UNIVERSIDAD TCNICA DE MACHALA

UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS QUMICAS DE LA

SALUD
CARRERA DE BIOQUMICA Y FARMACIA

CONTROL DE MEDICAMENTOS
TEMA:

Cromatografa de
lquidos de alta
resolucin (HPLC).
DOCENTE: Dr. Carlos Garca. Mg.Sc
CURSO: Quinto Ao A
INTEGRANTES:
Vicente Orellana Hurtado
Arelis Rogel Galarza

Introduccin
Los avances en el campo de la biotecnologa han requerido el uso de tcnicas
ms eficaces para la separacin y purificacin de biomolculas. La
cromatografa de lquidos ha resultado ser una herramienta muy poderosa y
eficiente para la separacin de mezclas complejas tanto de compuestos de
bajo peso molecular como de protenas y cidos nucleicos (Esquivel & Leal,
2004).
En la cromatografa lquida de alta resolucin, la fase mvil es un lquido que
fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija. La separacin
cromatografa en HPLC es el resultado de las interacciones especficas entre
las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y estacionaria (Ozores, M.
2014).
A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto
rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est
limitada por la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra (Ozores, M.
2014).
La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos
naturales lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos
polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva,
otro parmetro se encuentra disponible para la selectividad, en adicin a una
fase

estacionaria

activa.

Ofreciendo

una

mayor

variedad

de

fases

estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones

selectivas y ms posibilidades para la separacin (Ozores, M. 2014).

Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC)

La cromatografa lquida (HPLC), es una tcnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla.

Consiste en una fase estacionaria no polar

(columna) y una fase mvil. La fase estacionaria es slica que se ha tratado con
RMe2SiCl . La fase mvil acta de portador de la muestra. La muestra en
solucin es inyectada en la fase mvil. Los componentes de la solucin
emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con
la columna. Estas interacciones qumicas, determinan la separacin de los
contenidos en la muestra. La utilizacin de los diferentes detectores depender
de la naturaleza de los compuestos a determinar (Miranda, & Martn, 2013).

Aplicaciones
Campos de Aplicacin de HPLC (Ozores, M. 2014):

Frmacos: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos

Bioqumica: Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos

Productos de alimentacin: Edulcorantes artificiales, antioxidantes,

aflatoxinas, aditivos

Productos de la industria qumica: Aromticos condensados,

tensoactivos, propulsores, colorantes

Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB

Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos

Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de

orina, estrgenos.

Equipo de HPLC
La cromatografa de lquidos de alta resolucin utiliza presiones elevadas para
hacer pasar un flujo de fase mvil a travs de una columna empacada con
partculas micromtricas. Sin la aplicacin de presin sera prcticamente
imposible que el diluyente pasara a travs de la columna. Un equipo de HPLC

bsicamente debe contar con un sistema de bombeo que impulse el flujo de la

fase mvil a travs de la columna, una columna que separe los componentes
de la muestra, un detector que mida alguna caracterstica de dichos
componentes conforme van saliendo de la columna y un procesador que
convierta la seal electrnica del detector en un cromatograma (Esquivel &
Leal, 2004).

Diagrama de flujo de proceso del HPLC

Partes del Equipo de HPLC

Sistemas para el tratamiento de los disolventes
Los recipientes que contienen los solventes a menudo se equipan con un
sistema para eliminar los gases disueltos, como oxgeno y nitrgeno, que
interfieren formando burbujas en los sistemas de deteccin. Un desgasificador
puede consistir en un sistema de bombeo por vaco, dispositivos para calentar
y agitar los disolventes o sistemas de difusin que permiten arrastrar los gases
disueltos fuera de la solucin mediante finas burbujas de un gas inerte de baja
solubilidad. Para poder hacer eluciones por gradiente, los equipos de HPLC
modernos cuentan con recipientes conectados a una mezcladora, lo que
permite variar la relacin de los disolventes en forma programada y modificar
los valores de manera lineal o exponencial (Esquivel & Leal, 2004).

Sistemas de bombeo
La bombas recprocas son las ms usadas, el 90 % de los equipos de HPLC
modernos cuentan con este sistema de bombeo. El disolvente es expulsado de
una cmara por el movimiento de vaivn de un pistn accionado por un motor.
Las bombas recprocas tienen la desventaja de que producen un flujo con
pulsaciones que se manifiesta como ruido en la lnea base del cromatograma
(Esquivel & Leal, 2004).

Sistemas de inyeccin de la muestra

El mtodo ms ampliamente utilizado para la introduccin de la muestra utiliza
dispositivos en forma de bucle, que pueden introducir la muestra a presiones
de hasta 7000psi con una precisin aceptable (Esquivel & Leal, 2004).
.Columnas
Para aumentar la vida de la columna analtica se coloca delante una
precolumna que elimina la materia en suspensin y los contaminantes de los
disolventes. La composicin del relleno de la precolumna debe ser semejante
al de la columna analtica; sin embargo, el tamao de la partcula es por lo
comn mayor para minimizar la cada de presin (Esquivel & Leal, 2004).
.

Tipos de relleno de la columna

Los rellenos de partculas porosas para HPLC estn formados por micro
partculas porosas con dimetros entre 3 y 10 m y con la menor dispersin
posible para un tamao determinado. La slice es el material ms comnmente
empleado para este tipo de columnas, debido a que se pueden producir
partculas con dimetros muy uniformes (Esquivel & Leal, 2004).

Proceso de pulverizacin de la muestra

Aspersin
Pesar 1000 g de muestra (Hortalizas,

frutas,

etc.). Para seleccionar la

muestra, se mide los parmetros de color, L, a* y b* con el colormetro (Arias y

col., 2000).
Se extrae el jugo de la muestra y se mide los parmetros de color al jugo
extrado para tenerlos como referencia. Despus se determina los slidos
solubles totales con el refractmetro. De acuerdo con el porcentaje de slidos
determinado y al peso de jugo extrado, se calcula la cantidad en gramos. El
jugo con el encapsulante se coloca en el secador por aspersin, donde se
selecciona la temperatura del aire de entrada, cuyos valores son de 170 y 180
C. La velocidad de alimentacin se ajusta de manera que la temperatura
mxima del aire, a la salida fuera de 80C. Una vez obtenido el polvo de la
muestra en cada tratamiento, se coloca en bolsas de polietileno dentro de un
frasco de vidrio y posteriormente se cubren con papel aluminio. Luego se
almacenan en un lugar fresco y seco, debidamente etiquetado. (Candelas y
col., 2005).

Nebulizacin
Un secado por nebulizacin comprende bsicamente la cmara de secado, por
lo general de fondo cnico, el atomizador y un sistema de separacin de polvos
y gotas, adems de un apropiado sistema de bombeo, calentador de aire, etc
(Vita Jato, 2008).

Secadero por nebulizacin: 1) tanque de alimentacin, 2) atomizador centrfugo,

3) cmara de desecacin, 4) filtro de aire, 5) ventilador, 6) calentador de aire, 7)
conducto, 8) dispersador de aire ajustable, 9) ventilador de aire fro, 10) cmara
del producto, 11) colector del producto, y 12) ventilador.

La muestra es liberada en el atomizador por flujo de gravedad o con una

bomba apropiada. La velocidad de alimentacin se ajusta para que cada gota
de lquido atomizado sea completamente desecada antes de que se ponga en
contacto con la pared de la cmara de secado, para que as el polvo resultante
no se sobrecaliente (Vita Jato, 2008).

Liofilizacin
Es un proceso de desecacin donde la muestra con el solvente, por lo general
agua, es primero congelado y posteriormente eliminado por sublimacin en un
entorno de vaco. La temperatura a la que es sometida la muestra est por
debajo de aquella a la que muchas sustancias inestables sufren cambios
qumicos. Debido a la baja temperatura a la cual se opera, la prdida de
constituyentes voltiles es mnima (Vita Jato, 2008).

Artculos Cientficos:
Validacin de un Mtodo de Extraccin de Alicina en
Ajo y su Cuantificacin por HPLC
RESUMEN
Entre los constituyentes de mayor actividad biolgica del ajo destaca la alicina,
compuesto sulfurado altamente inestable responsable de sus propiedades
farmacolgicas adems de su olor caracterstico. Debido a la elevada
degradabilidad de alicina, es importante el establecimiento de un mtodo

eficiente de extraccin y de cuantificacin que pueda ser usado en procesos de

control de calidad en la industria de suplementos alimenticios. En este trabajo
se describe un mtodo de extraccin de alicina y su cuantificacin por HPLC
(High Performance Liquid Chromatography). Se realiza una validacin del
mtodo

evaluando

parmetros

de

linealidad,

exactitud,

precisin,

reproducibilidad, selectividad y robustez (Daz & Jimnez, 2008).

Extraccin del analito
El mtodo incluy la preparacin de una Disolucin de Estndar Interno de phidroxibenzoato de etilo diluyendo aproximadamente 0.53 g del compuesto en
1 000 mL de agua. Adicionalmente fue necesaria la preparacin de una
solucin acuosa 1 mM de cido ctrico cuya funcin es detener la reaccin de
formacin de alicina (Daz & Jimnez, 2008).
Extraccin: Se pes con exactitud de 0.001 g, aproximadamente de 1 a 5 g de
ajo y se transfiri a un matraz Erlenmeyer de 250 mL seguido de la adicin de
aproximadamente 30 g de la disolucin del estndar interno. La mezcla de ajo y
disolucin de etilparabeno se homogeniz durante aproximadamente 2.5 min, y
al finalizar se mantuvo en reposo a temperatura ambiente por 30 min.
Posteriormente se centrifug a 3 500 rpm durante 10 min. Del sobrenadante se
tomaron 2 mL y se aforaron a 10 mL con la disolucin de cido ctrico.
Finalmente la disolucin final se filtr a travs de una membrana Millipore para
su anlisis por HPLC (Daz & Jimnez, 2008).
Anlisis por HPLC: Las condiciones de anlisis fueron: fase mvil
Metanol/Agua 45/55 a flujo de 0.8 mL/min; Temperatura de anlisis 25 C y
deteccin UV a 230 nm.
Cuantificacin: Para la determinacin de la concentracin de alicina, se
realiz un anlisis cromatogrfico usando el Polvo de Ajo Estandarizado como
patrn.

El cromatograma obtenido para la muestra de ajo fresco presenta un perfil

cromatogrfico de una intensidad de la seal de alicina indica que la muestra
presenta una alta concentracin del metabolito, de manera que la muestra no
representara ninguna limitante para realizar la validacin del mtodo (Daz &
Jimnez, 2008).

Extraccin y caracterizacin de principios activos con propiedades

antioxidantes y antibacterianas, a partir de residuos del procesamiento de
alcachofas.
RESUMEN:
En

esta

investigacin

se

determin

la

presencia

actividad

de

compuestos fenlicos como el cido cafeico (sin dato) y cido clorognico

(40.06 - 82.86 mg/L) en brcteas de alcachofa mediante la aplicacin de
tcnicas de extraccin
slido-lquido, fenoles totales de Folin-Ciocalteu, actividad antioxidante con
el

reactivo

DPPH,

actividad

antibacteriana, cromatografa en capa fina

(TLC) y HPLC. Los resultados demostraron que el extracto con mayor

concentracin de fenoles totales en equivalentes de quercetina fue
el

extracto hidroalcohlico (0.160 mg EQT/100g brcteas frescas), seguido

del extracto alcohlico (0.153 mg

EQT/100g

hidrolizado

EQT/100

sin

calor

(0.142 mg

brcteas
g

frescas),

del

brcteas frescas) y, del

hidrolizado con calor (0.001 mg EQT/100g brcteas frescas). Durante la prueba

de actividad antioxidante se observ que los extractos, alcohlico e
hidroalcohlico, fueron capaces de reducir al reactivo DPPH en 91.46% y
91.28% respectivamente. La prueba de actividad antibacteriana de estos
dos

extractos

en

cultivos

de Staphylococcus

aureus y Salmonella spp.

demostr que tienen propiedades antibacterianas. Basado en los resultados, es

posible afirmar que las brcteas de alcachofa son un valioso recurso
para obtener principios activos tiles como antioxidantes y antibacterianos
(Naranjo, 2009).
OBTENCIN Y PREPARACIN DE LA MUESTRA. Las muestras de brcteas
de alcachofa fueron obtenidas de la empresa INAEXPO, perteneciente a
PRONACA, en Puembo, Pichincha-Ecuador. La preparacin de las muestras
consisti en secarlas a una temperatura menor a 40C para evitar la alteracin
de los principios activos y, finalmente fueron pulverizadas (Naranjo, 2009).
EXTRACCIN DE PRINCIPIOS ACTIVOS. Los extractos de brcteas de
alcachofa se obtuvieron aplicando tcnicas de extraccin slido-lquido
recomendadas por. La primera tcnica aplicada fue la maceracin del
pulverizado en etanol durante 30 das, utilizando 10 mL de etanol al 99.6% por
cada 10g de brcteas pulverizadas. De este procedimiento se obtuvieron dos
extractos, uno alcohlico y otro hidroalcohlico mediante la adicin de agua
durante la maceracin.La segunda tcnica aplicada para la extraccin de
principios activos fue la hidrlisis cida con cido clorhdrico (HCl) 6N,
utilizando 200 mL de HCl por cada 15g de brcteas pulverizadas durante tres
das, luego de la maceracin en cido clorhdrico (HCl) se dej el extracto en
reflujo durante 12 horas. De este procedimiento se obtuvieron dos extractos, un
hidrolizado con calor y otro a temperatura ambiente. Finalmente todos los
extractos fueron concentrados en rotavapor con vaco y a una temperatura
menor de 40C. (Naranjo, 2009).
TAMIZAJE FITOQUMICO Y CROMATOGRAFA HPLC
El tamizaje fitoqumico del pulverizado y la cromatografa HPLC de los
extractos alcohlico e hidroalcohlico se realizaron en el laboratorio de
Productos Naturales de la Universidad Politcnica Salesiana por el profesor
Wilson Tapia MSc. Para la cromatografa HPLC se utilizaron como estndares
cido cafeico, cido clorognico y quercetina (Naranjo, 2009).
RESULTADOS

El resultado del anlisis realizado al extracto alcohlico e hidroalcohlico

mediante HPLC revela que las concentraciones de cido clorognico son
Rf de los compuestos identificados en los cromatogramas.
Extractos

Alcohlico

Hidroalcohlico

Rf c. Cafeico
Rf c. Clorognico

0.96
0.54*

0.95
0.54*

Hidrolizado
sincalor
0.95*
0.53

Rf Muestra

0.84
0.71

0.82
0.65

0.90*
0.76

0.59*

0.52*

0.42

82.8560 y 40 .0613 mg/L, respectivamente. Estos extract os no contienen cido

cafeico y quercetina segn los cromatogramas.

Cromatograma HPLC del extracto alcohlico

Bibliografa:

-Arias R., Lee T., Logendra L.& Janes H. (2000). Correlation of lycopene measured by
aaaaHPLC with the L, a, b color reading of a hidroponic tomato and the relationship of
aaaamaturity with color and lycopene content. J. Agric. Food Chem. (48) pp. 16971702.
-Candelas M, Alans M & Olague F. (2005) Extraccin y cuantificacin por HPLC de
aaaalicopeno en tomate y polvo de tomate. Facultad de Ciencias Qumicas de la
aaaaUJED.(En lnea)(Disponible en): www.respyn.uanl.mx/especiales/2005/ee-13aaaa2005/.../CNA37.pdf
-Daz J. & Jimnez L. (2008). Validacin de un Mtodo de Extraccin de Alicina en Ajo
aaaay su Cuantificacin por HPLC. Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados
aaaadel Instituto Politcnico Nacional. Mxico. (En lnea).(Disponible en):
aaaahttps://www.cenam.mx/simposio2008/sm_2008/memorias/S2/SM2008-S2A2aaaa1066.pdf
-Esquivel, E & Leal, L. (06/ 2004). Cromatografa De Fase Reversa. Mtodos
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-Miranda, A & Martn, O (12/2013). Cromatografa Lquida (HPLC).(En lnea)

(Disponible aaaaen): http://www.ucm.es/data/cont/docs/650-2013-12-02-aaaagases
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-Naranjo B. (2009), Comunicacin personal, Escuela Politcnica del Ejrcito, Ecuador.
-Ozores, M. (2014). Cromatografa de lquidos HPLC. Laboratorio de Tcnicas
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).
(En
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http://laboratoriotecnicasinstrumentales
aaa.es/analisis-qumicos/cromatografa-de-lquidos-hplc
- Vita Jato. (2008). Aspectos fundamentales de los sistemas farmacuticos y
aaaaoperaciones

bsicas.

Tecnologa

Farmacutica.

Facultad

aaaaUniversidad de Santiago de Cornpostela. Vol 1.Pg.482-498

de

Farmacia.