia por antibióticos en
numerosas infecciones bacterianas. En el tema 27 hablaremos más
sobre los plásmidos de resistencia (plásmidos R) y sobre su carácter
"modular", es decir, el hecho de que en buena parte están "cosntruidos"
a base de módulos o "cassettes" formados por transposones, IS,
transposones anidados (un transposón dentro de otro), etc.

2.4.6 EMPLEO DE TRANSPOSONES COMO HERRAMIENTAS EN ESTUDIOS

GENÉTICOS

Para finalizar este apartado sobre los elementos genéticos móviles, diremos que los
transposones bacterianos se han convertido en poderosas herramientas para el análisis
genético y para la manipulación genética. Por ejemplo:

• Para realizar mutagénesis por inserción. El seguimiento, búsqueda y

estudio de los mutantes generados por transposones que portan genes
de resistencia a algún antibiótico es muy fácil y cómodo, ya que la
inactivación insercional de un gen va acompañada de la aparición del
fenotipo de resistencia al antibiótico codificado por el transposón (es
decir, los transposones actúan como "marcadores" genéticos portátiles
fáciles de seguir.
 • Los elementos genéticos móviles se pueden emplear como regiones
portátiles de homología, que pueden facilitar determinadas
transferencias conjugativas.
• Se pueden crear genotecas (bibliotecas de genes) derivadas por
transposición aleatoria de un Tn a distintos lugares de un genomio.
• Con determinados Tn se pueden generar frecuentes delecciones.

Pero además, la conjunción del empleo de transposones portados por plásmidos o por
fagos, junto con las técnicas de Ingeniería Genética in vitro, y otras técnicas de
manipulación genética, constituyen un arsenal muy poderoso que está haciendo avanzar de
forma espectacular nuestros conocimientos de las bacterias y nuestro potencial de "diseñar"
de forma preconcebida nuevas combinaciones genéticas (genes híbridos artificiales,
"creación" de nuevas rutas metabólicas no existentes en la naturaleza, etc...)

3. SISTEMAS DE RESTRICCIÓN Y MODIFICACIÓN

3.1 INTRODUCCION Y APROXIMACIÓN HISTÓRICA

En la introducción a este capítulo ya aludimos a los varios destinos que puede experimentar
el material genético del exogenote una vez que entra al endogenote:

• si el exogenote es un replicón funcional (que posee un origen de

replicación capaz de ser reconocido por la maquinaria replicativa de la
célula receptora), este exogenote permanece como tal replicón en
estado autónomo (por ejemplo, plásmidos).
• El exogenote puede recombinarse con el endogote, mediante algunos de
los procesos recombinativos descritos en la 10 parte de este tema.
• Pero el exogenote puede sufrir otra alternativa: puede ser reconocido
como "extraño" por parte de la célula hospedadora, por medio de
un fenómeno enzimático llamado restricción, que conduce a la
destrucción de este exogenote. Este va a ser el objeto de estudio de esta
2ª parte del tema 24.

La restricción es un sistema que poseen muchas cepas bacterianas, y representa una especie
de "barrera" frente a la permanencia de ADN extraño que hubiera podido entrar por alguno
de los sistemas que estudiaremos en los capítulos siguientes. De esta forma, las bacterias
evitan la "promiscuidad" en los intercambios genéticos. El posible significado adaptativo de
este tipo de sistemas es el de conferir "inmunidad" frente a exogenotes (por ejemplo, fagos)
que pudieran poner en peligro la individualidad genética e incluso la superviviencia de la
bacteria en cuestión.

La restricción va asociada a un sistema "paralelo" de salvaguardia del ADN de la bacteria

frente al propio sistema de restricción. Este sistema de protección del ADN propio se
denomina modificación, y mediante él, el ADN queda "marcado" químicamente por
metilación de determinadas secuencias.

La restricción y modificación fue descubierta en 1968, a resultas de una serie de estudios

sobre la infección del fago λ en dos cepas diferentes de Escherichia coli (las llamadas
cepas "K12" y "B"):

Observar que los fagos obtenidos por infección en cada una de las cepas están
"restringidos" a crecer en el mismo tipo de cepa del cual proceden.

Ahora bien, como se puede ver, cuando se intenta infectar una cepa con fagos obtenidos a
partir de la otra cepa, la restricción no es total: siempre hay un pequeño porcentaje (del
orden de 1 en 10 000) de fagos que "escapan", y que después de esto pueden crecer en la
otra cepa con eficiencia de 100%. Explicación:

• Cada cepa posee una actividad endonucleasa que reconoce como

extraño al ADN del fago crecido en la otra, y lo destruye. A este tipo de
endonucleasas se las denomina endonucleasas de restricción, o más
abreviadamente, restrictasas.
• Con baja frecuencia, el ADN de un fago puede "escapar" a la restricción
de la cepa opuesta a donde ha crecido. Una vez que ha escapado, este
ADN es reconocido como "propio" por parte de esta cepa, de modo que
este fago podrá crecer con total eficiencia (100%) en dicha cepa. La
razón es que el ADN es modificado químicamente por el hospedador, de
modo que queda protegido de la correspondiente restrictasa de esa
misma cepa. La modificación química consiste en la introducción de
grupos metilo (CH3-) en determinadas bases dentro de determinadas
secuencias del ADN, lo cual está catalizado por una metilasa
específica.

Se han descrito varios tipos distintos de sistemas de modificación-restricción (M-R), según

sus mecanismos de acción generales, pero nosotros sólo trataremos los dos mejor
concocidos: M-R tipo I, tipo II.

3.2 SISTEMAS M-R DE TIPO I.

Fueron los primeros en ser descritos. Precisamente el ejemplo típico lo constituye el caso al
que acabamos de hacer referencia en la página anterior. La cepa K12 de E. coli posee el
sistema llamado EcoK, y la cepa B posee el llamado EcoB. Lo característico de los
sistemas M-R de tipo I es que las actividades de modificacación y las de restricción están
producidas por un complejo multiproteico (multimérico), que realiza los dos tipos de
actividades. Ejemplo: Complejo de EcoK posee 2 subunidades R (con actividad nucleasa
de restricción), 2 subunidades M (con actividad de metilación)y 1 subunidad S (confiere
especificidad de reconocimiento de secuencia al complejo).
 • Reconocen secuencias relativamente grandes, que no presentan
simetrías.
• La actividad endonucleasa (de las subunidades R) no corta dentro de
la secuencia reconocida, sino lejos de ella, a distancias variables (del
orden de unos 1000 pb., y en lugares inespecíficos.
• Por otro lado, la actividad nucleasa va acompañada de hidrólisis de
ATP
• La actividad metilasa del complejo hace uso de S-adenosil-metionina
(SAM) como donador de los grupos metilo.

Veamos en más detalle el comportamiento del complejo del complejo EcoB. Observen que
el complejo se comporta de modo diferente según que actúe sobre ADN de tipo parental
previamente metilado en ambos cadenas, o de que actúe sobre ADN hemimetilado
(situación que se produce inmediatamente después de la replicación), o sobre ADN no
metilado en la secuencia-diana (que sería reconocido como "extraño"):

• sobre ADN metilado: es reconocido como "propio" (merced a la

subunidad S); no sufre ninguna reacción por parte de EcoB.
• sobre ADN hemimetilado: las subunidades M metilan la cadena no
metilada (cadena hija de nueva síntesis).
• sobre ADN no metilado: es reconocido como "extraño". Interviene la
actividad restrictasa, con hidrólisis de ATP. El ADN es destruido.

3.3 SISTEMAS M-R DE TIPO II

Observen las diferencias con respecto a los de tipo I:

• Las actividades metilasa y restrictasa están en proteínas distintas

que no forman complejos multifuncionales.
• No requieren ATP. Sólo necesitan iones Mg++ para funcionar. La
metilasa, además, usa SAM como donador de metilos.
• Cada miembro de la pareja de modificación y restricción reconoce la
misma secuencia específica de ADN.
• La secuencia reconocida consiste siempre en un corto número de pares
de bases. Típicamente consta de 4 o 6 p.b. que constituyen una
secuencia palindrómica o con una simetría patente.
• La metilasa suele ser una proteína monomérica, que introduce grupos
metilo en una A o en una G (según la metilasa en cuestión), en ambas
cadenas, dentro de la secuencia reconocida.
• La restrictasa suele ser una proteína formada por dos subunidades del
mismo tipo, ensambladas simétricamente. Muchas restrictasas cortan
dentro de la secuencia, dejando extremos protuberantes mutuamente
cohesivos, o extremos romos (según la restrictasa en cuestión). Algunas
restrictasas dejan extremos protuberantes 5', mientras que otras dejan
extremos protuberantes 3'.
El mecanismo general de las restrictasas de tipo II es más sencillo que las de tipo I: cada
subunidad del dímero reconoce la misma secuencia, presente en cada una de las partes
especulares del palíndromo, y realiza un corte en un lugar específico, que obviamente tiene
su correspondiente en la otra cadena de la otra mitad del palíndromo.

Existen cientos de restrictasas de tipo II (y se están descubriendo continuamente). Más de la

tercera parte de las cepas bacterianas presentan al menos un sistema M-R de tipo II.
Muchas de ellas son codificadas a partir de genes situados en plásmidos.

Se habla de isosquizómeros para referirse a aquellas restrictasas que, siendo diferentes y

procediendo de especies distintas, reconocen y cortan la misma secuencia, dejando el
mismo tipo de extremos.

No hace falta insistir en la importancia práctica de las restrictas de tipo II, como
herramientas básicas -junto con la ADN ligasa- en la Ingeniería Genética. El biólogo cuenta
con un impresionante "arsenal" -comercializado- de enzimas (no sólo las que acabamos de
citar) para manipular a placer el ADN de cualquier ser vivo...(pero esta es ya otra historia,
que el alumno interesado irá conociendo en esta y en otras asignaturas).

CONCEPTO Y APROXIMACIÓN HISTÓRICA

La transformación se puede definir como la variación hereditaria de una célula bacteriana
susceptible, originada por la captación de ADN desnudo libre en el medio, con la
posterior recombinación del exogenote con el genomio de la célula en cuestión
(endogenote). Tras la transformación, la célula que ha recibido el ADN se suele denominar
transformante.

Recordemos brevemente los hitos históricos que jalonan el descubrimiento de la

transformación en bacterias:

• La transformación fue el primer proceso de transferencia genética que se describió

en los procariotas, y este hallazgo constituyó la base para suministrar el primer dato
incontrovertible acerca de la naturaleza química del material genético: a partir de
1944 empezó a quedar claro que era el ADN el portador de la información genética
de los seres vivos.
• Todo comenzó con los trabajos de Griffith (1928) sobre el neumococo. Recuérdense
sus clásicos experimentos con las cepas S (lisas, capsuladas y virulentas) y R
(rugosas, no capsuladas y avirulentas), inoculadas en ratones:

cepas S vivas inoculadas en ratones  ratón muere

cepas R vivas inoculadas en ratones  ratón vive

cepas S muertas por calor ratón vive

 cepas S muertas por calor + R vivas  ratón muere. La autopsia revela la
presencia de neumococos vivos virulentos (tipo S).

• Ni Griffith ni los investigadores de la época se dieron cuenta de la importancia de

este resultado, ni sacaron la conclusión pertinente: que una sustancia que confiere
una nueva propiedad heredable a un organismo (la "sustancia transformante"
procedente de las S muertas y que captan las R vivas) debe a su vez ser capaz de
replicación. (De hecho, y aunque ahora nos parezca mentira, Griffith pensaba que el
principio transformante era el polisacárido capsular de las cepas S, ausente en las
cepas R).
• En 1944 el equipo formado por Avery, MacLeod y McCarty descubrió la naturaleza
del misterioso "principio transformante": el ácido desoxirribonucleico (ADN). Ellos
lograron desarrollar un sistema in vitro, en el que iban ensayando diversas
fracciones (con diferentes componentes) procedentes de las células S virulentas
frente a células R vivas. (A pesar de los elegante experimentos, la comunidad
científica no los aceptó inmediatamente (), en parte debido a que se suponía más
lógico que el material de la herencia fuera algún tipo de proteínas. Al fin y al cabo,
las proteínas tienen una enorme variedad, a base de 20 tipos de aminoácidos. ¿Qué
diablos podía significar que el ADN fuera el material genético, cuando se sabía que
era una molécula monótona e insulsa a base de sólo cuatro tipos de bases
nitrogenadas en proporciones casi semejantes?).
• El siguiente paso importante sobre la transformación lo da Hotchiss (1949), que
realiza ensayos in vitro al estilo de los de Avery y compañía, pero con ADN
extremadamente puro. Los remisos contestatarios no tuvieron más remedio que
empezar a batirse en retirada. Como sabemos, los últimos incrédulos (que en los
años 40 eran la mayoría) sólo se convirtieron (tras el correspondiente
arrepentimiento y propósito de enmienda) cuando Hershey y Chase (1952)
realizaron sus ingeniosos experimentos de marcado del ADN y de las proteínas de
un fago. Poco más tarde irrumpieron Watson y Crick con su modelo de la doble
hélice, que sugería el modo de duplicación de la información genética ...pero en fin,
todo esto nos aleja de nuestra historia, y no queremos convertir nuestra narración en
un caso de "novela dentro de otra novela", al estilo de Cervantes.

2. TRANSFORMACIÓN NATURAL
2.1 CARACTERES GENERALES DE LA TRANSFORMACIÓN
NATURAL

1. El ADN, para que sea capaz de transformar, ha de ser de cadena doble.

2. Para cada evento de transformación basta la interacción de una sola molécula de
ADN con la célula receptora. Por otro lado, el número de moléculas de ADN que
puede tomar una misma célula es limitado, y presenta una cinética de saturación
(meseta que indica que ya no se pueden captar más moléculas). Observen la cinética
de orden 1 en la primera parte de la curva. A partir de cierta concentración de ADN
transformante, se da la meseta de saturación (no aumenta el nº de colonias
transformadas).
 3. No todas las células de un mismo cultivo son transformables en cualquier momento
del ciclo de crecimiento. La competencia es el estado fisiológico característico
que permite captar ADN del medio exterior. Este estado de competencia es
diferente para cada especie bacteriana capaz de experimentar transformación, y
dentro de cada especie está influido por una serie de parámetros como:

• densidad celular del cultivo

• temperatura
• pH
• nutrientes (fuentes de C o de N, iones...)

Ejemplos:

En Streptococcus pneumoniae la competencia afecta al 100% de las células

en fase exponencial.

En cambio, en Bacillus subtilis solamente una minoría (1-20%) de células se

hacen competentes, y sólo durante la fase estacionaria.

1. Se denomina fase de eclipse durante la transformación al período transitorio

durante el cual, si se extrae el ADN recién entrado (exogenote), este ADN es
incapaz de volver a transformar. Es decir, tras su entrada a la célula receptora, el
ADN del exogenote parece haber "desaparecido" transitoriamente a efectos de
capacidad transformadora (ya veremos por qué).

En la transformación natural de diversas especies bacterianas se dan una serie de fases

comunes a todas ellas, aunque en cada caso existen rasgos propios:

1. Competencia
2. Unión y entrada del ADN exógeno a la célula
3. Fase de eclipse
4. Destino del ADN exógeno (exogenote): recombinación con el endogenote.

En la naturaleza, la fuente de ADN exógeno suele ser la lisis espontánea de células de la

misma especie, que actúan como "donadoras" (una especie de inmolación o suicidio
altruista, para mayor gloria -o sea, para mayor superviviencia- de la especie). En otros
casos no hay lisis, sino que parte de la población bacteriana extruye ADN, que pasa al
medio.

Existen varios géneros con especies que poseen sistemas naturales de transformación:

Entre las bacterias Gram positivas los ejemplos más estudiados son los de:

• Streptococcus
• Bacillus
Entre las bacterias Gram negativas:

• Haemophilus
• Neisseria
• Moraxella
• Acinetobacter
• Azotobacter
• Pseudomonas
• Cianobacterias del gén. Synechococcus

A continuación describiremos algunos de los sistemas de transformación mejor conocidos.

Primero abordaremos los de bacterias Gram positivas, y posteriormente aludiremos más
brevemente a los de Gram negativas, comentando las diferencias de éstas respecto de las
primeras.

2.2 TRANSFORMACIÓN EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS:

Los sistemas de estas bacterias Gram positivas son inespecíficos respecto de la captación
de ADN exógeno: no distinguen entre ADN homólogo (de la misma especie) o ADN
heterólogo (de otras especies). Sin embargo, aunque físicamente puede entrar ADN
heterólogo, éste se recombina posteriormente con el endogenote sólo en el caso de
presentar con él un grado de homología suficientemente alto. Únicamente se recombinan
moléculas de ADN de la misma especie (o en algunos casos, de especies muy cercanas).

Veamos comparativamente los procesos de transformación en el neumococo (S.

pneumoniae) y en B. subtilis:

2.2.1 EN Streptococcus pneumoniae

Desarrollo de la competencia (y modo de unión del ADN a la superficie celular):

Como dijimos, el estado de competencia se encuentra condicionado por una serie de

factores, como densidad celular, temperatura, pH, etc.

• La competencia se desarrolla al final del periodo de crecimiento exponencial

(fase logarítmica);
• Afecta prácticamente a la totalidad de las células del cultivo (100% de células
competentes).
• Conforme las células van creciendo (se van multiplicando), van sintetizando y
excretando al medio un péptido específico (de 5-10 kDa), llamado factor activador
de la competencia (FAC). Este factor no ejercerá su efecto hasta que la densidad
celular alcance un valor del orden de una 107 células/ml, momento en el que el FAC
se habrá acumulado hasta lograr una concentración adecuada para ejercer su
función.
 • Entonces, el FAC se une a un receptor específico de la superficie celular, lo que
provoca (no se sabe cómo) la inducción de la expresión de una serie de genes, que
codifican unas 12 proteínas específicas de la transformación, entre las que se cuenta
una autolisina.
• Esta autolisina provoca una degradación parcial y controlada de la pared celular, de
modo que quedan al descubierto complejos de proteínas que son sitios de unión al
ADN exógeno (existen unos 30-80 sitios de unión por cada individuo de
neumococo).
• El ADN exógeno libre en el medio se une a estos sitios, que cuentan con una
actividad endonucleasa específica de transformación: provoca incisiones en una
de las hebras del ADN c.d. El extremo 3' generado queda unido a alguna proteína
del complejo receptor.

Las incisiones consecutivas en una misma molécula de ADN exógeno están

separadas entre sí por una media de una 6 kb.

Recordemos que el ADN no tiene por qué ser específico: se puede unir ADN
de procedencias muy diversas (incluso ADN eucariótico).

Entrada del ADN y fase de eclipse

Esta fase se pone de manifiesto en el laboratorio por el hecho de que el ADN exógeno se
convierte a una forma resistente a la DNasa. Esto significa que este ADN ha sido
transportado desde el medio externo al interior celular (o al menos a algún
"compartimento" donde se ve protegido del ataque de la nucleasa). Este paso del proceso de
transformación depende de:

• cationes divalentes (Mg++, Ca++), o monovalentes (K+);

• una endonucleasa situada a nivel de membrana (endonucleasa-I), que degrada la
cadena que previamente (en la fase 1ª) había permanecido intacta.

En S. pneumoniae:

• La endonucleasa-I de membrana rompe la cadena que previamente había quedado

intacta, y a partir del sitio de corte va degradando esta cadena no unida al complejo
receptor (liberando oligonucleótidos de 1 a 10 bases de longitud). Simultánea y
concomitantemente con esta acción, la otra cadena (la que antes se había unido al
receptor) va pasando al citoplasma, comenzando por su extremo 3', y
progresando hacia su extremo 5', a expensas precisamente de la energía derivada
de la hidrólisis de la cadena opuesta.
• Conforme va entrando, esta cadena va siendo recubierta por monómeros (de unos
20 kDa) de una proteína específica, hasta formarse el complejo de eclipse (entre ese
ADN de c.s. y las proteínas). Dicho complejo cumple dos funciones:

protege al exogenote del ataque de las nucleasas citoplásmicas;

 prepara al exogenote para la ulterior fase de recombinación.

• Si utilizáramos este ADN de c.s. del complejo de eclipse para intentar una nueva
transformación, no podría ser reconocido por el complejo receptor que describimos
anteriormente. Esta es la razón de la existencia de lo que hemos denominado
período de eclipse.

Destino del ADN del exogenote

Recombinación de la cadena sencilla del exogenote con la zona complementaria del

endogenote, previo desplazamiento y ulterior degradación de la cadena homóloga de éste.
Esta recombinación homóloga es muy eficiente (un 50% del ADN transportado se integra).

• Como resultado de esta integración se forma un heterodúplex.

• Si el heterodúplex posee malos emparejamientos de bases (debido a que la
secuencia del exogenote no es idéntica a la del endogenote), pueden ocurrir dos
alternativas, dependiendo de si estos malos emparejamientos logran o no ser
reparados antes del siguiente ciclo de replicación del genóforo:

1. si son reparados antes de la replicación se puede perder el marcador portado por el

endogenote, que se ve sustituido por el del exogenote;
2. si el heterodúplex no se repara en el siguiente ciclo replicativo cada cadena servirá
de molde para una nueva doble hélice, pasando cada una a una célula hija. De este
modo, a partir de este evento de recombinación surge una progenie mixta: existe un
subclon recombinate y otro que no lo es.

Es de destacar que, además, S. pneumoniae posee un sistema muy refinado para facilitar
esta recombinación en los fenómenos de transformación:

• existe un gen (hex) que codifica una proteína que se une a varios lugares concretos
del genomio hospedador, e interviene en la corrección de las bases mal
emparejadas. Si el exogenote se integra lejos de uno de los sitios reconocidos por
Hex, no se ve reparado por dicho sistema, el heterodúplex "escapa" a la corrección,
y por lo tanto toda la progenie heredará el marcador nuevo procedente del
exogenote.

2.2.2 EN Bacillus subtilis

Las principales diferencias respecto del modelo del neumococo, en esta fase inicial de
competencia, son las siguientes:

• La competencia se desarrolla después de la fase exponencial, durante el inicio de la

fase estacionaria.
 • Los "cultivos competentes" son heterogéneos: existe una minoría de células (<
25%) auténticamente competentes, y se encuentran en un estado metabólico
alterado:

no replican más su cromosoma;

se embarcan en pocas actividades biosintéticas;

aumenta el número de mesosomas, muchos de ellos concentrados en la

región ecuatorial.

Desarrollo de la competencia

Los últimos hallazgos sobre este sistema parecen indicar que la competencia en B. subtilis
está sometida a tres tipos de controles:

1. Primer control, según la fase de crecimiento. Esto parece depender en última

instancia de la acumulación en el medio de un factor de competencia excretado
durante la fase previa a la estacionaria. El factor interacciona durante la fase
estacionaria con receptores de superficie, que "reemiten" la señal al interior celular,
para que se induzcan una serie de genes relacionados con la transformación.
2. Segundo control, de tipo nutricional. Para que se induzca la competencia, el medio
de crecimiento ha de poseer glucosa como fuente de C, junto con una mezcla de
aminoácidos. Las señales nutricionales que detecta la bacteria para provocar el
estado de competencia parecen depender (al menos en parte) del agotamiento de
algunos aminoácidos y de alguna señal derivada del metabolismo de la glucosa.
3. Tercer control, según el tipo celular. Como acabamos de decir, existen células
competentes y no competentes. Es aún un misterio cómo se desarrolla este
"dimorfismo" para la competencia. Lo que sí se sabe es que durante todo el
crecimiento, algunas células (probablemente las no-competentes) excretan al medio
ADN de alto peso molecular, que será la fuente del ADN transformante.

De esos controles, el mejor conocido hasta ahora es el relacionado con la densidad celular,
basado en la detección de una feromona, y que depende de un sistema regulador de dos
componentes (repasar el tema 22):

Mientras B. subtilis va creciendo, va segregando un péptido, denominado feromona ComX.

Obviemente, en un sistema cerrado, dicha hormona se va acumulando en el medio.

• Cuando se alcanza cierto nivel de ComX (y esto sólo sucede a partir de ciertas
densidades altas de cultivo), esta feromona interacciona con una proteína de
membrana denominada CompP. CompP es una histidín-proteín-quinasa, del tipo de
los sensores autofosforilables. Cuando se le une CompX, la ComP se autofosforila,
y entonces fosforila a su vez a una proteína citoplásmica llamada ComA.
 La ComA~P es un regulador de respuesta, que en ese estado fosforilado actúa como
activador de la transcripción de varios genes, incluyendo el gen srfA, que se requiere para
inducir otros genes del estado competente.

(Curiosamente, parecen existir vínculos entre desarrollo de la competencia y esporulación y

no sólo mera coincidencia de sus respectivos desencadenamientos en el tiempo, ya que hay
genes que intervienen en la regulación de ambos procesos).

Entrada del ADN y fase de eclipse

• El complejo de eclipse queda retenido transitoriamente el el espacio

periplásmico.
• Al parecer (no está confirmado) dicho complejo entra luego a través de los
mesosomas ecuatoriales, que de esta forma facilitarían el acceso del exogenote al
cromosoma hospedador (recuérdese que el mesosoma es el punto de anclaje del
genóforo bacteriano).

2.3 TRANSFORMACIÓN EN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Una diferencia característica de los sistemas en Gram negativas con respecto a los de Gram
positivas es que el estado de competencia no depende de señal activadora segregada al
medio.

En las especies del género Neisseria las células se mantienen competentes durante todo el
ciclo de crecimiento, cosa excepcional dentro de los sistemas naturales de transformación.
Además, la transformación sólo se da en las cepas fimbriadas de Neisseria (poseedoras de
pelos o fimbrias, o sea, fenotipo Fim+).

Comparemos la transformación en Haemophilus (por ejemplo, en la especie H. influenzae)

con la de los sistemas Gram positivos estudiados más arriba:

• La competencia se da en fase estacionaria.

• La competencia afecta al 100% del cultivo.
• La competencia se induce internamente, no existiendo factores liberados que
actúen desde fuera.
• El sistema de entrada del ADN discrimina entre ADN de esta especie (o, en todo
caso de especies cercanas) y ADN de otras procedencias: solamente capta ADN de
especies del mismo género, y con gran eficiencia. La secuencia en cuestión es la
siguiente (se muestra sólo una de las cadenas): 5'AAGTGCGGTCA-3'. Dicha
secuencia aparece repetida y repartida en el genomio de H. influenzae unas 600
veces, a una media de una copia cada 4 kb. Como se puede comprobar, esta
frecuencia es muy superior (3 órdenes de magnitud) a la que predice el cálculo de
probabilidades en el caso de que apareciera aleatoriamente (4000 kb). Así pues, el
genomio de estas bacterias está "preparado" (mediante la existencia sobreabundante
 y no-aleatoria de esta secuencia) para participar en eventos de reconocimiento
específico por parte de receptores encaminados a la entrada de ADN propio por
medio de fenómenos de transformación.
• Esta selectividad de secuencia se debe a la existencia de unos pocos (3-4) complejos
receptores de superficie, dispuestos en prolongaciones vesiculares de la membrana
externa (transformosomas), que reconocen esa secuencia específica de 11 pb a
partir de trozos de ADN de cadena doble de unas 30 a 50 kb.
• El ADN entra en forma de doble cadena a través del transformosoma.
• No existe complejo de eclipse entre ADN y proteínas.
• El ADN de c.d. del exogenote se despliega en sus dos cadenas, una de las cuales es
recombinada con la porción equivalente del endogenote (por desplazamiento de la
porción homóloga de ese endogenote).

2.4 SIGNIFICADO BIOLÓGICO DE LA TRANSFORMACIÓN

NATURAL

Como acabamos de ver, los sistemas naturales de transformación representan mecanismos,

a veces bastante sofisticados, de transferencia génica en ciertas bacterias, y no deben en
absoluto considerarse como meras "curiosidades" o "accidentes" de algunos procariotas.
Géneros como Haemophilus, Streptococcus o Bacillus presentan exquisitos refinamientos
moleculares encaminados, en última instancia, a facilitar expresamente la recombinación
genética tras un proceso específico de transformación, induciendo una serie de funciones
totalmente exclusivas para tal propósito. Estos mecanismos han debido de evolucionar
debido probablemente a ciertas presiones selectivas del ambiente, y han sido
"aprovechados" para producir un plus de diversidad genética, que debe de jugar un papel
importante en la dinámica ecológica de las especies que lo poseen. Así, por ejemplo, parece
ser que el sistema de transformación de Neisseria gonorrhoeae (el gonoco) permite que
esta bacteria cambie más fácilmente determinadas moléculas de superficie, de modo que
estos cambios antigénicos suponen una ventaja adaptativa para evadir el sistema inmune del
hospedador mamífero.

Una pregunta más difícil de responder es la del origen evolutivo de la capacidad de

transformación. Aquí caben diversas hipótesis.

• Hipótesis de la reparación de ADN: sugiere que la capacidad de competencia

apareció en B. subtilis. (esporulante) como un sistema de obtener moldes de ADN
para la reparación. La argumentación sigue el siguiente curso: se sabe que la
competencia en esta especie está regulada por controles que son en parte comunes
con los del desencadenamiento de la esporulación (recordar que decíamos que en B.
subtilis la competencia se induce en fase estacionaria, lo cual también ocurre con la
esporulación). Por otro lado, también se recordará que al final de la fase
exponencial ocurren grandes cambios metabólicos en esta bacteria, siendo uno de
ellos el que pasa de un metabolismo fermentativo a uno oxidativo. En el
metabolismo oxidativo se producen numerosos radicales libres, que pueden
provocar daños en el ADN. Por lo tanto -concluye esta hipótesis- , no sería extraño
que la competencia hubiera evolucionado como una forma de obtener ADN de
 repuesto, que capatarían ciertos individuos de la población, para usarlos en la
reparación de sus genomios. Posteriormente el sistema se refinaría y seviría para
incrementar la variabilidad genética y la capacidad de adaptación. (De hecho, en B.
subtilis y en S. pneumonie se ha visto que el gen recA de la recombinación
homóloga se induce en respuesta al desarrollo de la competencia.
• Hipótesis de la nutrición: Quizá pudo surgir como una manera de obtener nutrientes
adicionales a partir de ADN exógeno.
• Hipótesis de la recombinación: pudo haber una presión selectiva que favoreciera el
desarrollo de un mecanismo de intercambio y recombinación de ADN, por los que
las poblaciones de ciertas bacterias podrían poner a prueba nuevas combinaciones
de genes (algo parecido a lo que pasó con el desarrollo de la sexualidad en los
eucariotas). Ello aumentaría la diversidad y podría acelerar la evolución. De hecho,
algunas de las especies transformables de modo natural "excretan" ADN durante el
crecimiento. Ese ADN, captado en el caso de Haemophilus o Neisseria de un modo
muy específico, puede favorecer la adaptación de otros miembros de la especie. De
hecho, en esas especies, parece que la transformación aumenta la diversidad
antigénica, y por lo tanto son mejores las probabildades de sobrevivir en el huésped
al que parasitan.

3. TRANSFECCIÓN
Se define la transfección como la infección de una célula hospedadora mediante ADN
obtenido de un virus. El ADN del virus así introducido, al expresar su programa genético
en la célula, termina desencadenando la producción de nuevas partículas de virus dentro,
que al igual que en la infección "clásica" por virus completos, conduce a la muerte y lisis de
la célula, con la liberación de la progenie de nuevos viriones. Las características de unión
de ADN y entrada dependerán del sistema de células competentes que se esté empleando,
mientras que el resultado de la transfección depende (al igual que en los ciclos líticos
naturales de los virus) del programa del virus en cuestión.

4. TRANSFORMACIÓN ARTIFICIAL
Muchas especies bacterianas carecen de sistemas naturales de transformación. En los
últimos años se ha logrado desarrollar sistemas artificiales para producir "células
competentes" en algunas de ellas (como Escherichia coli, Salmonella typhimurium y
algunas especies de Pseudomonas), lo cual ha hecho avanzar los estudios genéticos,
especialmente mediante manipulaciones in vitro: por ejemplo, la transformación artificial
de E. coli con ADN plasmídico es una de los métodos básicos de la Ingeniería Genética.

La obtención de células competentes en E. coli consiste en ir concentrando un cultivo

recogido en fase logarítmica, mediante lavados sucesivos en una solución fría (4ºC) de
Cl2Ca, tras lo cual la mezcla de células y ADN se someten a unos 2 min. a 42ºC (choque
por calor). Este tratamiento altera las envueltas (sobre todo la membrana externa) y
aumenta su permeabilidad al ADN. Los plásmidos entran a la célula como moléculas de
cadena doble intactas, mientras que los ADN lineales, que entran de la misma forma, son
degradados por nucleasas citoplásmicas (RecBCD). Los transformantes se suelen
seleccionar en base a la resistencia a algún o algunos antibióticos conferidos por los
plásmidos artificiales usados en Ingeniería Genética. En otras bacterias (p. ej., en ciertas
Gram-positivas) el método consiste en obtener protoplastos en medio hipertónico, y
posterior tratamiento de éstos mezclados con el ADN con un agente como el
polietilénglicol, que fomenta la fusión de protoplastos y el englobamiento de ADN
exógeno. Más recientemente se ha introducido la técnica de la electroporación: las células
se someten a cortos pulsos de corriente eléctrica de alto voltaje, lo cual altera las envueltas
y permite la captación de ADN en una amplia variedad de bacterias, tanto Gram-positivas
como Gram-negativas.

PREÁMBULO: AVANCE DE CONCEPTOS SOBRE

BACTERIÓFAGOS

Antes de entrar de lleno en el tema de la transducción, conviene que adelantemos algunas

ideas generales sobre los virus bacterianos con genomio de ADN, que nos serán útiles para
el presente capítulo.

• El proceso de la infección comienza cuando la partícula del fago se

adsorbe sobre receptores en la superficie de la bacteria.
• Inyecta el ADN contenido en su cápsida. Entrada del ADN fágico a la
célula hospedadora. Este ADN tenderá a expresar su programa genético,
pero el resultado final dependerá de que el fago sea de tipo virulento o
de tipo moderado:

A. Si el fago es de tipo virulento:

Se expresa el programa genético vegetativo (lítico) de su genomio, destinado a producir

muchas copias de ese ADN fágico, y muchas cápsidas proteicas. En el interior de cada
cápsida se introduce ("se empaqueta") una copia del genomio del fago. Las nuevas
partículas (viriones), una vez completadas y ensambladas, lisan a la bacteria, quedando
libres en el medio y preparadas para infectar nuevas células de la especie bacteriana
hospedadora.

B. Si el fago es de tipo moderado pueden darse dos alternativas distintas:

• El ADN inyectado expresa su información vegetativa, de modo que se

produce un ciclo lítico, productivo de nuevos viriones, similar al descrito
para los fagos virulentos; o bien
 • Se pueden reprimir las funciones líticas del fago. En este caso el ADN del
fago establece una relación benigna con su hospedador: suele
incorporarse por recombinación específica de sitio conservativa (ver
tema 24), integrándose en el genóforo bacteriano. A partir de este
momento, el ADN del fago (que ahora se llama profago) permanece en
esta situación, como una porción más del genomio de la bacteria,
replicándose como parte de éste. El profago mantiene reprimidas todas
sus funciones líticas (vegetativas), expresando solamente una proteína
represora de aquellas funciones (todo esto lo veremos en detalle en la
sección de Virología). La célula bacteriana portadora de un profago se
denomina lisogénica, y el clon derivado de ella, clon lisogénico. Este
tipo de relación benigna es estable, pero de forma espontánea, en
algunas de las células del clon lisogénico el profago "despierta" y se
activan sus funciones vegetativas: el profago se escinde del genomio
bacteriano (de nuevo por recombinación específica) y expresa su
programa lítico, que conduce a la producción de nuevos viriones, con
lisis de la bacteria. Este fenómeno recibe el nombre de inducción.
Artificialmente se puede provocar la inducción de casi todo el cultivo
lisogénico, tratándolo con determinados agentes (luz UV, mitomicina,
etc.) que dañan el ADN y que inducen el sistema SOS.

2. APROXIMACIÓN HISTÓRICA Y CONCEPTOS GENERALES

SOBRE LA TRANSDUCCIÓN

La transducción fue cronológicamente el último sistema de transferencia genética

bacteriana que se descubrió.

En 1951 Joshua Lederberg y su colaborador Zinder estaban investigando en Salmonella la

posible existencia de un sistema de conjugación al estilo del que se acababa de descubrir en
su pariente Escherichia coli (ver capítulo 27). Mezclaron dos cepas de Salmonella, cada
una con un juego distinto de marcadores genéticos. (Eureka! Obtuvieron recombinantes.
Descartaron que se tratara de transformación, ya que los resultados eran similares si
añadían DNasa al sistema. Entonces, ¿era un fenómeno de conjugación? Realizaron el
experimento del tubo en "U", con una membrana separando los dos brazos de la U, en cada
uno de los cuales se colocaba una de las cepas. La membrana impide el paso de bacterias y
los contactos intercelulares directos entre las dos cepas. Pues bien... seguía habiendo
recombinantes. Esto descartaba, pues, que se tratara de conjugación. Se postuló que debía
de existir un "agente filtrable" resistente a las nucleasas, responsable último de la
transferencia genética.

¿Cuál era la naturaleza exacta del misterioso agente filtrable? Por experimentos
independientes se sabía que una de las dos cepas de Salmonella producía un fago (llamado
P22), de tipo moderado. Con una serie de ensayos se demostró que era precisamente este
fago el responsable de los recombinantes:
 • el tratamiento de sobrenadantes de esa cepa con calor o con antisuero
provocaba la inactivación tanto del fago como del agente filtrable;
• las cepas de Salmonella resistentes a P22 (porque no adsorben el fago)
no pueden interaccionar con el agente filtrable, y por lo tanto tampoco
dan recombinantes;
• finalmente, se comprobó que la cepa productora del agente filtrable
poseía un fago moderado en forma de profago. La inducción de esta
cepa lisogénica era la responsable de producir algunas partículas de
fagos portadoras de material genético de la cepa de origen, que los
fagos inyectaban posteriormente a las células de la cepa receptora.

Así pues, se acababa de descubrir un nuevo sistema de transferencia genética entre

bacterias, sistema que fue bautizado con el nombre de transducción.

La transducción se puede definir como el proceso de transferencia genética desde una

célula donadora a otra receptora mediatizado por partículas de bacteriófagos que contienen
ADN genómico de la primera. En la transducción podemos distinguir dos estapas
diferenciadas:

1. Formación de la partícula fágica transductora: un trozo de material

genético de la célula donadora se introduce en el interior de la cabeza
de la cápsida de un fago. Las partículas transductoras son en cierta
manera "subproductos" anómalos del ciclo normal del fago.
2. La partícula transductora inyecta de forma habitual el ADN que porta a
la célula receptora, donde este ADN puede eventualmente
recombinarse y expresar su información.

La transducción descubierta por Lederberg y Zinder se llama transducción generalizada.

• Mediante ella se puede transferir cualquier marcador del genóforo del

donador, con aproximadamente la misma frecuencia relativa (de ahí el
calificativo de generalizada).
• La transducción generalizada se produce sólo como consecuencia de
infecciones líticas.
• El ADN del genomio de la bacteria donadora que es introducido en la
partícula transductora suele ir sin acompañamiento de ADN del
propio fago. Por ello, a esta peculiar partícula consistente en cápsida
del fago que encierra sólo ADN genofórico de la bacteria se la denomina
pseudovirión.

Siguiendo con la buena racha de descubrimientos, pocos años más tarde (1956), el mismo
Lederberg (esta vez junto con su mujer, y con Morse) hallaron un tipo nuevo de
transducción, mientras estaban estudiando el sistema del fago moderado λ y su
hospedador, E. coli. Este tipo de transducción recibió el nombre de transducción
especializada, y sus caracteres distintivos son:
 • sólo se transfieren marcadores cromosómicos cercanos al sitio de
integración del ADN del fago (profago) en la célula lisogénica (p. ej., en
el caso de λ , los marcadores gal o bio);
• se produce únicamente como consecuencia de la inducción de la
célula lisogénica por escisión del profago y consiguiente entrada a
fase lítica, productora de nuevas partículas de fago;
• el ADN genómico de la bacteria transportado por la partícula
transductora va unido a ADN del fago;
• la célula transductante se suele convertir en lisogénica para el fago
correspondiente.

3. TRANSDUCCIÓN GENERALIZADA

Se caracteriza porque en ella se puede transferir cualquier trozo de genóforo bacteriano,

con tal de que tenga un tamaño compatible con la capacidad de "empaquetado" de ADN de
la cápsida del fago. La partícula transductora (pseudovirión) se forma por
empaquetamiento anómalo de ADN genofórico bacteriano. En el interior de la cabeza del
pseudovirión sólo existe ADN bacteriano, sin ADN del fago. Las partículas transductoras
sólo se forman como consecuencia de infecciones líticas del fago.

Mecanismo de la transducción generalizada promovida por el fago P22 de S.

typhimurium.

1ª fase: producción de las partículas fágicas transductoras (=pseudoviriones): Por

encapsidamiento ilegítimo de ADN cromosómico. De vez en cuando, el sistema fágico
encargado de introducir su ADN en la cápsida (sistema pac), se "equivoca", y en su lugar
introduce un trozo de tamaño equivalente del genóforo de la bacteria donde está teniendo
lugar la infección.

Al parecer, el cromosoma bacteriano contiene secuencias que eventualmente pueden ser

reconocidas de vez en cuando por el sistema del fago, de manera que puede introducirse un
trozo de ADN de Salmonella en la cápsida.

Al final de esta fase, la célula hospedadora se lisa. El lisado (sobrenadante) contiene una
mayoría de viriones auténticos y un pequeño número de pseudoviriones, cada uno con un
trozo aleatorio distinto del genomio de la bacteria.

2ª fase: Destino del ADN del exogenote: Mezclemos el lisado obtenido en la fase anterior
con un cultivo de la cepa receptora (dotada de marcadores genéticos adecuados). Cada
pseudovirión inyecta de forma normal su ADN a una bacteria. Este ADN puede tener
varios destinos posibles:

• 1) puede ser destruido por exo- y endonucleasas citoplásmicas.

• 2) Puede recombinarse con la región homóloga del genóforo del
receptor, mediante la actuación del sistema de recombinación general
dependiente de RecA. Se produce una recombinación con dos
 sobrecruzamientos ("crossing-overs"), que conduce a la integración de
doble cadena de ese exogenote, con eliminación de la zona homóloga
del endogenote.
• 3) Puede ocurrir que el exogenote no sea ni destruido ni recombinado;
este ADN puede persistir en la célula sin replicarse. La consecuencia
de esto es que cuando la célula que originalmente recibió ese ADN
exógeno se divida, lo pasará solo a una de las dos células hijas, la cual a
su vez la pasará a una hija en la siguiente división, y así sucesivamente.
Tenemos, pues, que el exogenote se va diluyendo en el clon por
transmisión unilinear: tras varias generaciones, el clon consta de n-1
células sin exogenote y una sola célula con ese exogenote. A este
fenómeno se le conoce con el nombre de transducción abortiva, y es
más frecuente que la transducción completa derivada de recombinación
(más de 90% frente a sólo 1-5%).

La célula que alberga el exogenote abortivo puede expresar los genes de éste: por lo tanto,
la célula transductante abortiva contiene proteínas derivadas del exogenote. Parte de las
proteínas (en principio la mitad), pasarán a la célula hija que no reciba el exogenote en la
siguiente generación. Las hijas de la hija ("las nietas no herederas del original") reciben la
cuarta parte, etc... es decir, aparte de la célula hija que en cada generación hereda el
exogenote, sus parientes no-herederos más cercanos reciben proteínas derivadas de la
expresión previa de los genes del exogenote. Esto significa que las células no herederas
pueden poseer, durante unas pocas generaciones, la función o funciones del exogenote,
hasta que el producto correspondiente se diluya o se inactive.

Esto permite detectar fácilmente determinados tipos de transductantes abortivos,

distinguiéndolos de los transductantes completos. Por ejemplo, si estamos seleccionando
transductantes en base a la adquisición, por parte de una cepa receptora auxotrofa, de la
versión silvestre del gen que tiene mutado, sembrando en placas de Petri con medio
mínimo, se distinguen dos dos tipos de colonias:

colonias grandes, correspondientes a transductantes completos;

microcolonias, correspondientes a los transductantes abortivos.

• 4) Si el exogenote es un plásmido, al llegar a la célula receptora, puede

replicarse autónomamente.
• 5) Si el exogenote contiene un transposón, éste puede insertarse en el
genoma de la célula receptora.

No todos los fagos virulentos pueden actuar como mediadores de transducción

generalizada. Los fagos con esta capacidad suelen ser aquellos que no degradan totalmente
el ADN del hospedador inmediatamente después de entrar (de otra manera, no habría ADN
intacto que transducir). Además, su sistema de empaquetamiento de ADN no debe ser muy
específico: fagos como el P22 de Salmonella typhimurium o el P1 de Escherichia coli
tienen un mecanismo de empaquetado secuencial de unidades de concatémeros, mecanismo
que reconoce secuencias que también existen con cierta frecuencia en el genoma del
hospedador.
La transducción generalizada ha sido muy útil en el análisis genético de bacterias y la
construcción de nuevas cepas. El alumno seguramente estudiará en la asignatura de
Genética algunas aplicaciones, incluida la elaboración de mapas de ligamiento. En las
prácticas de Virología del Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias los
estudiantes realizan un interesante experimento de co-transducción que permite aplicar
algunas de estas ideas.

4. TRANSDUCCIÓN ESPECIALIZADA (=RESTRINGIDA)

Recordemos que fue descubierta por el equipo de Lederberg (1956), mientras hacían
experimentos de inducción de células de E. coli lisogenizadas con el fago λ . Este tipo de
transducción consiste en la transferencia -mediatizada por fagos moderados producidos en
la inducción de un cultivo lisogénico-, de un número limitado de marcadores,
correspondientes a los loci genéticos adyacentes al sitio de integración del profago. La
transducción restringida nunca ocurre por infecciones líticas. El ADN transducido va unido
a ADN del fago.

Mecanismo de la transducción especializada promovida por el fago λ de Escherichia

coli

1ª fase: Producción de los fagos transductores: Supongamos una cepa silvestre de E. coli
K12 (λ +), o sea, lisogénica para el fago λ . Como ya sabemos, el profago se encuentra
integrado entre los operones gal y bio.

• Inducimos artificialmente este cultivo lisogénico (tratando, p. ej., con

rayos UV, o con mitomicina-C). El profago desreprime sus funciones
vegetativas, de modo que va a entrar en un ciclo lítico, comenzando por
escindirse del lugar de integración, por medio de una recombinación
específica conservativa entre sus extremos (BOP' X POB'). Con una baja
frecuencia (10--5-10--6) se producen escisiones anómalas del profago:
bucles anómalos, de modo que se forman círculos que llevan una
porción adyacente del cromosoma bacteriano (dependiendo de los
casos, o gal o bio), y en cambio, queda un trozo del genomio del fago.
De esta forma se pueden formar fagos λ defectivos (λ d) para alguna
función fágica, pero con la "contrapartida" de ser portadores de material
genofórico de la bacteria hospedadora.
• Así pues, de esta forma se obtiene un lisado (llamado lisado LTF, de baja
frecuencia de transducción), donde existe una pequeña proporción
(alrededor de 10--6) de partículas defectivas del fago portadoras de ADN
cromosómico. Estos viriones, por sí solos no podrían establecer
lisogenia, pero si en una misma célula inyectaran su ADN un fago
defectivo y otro silvestre, este último actuaría como fago auxiliador
("helper") de modo que el defectivo sí podría entonces establecer
lisogenia. A continuación veremos precisamente cada una de estas dos
posibilidades. (En ambos casos vamos a suponer que las partículas
 transductoras portan el operón silvestre gal+, y que empleamos una
cepa receptora mutante gal--).

2ª fase en el caso de infectar una cepa receptora con el lisado anterior a baja
multiplicidad de infección: Imaginemos que mezclamos un cultivo de la cepa receptora
con un lisado LTF, a una multiplicidad de infección (m.d.i., o en inglés, m.o.i) de alrededor
de 1 (o sea, cada bacteria recibe, por término medio una sola partícula de fago).

• Una partícula λ gal+ inyectaría de forma normal su ADN en la bacteria

gal--. El ADN lineal del fago se circulariza como de costumbre. Pero
obsérvese que este ADN no posee un sitio att normal, sino que presenta
solamente el sitio BOP' (derivado de la escisión anómala producida en el
ciclo anterior), y además, al ser defectivo, cabe la posibilidad de que
haya perdido el gen int que codifica la integrasa. En este caso, la única
posibilidad de integración del ADN es mediante recombinación
homóloga simple (un solo crossing-over) propiciada por el sistema
RecA de la bacteria receptora.
• El resultado de esta recombinación homóloga es la creación de un
heterogenote gal+/gal-- con un profago λ defectivo, que debido a
ese carácter defectivo no es inducible (no provoca lisogenia). Observar
que cada copia del gen gal es en realidad un "mosaico", con una porción
derivada del exogenote y otra del endogenote. Este heterogenote con
fenotipo Gal+ es estable.

2ª fase en el caso de infectar la cepa receptora con el lisado LTF a una alta
multiplicidad de infección: Imagimenos ahora que mezclamos una media de 10 partículas
de fago del lisado obtenido en la primera fase con 1 célula de la bacteria receptora (o sea,
una m.o.i.=10).

• Algunas bacterias reciben el ADN del fago defectivo (λ dgal+) junto con
el ADN del fago silvestre.
• El ADN del fago silvestre se integraría de la forma habitual, mediante su
sistema de recombinación específica de sitio (POP' X BOB'). Este ADN del
fago silvestre actúa como auxiliador respecto del defectivo: le suministra
sitios para la recombinación y la función de la integrasa. Por lo tanto, a
continuación se produce otro evento de recombinación específica entre
ambos ADN de λ .
• El resultado es un heterogenote gal+/gal-- que es doble lisogénico
(λ +/λ d). Su fenotipo sería Gal+ y λ +, capaz de producir, por
inducción partículas de fago silvestres y defectivas.
• Supongamos que inducimos ahora este clon doble lisógeno: se producen
dos bucles en cada célula, uno que regenera el genomio circular del λ
silvestre, y otro que origina el de λ dgal+. Observar, pues, que el
resultado de esta inducción es un lisado donde existe un 50% de λ + y
un 50% de fagos portadores del gen gal+. Si este lisado lo usamos para
infectar de nuevo una cepa gal--, la proporción de transductantes Gal+
será muy alta. Por esta razón, al lisado obtenido por inducción del doble
 lisógeno λ +/λ d se le denomina lisado HTF (alta frecuencia de
transducción).

La transducción especializada con el fago λ permitió los primeros aislamientos

("clonaciones") de genes in vivo, pero por supuesto, desde mediados de los años 70 la
clonación de genes se realiza ya con métodos de ADN recombinante (ingeniería genética).

CONCEPTO Y APROXIMACIÓN HISTÓRICA

La conjugación bacteriana es el proceso de transferencia de información genética desde una

célula donadora a otra receptora, promovido por determinados tipos de plásmidos, y que
requiere contactos directos entre ambas, con intervención de estructuras superficiales
especializadas y de funciones específicas. El descubrimiento de la transformación había
revelado ya la existencia de recombinación genética entre porciones de genomios
bacterianos. En mitad de los años 40, la pregunta que se planteaba era: ¿existe algún tipo de
recombinación bacteriana que suceda al estilo de la reproducción sexual de los eucariotas?

Se descubrió que ciertas bacterias presentan una forma de recombinación que recordaba en
algunos rasgos a la sexualidad: un tipo de célula donadora ("macho") donaba directamente
parte de su material genético a otro tipo (la receptora, equivalente a la "hembra"), con
ulterior recombinación entre ambos. A este fenómeno se le denominó conjugación, por su
similitud aparente con lo que sucede en eucariotas. Sin embargo, como veremos enseguida,
la conjugación no es una forma auténtica de sexualidad al estilo de los eucariotas.

Con la perspectiva de los años, se puede decir que el descubrimiento de la conjugación

bacteriana fue uno de los más fortuitos, pero al mismo tiempo, de los más felices y
trascendentales de toda la Biología del siglo XX. Muchos biólogos habían intentado
infructuosamente demostrar conjugación de tipo "sexual" en bacterias. Lederberg y Tatum
(1946), que a la sazón investigaban en la Universidad de Yale, tuvieron la enorme suerte de
"escoger" (sin saberlo a priori) una de las pocas especies bacterianas (Escherichia coli) que
presentan sistemas naturales de conjugación, y aún más, la cepa concreta denominada K12,
que llevan uno de estos sistemas... Pero todavía mejor: como se descubriría muchos años
después, el sistema conjugativo de dicha cepa es casi único por su capacidad de
conjugación permanente, no estando sometido a los controles negativos típicos de la
inmensa mayoría de los demás sistemas que luego se descubrieron. En resumen, un
extraordinario "golpe de suerte" en el año 1946 dio el "pistoletazo de salida" para una de las
épocas más gloriosas de la Biología, contribuyendo de modo excepcional al origen de la
Biología Molecular. A continuación expondremos los hitos más importantes en el estudio
de la conjugación en Escherichia coli K12 (consulten los esquemas)

1.1 EXPERIMENTOS DE LEDERBERG Y TATUM

Joshua Lederberg y Edward Tatum (1946) mezclaron dos cepas doblemente auxotrofas,
dotadas de distintos marcadores genéticos:

Cepa "A" (Met--, Bio--, Thr+, Leu+) cepa "B" (Met+, Bio+, Thr--, Leu--)

Sembrar 2·108 céls de "A" Sembar 108 céls de "A" + 108 Sembrar 2·108 céls de "B"
céls de "B"
plaquear en medio mínimo e incubar varios días

No crecimiento Colonias prototrofas a una No crecimiento

frecuencia de 10-5 - 10-6, muy
superior a la frecuencia
esperada de doble reversión
(10-14).
Estos prototrofos debían haber surgido por recombinación.

¿Qué proceso de transferencia genética había dado origen a los recombinantes? Se descartó
que fuera por transformación:

• No había recombinantes si se usaban extractos libres de una cepa y se

mezclaban con células enteras de la otra cepa.
• Si en el experimento original se añadía DNasa, no cambiaban los
resultados.
• Se vio que se necesitaban contactos directos entre las células de las dos
cepas, mediante el experimento del tubo en "U" de Davis: si en cada
rama de la U se coloca una cepa distinta, y ambas están separadas
físicamente (en la base de la U) por un filtro con poros de tamaño
inferior al del diámetro de las bacterias, no aparecían recombinantes.

En ulteriores experimentos se comprobó que existían dos tipos de cepas de cara a la

producción de recombinantes:

• cepas fértiles (F+): aquellas que al mezclarlas con otras, daban lugar a
recombinantes;
• cepas infértiles (F--).

Los cruces de tipo F+ x F-- dan origen a recombinantes;

Los cruces de tipo F--x F-- no dan origen a recombinantes.

Por otro lado, se observaron dos importantes propiedades de los cruces F+ x F--:
 • casi la totalidad de las células infértiles (F--), al final de la conjugación,
adquirían la capacidad de fertilidad (se convertían en células F+);
• sin embargo, los recombinantes aparecían con mucha menor frecuencia
(alrededor de 10-5).

El origen de ambos fenómenos estriba en la posesión, por parte de las células F+, del
llamado "factor sexual o factor de fertilidad F", (que hoy sabemos que es un plásmido, pero
tal extremo se desconocía aún en esa época). Por lo tanto, de alguna manera el factor F
debía de tener la doble capacidad de transferirse con alta frecuencia (casi el 100%) a las
células F--, y de dar origen en ellas a recombinantes, pero con mucha menor frecuencia (10--
5
). ¿Cómo explicar esta doble capacidad del factor F, con dos frecuencias tan diferentes?
Las bases para la respuesta a esta pregunta fueron colocadas en el siguiente gran capítulo de
esta historia:

1.2 AISLAMIENTO DE LAS CEPAS Hfr POR LEDERBERG Y HAYES

En los años de 1950 Joshua Lederberg y William Hayes, cada uno por separado, aislaron un
nuevo tipo de cepas fértiles a partir de las cepas F+ originales, cuyas propiedades distintivas
respecto de las cepas F+ eran:

a. Provocaban fertilidad (o sea, daban recombinantes al cruzarlas con F--)

con una frecuencia muy alta (unas 1000 veces superior a la de las
cepas F+). Por ello, el nombre que se dio a este nuevo tipo de cepas
fértiles fue el de Hfr (iniciales, en inglés, de alta frecuencia de
recombinación).
b. A diferencia de las F+, las cepas Hfr no suelen convertir en fértiles a las
cepas F-- tras el cruce conjugativo con ellas.

Entonces, la pregunta obvia era: ¿qué relación existe entre las células Hfr y las células F+ de
las que parecen derivar?

1.3 El MODELO DE CAMPBELL

Alan Cambell propuso en 1962 un modelo hipotético que posteriormente se vio confirmado
por otros experimentos, y que daba cuenta del comportamiento de las cepas F+ de
Lederberg y de las Hfr de Lederberg y Hayes:

• En las células F+ el factor de fertilidad F se encuentra en forma de

plásmido de replicación autónoma, independiente del cromosoma. En
este estado, el factor F sólo puede provocar su propia transferencia
conjugativa a las células F--, de modo que éstas adquieren a su vez dicho
factor F.
• En una población de células F+, de vez en cuando (con una frecuencia de
10-5), el factor F interacciona con el cromosoma: se integra en él, y
entonces se replica conjuntamenente con el genóforo de la bacteria
(actuando, pues, como episoma). En esta situación, el factor F puede
"arrastrar" al cromosoma y transferir parte de él a la célula receptora F--.
Sin embargo, en esta situación el factor F no se transfiere completo a la
 célula receptora, razón por la cual los cruces Hfr x F-- no suelen conferir
el carácter F+ a los exconjugantes del receptor.
• En resumen: cada cepa Hfr es clon procedente de un evento de
integración del factor F en un sitio del cromosoma de E. coli. En estos
clones todas las células tienen la capacidad de transferir porciones de
cromosoma y por ello confieren alta frecuencia de recombinación. Así
pues, en un cultivo F+ normal, existe una pequeña proporción de células
Hfr. Esa minoría de células Hfr son las responsables de la baja frecuencia
de recombinantes que provocan los cultivos F+.

El análisis del proceso de conjugación y de la transferencia de marcadores cromosómicos

se vio grandemente impulsado una vez disponibles las cepas Hfr puras. Se fueron
obteniendo diversas cepas Hfr, cada una de las cuales se caracterizaba por una mayor
eficiencia de transferencia de determinados marcadores. El siguiente gran avance en el
estudio de la conjugación se produjo trabajando sobre una de estas cepas, la denominada
HfrH (la "H", en honor de Hayes):

1.4 EXPERIMENTOS DE LOS CRUCES INTERRUMPIDOS DE JACOB

Y WOLLMAN

Estos autores, que trabajaban en el Instituto Pasteur de París, realizaron a partir de 1956 una
importantísima serie de experiencias, que demostraron que la transferencia conjugativa
tiene una polaridad (un sentido determinado): la transferencia de ADN por cada cepa Hfr es
unidireccional y linear, o sea, los genes del donador van entrando al receptor en un orden
determinado.

• Imaginemos una cepa Hfr con un juego de marcadores (A+, B+, C+, D+, F--,
G--), y una cepa F-- con el juego opuesto (A--, B--, C--, D--, F+, G+).
Mezclamos ambas cepas, y a distintos tiempos extraemos alícuotas, y
las agitamos fuertemente, con objeto de deshacer las parejas que se
estaban conjugando (de ahí el nombre de "cruces interrumpidos" que
recibe el experimento).
• Cada una de estas alícuotas es sembrada en un medio mínimo
suplementado con los requerimientos correspondientes a los marcadores
A, B, C y D. (Obviamente, en este medio, sólo puede crecer la cepa
receptora). Tras incubar las placas, se obtienen colonias derivadas de la
cepa receptora, procedentes de las mezclas de conjugación.
• Ahora realizamos réplicas en placa (p. ej., por el método del tampón de
terciopelo), "copiando" los transconjugantes en sendas placas de medio
mínimo suplementadas con mezclas de 3 de los 4 requerimientos que
originalmente le hacían falta a la cepa receptora. Mediante esta forma,
lo que pretendemos es ver la posible adquisición de las versiones
silvestres de los marcadores (mutantes) de esa cepa, versiones que
obviamente habrá debido de adquirir tras transferencia conjugativa de
partes de cromosoma procedentes de la cepa donadora.
• Se anota la frecuencia de aparición de cada alelo silvestre, y los
resultados se representan en función de los tiempos a los que se
 extrajeron e interrumpieron las muestras del cruce conjugativo (ver
gráfica).

De la representación gráfica de porcentaje de recombinantes (eje de ordenadas) en función

del tiempo de conjugación (abscisas) se deduce lo siguiente:

1. Cuanto más tiempo se deja la conjugación sin interrumpir, más material

genético se transfiere.
2. Los genes van entrando ordenada y secuencialmente. La frecuencia
relativa obtenida para cada marcador (es decir, el nº final de
recombinantes) está en relación (inversa) con el tiempo en que éste
comienza a aparecer (a menor tiempo de aparición, mayor frecuencia
final de ese marcador). Cada marcador tiene un tiempo de entrada
inicial característico (que en la gráfica se manifiesta por el punto del eje
de abscisas cortado por la curva).
3. Cada marcador da una curva con una pendiente característica. El hecho
de que exista pendiente (y no que exista una recta en vertical desde el
momento de aparición del marcador) implica que cada marcador no
entra a la población de bacterias receptoras "de un tirón", sino que
algunas células lo reciben antes y otras después, dentro de un cierto
rango de tiempos. La existencia de una meseta final significa que a
partir de un punto ya no entra más marcador (es decir, ya se ha
producido toda la transferencia de ese marcador).

Resumiendo las consecuencias de este experimento: En la conjugación Hfr x F-- el

cromosoma entra en la célula receptora con una orientación determinada, de modo que
los genes entran ordenada y secuencialmente. El tiempo en que comienza a detectarse un
determinado marcador, así como la frecuencia final de dicho marcador en los
transconjugantes dan una estimación de su distancia respecto del origen de
transferencia. La correlación entre tiempo de aparición y frecuencia final del marcador
sugiere que las parejas de cruce donador-receptor se separan espontáneamente en
algún momento de la conjugación; de no existir tal separación espontánea, se terminarían
obteniendo frecuencias del 100% para cada marcador individual, incluidos los más alejados
del origen de transferencia.

• Precisamente esto último es la base por la que se aprovecha el sistema

de conjugación para la elaboración de mapas genéticos del cromosoma
bacteriano. Como este aspecto es tratado oportunamente en la
asignatura de Genética, nosotros no vamos a insistir más en él, aparte
de recordar que fue precisamente utilizando distintas cepas Hfr como se
comprobó genéticamente que el cromosoma de E. coli es, en efecto,
circular.
• La unidad de medida en el mapa genético de la bacteria es el minuto. El
cromosoma de E. coli tiene unos 100 minutos; si tenemos en cuenta que
el cromosoma mide 4.200.000 pares de bases (pb), esto significa que la
transferencia cromosómica promovida por F se da a razón de 4.200
pb/min, es decir, unas 700 pb/ seg.
• Existen 22 tipos distintos de cepas Hfr. Cada una se caracteriza por
poseer el factor F en un punto concreto del cromosoma de E. coli, y de
 transferir ese cromosoma con un sentido determinado. Existen pares de
cepas Hfr cuyo factor F está integrado en la misma localización del
genóforo, pero que transfieren cromosoma en sentidos opuestos: los
marcadores que una de ellas transfiere en primer lugar son los últimos
que transfiere la otra cepa Hfr.

2. INDUCCIÓN ZIGÓTICA

Imaginen un cruce entre una cepa Hfr (λ +) -o sea, una Hfr lisogénica para el fago
Lambda- y una cepa F-- no lisogénica. En este tipo de cruces se observa que sólo se
transfieren los marcadores genéticos situados antes del profago λ (este "antes" está
en referencia, obviamente, al sentido concreto de transferencia que tenga la cepa Hfr
en cuestión). No se detecta nunca transferencia de los marcadores colocados
después del sitio del profago. La explicación es muy sencilla: como estudiaremos
oportunamente en la sección de Virología, el profago integrado sólo expresa un gen,
el cual produce una proteína que mantiene reprimidos los genes de las funciones
líticas. En la cepa lisogénica Hfr (λ +) existe una concentración de represor de λ
suficiente para mantener esa represión en la célula donadora. Ahora bien, en un
cruce con una cepa F-- no lisogénica, cuando entre la porción de cromosoma
donador que porta el profago, este profago se encuentra en un entorno celular que
no tiene represor de sus funciones vegetativas; por lo tanto, se produce una
inducción y entrada a ciclo lítico, con muerte de la célula receptora. A este
fenómeno se le conoce con el apropiado nombre de inducción zigótica.

3. ESTUDIO DE LA CONJUGACION PROMOVIDA POR EL

PLASMIDO F DE E. COLI

3.1 DESCRIPCIÓN DEL PLÁSMIDO F Y DE SUS FUNCIONES

BÁSICAS

El factor responsable de la fertilidad de E. coli K12, o sea, el plásmido F, es un

ejemplo de plásmido conjugativo que tiene la capacidad de interaccionar con el
cromosoma bacteriano para integrarse en él (episoma). El factor F puede
encontrarse en uno de tres posibles estados:

o autónomo, en las células F+;

o integrado (como episoma), en las células Hfr;
o autónomo, pero con un trozo de cromosoma, en las cepas F' (ver
el apartado sobre sexducción).

En estos tres estados realiza el mismo tipo de funciones esenciales.

Estructura física:
 o ADN circular de cadena doble, cerrado covalentemente (C.C.C.);
o superenrollado negativamente (requiere la acción de la girasa);
o tamaño: 100 kilobases. El mapa físico de F posee coordenadas en
kb de 0 a 100 (obviamente el 0 y el 100 son el mismo punto),
tomando como punto arbitrario de referencia (0/100) el borde
izquierdo de la secuencia de inserción IS3a.

Organización genética y funcional: Se han identificado unos 60 genes en el

plásmido F. Vamos a echar una ojeada al mapa de F para describir los principales
grupos de genes según las funciones que realizan:

1. Porción tra (genes que codifican funciones relacionadas con la

transferencia conjugativa). Existen unos 25 genes tra, repartidos en unas 33 kb
(o sea, casi la tercera parte de F está dedicado a genes de conjugación). La
mayor parte de esos genes están formando parte de un gran operón traY……Z
(unos 20 genes). Los genes tra se pueden clasificar en:
a. Necesarios para la biosíntesis y ensamblaje de los pelos
sexuales. Entre ellos está el gen traA, que codifica la pre-
propilina, es decir, el precursor que por maduración se
convertirá en la pilina F, la proteína constitutiva de los pelos
sexuales de tipo F. Otros genes tra intervienen en la
maduración de la pilina, y en el ensamblaje de las
subunidades para dar el pelo F.
b. Estabilización de los agregados de conjugación: traG, traN.
c. Metabolismo del ADN durante la conjugación: traI, traD,
traM, traY, traZ.
d. Regulación genética de la transferencia: traJ determina un
activador transcripcional del gran operón traY…Z; finP, finO
formarían un sistema de control negativo sobre el gran
operón traY...Z, pero como veremos, este sistema no es
funcional en el plásmido F debido a que el finO tiene una
inactivación insercional permanente por la secuencia de
inserción IS3.
e. Exclusión de superficie: traS, traT.
2. Regiones para la replicación vegetativa del plásmido F: la zona
RepFIA es la más importante, y posee genes relacionados con la
replicación vegetativa, con la incompatibilidad de F respecto de
otros plásmidos (Inc) de tipo similar, y con el reparto de las copias
replicadas de F a las células hijas.
3. Existen varias secuencias de inserción: dos copias de IS3, una
copia de IS2 y una copia de Tn1000 (antes llamado γ δ , y que
pertenece a la misma familia que los transpones Tn1, Tn3, etc).
Precisamente son estas secuencias de inserción las que permiten
la integración de F en varios lugares del cromosoma, por medio de
recombinación homóloga con elementos similares del genóforo
bacteriano. Aludiremos a esto de nuevo, cuando tratemos el
origen de las cepas Hfr y de las cepas F'.
4. Observen que existen dos secuencias ori (es decir, orígenes de
replicación). Una de ellas, la oriV actúa como origen de replicación
vegetativa, y la otra (oriT, de unas 300 pb) es el origen para la
 transferencia conjugativa, que como veremos enseguida, implica
un tipo especial de replicación.

3.2 FISIOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CONJUGACIÓN

Podemos distinguir en la conjugación dos grandes fases:

• contactos entre células F+ (o, en su caso, Hfr) y F--;

• transferencia del ADN.

3.2.1 CONTACTOS ENTRE CÉLULAS F+ Y F--

Las células F+ (o las Hfr) forman de 1 a 10 pelos sexuales (repasar aquí lo que se dijo
oportunamente en el cap. 11 sobre este tipo de pelos, que son distintos de las fimbrias de
tipo adhesivo). El pelo interacciona específicamente, a través de su punta, con un receptor
de la célula F-- (concretamente, parece ser que se trata de la proteína OmpA, de la
membrana externa).

En los cruces se ha visto que más que parejas de cruce existen agregados de cruce, donde
varias células de ambos tipos (hasta unas 20) se encuentran relacionadas por contactos
directos. Las cosas ocurren de la siguiente manera:

Una célula F+ contacta por medio de la punta de su pelo F con el receptor de superficie de
una F-- El pelo F se va despolimerizando desde su base, lo cual provoca la apariencia de que
se va retrayendo. En ese movimiento de retracción, la célula F-- se va acercando a la F+.
Cuando el pelo se termina de desintegrar, las células se ponen en contacto directo pared-
pared. Se forma un puente conjugativo que pone en contacto los citoplasmas de ambas
células Las parejas o agregados de cruce se estabilizan por la acción de los genes traN y
traG del plásmido F, y de ompA de la célula F--. La proteína producida por traD (localizada
en ambas membranas, citoplásmica y externa) parece que facilita el transporte del ADN a la
célula receptora. Tras cierto tiempo de conjugación, el agregado se desagrega de forma
activa.

Aquí hablaremos de un fenómeno interesante, que tiene que ver con las interacciones entre
superficies celulares: se trata de la exclusión superficial, y consiste en un sistema por el
que se evita que las células de tipo F+ puedan actuar como receptoras frente a otras F+. Se
sabe que la acción de dos genes del plásmido F realizan esta función:

• traT: su producto se sitúa en la membrana externa, impidiendo la

formación de contactos con pelos sexuales de otra célula F+.
• traS: su producto, situado en la membrana citoplásmica, evita la entrada
de ADN desde otra célula F+.

Otro fenómeno que se puede observar en los cruces F+ x F-- es la zigosis letal. Ocurre
cuando la proporción de células F+ es muy superior a la de F-- (p. ej., de 10:1). En este caso,
las células receptoras pueden morir, debido a que están siendo modificadas en muchos
puntos de su superficie por numerosos contactos con células F+.

3.2.2 TRANSFERENCIA Y PROCESAMIENTO DEL ADN CONJUGATIVO

La transferencia de ADN desde una célula F+ a una F-- es un proceso especial de

replicación asimétrica por círculo rodante.

• Una de las dos cadenas parentales del plásmido F pasa a la célula

receptora, replicándose en ella;
• La otra cadena parental se queda en el donador, sirviendo a su vez como
molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. Esto
explica porqué las células F+ siguen siendo F+ tras la conjugación.

Por lo tanto, la transferencia de ADN no implica que la doble hélice de F desaparezca del
donador para aparecer en el receptor, sino que al final, ambos miembros de la pareja poseen
un plásmido F completo.

Resumiendo el modelo que explicaremos luego, la transferencia conjugativa del plásmido F

ocurre de la siguiente manera:

• En la célula F+, una endonucleasa específica codificada por uno de los

genes tra reconoce y corta en una de las cadenas de la secuencia oriT
del plásmido.
• La cadena así cortada se ve desplazada por una helicasa codifica por
otro gen tra del plámido.
• Los productos de otros genes tra transfieren la cadena cortada al
receptor. Al parecer, los extremos de esa cadena permanecen
"anclados" a otra proteína Tra (es decir, durante el proceso nunca
quedan extremos libres como tales).
• Cuando la cadena rota ha terminado de entrar al receptor, la proteína
Tra que mantenía los extremos 3’ y 5’, vuelve a unirlos (se rehace el
enlace fosfodiéster).
• Durante el proceso de transferencia de la cadena rota en el receptor, se
están dando dos procesos de síntesis de ADN: por una lado, la cadena
intacta de F del donador sirve como molde para sintetizar la
correspondiente cadena complementaria (que es idéntica, claro está, a
la cadena desplazada hacia el receptor); y al mismo tiempo, en el
receptor, la cadena transferida, conforme va entrando, va sirviendo para
sintetizar la cadena complementaria. De este modo, al final, el donador
sigue siendo F+, y el receptor se ha convertido en F+.

Veamos el modelo actualizado que incorpora lo que se conoce de este proceso (aunque por
supuesto, aún quedan puntos hipotéticos por aclarar):

1. Corte específico de una de las cadenas de F a nivel de la

secuencia oriT. El corte lo realiza el complejo {TraY+TraZ}, que se
localiza anclado en el poro o canal de conjugación. Así pues, este
 complejo actúa en este momento como una endonucleasa específica
que corta en una sola de las cadenas de F, dentro de la secuencia oriT.
2. El producto del gen traM suministra la señal, por un mecanismo
desconocido, para desencadenar la transferencia.
3. El extremo 5' generado en el corte a oriT entra a la célula receptora,
pero dicho extremo permanece unido al complejo {TraY+TraZ}. La
transferencia progresa en el sentido 5'  3'. El complejo {TraY+TraZ}
actúa ahora como una helicasa de tipo I, de modo que va
desenrollando la doble hélice del F, separando las dos hebras, e
hidrolizando ATP simultáneamente (o sea, la helicasa de F es una ATPasa
dependiente de ADN). De esta forma se va desenrollando la doble hélice
a razón de unas 1200 pb/ seg.
4. Síntesis conjugativa del ADN: Se producen dos procesos simultáneos
de síntesis de ADN, uno en cada célula:
a. Síntesis de la cadena de reemplazo del donador (SCRD):
esta síntesis opera de modo continuo (sería equivalente a la
síntesis de la cadena adelantada de la replicación normal). Esta
síntesis se inicia a partir de un ARN cebador ("primer" en inglés)
sintetizado por un primosoma que reconoce una secuencia (n')
situada cerca de oriT.
b. Síntesis de la cadena complementaria en el receptor
(SCCR): a diferencia de la anterior, es discontinua, a base de
fragmentos de Okazaki (por lo tanto, sería la equivalente de la
síntesis de la cadena retrasada).

En ambos casos parece ser que el primosoma responsable de los ARN cebadores no
es exactamente idéntico al que se emplea en la replicación "normal", sino que está
modificado por alguna función específica codificada por el plásmido F (una primasa
específica del factor F).

5. Circularización del ADN transferido y replicado, y adquisición de

configuración final: No se sabe exactamente cómo ocurre la
circularización (o sea, cómo se vuelven a ligar los extremos generados
por la rotura descrita en el apartado 1º). Parece ser que el complejo
{TraY+TraZ} "guarda" la energía del enlace fosfodiéster que él corta
(conservándola al unirse con el ADN cortado), y luego la vuelve a
emplear para "sellar" el corte una vez que las cadenas han sido
replicadas-y-transferidas (o sea, el complejo actuaría al final como una
"ADN-ligasa"). Posteriormente, sobre esta molécula circular cerrada
covalentemente (C.C.C.) y aún "relajada", actúa la ADN-girasa,
introduciendo superenrollamiento negativo. En esta configuración, el
plásmido F queda intacto y funcional en el transconjugante.
6. En el caso de cruces Hfr x F--, al menos una parte del fragmento
cromosómico "arrastrado" desde el donador al receptor se recombina,
con un doble sobrecruzamiento (por el sistema de RecA) con la porción
homóloga del endogenote, lo que lleva a sustitución de unas secuencias
por las otras.
3.3 REGULACION GENÉTICA DE LA
CONJUGACION
La mayor parte de los plásmidos conjugativos (pero curiosamente no el F) tienen un control
negativo de su transferencia, de modo que sólo se transfieren a alta frecuencia durante unas
pocas generaciones, al cabo de las cuales se establece una baja frecuencia de conjugación().
El resto del tiempo, los genes tra están reprimidos.

Vamos a referirnos a un plásmido que sí tiene control negativo: el R1, perteneciente a otro
grupo de incompatibilidad (IncFII) distinto del F, pero que por lo demás tiene funciones
similares:

La regulación negativa se produce por la acción de los genes finO y finP, e implica un
mecanismo basado en ARN regulatorio antiparalelo (antisentido).

• finO está situado distalmente respecto del gran operón traY……Z.

• finP está situado en la zona proximal, superpuesto de hecho con el
gen traJ, transcribiéndose en sentido opuesto, a partir de la
cadena opuesta a la que se usa para la transcripción de traJ.
• El ARN producido por transcripción de finP es antiparalelo respecto de
una parte del ARNm del gen traJ. El producto de traJ es un activador de
la transcripción del gran operón traY.....Z. Ahora bien, el ARN
antiparalelo de finP tiende a emparejarse con la porción 5' del ARNm de
traJ, ocultando la secuencia de Shine-Dalgarno. La conjunción de la
expresión de finP y de finO (que produce una proteína represora)
tienden a dificultar la expresión (a nivel traduccional y
transcripcional) del gran operón tra.

La superposición de un sistema de regulación positiva (por traJ) con otro de regulación

negativa (por finO + finP) es la responsable de una importante característica de muchos
plásmidos conjugativos: su dispersión esporádica de tipo epidémico entre poblaciones
bacterianas:

• Supongamos que partimos de una población donde originalmente casi

todas las células son de tipo infértil (F-- o R--), y donde existe una minoría
de células poseedoras de un plásmido conjugativo con el tipo de
regulación que acabamos de describir. Cuando alguna de las células
infértiles reciban por conjugación una copia del plásmido, tiene que
pasar un tiempo (contado en generaciones de divisiones celulares) hasta
que se vayan acumulando los productos de los genes finO y finP hasta
que alcancen una concentración suficiente como para inhibir la
conjugación. Por lo tanto, durante unas pocas generaciones el plásmido
tiene una gran tendencia a transferirse a células F--. Se dice que durante
ese tiempo ocurre una alta frecuencia de transferencia (HFT). De este
modo, bastan esas pocas generaciones para que el plásmido se
disemine de forma epidémica a casi toda la población.
 • Al cabo de ese tiempo, la acumulación del ARN de finP y de la proteína
de finO llega a un nivel que ya es capaz de inhibir la conjugación
eficazmente. El cultivo pasa, pues, a la modalidad de baja frecuencia de
transferencia conjugativa (LFT). Sin embargo, para cuando se haya
establecido este control, prácticamente todas las células se habrán
convertido ya en F+. Estamos, pues, ante un sistema de conjugación que
permite "prever" su propia desconexión (con el consiguiente ahorro),
una vez que se ha logrado el "objetivo" de haberse diseminado a la
población.

Significado adaptativo de este sistema de control: Como acabamos de exponer, este

sistema asegura la rápida dispersión epidémica de los plásmidos, de modo que la represión
de la transferencia se produce coincidiendo con la situación en la que de hecho el plásmido
conjugativo ha "invadido" toda o casi toda la población, ahorrándose la energía y materiales
que tendría que dedicar a fabricar pelos sexuales y demás funciones conjgativas en unas
circunstancias en las que serían superfluos.

Pero además, como se recordará, los pelos sexuales son la zona de reconocimiento de una
diversidad de fagos (p. ej., para los pelos F existen diversos fagos icosaédricos de genomio
ARN que se adsorben a los laterales del pelo, y fagos filamentosos de ADN que comienzan
su infección uniéndose a la punta del pelo sexual). Cabe imaginar que la represión de las
funciones tra (entre ellas, claro está, la fabricación del pelo) son una ventaja para la
bacteria, al evitar que durante la mayor parte del tiempo puedan iniciar la infección dichos
fagos específicos.

4. INTERACCIONES DEL PLÁSMIDO F CON EL

CROMOSOMA

4.1 FORMACIÓN Y CARACTERÍSTICAS DE LAS CEPAS Hfr

Como ya dijimos, el plásmido F puede pasar desde su estado autónomo a un estado

integrado en el cromosoma bacteriano (episoma), lo que es el origen de la creación de las
cepas Hfr. Veamos ahora la base genético-molecular de este proceso:

Se da una recombinación entre secuencias homólogas presentes simultáneamente en el

plásmido F y en el cromosoma, que son secuencias de inserción. Concretamente, en F
existen 2 copias de IS3, 1 copia de IS2 y una copia de Tn1000 (que hasta hace poco se
denominaba γ δ ), y en el cromosoma hay varias copias de IS. Esta recombinación se da
principalmente debido a la actuación del sistema de recombinación homóloga
(dependiente de RecA), de modo que las IS funcionan aquí como regiones portátiles de
homología implicadas en eventos de recombinación homóloga con un sobrecruzamiento
("crossing-over") sencillo. Sin embargo, en las cepas mutantes recA--, la recombinación
puede tener lugar por el sistema de recombinación ilegítima propio de los elementos
transponibles (el mecanismo sería el de la fusión de replicones, al que aludimos cuando
estudiamos la transposición). En cualquiera de los dos casos, el plásmido integrado, es
decir, el episoma, aparece "emparedado" entre dos copias de la IS implicada en la
recombinación.

Cada recombinación origina una Hfr distinta, dependiendo de las secuencias IS implicadas,
de su localización dentro del cromosoma de E. coli, y de la orientación. Ya dijimos que se
han identificado unas 22 cepas Hfr distintas, y que existen ejemplos de parejas de Hfr que
transfieren cromosoma a partir del mismo punto cromosómico, pero en orientaciones
opuestas.

Recordemos de nuevo que las Hfr codifican todas las funciones del plásmido F. Al
promover la transferencia conjugativa, "arrastran" al cromosoma desde el oriT. Para que se
transfiriera todo el cromosoma, la pareja de cruce debería permanecer unida 100 minutos, y
en ese caso, lo último que se transfiere es la porción del plásmido F que queda al otro lado
de oriT (y que es la que lleva la región tra). Pero como dijimos, ello ocurre raramente
(porque antes las parejas de cruce se deshacen espontáneamente), y por lo tanto, esta es la
razón de que en los cruces HfrXF-- los transconjugantes siguen siendo F--.

Así pues, en la mayer parte de los cruces HfrFXF--, lo que se transfiere (el exogenote) es un
fragmento más o menos largo de ADN cd lineal del donador, encabezado por una parte del
plásmido F y seguido por un trecho de cromosoma. Este fragmento no tiene capacidad de
replicación autónoma, y su destino será perderse a no ser que se recombine con alguna
porción homóloga del endogente. Si ocurre esa recombinación, y suponiendo (como ocurre
en los experimentos) que donador y receptor tienen marcadores distintos, nosotros
detectamos eso precisamente por la alta frecuencia de recombinantes entre la población de
transconjugantes receptores. No hace falta insistir (ya lo vimos en los experimentos de
Jacob y Wollman) que para cada cepa Hfr existe un "gradiente" de marcadores transferidos,
según su frecuencia final en los transconjugantes, que a su vez se correlaciona con el
tiempo de entrada al receptor (siendo esto la base de la elaboración de mapas genéticos por
conjugación).

4.2 REVERSIÓN DE LAS CEPAS Hfr, ORIGEN DE

LAS F', Y SEXDUCCIÓN
La cepa Hfr puede revertir a F+, por una escisión precisa (exacta), que implica los extremos
del factor integrado (las secuencias IS que lo "emparedan"). Cada cepa Hfr concreta
presenta una frecuencia característica de reversión a F+. Algunas cepas son muy inestables,
de modo que revierten frecuentemente, lo que obliga a purificarlas continuamente en el
laboratorio para evitar que al final se obtenga una población F+. En cambio, otras cepas son
muy estables. La cepa HfrC es la más estable, de modo que raramente revierte por escisión.

Pero también pueden ocurrir escisiones imprecisas (en las que están implicadas secuencias
repetida diferentes a las IS que flanquean al episoma), de modo que el factor F adquiere
trozos de genomio bacteriano adyacentes al lugar donde estaba integrado. Estos plásmidos
F autónomos que adquieren e incorporan permanentemente un trozo de genomio
bacteriano, se denominan F' (F-primas). Dependiendo de qué se lleva en su escisión
anómala se pueden distinguir:

1. Escisiones que dejan parte de F en el genóforo pero que

adquieren genes a uno u otro lado del sitio original de inserción:
generan las F' de tipo I, que a su vez pueden ser:
a. F’ de tipo Ia: adquiere genes del lado proximal (o sea, aquellos
que la cepa Hfr original transfería en primer lugar);
b. F' de tipo Ib: adquiere genes del lado distal (los que se transferían
tardíamente por la cepa Hfr original).
2. Escisiones que no dejan ninguna porción de F en el genomio bacteriano,
pero que incorporan genes a ambos lados del sitio de inserción
original: generan F' de tipo II.

A las cepas donde se genera originalmente cada F' concreto se las llama con el nombre de
cepas F' primarias. Cada plásmido F' porta un segmento concreto y discreto de
cromosoma, que dependiendo de la cepa puede tener una longitud de hasta el 25% del
cromosoma bacteriano. Observen que una cepa F’ primaria tiene una delección en su
cromosoma, pero esa delección no es letal, porque el trozo de ADN escindido sigue en la
célula, aunque formando parte ahora del F prima.

Si realizamos un cruce F' x F--, la célula receptora adquiere ese plásmido F', y por lo tanto,
los genes bacterianos portados por dicho F'. Esta es la base del siguiente concepto:

4.3 SEXDUCCIÓN

La sexducción consiste en el transporte de material genético desde una célula a otra por
medio de plásmidos F'. Sus caracteres distintivos respecto de los cruces F+ x F-- y de los Hfr
x F-- son:

• A diferencia de los cruces F+ x F--, el plásmido F' transfiere regiones

cromosómicas discretas a altas frecuencias (cercanas al 100%);
• Pero a diferencia de los cruces Hfr x F--, el receptor se convierte en fértil.

Las cepas generadas por transferencia a ellas de un F' desde una cepa F' original se
denominan F' secundarias. Tras la sexducción, si la cepa receptora es recA+, se produce
una recombinación entre segmentos cromosómicos (procedentes de la célula donadora)
portados por el F' y marcadores cromosómicos homólogos de esa cepa receptora. Se origina
una cepa parecida a las Hfr (pero que no se ha producido por recombinaciones a través de
las IS), que es merodiploide (diploide parcial) por recombinación, y no un
recombinante por sustitución.

Si se cura una cepa F' primaria de su plásmido F', obviamente quedará sin los genes
cromosómicos que había "secuestrado" el factor F'. Si dichos genes eran esenciales para la
viabilidad celular, el resultado es que la célula muere. Si no eran esenciales, se producirá la
pérdida de funciones correspondientes, con la pertinente alteración del fenotipo.
El uso de factores F-primas fue muy útil durante muchos años para hacer análisis genéticos
en bacterias (por ejemplo, muchos de los datos sobre el operón lac de Escherichia coli se
obtuvieron con F-primas, lo cual permitía realizar pruebas de complementación cis-trans).
Sin embargo, actualmente, al igual que otras técnicas in vivo desarrolladas durante la "edad
de oro de la genética molecular" (años 50-60), han sido prácticamente desplazadas por los
métodos de Ingeniería Genética.

5. ALGUNAS IDEAS ADICIONALES SOBRE BIOLOGÍA DE

LOS PLÁSMIDOS

Vamos a concluir el presente capítulo con una rápida visión de algunos aspectos
importantes de la biología de los plásmidos, deteniéndonos en algunos sistemas plasmídicos
distintos al tipo del factor F que acabamos de estudiar.

5.1 TIPOS DE PLÁSMIDOS

Existe una amplia variedad de plásmidos. Los plásmidos bacterianos son de muchos tipos
distintos, pero a grandes rasgos podemos clasificarlos atendiendo a diversos caracteres:

1. Según que sean autotransmisibles por conjugación o no:

a. plásmidos conjugativos
b. plásmidos no-conjugativos. Dentro de esta categoría se incluyen:
i. plásmidos no movilizables
ii. plásmidos movilizables por otros que sí son conjugativos.
2. Según su control de replicación vegetativa:
a. Plásmidos de control estricto del número de copias: tienen bajo
número de copias por cromosoma en la misma célula. Suelen ser
plásmidos de tamaños medianos (unas 30 kb) a grandes (cientos
de kb) P. ej., el factor F se mantiene a 1-2 copias por cromosoma.
b. Plásmidos de control relajado: alto nº de copias por cromosoma
(más de 10). Suelen ser plásmidos pequeños (menos de 10 kb).
Algunos de ellos tienen un sistema de replicación especial, y son
amplificables cuando a las bacterias que los poseen se les añade
cloramfenicol: este antibiótico detiene la síntesis de proteínas, lo
que afecta a la replicación del cromosoma, ya que para que se
inicie cada ciclo de replicación cromosómica se necesita un nuevo
"pool" de determinadas enzimas. Pero esto no afecta a la
replicación del plásmido, que de este manera se "amplifica" y
aumenta aún más su proporción respecto del cromosoma.
3. Según el tipo de fenotipos que codifican (y dejando aparte a los
plásmidos crípticos, de los que se desconoce su función fenotípica):
a. Plásmidos R, que codifican una o más resistencias a drogas
(antibióticos) y/o resistencia a metales pesados.
b. Plásmidos bacteriocinogénicos, que codifican alguna bacteriocina
y simultáneamente confieren inmunidad frente a esa bacteriocina
a la bacteria que lo posee. Dentro de ellos, de los más estudiados
 son los plásmidos Col, que producen colicinas (bacteriocinas de E.
coli).
c. Plásmidos de virulencia, que codifican funciones relacionadas con
la virulencia en muchas bacterias patógenas. Por ejemplo:
i. plásmido de la toxina tetánica en Clostridium tetani.
ii. plásmido de la toxina del ántrax en Bacillus anthracis.
d. Plásmidos que codifican factores de colonización (para la invasión
de los tejidos de su hospedador).
e. Plásmidos de cepas de Pseudomonas, que confieren rutas
metabólicas capaces de utilizar como fuentes de carbono y
energía sustancias que otros organismos no pueden catabolizar:
i. plásmidos OCT (degradación del octano);
ii. plásmidos TOL/XYL (degradación del tolueno y xileno);
iii. plásmidos NAF (degradación del naftaleno), etc.
f. Plásmidos de cepas de Rhizobium responsables de funciones
relacionadas con el establecimiento de las simbiosis fijadoras de
nitrógeno en los nódulos radicales de las leguminosas (pSym y
otros tipos).
g. Plásmidos Ti y Ri de Agrobacterium, responsables de la
producción de tumores en numerosas plantas dicotiledóneas.
h. Existen igualmente plásmidos que codifican más de un tipo de
fenotipos: p. ej., plásmidos que suministran resistencia a
antibióticos y capacidad de virulencia.
4. Plásmidos según el grupo de incompatibilidad. Recordar la definición de
incompatibilidad entre plásmidos que se dio oportunamente, y la base
de este fenómeno: dos plásmidos son incompatibles (no pueden
permanecer establemente en la misma célula) porque comparten un
mismo sistema de replicación y segregación de las copias. Como se
sabe, los plásmidos se pueden clasificar según su pertenencia a un
mismo grupo de incompatibilidad.
a. Así p. ej., el plásmido F pertenece al llamado grupo IncFI;
b. Los plásmidos R1 y R100, de resistencia a antibióticos, pertenecen
al grupo IncFII.

Obsérvese que dos plásmidos conjugativos pertenecientes a grupos de incompatibilidad

diferentes pueden poseer regiones tra semejantes, y tipos de pelos sexuales parecidos. Esto
es precisamente lo que ocurre con el F comparado con el R1 o el R100.

5.2 MÁS IDEAS ACERCA DE PLÁSMIDOS EN BACTERIAS GRAM

NEGATIVAS

En Gram negativas existe una muy amplia variedad de plásmidos. Podemos encontrar
ejemplos de plásmidos conjugativos, aunque no todos basados en el sistema que hemos
estudiado para el factor F. Muchos plásmidos conjugativos poseen pelos de tipo F (por ej.,
los ya citados R1 y R100), pero existen otros tipos de sistemas, con sus correspondientes
clases de pelos sexuales. p. ej., el plásmido colicinogénico ColE1 posee pelos de tipo "I".
Existen muchos casos de plásmidos no conjugativos, pero algunos de ellos pueden ser
transferidos a cepas receptoras cuando "conviven" en la célula donadora con otro plásmido
conjugativo capaz de movilizarlos. Ello suele deberse a que estos plásmidos no
autotransmisibles pero movilizables carecen de la región tra, pero poseen una región
denominada mob (del inglés "mobilizable"), que es reconocida por proteínas Tra de
conjugación suministradas en trans por el plásmido movilizador, aunque la región mob del
plásmido movilizable suministra una región en cis (la secuencia oriT) y un par de funciones
en trans (la endonucleasa específica que actúa sobre oriT , y una helicasa).

En algunas bacterias Gram negativas, p. ej., en cepas de Pseudomonas existe un tipo

especial de plásmido conjugativo, que tiene la facultad de transferirse a sí mismo y
transferir cromosoma entre una amplia variedad de bacterias Gram negativas, incluyendo
entre géneros muy diferentes. A esta clase de plásmidos se le ha dado el nombre de
plásmidos promiscuos, y se han usado mucho para realizar mapeos y análisis genéticos en
bacterias que por sí mismas carecen de sistemas naturales de conjugación. Ejemplos:

• determinados plásmidos de resistencia a antibióticos pertenecientes al

grupo IncP1 (como el RP4 y el R68.45, ambos con el fenotipo Ampr, Kanr,
Tetr).
• Plásmidos del grupo IncW (como el R388).
• Plásmidos del grupo IncN (como el pKM101)

La existencia de plásmidos conjugativos, promiscuos o no, y de plásmidos no conjugativos

pero movilizables, explica la rápida diseminación de muchos plásmidos de resistencia a
antibióticos a una amplia diversidad de bacterias, incluyendo importantes patógenas, lo que
hace cada vez más difícil la lucha por quimioterapia contra estas últimas. De hecho, un
importante problema sanitario lo suministran estas cepas multirresistentes, muchas de las
cuales están "acantonadas" en los ambientes hospitalarios, donde la presión selectiva es
grande. A continuación nos detendremos precisamente en un comentario sobre los
plásmidos R, su significado evolutivo y su importancia epidemiológica.

5.3 PLÁSMIDOS R

Los plásmidos de resistencia a antibióticos (plásmidos R) fueron descubiertos en los años

50 en Japón, cuando se investigaban cepas de Shigella multirresistentes (Cmr, Smr, Sur,
Tetr) que habían empezado a aparecer y proliferar, de modo que en pocos años se
diseminaron rápidamente por todo el primer mundo. Enseguida se encontraron en
numerosos países cepas de E. coli y de otras enterobacterias con plásmidos similares.

Del intenso estudio a que han estado sometidos estos plásmidos desde entonces se deduce
que los plásmidos R son "maleables" y que evolucionan rápidamente ante la presión
selectiva. Con las modernas técnicas de Ingeniería Genética y de secuencición de ADN ha
sido posible medir el grado de similitud de los genes plasmídicos de resistencia a
antibióticos procedentes de bacterias muy diferentes, y de orígenes geográficos muy
alejados entre sí, deduciéndose que estos genes han debido de "pasar" de forma epidémica
de unas cepas a otras, entre especies y géneros muy distintos ("transmisión horizontal" de
información genética). Un mismo gen, conservado en su secuencia en especies muy
alejadas, puede sin embargo estar situado en plásmidos de diferentes tipos y grupos de
incompatibilidad. Esto ya es un indicio de que los plásmidos R son bastante "moldeables",
y que han venido evolucionando rápidamente desde que el hombre introdujo los
quimioterápicos a mediados de este siglo.

Para hacernos una idea concreta del tipo de procesos implicados en este gran "experimento
de evolución bacteriana" desencadenado por el hombre, veamos la estructura del ya citado
plásmido R1, un típico plásmido R conjugativo.

Observen en los mapas genéticos que posee dos grandes regiones, denominadas
determinantes:

• det-r: región portadora de los genes de resistencia a distintos

antibióticos.
• det-RTF: región con los genes tra, responsable del carácter conjugativo
del plásmido.

Veamos en más detalle el determinante "r". Comprobaremos que está compuesto de

"módulos", algunos de los cuales son transposones. El determinante "r" como un todo está
limitado por dos copias directas del IS1. Existe dentro un transposón, el Tn4, que codifica
Smr y Sur, pero a su vez, dentro de él se insertó otro transposón, el Tn3 (que codifica
Ampr). Por fuera del "doble transposón" Tn4-Tn3 encontramos más genes de resistencias:
Cmr (a la izquierda), y Kanr, Neor. Las copias de IS1 hacen que todo el determinante "r" se
comporte a su vez como un enorme transposón compuesto:

• El "r" puede transponerse a otro plásmido totalmente diferente, o incluso

al cromosoma;
• El "r" puede escindirse, es decir, puede separarse del RTF, por
recombinación homóloga entre las dos copias directas de IS1.
• El "r" puede amplificarse: se originan varias copias de "r" dentro del
mismo plásmido, de manera que esto permite a la bacteria resistir
mayores concentraciones de los antibióticos.

Consecuencias evolutivas y epidemiológicas: Aunque en la naturaleza, e

independientemente de la acción humana, ya existían plásmidos R antes de la era de los
antibióticos, está claro que desde el uso masivo de los quimioterápicos se ha originado un
aumento espectacular del número de cepas bacterianas portadoras de plásmidos R, así como
el hecho de que los R que se están aislando recientemente llevan mayor número de genes de
resistencia, lo que está dificultando los tratamientos de ciertas enfermedades infecciosas.

Estamos ante un espectacular "experimento" de genética de poblaciones, en el que la acción

humana ha llevado a la supervivencia y prevalencia de las cepas bacterianas más aptas, por
adaptación evolutiva frente a una fuerte presión selectiva.

Para ilustrar esto, basta hacer una sencilla comprobación: si se trata a un paciente con
tetraciclina, al cabo de una semana las cepas de E. coli que se aislen de sus heces serán casi
en su totalidad Tetr.
Está claro que la prescripción y uso indiscriminado de antibióticos como terapia provoca
una presión selectiva que favorece la prevalencia de cepas portadoras de plásmidos R, que
van "incorporando" genes de resistencia a diversos quimioterápicos. El uso de un
antibiótico provoca la selección automática de las demás resistencias a otros antibióticos,
ya que los genes responsables respectivos forman parte del mismo replicón, que además, al
ser en muchos casos de tipo conjugativo, puede diseminarse a otras cepas de la misma o de
diferentes especies.

En muchos países se usan antibióticos como suplementos de dieta para los animales
domésticos. Se ha comprobado que esto es también una fuente de transmisión de cepas
resistentes a humanos.

Otra cuestión evolutiva, aún no resuelta, es la del origen último de los genes de resistencia
que tan fácilmente parecen transferirse entre especies bacterianas. Una hipótesis es que
proceden de bacterias del suelo del grupo de los Actinomicetos, sobre todo del género
Streptomyces, que son típicos productores de antibióticos, y que poseen de modo natural
mecanismos de resistencia para evitar que el antibiótico que producen les afecte
negativamente.

5.4 CONJUGACION EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS

Hasta ahora, y a diferencia de Gram negativas, se han encontrado pocos sistemas

conjugativos en Gram positivas. Existen ejemplos de plásmidos autotransmisibles en
especies de Streptococcus, Enterococcus, Bacillus, Clostridium y Streptomyces, y todos
ellos son bastante diferentes de lo estudiado en Gram negativas. Por ejemplo, en ninguno de
estos hay implicación de pelos sexuales.

Los plásmidos conjugativos de los cocos en cadenas (géns. Streptococcus y Enterococcus)

han recibido cierta atención en los últimos años.

• Algunos de estos plásmidos (p. ej., pAMß1) promueven una conjugación

poco eficiente en líquidos, pero muy eficiente cuando las cepas
donadoras y receptoras se mezlan sobre la superficie de un filtro de tipo
Millipore.
• Otros plásmidos son muy eficientes en líquidos, como les ocurre a
ciertos plásmidos de Enterococcus faecalis. En estos casos el sistema de
conjugación de la célula donadora portadora del plásmido responde a
la presencia en el medio de feromonas sexuales excretadas por
las células receptoras, carentes del plásmido. Existen varios
ejemplos de este tipo que funcionan según este modelo. En cada caso,
cada tipo de célula donadora (según el plásmido concreto que lleve)
responde a un tipo definido de feromona. Las feromonas son pequeños
péptidos de alrededor de 1.000 dalton de peso molecular. Una cepa
receptora puede producir varias feromonas distintas, cada una
"dedicada" a provocar una respuesta conjugativa en diferentes cepas
donadoras según el plásmido que porten. Cuando una determinada
feromona alcanza la superficie celular de la correspondiente célula
donadora, induce en esta una serie de funciones relacionadas con la
 conjugación, una de las cuales es la producción de sustancias de
agregación, que provocan la adhesión entre donadoras y receptoras.
Una vez que la célula originalmente receptora recibe el plásmido, se
convierte en donadora de ese plásmido, y se reprime la producción de la
feromona correspondiente, aunque las otras posibles feromonas se
siguen sintetizando.

Por ejemplo, las células portadoras del plásmido pAD1 detectan un tipo concreto de
feromona, lo que genera la respuesta de agregación con las células que producen esa
feromona.

5.5 TRANSPOSONES CONJUGATIVOS EN ENTEROCOCCUS

En E. faecalis y otros cocos Gram positivos se ha descubierto una clase especial de

transposones que tienen la curiosa propiedad de inducir conjugación entre dos células para
transponerse desde el cromosoma de la donadora al de la receptora, pero sin producir
transferencia de marcadores cromosómicos. El mecanismo aún se desconoce en detalle,
pero parece que implica la circularización del transposón al escindirse del genóforo
donador. Al parecer, esta clase de transposones conjugativos son los principales
responsables de la diseminación de resistencias a antibióticos entre cepas de estos
estreptococos y a otras bacterias Gram-positivas. Ej.: Tn916, que codifica Tetr y que mide
unas 16 kb.

5.6 TRANSFERENCIA CONJUGATIVA ENTRE

REINOS
Un sorprendente sistema de intercambio de material genético nada menos que entre una
bacteria y plantas superiores lo tenemos en el caso de la bacteria Agrobacterium
tumefaciens, que parasita una amplia diversidad de plantas dicotiledóneas. Como el
estudiante verá en la sección de Taxonomía bacteriana, esta bacteria provoca el llamado
"tumor en agalla" en los tallos de muchas plantas, debido a que posee un plásmido llamado
Ti (iniciales inglesas de "inducción de tumoración (=agalla en corona)". Los productos de
ciertos genes del plásmido Ti detectan la presencia de la planta, y activan a los genes tra,
que promueven la transferencia a la célula vegetal de un segmento del plásmido
denominado ADN-T. Dicho ADN-T se integra en el genoma vegetal, y allí los genes que
lleva, que son de tipo eucariótico, obligan a la planta a fabricar hormonas vegetales
(responsables del crecimiento incontrolado de las células de la planta) y a fabricar unas
sustancias (las opinas) que sólo puede usar la bacteria como fuente de C y energía. Estamos
ante un extraordinario caso de "colonización genética" de una bacteria sobre un organismo
superior.

Los humanos hemos aprendido, a nuestra vez, a "domesticar" el sistema del plásmido Ti, de
modo que actualmente, a partir de él se puede realizar Ingeniería Genética de plantas. La
mayor parte de las plantas transgénicas están obtenidas con algún sistema de plásmidos
artificiales derivados de Ti, que funcionan como vectores para introducir genes foráneos en
una amplia diversidad de especies vegetales.