Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
APOSTILA
MTODO ESTEREOLGICO
ALUNOS:
Aurlia de Ftima Mazon
Carla Cristina Cavalcante Cerqueira
Cssio Arilson de Andrade
Eliane A. Santos Monteiro
Fbio de Jesus Castro
Flvia Santanna Rios
Guilherme Henrique Dyonisio Pinheiro
Jesiel Mamedes Silva
Jorge Takasusuki
Marcos Flvio Pdua Ges de Moraes
Marise Margareth Sakuragui
Odila Rigolin de S
Oscar Tadeu Ferreira da Costa
Roger Nicolas Bulin
Sandro Estevan Moron
ESTEREOLOGIA
PRNCIPIOS GERAIS
experimentos com ovinos. Micrografias foram tiradas dos pulmes de ovinos recmnascidos por meio de cesariana com 80 e 100% da gestao. Baseado nestas fotografias,
podemos determinar a rea da superfcie pulmonar durante a ltimo perodo de gestao.
Este exerccio visa verificar se houve alterao na rea de superfcie pulmonar
durante os ltimos 20% do perodo de gestao.
A superfcie expressa como se segue: 1) pelo volume relativo do pulmo; 2)
pelo volume relativo ou absoluto da massa corporal.
A rea de superfcie relativa ao volume do pulmo, ser considerada como a
relao superfcie por volume (SV). A superfcie absoluta (SL) dada pela equao SL=
SV . VL, onde VL o volume do parnquima pulmonar. A rea de superfcie (SM) em
relao a massa corporal (MB) dada por SL/MB.
O "parnquima" pulmonar (+/- 20% do pulmo) constitudo de tecido
respiratrio (paredes alveolares e capilares) e pelo espao ocupado pelo ar. As estruturas
de conduo de ar e sangue, assim como o tecido conectivo so definidos como "no
parnquima".
Colocando-se aleatoriamente uma transparncia contendo uma grade de teste (test
lines) sobre a fotografia podemos determinar a SV dos pulmes.
1. Coloque sobre a fotografia a grade de teste (Figura 1) .
2. Calcule o comprimento das linhas teste LT, que caem sobre o parnquima pulmonar
da seguinte maneira:
a) Identifique as partes no parnquimticas (ductos de ar, vasos sangneos e tecido
conectivo), marcando as na transparncia.
b) Conte os pontos (iniciais e finais) PT das linhas de teste que caem sobre o
parnquima.
c) Calcule o comprimento das linhas de teste LT que incidiram sobre o parnquima
-4
LT = d/2 . PT = 1058,4 . 10
5. Calcule a relao entre a rea de superfcie (SL) e o volume pulmonar (VL) a partir da
frmula:
-4
-1
2 IL = SV = SL/ VL = 0,094 . 10 = 940 cm
AMOSTRAGEM
47
167......
887
Variaes
Podem ocorrer dois tipos de variaes:
- Variao Biolgica - os estereologistas assumem uma variao de 15% em
uma populao
Este tipo de variao pode ser reduzido aumentando-se o tamanho da amostra.
- Variao sistemtica - relacionada ao erro humano e estimada em 10%
OBS: Recomenda-se uma pausa a cada hora e meia quando se faz estereologia, pois
os erros aumentam significativamente aps este perodo.
"O Fractionator"
O "fractionator" o sistema de amostragem mais simples utilizado em
estereologia, e talvez por esta razo, o mais preciso. O princpio o seguinte: Retira-se
uma frao do objeto, por exemplo, um milsimo. Conta-se todas as partculas presentes
nesta frao. Uma estimativa imparcial do nmero total de partculas presentes no objeto,
consistir no nmero de partculas contadas multiplicado pela frao, no caso 1000.
Entretanto, imprescindvel que a frao obtida seja conhecida e que satisfaa uma
probabilidade randomicamente uniforme, ou seja, que toda parte do objeto tenha tido a
mesma chance ou probabilidade de ter sido includa na amostragem.
Para ilustrar melhor o princpio, utilizaremos o seguinte exemplo:
As letras presentes em uma folha de jornal representam uma populao de
partculas. O objetivo estimar o nmero total N de partculas (letras) da folha.
Procedimento:
1. Prepare a folha, retirando figuras e eventuais espaos em branco.
2. Corte a folha ao meio e em seguida corte uma das metades em 20-30 pedaos.
- arranje os pedaos por ordem de tamanho como demonstardo abaixo
ooooooooo)
(ooooo
- colete uma amostra retirando um pedao a cada dois (veja setas acima). Esta
amostragem sistemtica chamada "fractionator"
(ooooooo) Frao amostrada = 1/2
3. Sub-amostragem
A. Corte a amostra acima em 20-30 pedaos
B. Arranje como feito anteriormente
C. Retire sistematicamente 1/3 dos pedaos
- para iniciar a amostragem, escolha randomicamente com o auxlio de uma
tabela de nmeros randmicos, um nmero entre 1 e 3
- colete os pedaos e dispense o restante
- a frao amostrada agora corresponde a 1/2 x1/3 = 1/6
4. Repita os itens A-C, porm, sub-amostre 1/4 do material
- frao amostrada = 1/4 x 1/6 = 1/24
5. Repita A-C, amostrando 1/5 do material
- frao amostrada = 1/24 x 1/5 = 1/120
6. Conte o nmero de partculas (letras) na amostra. Toda letra que tiver pelo menos sua
parte inferior direita representada na amostra ser considerada.
- Nmero de partculas = X
- Estimao do nmero total No = 120 . X
7. Pegue a segunda metade da folha e repita o procedimento
- frao amostrada = 1/120
- nmero de partculas = Y
- estimao do nmero total Ne = 120 . Y
- O nmero total final estimado N :
N = 1/2( No + Ne)
8. Pode se estimar o coeficiente de variao pela frmula abaixo:
CV = [1/3n (No - Ne / No + Ne )2]1/2
onde n corresponde ao nmero de folhas (neste exemplo n =1)
Este mesmo procedimento pode ser aplicado a vrios tipos de objetos de estudo
(e.g. rim, bao, fgado, etc...).
Uma caracterstica importante do "fractionator" a no necessidade de medidas
dimensionais (aumento do microscpio, espessura da seco, etc.) o que torna a
estimativa totalmente independente das deformaes que por ventura possam existir ( ex.
encolhimento e/ ou inchao).
VOLUME DE REFERNCIA
Para estimar-se o volume de uma determinada estrutura, necessrio conhecer
um Volume de Referncia.
O mtodo para estimar o volume de referncia mais comumente usado em
estereologia o Mtodo de Cavalieri (Cavalieri, 1635; Gundersen and Jensen, 1987).
Outros mtodos que podem ser mais apropriados, incluem simplesmente pesagem e
imerso em gua. Se o rgo apresenta consistncia e densidade conhecidas, ento
determina-se o volume diretamente atravs da pesagem. A volumetria usando imerso em
gua baseia-se no Princpio de Arquimedes do deslocamento dos fluidos. Contudo, se o
rgo possuir cavidades que se abrem para o meio externo, como o pulmo, o volume
subestimado atravs deste mtodo.
Para a determinao do Volume de Referncia os mtodos mais freqentemente
empregados so : Deslocamento de Volume e do Princpio de Cavalieri:
1. DESLOCAMENTO DE VOLUME
Recomenda-se a utilizao de tecidos frescos. Se forem utilizados tecidos
fixados, deve-se ter o cuidado de utilizar um fixador que provoque o mnimo de retrao
no material. Para mamferos, o fixador recomendado Glutaraldedo a 2% em tampo
levemente hipertnico, aproximadamente 350 mOsm.
Mtodo:
O volume determinado atravs da imerso do corpo em fluido e registro do peso em
balana (Fig. 3).
1) Sobre o prato de uma balana, colocar um frasco contendo soluo fisiolgica ou
tampo.
2) Tarar a balana
3) Prender o rgo no suporte e mergulhar na soluo, sem que ele toque no fundo ou
nas paredes do frasco.
4) A diferena de massa indicada pela balana revela o volume do rgo.
Tampo
2. PRINCPIO DE CAVALIERI
Em certos casos no possvel medir o volume de uma estrutura pelo Mtodo do
Deslocamento, por exemplo quando o rgo muito pequeno ou quando impossvel
separar a estrutura estudada de outros rgos ou tecidos. Nestes casos, utiliza-se o
Princpio de Cavalieri. Este mtodo possibilita a estimativa de volumes confiveis,
mesmo em rgo com formas irregulares.
O matemtico italiano Cavalieri (1598-1647) mostrou que o volume de um
objeto (V) pode ser estimado a partir de seces paralelas separadas por uma distncia
conhecida (t), somando-se as reas de todas as seces transversais do objeto (
A) e
multiplicando este resultado por t (Gundersen et al., 1988).
A nica condio imposta por este mtodo que o primeiro corte seja randmico
no objeto. A estimativa completamente independente da orientao do conjunto de
cortes e da forma do objeto (Figuras 4A e 4B).
t1
t2 ..................... t n
T = ti
_
_
V = t A (V= volume, t = espessura, A = rea)
10
Mtodo:
1) Mede-se o comprimento do rgo com uma rgua, na direo perpendicular a que se
vai cort-lo.
2) Utilizando-se um Normograma (4C), determinar o nmero de cortes necessrios de
acordo com a complexidade do rgo.
3) Calcular a espessura (t) do corte dividindo-se o comprimento do rgo pelo nmero
de cortes que sero feitos.
4) Para determinar-se o ponto de incio dos cortes, escolhe-se um nmero menor ou
igual a t na tabela de nmeros randmicos (anexo 1), multiplica-se este nmero por t
e divide-se por 10.
5) Os cortes devem ser virados, de modo que a mesma face de todos os cortes fique
voltada para cima.
6) O corte que no possuir uma rea de corte na face correspondente aos demais deve ser
descartado.
7) Utilizando-se novamente o normograma, determina-se o nmero de pontos que
necessitam ser contados, de acordo com o Coeficiente de Erro (CE) permitido.
8) Escolhe-se uma grade isotrpica cujo nmero de pontos coincidentes com todos os
cortes ao mesmo tempo seja semelhante ao nmero de pontos encontrados no
normograma. Mede-se a distncia entre dois pontos na grade (d).
9) Conta-se o nmero total de pontos (P) coincidentes com todos os cortes.
10) Calcula-se a rea (A) dos cortes:
A = P x d2
11) Calcula-se o Volume (V) do rgo:
V=txA
11
Figura 4C. Normograma para predizer o nmero de cortes necessrios de acordo com a
complexidade do rgo. Quanto mais complexo o rgo maior nmero de pontos devem
ser utilizados. (Gundersen & Jensen, 1987).
12
Exemplo:
1) Mediu-se o comprimento de um modelo de um rgo feito com massa plstica,
obtendo-se 46 mm ou 4,6 cm.
2) Considerando-o como um rgo de baixa complexidade, encontrou-se no
normograma que so necessrios cerca de 5 cortes.
3) Calculo-se a espessura de cada corte:
t = comprimento (mm) / no de cortes => t = 46/5 t = 9,2 mm ou 0,92 cm
4) Escolheu-se um nmero randmico na tabela, obtendo-se 7, o qual foi multiplicado
por t para obter-se o ponto de incio dos cortes:
Ponto de Incio = 7 x 9,2 mm /10
Ponto de Incio = 6,4 mm ou 0,64 cm
5) Foram feitos, ento, 5 cortes com espessura de 9,2 mm a partir do ponto de incio.
6) Atravs do normograma determinou-se que seriam necessrios de 20 a 30 pontos para
um CE=0,05.
7) Uma grade isotrpica, cujo d = 0,6 cm, foi colocada foi colocada sobre os cortes e os
pontos foram contados, obtendo-se P = 20
8) A rea foi calculada: A = 20 x (0,6)2 => A = 7, 20 cm2
9) O volume foi calculado: V = 0,92 x 0,72=> V = 6,62 cm3.
+ SL /VGI
* VFI / VFI
+ SL
= VFI /MB
13
ou
VGI / MB * VFI
+ SL /VGI
* VSL / VFI
+ SL
= VSL /MB
onde VGI o Volume das Brnquias; MB a Massa do Corpo; VFI o Volume ocupado
pelos filamentos branquiais; VSL o volume ocupado pelas lamelas secundarias e VFI + SL
o volume ocupado pelos filamentos e lamelas respiratrias simultaneamente.
VOLUMETRIA
MTODO DELESSE:
Teorema de Delesse:
Num plano seccional mdio, a frao de rea de um componente igual a
frao de volume que este componente ocupa dentro do todo.
A / AREF = V/ VREF
onde A a rea; AREF a rea de referncia; V o volume e VREF o
volume de referncia.
Exemplo: Medir o Volume de Mitocndrias nos Hepatcitos
VLIV / MB x VHEP / VLIV x VML / VHEP = VML / MB
onde VLIV o volume do fgado; MB a massa do corpo; VHEP o volume
ocupado pelos hepatcitos e VML o volume ocupado pelas mitocndrias .
A amostra precisa ser bem representativa do total (uniforme).
A amostra deve ter uma Distribuio Uniforme
Direo Isotrpica e
Distribuio Randmica
A grade (Test Probe) tambm deve ser Uniforme
Isotrpica
Randmica
em relao amostra.
Exemplo:
Tem-se um cubo de parafina com as seguintes dimenses: 102,29 x 99,70 x
81,48 mm. Este cubo contm 50 pequenos cubos pretos, sendo que cada um possui
as seguintes dimenses: 1,5 x 1,4 x 1,4 mm. Deseja-se saber qual o volume
ocupado pelos 50 cubos pequenos dentro do cubo maior. O volume do cubo maior
ser o volume de referncia.
14
Figura 6B. Grade P4 observe que os pontos esto mais espalhados (menor
15
nmero de pontos por unidade de rea)
Grade P5
Grosso
Corte
1
2
3
4
5
6
7
Fino
Grosso
Fino
Face
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
Pi
1
3.5
1.66
3
1.25
5
2.8
Pt
13.8
15
12
14
14
14
14
Pi
28.4
25
18.6
30.7
29.5
30
22.8
Pt
132.2
128
126.6
127.2
130
125
134
Pi
1.4
1
1.25
1.25
1.25
2.25
2.25
Pt
6
6.3
6.75
7.5
6.75
7.5
7.5
Pi
32
31.5
25.75
32
33.2
32.75
30.25
Pt
155
154
154.25
154
149
157.5
154
X=
2.6
13.8
26.4
129.7
1.52
6.9
31.06
153.96
SD
XPi/xPt
V CUB
1.42
0.89
4.5
3.2
0.51
0.61
2.52
2.53
0.235
0.19
0.205
168.7
0.22
16
Ateno!! No se esquea que voce analisa somente uma das faces cortadas, ou seja,
as faces A ou as faces B, pois teoricamente a face 1B e a face 2A, por exemplo, contm a
mesma estrutura. Observe a tabela acima e veja que foram analisadas somente as faces B do
cubo.
Vcubo / VREF x VREF = Vcubo
(xPi/xPt) x VREF = 0.203 x 830.9 Vcubo = 168.7 cm3
Atravs da estereologia o volume do cubo foi estimado em 168.7 cm3, enquanto o
volume do cubo calculado foi: 50 cubos x 1.4 cm x 1.4 cm x 1.5 cm = 147 cm3.
17
Grfico 1
Exemplo de Orientao Isotrpica
Grfico 2
Exemplo de Orientao Anisotrpica
18
16
3.5
14
Nmero de
Interseces
3
2.5
2
1.5
1
12
10
8
6
4
2
0.5
338
67.5
90
248
113
225
135
158
270
113
225
135
203
158
180
180
IUR
Usa-se qualquer tipo de grade
Ex.: matriz retangular, expanded circular Merz Grid
90
248
VUR
Usa-se grade ciclide
18
315
337.5
270
67.5
292.5
225
247.5
45
203
22.5
10
293
1
270
20
15
315
45
293
180
0
22.5
315
202.5
Diagrama de Rose
Orientao Anisotrpica
0
338
135
ngulos
ngulos
Diagrama de Rose
Orientao Isotrpica
157.5
90
112.5
45
0
315
337.5
270
292.5
225
247.5
180
202.5
135
157.5
90
112.5
45
67.5
22.5
67.5
22.5
Nmero de
Interseces
4.5
19
20
+
+
+
Figura 9. Esquema do corte ( esquerda) e da grade utilizada ( direita). A seta indica
um detalhe da grade (como um ponto de referncia).
A idia de seces verticais foi primeiro proposta especificamente para estimar
rea de superfcie (Baddeley et al., 1986). Contudo, o mtodo tem se tornado de uso
geral e o mtodo de amostragem de muitas investigaes biomdicas. A partir de tais
seces uma ampla variedade de parmetros podem ser estimados (Sv, Vv, Nv, Lv,
etc.). A menos que haja uma forte razo para usar seces isotrpicas, as seces
verticais devem representar o mtodo de amostragem preferencial. O sistema de
anlise (grade) usado do tipo ciclide (Fig. 10).
Figura 10. A figura acima mostra uma seco vertical sobreposta com um sistema
de grade ciclide.
21
MEDIDAS DE COMPRIMENTO
Qual o melhor mtodo para medir o comprimento de superfcie?
Como definir o ngulo para determinar as medidas na foto?
Qual a melhor grade para realizar as medidas e como calibr-la em
relao ao objeto?
Utilizaremos as medidas de barreira gua-sangue nas brnquias dos peixes
para elucidar as questes acima.
BARREIRA GUA-SANGUE
Categorias:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
gua-sangue;
gua-gua;
Sangue-gua;
Sangue-sangue;
gua- *;
Sangue- *.
22
23
d = 0, 6 cm
Calibrao da Grade
2d
d
24
0,5.
.d
Figura 11. Comprimento de um arco ciclide
Clculo de magnificao: Comprimento da fotografia / aumento do objeto
Ex. uma foto com 12 cm de comprimento e 2100x de aumento
12/2100 = 57 m
57 m 12cm de fotografia
x
1cm
x = 4,75 m
1cm de fotografia = 4,75 m
BARREIRA GUA-SANGUE
25
Clculos:
Comprimento de um arco ciclide 0,53 m
Superfcie em relao ao volume
Lt = 0,53.185 = 98 m
Sv = 2. 12/98 = 0,24 m-1
Tabela II. Clculo da barreira gua-sangue
Distncia da barreira (cm)
3,6
7,5
4,1
3,0
3,0
6,0
x = 4,25 cm = 2,85m
x3-D = x . 0,5 = 2,12 cm = 1,42m
= 3,7 cm = 2,48 m
3-D= 2/3.tn = 2,47 cm = 1,65 m
26
4,8
2,0
= 34
Use
Noo
aumento da
micrografia
Determine o
comprimento
da foto e
divida pelo
aumento dado.
No
Possui barra
de dimenso?
Calcule
comprimento
arco ciclide
(m)
Sim
Medir o
comprimento da
barra em mm **
Calcule d
(m) e comp.
barra
Calcule Lt:
comprimento total
Lt = L/Pt * PT
PT = n. total de pontos
sobre o tecido.
L/Pt= arco ciclide
Exerccio Proposto:
1. Determine a espessura da barreira de difuso ar-sangue na micrografia
eletrnica pulmo de cobra (Figura 14).
28
Distncia
(cm)
1,7
1,3
ti 1/ti
0,588
0,769
29
0,8
1,8
0,4
0,3
0,3
X = 0,842
X3-D = 0,421
0,125
0,555
2,5
3,333
3,333
1/ti/N=
1,761
3-D = 0,378
NMERO
Comprimento
rea
Volume
DIMENSO
1
2
3
MEDIDA
Volume
rea da superfcie
Comprimento
Nmero
DIMENSO
3
2
1
0
30
Linhas
proibida
31
TIPOS DE ERRO
Quando estruturas laminares no so cortadas perpendicular ao seu plano, a
espessura superestimada. Os efeitos so como a seguir:
32
REFERNCIAS
33
34
33339999999999
35