Miguel Augusto Golono

Epidemiologia e caracterizao molecular de

vrus da Influenza em aves residentes e
migratrias no Brasil

Tese apresentada ao Programa de

Ps-Graduao Interunidades em
Biotecnologia USP/Instituto Butantan/
IPT, para obteno do Ttulo de
Doutor em Biotecnologia.

So Paulo
2009

Miguel Augusto Golono

Epidemiologia e caracterizao molecular de

vrus da Influenza em aves residentes e
migratrias no Brasil

Tese apresentada ao Programa de

Ps-Graduao Interunidades em
Biotecnologia USP/Instituto Butantan/
IPT, para obteno do Ttulo de
Doutor em Biotecnologia.
rea de concentrao: Microbiologia
Orientador: Prof. Dr. Edison Luiz
Durigon

So Paulo
2009

DADOS DE CATALOGAO NA PUBLICAO (CIP)

Servio de Biblioteca e Informao Biomdica do
Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo
reproduo total

Golono, Miguel Augusto.

Epidemiologia e caracterizao molecular de vrus da influenza em
aves residentes e migratrias / Miguel Augusto Golovo. -- So Paulo,
2009.
Orientador: Edison Luiz Durigon.
Tese (Doutorado) Universidade de So Paulo. Instituto de Cincias
Biomdicas. Programa de Ps-Graduao Interunidades em
Biotecnologia USP/IPT/Instituto Butantan. rea de concentrao:
Biotecnologia. Linha de pesquisa: Virologia clnica e molecular.
Verso do ttulo para o ingls: Epidemiology and molecular
characterization of influenza virus in migratory and resident birds in
Brazil.
Descritores: 1. Influenza 2. Vigilncia epidemiolgica 3. Biologia
molecular I. Durigon, Edison Luiz II. Universidade de So Paulo.
Instituto de Cincias Biomdicas. Programa de Ps-Graduao em
Biotecnologia III. Ttulo.

ICB/SBIB0222/2009

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
Programa de Ps-Graduao Interunidades em Biotecnologia
Universidade de So Paulo, Instituto Butantan, Instituto de Pesquisas Tecnolgicas
______________________________________________________________________________________________________________

Candidato(a):

Miguel Augusto Golono.

Ttulo da Tese:

Epidemiologia e caracterizao molecular de vrus da

influenza em aves residentes e migratrias.

Orientador(a):

Edison Luiz Durigon.

A Comisso Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sesso

pblica realizada a ................./................./................., considerou
( ) Aprovado(a)

( ) Reprovado(a)

Examinador(a):

Assinatura: ................................................................................................
Nome: .......................................................................................................
Instituio: ................................................................................................

Examinador(a):

Assinatura: ................................................................................................
Nome: .......................................................................................................
Instituio: ................................................................................................

Examinador(a):

Assinatura: ................................................................................................
Nome: .......................................................................................................
Instituio: ................................................................................................

Examinador(a):

Assinatura: ................................................................................................
Nome: .......................................................................................................
Instituio: ................................................................................................

Presidente:

Assinatura: ................................................................................................
Nome: .......................................................................................................
Instituio: ................................................................................................

Dedico esta tese aos meus pais:

Edson Domingos Golono e Vera L. S. Golono

A meu irmo:
Edson Domingos Golono Jnior

A minha esposa:
Ana Paula Moreira

E as minhas filhas:
Amarillyz e Izabella Politi Golono

Agradecimentos

Agradeo a meu orientador prof. Dr. Edison Luiz Durigon, pela

confiana em mim depositada, pela amizade e por ser exemplo profissional
e pessoal a ser seguido.
Sou grato por todos os amigos que participaram da equipe de campo
e que muito ajudaram no desenvolvimento deste trabalho: Luiz Sanfilippo,
Carolina Ferreira, Renata Hurtado, Tatiana Ometto, Jos Maria Lopes,
Luciano M. Thomazelli, Cristiane Demetrio, Mrio Figueiredo, Ricardo
Lieutaud, Dra Danielle Bruna Leal de Oliveira, Dra Llian Walsh Keller e
Dra Juliana Nogueira Martins Rodrigues.
Agradeo ao Prof. Dr. Manoel Armando Azevedo dos Santos, Prof.
Dr. Paolo Marinho de Andrade Zanotto, a Dra. Silvana R. Favoretto
Lazarini, Dra. Viviane Fongaro Botosso e a pesquisadora Adlia Hiroko
Nagamori Kawamoto, pelos conselhos e amizade. Bem como a Maria
Jacinta de Faria e a Aziz Orro Medina pela grande amizade que formamos.
Registro a minha gratido a todos os amigos que fiz no Laboratrio
de Virologia Clnica e Molecular do ICB USP pela amizade e
companheirismo em todas os momentos de convvio: Andra Leal, Ariane
do Carmo Lins Carvalho, Danila Vedovello, Eduardo Salustino Faro,
Francisco Hernandes, Dra. Lourdes Rehder de Andrade Vaz de Lima, Dra
Maria Luiza Barbosa, Maria Paula (Misa), Anglica Cristine de Almeida
Campos, Dra Cludia Filoni, Dra Claudia Trigo Pedroso de Moraes, Dra
Dyana Alves Henriques, Fbio Carmona de Jesus Maus, Felipe Alves
Morais, Luiz Gustavo Bentim Ges, Jean Paulo Lopes Zukurov, Larissa
Cuba Lins, Lilia Mara Mesquita Dutra, Patrcia Alves Ramos Bosso e
Thereza Silva Souza.

Agradeo tambm aos Profs. Drs. integrantes da banca de exame de

qualificao que foram muito solcitos comigo: Prof. Dr. Willy Beak,
Prof. Dr. Saulo Duarte Passos e Prof. Dr. Jos Antnio Jerez.
Ao Dr. Robert G. Webster e David Walker por terem me recebido
to bem no St. Judes Childrens Research Hospital de Memphis, nos
Estados Unidos da Amrica.
A presidente do Programa de Ps-Graduao Interunidades em
Biotecnologia Prof. Dra. Ana Clara Guerrini Schenberg e aos secretrios
(a) Eliane de Araujo Gouveia, Fbia Reis Vilanova e Marcos Aurlio
Nogueira Loureno.
Aos funcionrios da Biblioteca que contriburam na elaborao, na
reviso textual e no apoio e suporte de informtica destas diretrizes.
Sou grato a FAPESP pela concesso da bolsa de doutorado e reserva
tcnica.

No sei quem sou nem sei por que motivo

Vim ao mundo e o que nele vim fazer.
Sei que penso e, portanto, sei que vivo,
Neste anseio instintivo de viver.

Porque procedo do homem primitivo,

H rugidos de fera no meu ser.
Bom e mau, triste e alegre, humilde e altivo,
No me posso, a mim mesmo, compreender.

Pois se, de mim, no sei causa e destino,

Que dos outros, do mundo, saberei?
Que definir, se a mim no me defino?

E sigo, ao lu da vida, a ignota lei,

Descrendo das verdades que imagino
E acreditando em tudo o que no sei.

Bastos Tigre

Resumo
Golono MA. Epidemiologia e caracterizao molecular de vrus da Influenza em aves
residentes e migratrias no Brasil [Tese]. So Paulo: Instituto de Cincias Biomdicas
da Universidade de So Paulo; 2009.
Os vrus da influenza aviria tm provocado epidemias e pandemias gripais em seres
humanos atravs dos tempos, a pandemia mais devastadora que se tem notcia, a gripe
espanhola em 1918, teve sua origem no vrus avirio do tipo A subtipo H1N1. Em
1997-1998 dezoito pessoas foram infectadas com o vrus avirio tipo A subtipo H5N1,
na cidade de Hong - Kong, seis pessoas foram a bito. A origem do H5N1 recai sobre as
aves selvagens que teriam infectado populaes de aves domsticas. Em apenas 3 dias
1,5 milhes de aves em granjas morreram ou foram sacrificadas, 100% da populao
das aves comerciais de Hong-Kong. Devido s aves selvagens, principalmente os
Anseriformes, serem o reservatrio natural de todos os subtipos da influenza A, e pela
possibilidade destes vrus causarem prejuzos econmicos e infectarem seres humanos,
que se faz necessrio a execuo do monitoramento de aves silvcolas e domesticas.
Atravs do monitoramento poderemos obter dados referentes aos subtipos prevalentes
nas populaes avirias, suas caractersticas patognicas e antignicas. Apesar de existir
programas de monitoramento contnuo de aves selvagens na Europa, Estados Unidos da
Amrica, Canad, Japo entre outros pases, pouco foi feito no Brasil.
Foram coletadas amostras de 1323 aves distribudas em todas as regies do Brasil no
espao de 3 anos. As amostras foram subdivididas em trs grupos: Swabs cloacais,
swabs orais e amostras de sangue para a obteno de soro.
Utilizamos nesta tese amostras coletadas de 671 aves. Estas amostras foram testadas por
meio das tcnicas de GeneScan, PCR em tempo real e RT-PCR e Duplex Nested-PCR
com deteco em gel de agarose.
Obtivemos 18 amostras positivas pelas tcnicas moleculares: 842, 974, 975, 1039, 1755,
1803, 1820, 1835, 1850, 2395, 2408, 2409, 2410, 2412, 2413, 2484, 2486 e 2527.
Testes moleculares foram feitos no intuito de melhorar a obteno de RNA viral de
amostras clnicas.

Palavras-chave:
molecular.

Influenza

aviria.

Vigilncia

Epidemiolgica.

Caracterizao

Abstract
Golono MA. Epidemiology and molecular characterization of influenza virus in
migratory and resident birds in Brazil [thesis]. So Paulo: Instituto de Cincias
Biomdicas da Universidade de So Paulo; 2009.
The avian influenza virus has caused epidemics and pandemics flu in humans through
the ages, the most devastating pandemic that we know, the Spanish flu in 1918, had its
origin in the avian virus type A subtype H1N1. In 1997-1998, 18 people were infected
with the avian virus type A subtype H5N1 in the city of Hong - Kong, 6 people died.
The origin of the H5N1 rests on the wild birds that have infected domestic poultry
populations. In just 3 days of 1.5 million poultry birds died or were destroyed, 100% of
the population of the poultry trade in Hong Kong. Because wild birds, especially
Anseriformes, are the natural reservoir of all influenza A subtypes, and the possibility of
these viruses cause economic losses and infecting humans, is that it is necessary to the
implementation of monitoring wild and domestic birds. By monitoring we can obtain
data on the subtypes prevalent in bird populations, their characteristics and pathogenic
antigens. Although programs exist for continuous monitoring of wild birds in Europe,
United States, Canada, Japan and other countries, little has been done in Brazil.
Samples were collected from 1323 birds distributed in all regions of Brazil within 3
years. The samples were divided into three groups: cloacal swabs, oral swabs and blood
samples to obtain serum. Used in this thesis samples collected from 671 birds. These
samples were tested by GeneScan techniques, real-time PCR and RT-PCR and Nested
Duplex PCR detection with gel electrophoresis.
We obtained 18 positive samples by molecular techniques: 842, 974, 975, 1039, 1755,
1803, 1820, 1835, 1850, 2395, 2408, 2409, 2410, 2412, 2413, 2484, 2486 and 2527.
Molecular tests have been made in order to improve the achievement of viral RNA in
clinical samples.

Keywords: Avian influenza. Surveillance. Molecular characterization.

Sumrio

1 Introduo...............................................12
2 Justificativa............................................27
3 Objetivos................................................29
4 Materiais e Mtodos......................................30
4.1 Expedies para coleta de amostras.....................30
4.2 Coleta de amostras.....................................36
4.3 Extrao de RNA das amostras virais....................38
4.4 Reao de transc. Rev. com Iniciador Randmico.........38
4.5 Reaes de Duplex Nested-PCR...........................38
4.6 Eletroforese em Gel de Agarose.........................39
4.7 PCR em tempo real......................................39
4.8 PCR para a Deteco via Genescan.......................40
4.9 Tcnica de GeneScan....................................41
4.10 Determinao de seqncia de nucleotdeos.............42
4.11 Edio e anlise das seqncias obtidas...............42
5 Aperfeioamento das Tcnicas de RT e PCR.................43
5.1 Extrao de RNA........................................43
5.2 Transcrio reversa com um ou dois Inic................43
5.3 PCR com cDNA com um, dois ou inic. Rand................44
5.4 Melhor. PCR. Oxalato amnia tetrametilada..............45
5.5 PCR, obteno de apenas um produto.....................46
5.6 Design de iniciadores modificados......................46
6 Determinao do Subtipo da Hemaglutinina.................47
6.1 PCR para a amplificao de HA inteira..................47
7 Resultados...............................................48
7.1 Deteco viral por PCR em tempo real...................48
7.2 Deteco viral atravs de GeneScan.....................49
7.3 Duplex Nested-PCR e RT-PCR tradicional.................50
7.4 Alinhamento das seqncias.............................53
7.5 Pesquisa das seqncias no "Genbank"...................54
8 Aperfeioamento das Tcnicas de RT e PCR.................54
8.1 PCR, cDNA com um, dois ou iniciadores randmicos.......54

8.2 Aperfeioamento de PCR Oxalato de amnia tetrametil....55

8.3 PCR, otimizao para a obteno de apenas um produto...55
9 Discusso................................................57
10 Concluso...............................................66
Referncias Bibliogrficas.................................67
Apndices..................................................73

1 Introduo

A gripe, em seres humanos, uma doena respiratria aguda causada pelos vrus
da influenza. Apesar de registros de epidemias e pandemias associadas com o vrus da
influenza existirem desde 412 a.C., somente em 1933 foi pela primeira vez isolado. Este
vrus, hoje classificado como sendo do tipo A, foi isolado em Londres, aps a ocorrncia de
uma epidemia. Em 1940 foi descoberta a existncia do tipo B e em 1950 o vrus da
influenza do tipo C foi isolado (Hilleman, 2002). Destes tipos virais, somente o tipo A
capaz de infectar naturalmente animais e de gerar pandemias na populao humana. Os
tipos B e C infectam apenas pessoas. Somente o tipo B tem a capacidade de provocar
epidemias, o tipo C causa apenas sintomas subclnicos.
No sculo XX, quatro pandemias acometeram o mundo e ocorreram nos anos
1918, 1957, 1968 e 1977 (Capua e Alexander, 2002).
A pandemia de 1918, tambm denominada gripe espanhola, assolou o mundo, foi
a mais grave das pandemias que se tem notcia, matou mais de 20 milhes de pessoas em
todo o planeta. No entanto, devido falta de registros em muitos pases durante a
pandemia, pesquisadores e historiadores relatam que esse nmero pode ter ultrapassado o
montante de 40 ou 50 milhes de mortos (Kuszewski e Brydak, 2000; Potter, 2001).
A pandemia de 1957 (gripe asitica) e a pandemia de 1968 (gripe de Hong
Kong) mataram juntas mais de 1,5 milhes de pessoas. Essas pandemias causaram danos
estimados de 32 bilhes de dlares economia mundial, principalmente pela perda de
produtividade, despesas com medicamentos e internaes (World Health Organization
(WHO) Influenza Fact Sheet 211, 1999).
Em 1977 o vrus da influenza (gripe Russa) infectou principalmente crianas e
jovens, sendo as pessoas com mais de 50 anos pouco afetadas. Esta pandemia atingiu mais
de 50% das crianas em idade escolar em todo o globo, no entanto, no foi responsvel por
altas taxas de mortalidade (Laver e Garman, 2002; Cox e Subbarao 2000).
Atualmente estamos passando por um perodo pandmico. Provocada pelo vrus
da influenza do tipo A subtipo H1N1, a primeira pandemia do sculo XXI. Dia 11 de
junho de 2009 a OMS elevou o alerta pandmico de 5 para 6, o que caracteriza, segundo
seus critrios, que a pandemia est em andamento. A fase 6 ocorre quando um determinado
vrus se dissemina por pelo menos duas regionais da OMS (WHO 2009d). Com a
propagao do vrus pandmico, muitos pases deixaram de fazer diagnsticos em
pacientes com quadro respiratrio leve ou moderado, concentrando os esforos nos
12

pacientes com quadro grave ou nos pacientes pertencentes aos grupos de risco. Portanto,
segundo o ltimo boletim epidemiolgico divulgado pela OMS (WHO, 2009e) no dia 13 de
novembro, consta que houve mais de 503.536 casos confirmados de gripe suna no mundo
com o total de mortes de no mnimo 6.260 pessoas. A regio mais afetada o grupo das
Amricas com pelo menos 190.765 casos confirmados e 4.512 bitos.
No Brasil, a transmisso sustentada da gripe suna, ou gripe pandmica, termo que
os rgos oficiais vm utilizando, foi declarada no dia 16 de julho de 2009. O Brasil, como
os demais pases onde a gripe suna se disseminou est concentrando os esforos nos
pacientes mais graves, ou seja, os pacientes que apresentaram sndrome respiratria aguda
grave (SRAG), no ltimo boletim do Ministrio da Sade com dados tabulados at o dia 10
de outubro (semana epidemiolgica 40), o Brasil teve 17.219 casos de SRAG provocados
pela gripe pandmica com 1.368 bitos (Ministrio da Sade (MS), 2009). Estado mais
afetado em nmero de casos o Paran com 7.630 pacientes com SRAG provocado pelo
H1N1 pandmico, o estado com maior quantidade de bitos So Paulo com 432 mortes
atribudas a gripe suna. A 31a semana epidemiolgica (SE) foi a que teve maior incidncia
por 100 mil habitantes de SRAG no Brasil, a partir desta SE houve declnio contnuo de
casos (Fig. 1).

Figura 1. Distribuio de SRAG por regio e por semana epidemiolgica (MS, 2009).

13

Apesar de todas as epidemias e pandemias terem infectado seres humanos, a

influenza no est restrita a espcie humana e capaz de causar debilidade ou mortalidade
em vrias outras espcies, entre elas os eqinos, os sunos, as focas e baleias (Chambers et
al., 1989), alm de aves.
As aves aquticas so os reservatrios naturais dos vrus da influenza com
capacidade de gerar pandemias. Estes vrus so agrupados dentro de um mesmo tipo
sorolgico denominado de tipo A (Webster et al., 1992).
Os vrus da gripe pertencem famlia Orthomyxoviridae, sendo os vrus do tipo A
pertencentes ao gnero Influenzavirus A (Bchen-Osmond, 2003).
Os subtipos virais do tipo A so classificados de acordo com as caractersticas
sorolgicas de suas duas glicoprotenas de superfcie, a hemaglutinina (HA) e a
neuraminidase (NA). Foram descritos 16 subtipos de HA, denominados de H1, H2, H3 at
H16 e 9 subtipos de NA, denominados de N1, N2, N3 at N9 (Webster et al., 1997;
Fouchier et al., 2005).
Os isolados de influenza tipo A so denominados pelos subtipos de HA e NA que
possuem, o local onde foram coletados e o ano, por ex. A/Hong Kong/03/68 (H3N2).
Os vrus da gripe, em aves aquticas, normalmente no provocam doena ou
sintomas nestes animais e se replicam preferencialmente em clulas do trato
gastrointestinal (Webster et al., 1978). Em aves domsticas os vrus do tipo A podem ser
divididos em dois grupos de acordo com sua habilidade de provocar doena e a gravidade
dos sintomas que causam. Vrus da influenza altamente patognicos para aves (HPAI, sigla
em ingls para highly pathogenenic avian influenza) podem exterminar uma criao ou
granja de galinhas em 24 horas. Estes vrus esto restritos aos subtipos H5 e H7. Todos os
outros subtipos causam apenas sintomas brandos e em sua maioria atacam o sistema
respiratrio e so designados como vrus pouco patognicos para aves (LPAI, sigla em
ingls para low pathogenic avian influenza). Apesar de as infeces virais do tipo LPAI
serem brandas, no podem ser ignoradas do ponto de vista comercial, pois, podem provocar
expressiva queda na produo de ovos no perodo em que as aves poedeiras ficarem
debilitadas (Alexander, 2000).
Foram registrados por volta de 24 eventos de HPAI em todo o mundo no perodo
de 45 anos compreendido no intervalo de 1959 a 2004, com milhes de aves domsticas
indo a bito ou sendo sacrificados e prejuzos na casa dos bilhes de dlares (Capua e
Alexander, 2004).
Estudos ecolgicos levantaram a hiptese de que todos os vrus da influenza do
14

tipo A encontrados em mamferos so derivados dos reservatrios avirios (Webster et al.,

1992).
Aps o surgimento de um subtipo que ainda no havia infectado seres humanos
ou aves domsticas, ocorre normalmente, epidemias devido rpida expanso deste vrus
atravs das populaes (Bridges et al., 2003). Depois de estabelecido na populao, um
subtipo do vrus da influenza, precisa alterar as propriedades antignicas de suas duas
glicoprotenas de superfcie, a hemaglutinina e a neuraminidase, para que possa escapar do
sistema imune do hospedeiro e, assim, continue a gerar novos surtos ou epidemias.
Dois mecanismos principais so responsveis pela mudana contnua na
antigenicidade dos vrus da influenza e so denominados shift antignico e drift
antignico (Zambon, 1999).
O drift antignico gerado por mutaes pontuais e cumulativas nos genes de
HA e NA. A alterao de um nico aminocido em HA pode permitir ao vrus mutante
escapar neutralizao dos anticorpos gerados em infeces anteriores e assim, provocar
uma epidemia (Nakajima et al., 2000).
O shift antignico pode ser definido como o aparecimento de um vrus da
influenza A contendo um novo subtipo de HA ou de HA e NA na populao, os quais so
imunologicamente distintos dos vrus da influenza que circulavam anteriormente. O shift
antignico ocorre quando vrus de influenza animal, que normalmente infectam
reservatrios avirios, so transmitidos para o homem. Evidncias sugerem que o
aparecimento de linhagens pandmicas pode ocorrer por dois mecanismos distintos. O
primeiro derivado da natureza segmentada do genoma dos vrus influenza e se refere ao
reagrupamento dos segmentos genmicos de vrus influenza humana e vrus influenza
animal, durante a co-infeco de uma mesma clula hospedeira. Os sunos se destacam
nesse contexto visto que possuem receptores celulares para vrus de origem aviria e
humana (Cox e Subbarao, 2000). O segundo mecanismo para o surgimento de linhagens
pandmicas a transmisso direta de uma linhagem animal para o homem (Cox e
Subbarao, 2000).
O genoma viral do tipo A composto de 8 segmentos de RNA de fita simples e
de polaridade negativa (complementar ao RNA mensageiro). Cada segmento est associado
nucleoprotena NP (Klumpp et al., 1997) e a um complexo de polimerase viral (Brown,
2000).
Englobando estes complexos, h uma matriz protica constituda por protena M1,
a qual envolvida por uma bicamada lipdica derivada da clula hospedeira (Braakman e
15

Anken, 2000). Duas glicoprotenas de superfcie, codificadas pelo genoma viral, projetamse atravs da bicamada lipdica, a HA e a NA. Ainda, uma terceira protena, formadora de
canais (M2), encontra-se inserida na bicamada lipdica (Fig. 2) (Mould et al., 2000).
Pelo menos 10 protenas so codificadas pelos genomas do vrus da influenza A
(Neumann et al., 2000) (Tabela 1).
No vrus tipo A, os segmentos 1, 2 e 3 codificam as protenas PB2, PB1 e PA
respectivamente. Estas protenas compem a polimerase viral, possuem atividade de
transcriptase (Hay, 1998).
O segmento 4 codifica a hemaglutinina (HA). A HA a glicoprotena de
superfcie viral mais imunognica. A HA se liga ao receptor de cido silico existente
na superfcie celular e age na fuso da partcula viral com a membrana endossmica
permitindo o acesso viral ao citoplasma celular (Skehel e Wiley, 2002).
A nucleoprotena NP codificada pelo segmento 5. No ncleo, a NP liga-se ao
RNA viral e o encapsida, estabilizando-o e protegendo-o da ao de RNases (Mena et
al., 1999).

Tabela 1. Organizao do genoma do vrus da influenza.

Genoma

Tamanho

Polipeptdios

Molculas

Codificados
*a

RNA viral

Tipo A

por vrion

2341

PB2

30 - 60

2341

PB1

30 - 60

2233

PA

30 - 60

1778

HA

500

1565

NP

1000

1413

NA

100

1027

M1, M2

3000, 20 - 60*c

890

NS1, NS2*b

nd, 130 - 200

Segmento

*a - Os segmentos de RNA so numerados de acordo com seus tamanhos decrescentes.

*b - Recentemente, NS2 recebeu o nome de NEP (nuclear export protein).
*c - Quantidade de molculas de M1 e M2 existentes em cada partcula respectivamente.
nd - No determinado.

16

A neuraminidase (NA) codificada pelo segmento 6. A NA tem a funo de

facilitar o acesso da partcula viral superfcie das clulas atravs da degradao de
cido silico do muco extracelular e de auxiliar na disperso dos vrus atravs da
destruio dos receptores de HA da superfcie celular, impedindo-as de serem
imobilizadas.
O segmento nmero 7 dos vrus influenza tipo A codifica as protenas M1 e
M2. A M1 faz parte da matriz protica, a qual forma uma camada eltron-densa logo
abaixo do envelope viral (Brown, 2000). A M2 uma protena formadora de canais
inicos que tem a funo de permitir a acidificao do interior dos vrions quando estes
se encontram nos endossomos celulares favorecendo o "desempacotamento" viral
(Hilleman, 2002).
Duas protenas, NS1 e NS2 ou NEP, so codificadas pelo segmento 8. A NS1
inibidora do processamento ps-transcricional de RNAm celular impedindo assim a
sntese de protenas antivirais (Chen e Krug, 2000). NS2 ou NEP tem a funo de
mediar exportao nuclear dos RNAs do vrion (ONeill et al., 1998).
A influenza transmitida de uma pessoa para outra atravs de aerossis.
Quando as gotculas contendo os vrus so inaladas, esses entram em contato com o
epitlio do trato respiratrio (Nicholson, 1998). As partculas virais, atravs da HA,
ligam-se a receptores de cido silico da superfcie celular e, assim, o vrion
endocitado e liberado no citoplasma da clula hospedeira (Fig. 3). Aps a entrada viral,
os nucleocapsdeos migram para o ncleo da clula e as protenas com atividade de
polimerase iniciam a transcrio dos RNAs do vrion (vRNAs) em RNAs mensageiros
(mRNAs) (Yewdell e Garca-Sastre, 2002). Compem o complexo de transcriptase
viral, as protenas PB1, PB2 e PA. A polimerase PB2 inicia o processo de transcrio.
A PB1 responsvel pelo processo de elongao do mRNA viral. A funo da
polimerase PA na transcrio primria ainda no conhecida, no entanto este
polipeptdio necessrio para a transcrio e replicao do vRNA (Nakagawa et al.,
1996).
Os transcritos produzidos so utilizados na traduo das protenas virais.
Acredita-se que o aumento da concentrao de NP livre dispare a mudana da sntese de
mRNA (transcrio) para a sntese de cRNA e vRNA (replicao). A replicao dos
vRNAs comea com a mudana de sntese de mRNA para cRNA e culmina com a
sntese do vRNA genmico que utiliza molculas de cRNA como molde (Honda et al.,
2001).
17

Fig. 2

Figura 2. Modelo estrutural do vrus da influenza do tipo A. Figura modificada de Kaiser, 2006.

Pouco se sabe a respeito do processo de montagem dos vrus da influenza.

Acredita-se que nucleocapsdeos formados externamente por protena M1 migrem para
a face interna da membrana plasmtica, para onde j foram transportadas as
glicoprotenas HA, NA e M2. Foi proposto que a interao de M1 com os domnios
citoplasmticos dessas 3 glicoprotenas sinalize o processo de brotamento (Hilleman,
2002).

18

Fig. 3

Figura 3 - Ciclo de vida do vrus da influenza. Modificado de Itzstein 2007.

Os variantes do vrus da influenza aviria tm provocado epidemias e

pandemias gripais em seres humanos atravs dos tempos, at mesmo a pandemia mais
devastadora que se tem notcia, a gripe espanhola em 1918, teve sua origem no vrus
avirio do tipo A subtipo H1N1 (Taubenberger et al., 2001). Em 1997-1998, dezoito
pessoas foram infectadas com o vrus avirio tipo A subtipo H5N1, na cidade de Hong
Kong, onde seis pessoas foram a bito. O vrus H5N1 no provocou uma epidemia ou
pandemia devido a sua incapacidade de se transmitir de uma pessoa a outra. A gripe do
frango como ficou conhecida, devido os vrus H5N1 serem transmitidos diretamente de
frangos infectados a pessoas, altamente patognica para galinhas.
A origem do H5N1 recai sobre as aves selvagens que teriam infectado com este
vrus a populao de aves domsticas. Em apenas 3 dias 1,5 milhes de aves em granjas
morreram ou foram sacrificadas, 100% da populao das aves comerciais de Hong19

Kong (WHO, 2006). Em maro de 1999 mais um subtipo relacionado influenza

aviria infectou pessoas em Hong Kong. Identificado como sendo do subtipo H9N2,
causou apenas quadros brandos de gripe, no entanto este subtipo atravs de
recombinao foi o doador de genes que codificam protenas internas do vrus H5N1.
Os vrus H9N2, tambm, no so capazes de serem transmitidos de uma pessoa para
outra, sendo transmitidos apenas de aves domsticas diretamente para seres humanos
(Katz, 2003). No incio de 2003, na Holanda, o subtipo viral H7N7, de origem aviria,
que ainda no havia sido encontrado em seres humanos, foi detectado em 89 pessoas e
causou, na maioria dos infectados, um quadro de conjuntivite. No entanto, duas pessoas
desenvolveram um quadro respiratrio com sintomatologia caracterstica de gripe e uma
foi a bito devido a complicaes pulmonares (Fouchier et al., 2004).
Desde janeiro de 2003, uma segunda onda da doena se iniciou Em HongKong, infectando trs pessoas de uma mesma famlia e matando duas, desde ento o
H5N1 no parou de causar infeces em humanos (WHO, 2009a). At o dia 24 de
setembro de 2009 (ltima atualizao da Organizao Mundial da Sade) j haviam sido
contabilizados 442 casos de infeco por H5N1 com 262 mortes, taxa de mortalidade de
59,3%. At o momento o H5N1 causou doena em pessoas de 15 pases (WHO, 2009b)
(Fig. 4).
Atualmente, os vrus do subtipo H5N1 so endmicos na sia e na frica, em
especial no Egito. Estes vrus encontraram um nicho ecolgico em aves domsticas e
apesar de ser de difcil transmisso para seres humanos, sua exposio constante aos
trabalhadores rurais e nos mercados asiticos e africanos eleva a chance de ocorrer uma
adaptao viral aos humanos e assim, se tornaram mais eficientes na transmisso viral
de pessoa para pessoa podendo dar incio a uma nova pandemia. Devido a isso,
importante o monitoramento de aves selvagens e domsticas para a conteno dos focos
avirios da doena. A Organizao Mundial de Sade Animal (OIE) divulga
periodicamente boletins sobre a gripe o H5N1 em aves. Desde o final de 2003 at a
ltima atualizao da OIE em 05 de novembro de 2009, o vrus H5N1 foi encontrado
em aves domsticas de 50 pases, os mais afetados so Vietn, Tailndia e Egito com
2.545, 1.141 e 1.084 surtos de gripe aviria respectivamente (Fig. 5) (OIE, 2009).

20

Figura 4: Casos humanos confirmados desde 2003 at 24 de setembro de 2009 (ltima

atualizao da OMS). Modificado de WHO, 2009c.

Alm do problema de sade, vrus da influenza aviria de alta patogenecidade

(HPAI), podem provocar grandes prejuzos econmicos. Quando um vrus HPAI
encontrado em uma granja, todo o plantel deve ser sacrificado para a conteno do
surto, com isso, as exportaes de carne e outros insumos derivados de aves de granja
so completamente paralisadas. Dentro do ranking dos maiores produtores de frangos
o Brasil est na terceira colocao, atrs apenas dos Estados Unidos da Amrica e da
China (Fig. 6), no entanto, no ranking dos exportadores, o Brasil ocupa a primeira
posio sendo o maior exportador de carne de frango do mundo desde 2004,
responsvel por 43,4% de toda a exportao mundial, dados tabulados at o ano de 2008
pela Associao Brasileira dos Produtores e Exportadores de Frangos (ABEF) (Fig. 7).

21

Figura 5. Mapa de surtos em aves domsticas e silvestres no perodo de 2005 a 05 de novembro

de 2009. Os crculos vermelhos indicam a localidade onde existem surtos em
andamentos em aves domsticas, os crculos azuis mostram as localidades onde
ocorreram surtos em aves domsticas, o tringulo amarelo mostra surtos em
andamento em aves silvestres, os tringulos verdes, so os surtos que ocorreram em
aves selvagens. Em bege est marcada a regio onde no existem dados de surtos
provocados por vrus avirio de alta patogenicidade.

Figura 6. Produo de carne de frango em milhares de toneladas (ABEF, 2008).

22

Figura 7. Exportao de carne de Frango em milhares de toneladas (ABEF, 2008).

Devido s aves selvagens serem o reservatrio natural de todos os subtipos da

influenza do tipo A e aliada a possibilidade destes vrus serem transmitidos s aves
comerciais, causar prejuzos econmicos e serem transmitidos para seres humanos,
necessrio que seja feito um monitoramento em aves selvagens e comerciais. Atravs do
monitoramento de aves selvagens poderemos obter dados dos subtipos prevalentes nas
populaes avirias, suas caractersticas patognicas e antignicas. Alm disso, o
monitoramento destas aves essencial para a identificao de subtipos com capacidade
de gerar epidemias ou at mesmo uma pandemia (Soares et al., 2005). Atravs deste
monitoramento possvel formar painis de amostras de referncia que podero ser
utilizadas na fabricao de vacinas para eventuais epidemias ou pandemia causadas na
populao por vrus de origem aviria. Apesar de existir programas de monitoramento
contnuo de aves selvagens na Europa, Estados Unidos da Amrica, Canad, Japo e os
pases asiticos que possuem casos originados pelos vrus avirio H5N1, pouco foi feito
no Brasil. O monitoramento das aves selvagens deve incluir as aves migratrias, que em
sua rota de migrao passam por vrios pases do mundo e, assim, podem transportar
vrus da influenza e infectar populaes de aves residentes e vice-versa (Fig. 8). Apesar
de cerca de 90 espcies de aves de 12 ordens diferentes serem portadoras de vrus da
influenza ou suscetveis s infeces causadas pelo vrus da gripe, apresentando
sintomas ou no, a maior variedade de subtipos e a grande maioria de isolados foram
obtidos de aves aquticas da ordem dos Anseriformes, que compreende patos, marrecos,
gansos e outros (Alexander, 2000).
23

Muitas aves que procriam no Brasil, migram para outras localidades nos
perodos de descanso reprodutivo. Isto favorece a disseminao de vrus da gripe para
vrias populaes no migratrias do Brasil e pases vizinhos. Vrias aves que procriam
em outros pases, tambm, migram para o Brasil em busca de alimento. Foram
registradas, no Brasil, 152 espcies de aves que visitam o pas regularmente em bandos
ou so vistas esporadicamente em nosso territrio, sendo que 101 espcies so de aves
aquticas, o principal reservatrio de vrus da influenza. Do total das 152 espcies de
aves visitantes, ou seja, que no se reproduzem em nosso pas, 91 so oriundas do
hemisfrio Norte, sendo 54 espcies aquticas. Outras 61 espcies chegam ao Brasil
provenientes de pases do hemisfrio Sul e da Antrtica, incluindo 46 espcies aquticas
(Sick, 2001). A rota migratria do Atlntico e a rota do Mississipi so as principais rotas
migratrias que chegam ao Brasil. rota do atlntico liga a regio rtica do mundo ao
litoral brasileiro e a rota do Mississipi passa pela mesma regio rtica e segue em
direo ao interior do pas.

Fig. 8. Principais rotas das aves migratrias. Modificado de Boere e Stroud, 2006.

24

O vrus da influenza replica no trato intestinal das aves, assim as aves

selvagens migratrias podem infectar atravs das fezes a gua ou o alimento utilizado
em granjas de aves domsticas e provocar a morte ou queda na produo de ovos
(Webster et al., 1997). Alm disso, as aves selvagens podem infectar sunos que
serviriam de intermedirios entre os vrus avirios e humanos.
As clulas sunas possuem receptores de cido silico caractersticos da
influenza aviria (NeuAc 2,3Gal) e humana (NeuAc 2,6Gal). Com isso vrus de aves
podem infectar sunos e durante o processo de replicao viral se adaptar aos receptores
humanos e adquirir a capacidade de infectar pessoas. As clulas de sunos quando coinfectadas por vrus avirios e humanos podem servir para o rearranjo dos segmentos
genmicos, durante o processo de montagem da partcula viral e gerar um vrus hbrido.
Este vrus hbrido pode ser capaz de provocar uma epidemia ou pandemia na populao
humana atravs do fenmeno de shift. Esta a hiptese para explicar o que pode ter
ocorrido na pandemia de 1918 (Fig. 9) (Webster et al., 1992; Zambon, 1999).
A Organizao Mundial da Sade (OMS) projeta uma pandemia originada pelo
subtipo H5N1 que pode afetar entre 20 e 50% da populao mundial com a quantidade
de mortes entre 2 e 7,4 milhes de pessoas. A expanso de uma pandemia no pode ser
impedida, mas possvel reduzir seu impacto, caso o pas esteja preparado e tenha um
plano de emergncia (WHO, 2005).

25

l
Figura 9. Modelos de gerao de cepas de vrus da influenza pandmicas em sunos. A - modelo
clssico de rearranjo entre vrus avirios ( 2,3) e humanos ( 2,6) mostrando a
incorporao de um gene avirio no vrus da influenza humana. B - Neste modelo o
vrus da influenza aviria adquire a capacidade de infectar seres humanos devido sua
adaptao ao receptor celular humano. Esta mudana mediada por processos de
drift no gene de HA. C - modelo de transmisso direta de vrus avirios para seres
humanos devido a HA ter a capacidade de se ligar em ambos os receptores.
Modificado de Horimoto e Kawaoka, 2001.

26

2 Justificativa

O monitoramento das aves selvagens, principalmente das aves aquticas, de

fundamental importncia em nosso pas, no s pelas implicaes econmicas, mais
fundamentalmente devido a implicaes na sade da populao humana e pela
necessidade de obtermos informaes sobre os subtipos virais que esto circulando em
nossas aves silvestres.
Pelo exposto, fica evidente a importncia de um modelo de deteco e subtipagem
de vrus da influenza aviria em circulao no nosso meio, principalmente por trazer
uma resposta ao servio de vigilncia epidemiolgica do Brasil e permita uma resposta
dos agentes de sade em termos individuais ou coletivos.
A utilizao de RT-PCR (reaes de transcrio reversa seguida de reaes em
cadeia da polimerase) para a deteco dos vrus da influenza aviria pode ser bastante
til e eficiente para o monitoramento destes vrus. Estas tcnicas so mais rpidas,
sensveis e especficas que mtodos baseados em isolamento viral em cultura de clulas
ou em ovo embrionado e em mtodos baseados em imunoensaios (Koenig et al., 2003).
A RT-PCR mais sensvel para amostras estocadas de vrus da influenza A na ordem de
103 em relao ao cultivo viral e entre 106 e 107 em relao ao ensaio de ELISA
(Steininger et al., 2002). Ensaios moleculares podem ser utilizados para a deteco, para
subtipagem e para a obteno de informaes da seqncia de nucleotdeos de qualquer
segmento gnico dos vrus da influenza A que bastante til para a compreenso
filogentica e epizotica destes vrus. Alm disso, RT-PCR requer pequenas
quantidades de RNA viral e pode ser feito a partir de amostras clnicas, de cultivados,
de material de bipsia e at mesmo de guano.
Em 2004 defendi a dissertao de mestrado intitulada de: Variantes
Moleculares do Vrus Influenza pelo Programa de Ps-Graduao em Cincias
Biolgicas (Biologia Gentica) do Instituto de Biocincias da USP. Portanto no
mestrado, mesmo trabalhando com vrus da influenza humana sazonal, adquiri
conhecimentos para o desenvolvimento desta tese de doutorado. Alm dos
conhecimentos tericos, tambm adquiri experincia com tcnicas moleculares que
formam a base experimental desta tese.
Portanto, este trabalho visa deteco de vrus da influenza A em amostras
coletadas de aves residentes e migratrias nas regies Norte, Nordeste, Sudeste e Sul do
Brasil e a obteno de dados de seqncia de nucleotdeos dos segmentos genmicos 4
27

e 6, responsvel pela codificao da hemaglutinina e da neuraminidase respectivamente.

Atravs dos dados de seqncia de nucleotdeos ser possvel determinar os subtipos de
HA e NA dos vrus existentes nas amostras coletadas e fazer estudos filogenticos.

28

3 Objetivos

1) Otimizao de tcnicas moleculares para a deteco de vrus da influenza,

em material oral e cloacal coletado de aves de interesse epidemiolgico. Esta
otimizao visa adequao de um mtodo a ser utilizado em trabalhos futuros como
parte de um projeto de monitoramento de gripe aviria continuado.

2) Deteco de vrus da influenza do tipo A em aves residentes e migratrias,

por meio das tcnicas moleculares de transcrio reversa e reao em cadeia da
polimerase, em amostras de zaragatoas coletadas de aves capturadas em regies do
territrio nacional sabidamente de confluncia migratria.

3) Determinao dos subtipos de influenza A das amostras positivas para o

conhecimento do pool viral existente no Brasil e para a comparao com vrus
detectados em outros pases do globo.

29

4 Materiais e Mtodos

4.1 Expedies para coleta de amostras

Para a realizao deste trabalho foram realizadas duas expedies com a durao
de um ms e outras cinco viagens para coleta de amostras (Fig. 10 e 11).
Para a coleta de amostras em vrias regies do pas foram adquiridos dois
veculos, uma Land Rover Defender 110 equipada com itens para o trabalho de campo e o
acesso a regies com estradas precrias e uma F350 4x4 cabine dupla e chassi estendido e
tambm equipada para rodar em regies de difcil acesso. Ainda, esta caminhonete
equipada com um laboratrio mvel (Fig. 10A). Este laboratrio mvel foi utilizado
principalmente para o processamento das amostras de sangue in loco. Faz parte da estrutura
de campo um barco de alumnio e motor para chegarmos a populaes ribeirinhas, alm de
outros equipamentos necessrios para a captura das aves silvestres ou domsticas e para
coleta, armazenagem e processamento das amostras.
As regies para a coleta de amostras foram escolhidas devido ao grande nmero
de aves migrantes e imigrantes existente nestas reas. A regio Norte, especialmente o Par
um ponto de parada de aves migratrias. Os municpios amostrados no Estado do
Maranho possuem uma rea extensa que alagada todos os anos formando um pantanal, o
que atra muitas aves. A coroa do Avio e os municpios visitados de Santa Catarina
pertencem a importantes reas e concentrao de aves marinhas e esto na rota migratria
do atlntico. Decidimos tambm coletar amostras de pingins dos aqurios de Santos e do
Guaruj, pois estas aves tambm so migratrias, apesar de chegarem ao Brasil apenas de
modo acidental e de modo geral doentes.
A primeira expedio foi realizada entre 03 e 30 de julho de 2005. Neste perodo
percorremos cerca de 9 mil quilmetros entre a cidade de So Paulo, Monte Negro em
Rondnia (distante 248 quilmetros de Porto Velho), Ilha do Mosqueiro (distrito de Belm
distante 85 quilmetros da mesma) e Marabitanas que pertence ao municpio de So
Caetano de Odivelas no Par, que dista 110 quilmetros da capital.
Em Monte Negro a Universidade de So Paulo (USP) possui um posto de
pesquisas avanado, o Instituto de Cincias Biomdicas 5.
Durante esta expedio coletamos amostras de 36 espcimes de passeriformes, de
275 patos (Cairina moschata), de 34 perus (Meliagres gallopavo), e de 1 ave no
identificada, totalizando amostras coletadas de 346 animais.
30

A segunda expedio com destino ao Par ocorreu entre os dias 5 de Julho e 6 de

Agosto de 2006. O trajeto percorrido por terra foi de 6.602 quilmetros. O primeiro destino
foi o distrito de Marabitanas, municpio de So Caetano de Odivelas, onde ficamos at o
dia 21 de julho de 2006. Chegamos a So Sebastio da Boa Vista, Ilha Maraj, dia 22 de
julho depois de 9 horas de viagem em um barco de linha que partiu de Belm PA.
Neste perodo coletamos amostras de 659 animais, sendo 530 de Patos (Cairina
moschata), 95 galinhas (Gallus gallus), 29 peru (Meliagres gallopavo), 2 de galinha
dangola (Numida meleagris), 1 de gara (Egretta thula), 1 de maguari (Ardea cocoi) e 1 de
gaivota (Larus sp.).
Ainda em 2006, mais precisamente nos dias 16 de outubro e 23 do mesmo ms,
realizamos coletas de amostras de pingins nos aqurios de Santos e do Guaruj. Todos os
pingins foram da espcie Spheniscus magellanicus (pingim-de-Magalhes). Os pingins
de Magalhes chegam ao Brasil de forma espordica e em geral solitrios. Foram coletadas,
em dois dias de trabalho, amostras orais, cloacais e de sangue de 67 pingins.
Foi realizada uma terceira viagem para o Estado do Par no perodo de 27 de
outubro a 04 de novembro de 2006. Foram coletadas amostras de 100 aves, 79 patos
(Cairina moschata), 6 galinhas (Gallus gallus), 6 maarico-pintado (Actitis macularia),
4 Trinta-Ris-Boreal (Sterna hirundo), 3 maarico-rasteirinho (Calidris pusilla), 1
maariquinho (Calidris minutilla) e 1 maarico-de-papo-vermelho (Calidris canutus).
Os municpios visitados foram: Breves localizado na Ilha do Maraj, e Bragana
distante 220 quilmetros de Belm.
Foram realizadas coletas em Santa Catarina, no perodo de 16 a 20 de novembro
de 2006. Os municpios visitados foram: Ararangu, Tijucas, Barra Velha e Navegantes,
distantes 214, 50, 120 e 90 quilmetros de Florianpolis respectivamente.
Foram coletadas amostras de 50 aves, sendo 12 de patos (Cairina moschata), 10
de galinhas (Gallus gallus), 14 de anseriformes no identificados, 6 de perus (Meliagres
gallopavo), 2 de galinhas dangolas (Numida meleagris), 3 de talha-mar (Rynchops niger),
1 de maarico-grande-de-perna-amarela (Tringa melanoleuca), 1 de quero-quero (Vanellus
chilensis) e 1 de caminheiro-zumbidor (Anthus lutescens).
Durante o perodo de 10 a 20 de abril de 2007 foi realizada uma viagem para os
municpios de So Bento, Bacurituba e Cajapi localizadas no Norte do Maranho (Fig. 12)
e outra viajem a Coroa do Avio que pertence ao municpio de Igarassu, regio
metropolitana de Recife PE. So Bento, Bacurituba e Cajapi distam 94, 85 e 68
quilmetros da capital maranhense respectivamente. Estes municpios esto na regio
31

conhecida como pantanal maranhense devido aos campos que so inundados

periodicamente.
No Maranho foram coletadas amostras de 74 animais: foram capturadas 44
marrecas-cabocla (Dendrocygna autumnalis), 18 irers (Dendrocygna viduata), 4 psvermelho,

marrecas-toicinho

(Anas

bahamensis),

paturis-preta

(Netta

Erythrophthalma), 2 frangos-dgua-comum (Gallinula chloropus) e 1 peru (Meliagres

gallopavo).
Em Pernambuco foram coletadas amostras de 27 maaricos de espcies no
identificadas.
No total foram coletadas amostras de 1323 animais. Sendo 981 amostras de
Anseriformes (74,2%), 185 de Galliformes (14%), 67 de pingins (5%), 39 de maaricos
(3%), 36 de passeriformes (2,7%) e 15 amostras de espcies diversas minoritrias ou no
identificadas (1,1%).
Todas as coletas foram autorizadas pelo IBAMA, licena nmero 201/2006
CGFAU e processo nmero 02027.002839/2005.

32

6C

9
F

Figura 10. A - Veculo Ford 350 utilizado nas expedies. B - Situao comum em fundos de quintal no norte
do Par. C - Criao comercial de patos com acesso livre ao lago e a aves selvagens (crculo
vermelho). D - Coletando amostra de sangue da asa de um pato. E - Coletando amostra oral de
uma galinha dangola. F - Laboratrio de segurana nvel 3+ utilizado para o processamento das
amostras.

33

Breves
So Sebastio da Boa Vista
So Caetano de Odivelas
Bragana
Ilha do Mosqueiro
Bacurituba
So Bento
Cajapi

Coroa do Avio
Monte Negro

- Primeira Expedio - 346 aves

- Segunda Expedio - 659 aves
- Santos e Guaruj - 67 aves
- Viagem ao Para - 100 aves
- Viagem a SC - 50 aves

Aqurio do Guaruj
Aqurio de Santos
Barra Velha
Tijucas
Navegantes
Ararangu

- Viagem ao Maranho - 74 aves

- Viagem a Pernambuco - 27 aves
Figura 11. Mapa do Brasil com as localidades de coleta de amostras marcadas com bandeiras coloridas. A
legenda mostra as bandeiras coloridas que sinalizam as reas amostradas, ao lado das bandeiras est
quantidade de animais amostrados.

34

Figura 12 - Regio norte do maranho. rea

alagada extensa e sazonal.
A Marrecos selvagens, domesticados e mantidos
cativos prximos a residncia.

B Anatdeos migratrios atrados em grandes

bandos devido fartura alimentar.
C Os anatdeos selvagens entram em contatos
com aves domsticas. Trs espcies selvagens se
encontram na foto, Dendrocygna Viduata (irer),
Dendrocygna autumnalis (marreca cabocla) e
Cairina moschata (pato selvagem) em conjunto
E

com marrecos e patos domsticos.

D Panorama da regio onde foram realizadas as
coletas. Extensa rea alagada.
E Abundncia de plantas aquticas atrai as aves
silvestres.
35

4.2 Coleta de amostras.

As amostras de material cloacal e oral foram coletadas com auxilio de zaragotoas.

Apos a coleta, as amostras foram transportadas em meio Eagle contendo 1,0% de albumina
bovina, 2.000 unidades de penicilina G, 2,5 g de estreptomicina, 6 g de gentamicina, 25
g de fungisona e 20% de glicerina e tambm em Trizol (Invitrogen). Estas foram
acondicionadas em tambores de nitrognio liquido no momento da coleta em campo para o
transporte at o laboratrio, aps as amostras foram transferidas para freezer - 70 C.
O sangue foi coletado por venopuno e adicionado a soluo anticoagulante de
Alsever. O soro das amostras foi separado e transportado em balo de nitrognio liquido a
196 C ate o manuseio laboratorial. A seguir o material foi estocado em freezer 70 C.
Foram coletadas amostras de 1323 animais. As amostras orais e cloacais foram
feitas em duplicatas, o soro tambm foi separado em duplicatas mais o hematcrito
remanescente das amostras de sangue, perfaz, portanto, sete amostras de cada animal,
totalizando 9.261 amostras obtidas.
As etapas bsicas que foram seguidas neste trabalho esto no fluxograma abaixo
(Fig. 13).

36

No

H mais
amostras para
serem testadas?

Sim

Amostras
clnicas avirias

Extrao de
RNA

Deteco viral
Testes Moleculares

No

Transcrio
reversa

Amostras
positivas?
Extrao de
RNA
Sim

Subtipagem viral.

Sim

Existem mais
amostras a
serem testadas?

No

Figura 13. Fluxograma bsico do trabalho desenvolvido.

Trmino da
parte
experimental.

37

4.3 Extrao de RNA das amostras virais

As amostras estocadas em Trizol foram acrescidas de 20 g de glicognio livre de
RNases no momento do descongelamento. Estas amostras foram homogeneizadas,
seguindo-se incubao por 5 minutos a temperatura ambiente. Aps foi adicionado 200 L
de clorofrmio (Merck) a mistura seguida de homogeneizao por inverso do tubo,
prosseguiu-se com incubao por 3 minutos a temperatura ambiente. A mistura foi
centrifugada a 12.000 x g por 15 minutos a 4 oC. A fase aquosa foi transferida para outro
tubo, e a precipitao do RNA foi feita a temperatura ambiente por 10 minutos aps a
adio de 500 L de isopropanol (Merck). O precipitado foi coletado por centrifugao a
12.000 x g por 10 minutos a 4 oC. O sobrenadante foi descartado, e o precipitado foi lavado
com 1 mL de etanol 75% (Synth). O RNA seco foi dissolvido em 40 L de gua livre de
RNases. Foram extrados o RNA de amostras coletadas de 1.192 animais.

4.4 Reao de transcrio reversa utilizando iniciadores randmicos

A transcrio reversa foi feita com a utilizao do kit comercial High-Capacity

cDNA Archive (applied Biosystems, cat. No 4322171). O RNA (20 L) extrado de cada
amostra foi incubado por 10 minutos a 25 oC na presena de 50 pMoles de random
primers e demais reagentes obtendo-se um tampo de reao de 50 mM de Tris-HCL (pH
8.3), 75 mM de KCL, 3 mM de MgCl2, 10 mM de dithiothreitol (DTT), 25 U/L da enzima
multiscribe RT, 1.5 mM de 25x cada dNTP (dATP, dGTP, dTTP e dCTP) e gua livre de
RNases para um volume total de 40 L. As reaes foram incubadas por 10 minutos a
25 oC seguida de incubao a 37 oC por 120 minutos. O cDNA foi estocado em freezer com
temperatura de -70 oC at sua utilizao.
Foram feitas reao de transcrio reversa para amostras coletadas de 1.192
animais.

4.5 Reaes de Duplex Nested-PCR para a deteco viral atravs de gel de agarose

Para essa reao foram utilizados dois conjuntos de iniciadores, um conjunto feito
para o gene da polimerase cida (PA) da influenza e outro conjunto para o gene codificador
da matriz viral (M). Os mesmos genes alvos foram utilizados para a segunda reao de

38

PCR, no entanto com a seqncia do iniciador mais interna que os utilizados na primeira
reao de PCR.
A amplificao foi realizada a partir de 10 L de cDNA acrescido de 20 mM de
Tris-HCL (pH 8.4), 50 mM de KCL, 1,5 mM de MgCl2, 25 pMoles dos primers PA-18 e
PA-689R e M-745 e M-970R, 2,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen), 10 mM de cada
dDNTP e gua ultra pura tratada com DEPC (dietil pirocarbonato). O segundo PCR foi
feito do mesmo modo com a exceo dos iniciadores e da concentrao dos mesmos que
foi de 10 pMoles. Os iniciadores da segunda reao de PCR foram o PA-61 e PA-611R e
M-795 e M-952R.
As amostras foram amplificadas no termociclador BioRad DNA Thermocycler
(BioRad). O programa de ciclagem consistiu de 40 ciclos de 1 minuto a 94 oC, 1 minuto a
54 oC, 1 minuto a 72 oC, e um ciclo final de 5 minutos a 72 oC. O tamanho das bandas
esperado ao final de 550 pares de bases para o gene codificador da PA e de 157 pares de
bases para o gene da matriz viral.
Infelizmente, devido o protocolo ainda no ter sido publicado, no me foi
permitido conhecer a seqncia destes iniciadores.

4.6 Eletroforese em gel de agarose

Um volume de 15 L de produto foi adicionado a 3 L de corante para amostra

6X (azul de bromofenol 0,25% e ficol tipo 400 15%), seguindo-se anlise por
eletroforese horizontal em gel de agarose 1.2% (Invitrogen Life Technologies), em
tampo 1X TAE (40 mM Tris-acetato pH 8,0, 1 mM EDTA). Os gis de agarose foram
corados com brometo de etdio na concentrao de 0,5

g/mL (Invitrogen Life

Technologies). Aps a corrida, as bandas foram visualizadas por iluminao com luz
ultravioleta e o gel foi fotografado.
Foram submetidas eletroforese amostras coletadas de 203 animais.

4.7 PCR em tempo real.

Para este teste foi utilizado o kit de deteco TaqMan Influenza A/H5 verso
1.0 (Applied Biossystems). Este kit faz a transcrio reversa e o PCR em um nico passo.
Cada reao foi feita de acordo com as instrues do fabricante que consiste nas
concentraes finais de dATP, dCTP e dGTP de 300 L, concentrao final de dUTP de
39

600 L, rTth polimerase na concentrao de 0,1 U/L, AmpErase UNG 0,01 U/L, 450 nM
de inciadores e 200 nM de sonda e 10 L de RNA extrado. O volume total da reao de
50 L. Para cada amostra feita duas reaes, uma para a deteco de vrus da influenza do
tipo A e outra para a deteco do subtipo H5. Cada reao utiliza as mesmas concentraes
citadas, diferindo apenas na seqncia do iniciador e da sonda. O kit contm, ainda, um
controle positivo para o tipo A, um controle para o subtipo H5 e um controle interno de
reao. Os controles so utilizados na concentrao de 1 fg por reao. O programa de
ciclagem consiste em um passo de 1 minuto a 72 oC, um passo de 50 oC por 2 minutos, um
ciclo de 30 minutos a 60 oC, um passo a 95 oC por 5 minutos e quarenta ciclos de vinte
segundos 94 oC e 1 minuto a 58 oC. Para cada lote de reao foi feito um controle positivo
para o tipo A, um para o subtipo H5 e um controle negativo. Alm destes controles, cada
reao foi feita com um controle interno.
Foram testadas amostras coletadas de 100 animais em um teste piloto.

4.8 Reaes de PCR para a deteco viral atravs de GeneScan

A amplificao foi realizada a partir de 5 L de cDNA acrescido de 20 mM de
Tris-HCL (pH 8.4), 50 mM de KCL, 1,5 mM de MgCl2, 25 pMoles dos primers FluA-F1
marcado com FAM (ctaagggctttcaccgaaga) e FluA-R1 (cccattctcattactgcttc) (Claas e col.
1992) 2,5 U de Taq DNA polimerase (Biotools), 10 mM de cada dDNTP e gua ultra pura
tratada com DEPC (dietil pirocarbonato). As seqncias alvo para os primers FluAF1 e
FluA-R1 foi uma regio conservada, do segmento genmico 8 (NS), para todos os subtipos
virais do tipo A (Fig. 14). As amostras foram amplificadas no termociclador GeneAMP
PCR system 9700 (Applied Biossystems). O programa de ciclagem consistiu de 40 ciclos
de 1 minuto a 94 oC, 1 minuto a 54 oC, 1 minuto a 72 oC, e um ciclo final de 5 minutos a
72 oC.

40

ATGGATTCCAACACTGTGTCAAGTTTCCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATATCCGGAAACAAGTTGTAG
ACCAAGAACTGAGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAGGTCCCTAAGGGGAAGAGG
CAATACTCTCGGTCTAGACATCAAAGCAGCCACCCATGTTGGAAAGCAAATTGTAGAAAAGATTCTGAAA
GAAGAATCTGATGAGGCACTTAAAATGACCATGGTCTCCACACCTGCTTCGCGATACATAACTGACATGA
CTATTGAGGAATTGTCAAGAAACTGGTTCATGCTAATGCCCAAGCAGAAAATGGAAGGACCTCTTTGCAT
CAGAATGGACCAGGCAATCATGGAGAAAAACATCATATTGAAAGCGAATTTCAGTGTGATTTTTGACCGA
CTAGAGACCATAGTATTACTAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGAGCAATTGTTGGCGAAATCTCACCATTGC

FluA-F1

CTTCTTTTCCAGGACATACTATTGAGGATGTCAAAAATGCAATTGGGGTCCTCATCGGAGGACTTGAATG
GAATGATAACACAGTTCGAGTCTCTAAAAATCTACAGAGATTCGCTTGGAGAAGCAGTAATGAGAATGGG

FluA-R1

GGATCTCCACTTACTCCAAAACAGAAACGGGAAATGGCGAGAACAGCTAGGTCAAAAGTTTGAAGAGATA
AGATGGCTAATTGAAGAAGTGAGACACAGATTAAAAACAACTGAAAATAGCTTTGAACAAATAACATTCA
TGCAAGCATTACAACTGCTGTTTGAAGTGGAACAGGAGATAAGAACTTTCTCATTTCAGCTTATTTAATG
ATAAAAA

Figura 14. Seqncia completa do gene NS (A/New York/3487/2009(H3N2), com a regio

complementar ao iniciador em negrito. A seta indica a direo de sntese dos iniciadores.
Produto esperado no tamanho de 192 pares de bases.

4.9 Tcnica de GeneScan

Os produtos de PCR foram analisados utilizando o seqenciador automtico de

DNA ABI Prisma modelo 310 (Applied Biossystems) atravs da deteco do primers
marcados com fluorescncia (FAM) que foram incorporados aos produtos. Para esta
deteco utilizou-se o programa GeneScan. O tamanho do fragmento esperado para
Influenza tipo A de 192 pares de bases.
Para a anlise foi utilizado 1 L do produto do PCR acrescido de 12 L de
formamida deionizada e 0,5 L de peso molecular marcado (GeneScan 500 TM Rox
Applied Biossystems). A mistura foi denaturada a 95 oC por 3 minutos e imediatamente
resfriadas em gelo. O material foi submetido a uma eletroforese pelo ABI 310 atravs de
seu capilar preenchido com o polmero POP-4 (Applied Biossystems). A corrida
eletrofortica foi de 30 minutos a uma temperatura de 60 oC. Os fluorforos incorporados
no produto de PCR e no peso molecular foram excitados por um feixe de laser e sua

41

luminescncia capturada por uma cmera digital. O resultado foi apresentado na tela de um
computador ligado ao ABI 310 na forma de eletroferogramas.
Atravs da tcnica de GeneScan, foram testadas amostras coletadas de 368
animais.

4.10 Reao de determinao de seqncia de nucleotdeos

Para a reao de determinao de seqncias de nucleotdeos foram utilizados 3.2

moles de cada iniciador, 2 L de BigDye terminator cycle sequencing kit 3.0 (Applied
Biosystems Inc), 6 L de tampo Save Money (200mM de Tris-HCl pH 9 e 5mM de
MgCl2), 30 a 100 moles de produto de "PCR" e, gua deionizada para completar o
volume final de 20 L. Os iniciadores utilizados foram os mesmos empregados no PCR
para a deteco viral atravs de GeneScan, com a exceo de que o primer FluA-F1 que
no estava marcado com FAM. Para cada amostra foram feitas quatro reaes de
seqnciamento, duas reaes utilizando iniciadores senso e duas com iniciadores antisenso. As reaes foram realizadas no termociclador "Thermal Cycler GeneAmp PCR
System 2400". O programa de ciclagem consistiu de 30 ciclos de 45 segundos a 94 oC, 15
segundos a 50 oC e 4 minutos a 72 oC.
Os produtos das reaes de determinao da seqncia de nucleotdeos foram
purificados em colunas do kit "DyeEx 2.0 Spin Kit" (Qiagen) de acordo com as instrues
do fabricante, seguindo-se secagem a vcuo por 30 minutos. As amostras purificadas foram
ressuspendidas em 5 L de formamida Hi-Di e denaturadas a 95 oC por 5 minutos e
submetidas eletroforese pelo seqenciador automtico ABI Prism 3100 atravs de seu
capilar preenchido com o polmero POP-6 (Applied Biossystems).

4.11 Edio e anlise das seqncias obtidas

As quatro seqncias de nucleotdeos obtidas para as amostras 2408, 2409, 2410,

2412 e 2413 foram alinhadas e editadas manualmente no programa de computador
"Sequence Navigator" (verso 1.0.1 Applied Biosystems). As seqncias editadas foram
comparadas utilizando-se o programa de computador ClustalX 1.83 (Thompson e col.,
1997) e traduzidas para aminocidos pelo programa "BioEdit Sequence Alignment Editor"
(verso 5.0.9) (Hall, 1999). Este ltimo programa tambm foi utilizado para a apresentao
grfica do alinhamento.
42

5 Aperfeioamento das Tcnicas de Transcrio Reversa e PCR

5.1 Extrao de RNA

A extrao de RNA foi feita com o Kit High Pure Viral RNA Extraction Kit da
Roche Inc. Seguiu-se com as recomendaes do fabricante. Foram extrados RNA de
200 L de vrus cultivados em ovos embrionados. Para a realizao dos testes foram
utilizados vrus do tipo A do subtipo H5N3 e H7N1 de baixa patogenicidade. Tambm
fizemos a extrao de RNA do cultivado da amostra 35 em ovo embrionado. O volume
final da extrao foi de 50 L.

5.2 Reao de transcrio reversa utilizando um ou dois Iniciadores

Inicialmente, para a reao de transcrio reversa, 9 L do RNA extrado (como
mostrado no item 1) de cada amostra foram desnaturados a 65 oC por 5 minutos na
presena de 10 pMoles de cada iniciador denominados de Uni-12 (5 agcaaaagcagg 3) e
Uni-13 (5 agtagaaacaagg 3) (Fig. 15) e 1 L de 10 mM de cada dNTP (dATP, dGTP,
dTTP e dCTP). Aps a desnaturao, a mistura foi transferida para banho de gelo e, foram
adicionados tampo para transcrio reversa, inibidor de RNase (RNAguard, Amershan
Pharmacia Biotec Inc) e DTT para concentraes finais de 1X (50 mM Tris-HCl, pH 8,3,
75 mM KCl, 3 mM MgCl2), 1 U/L e 10 mM respectivamente, considerando-se um
volume final de reao de 20 L. Seguiu-se incubao a 25 oC por 2 minutos e adio de
200 U de transcriptase reversa Superscript II RNase H- (200 U/L, Invitrogen Life
Technologies). A incubao a 25 oC foi prolongada por mais 10 minutos, seguindo-se
aumento de temperatura para 42 oC pelo tempo restante da reao, ou seja, 50 minutos.
Finalmente, a enzima foi inativada por calor a 70 oC durante 15 minutos.
Como a transcriptase reversa possui tambm a capacidade de polimerase, o
produto final a obteno de cDNAs de dupla fita. Os iniciadores Uni-12 e Uni-13 alm de
serem especficos para influenza, o que diminui a produo de cDNAs indesejados, se
ligam em todos os segmentos virais produzindo cDNAs de todos os 8 segmentos inteiros
(Offringa e col., 2000, Rajakumar e col., 1990).
O mesmo procedimento descrito acima foi aplicado com a utilizao de apenas
um iniciador, neste caso, foi utilizado somente o Uni-12.
43

Stio de Clivagem*

RNA
Viral

HA1

HA2

Direo de Sntese
5

(12)

Uni 12

HA2

3 Regio no Peptdio
Sinal
traduzida

HA1

Uni 13
(1779)

Direo de Sntese

Direo de Sntese

Figura 15. Esquema com a localizao dos iniciadores Uni-12 e Uni-13 em um cDNA dupla fita
contendo o gene codificador da hemaglutinina para o vrus da influenza.
* Representao no cDNA do stio de clivagem da protena.

5.3 PCR com cDNA sintetizado com um, dois ou iniciadores randmicos

Realizamos testes para verificao de qual metodologia de transcrio reversa

apresentaria melhores resultados em relao produo ou no de amplificados, no intuito,
de melhorar o rendimento e a recuperao de dados genticos virais a partir de amostras
clnicas.
A reao de PCR foi realizada num volume total de 50 L, utilizando-se de 2 L
de cDNA (sem diluio, diludos 10X, 100X e 1000x) ou do controle negativo de
transcrio reversa e nas seguintes condies: 20 mM Tris-Cl pH 8,4, 50mM KCl, 1,5 mM
MgCl2,

0,2

mM

de

cada

dNTP,

0,1M

de

iniciador

(5

BM-HA-1

tattcgtctcagggagcaaaagcagggg 3) e Bm-NS-890R (5 atatcgtctcgtattagtagaaacaagggtgtttt

3) (Hoffman e cols., 2001).

e 2,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen Life

Technologies). A regio em negrito dos iniciadores so complementares ao gene viral, a

regio 5 contm stios de restrio para as endonucleases BsmBI ou BsaI. Estas seqncias
aumentam a temperatura de anelamento e facilita a clonagem dos produtos de PCR.

44

3
5

O programa de ciclagem consistiu de 1 ciclo a 94 oC por 4 minutos, seguido de

40 ciclos de 94 oC por 20 segundos, 58 oC por 30 segundos e 72 oC por 3 minutos, seguidos
de um ciclo a 72 oC por 7 minutos e 1 ciclo a 4 oC por tempo indeterminado.
O procedimento acima foi realizado utilizando-se cDNA sintetizados com
iniciadores randmicos, sintetizados com o iniciador Uni-12 e sintetizados com os
iniciadores Uni-12 e uni-13 em conjunto.

5.4 Melhoramento na reao de PCR. Oxalato de amnia tetrametilada

Devido baixa carga viral e a existncia de inibidores, em amostras coletadas de

aves atravs de swabs orais e cloacais, se tornou importante, a utilizao de tcnicas ou
aditivos nas reaes de PCR para melhorar a produtividade das reaes em cadeia da
polimerase.
Dentre os vrios aditivos existentes, o oxalato de amnia tetrametilada
(SACHEM, inc.) se mostrou eficaz em testes realizados (Kovrov e Drber, 2000).
A reao de PCR foi realizada num volume total de 50 L, utilizando-se de 2 L
de cDNA (sem diluio, diludo 10, 100 e 1000X) ou do controle negativo de transcrio
reversa e nas seguintes condies: 20 mM Tris-Cl pH 8,4, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2,
0,2 mM de cada dNTP, 2 mM de oxalato de amnia tetrametilada, 0,1 M de iniciador
BM-HA-1

(5

tattcgtctcagggagcaaaagcagggg

3)

Bm-NS-890R

(5

atatcgtctcgtattagtagaaacaagggtgtttt 3) (Hoffman e cols., 2001). e 2,5 U de Taq DNA

polimerase (Invitrogen Life Technologies). A regio em negrito dos iniciadores so
complementares ao gene viral, a regio 5 contm stios de restrio para as endonucleases
BsmBI ou BsaI. Estas seqncias aumentam a temperatura de anelamento e facilita a
clonagem dos produtos de PCR.
O programa de ciclagem consistiu de 1 ciclo a 94 oC por 4 minutos, seguido de 40
ciclos de 94 oC por 20 segundos, 58 oC por 30 segundos e 72 oC por 3 minutos, seguidos de
um ciclo a 72 oC por 7 minutos e 1 ciclo a 4 oC por tempo indeterminado.

45

5.5 Reao de PCR otimizada para a obteno de apenas um produto

Com a utilizao dos primers Bm-HA1 e NS 890R so gerados dois produtos de

PCR na mesma reao. O primeiro produto o desejado, o gene codificador de HA inteiro
(~1.800 pares de bases) e outro, indesejado, o produto completo do gene codificador de
NS (~890 pares de bases). Com isso, necessrio que se faa a purificao do produto
desejado em gel de agarose antes que seja feito o seqenciamento de HA. Os dois produtos
ocorrem porque as regies conservadas 5 e 3 de HA e NS so quase idnticos, no sendo
possvel, atravs de uma reao de PCR sem modificaes, a obteno apenas do gene
codificador da hemaglutinina.
Como a hemaglutinina possui 16 subtipos diferentes, difcil desenhar um
iniciador que seja especfico somente para HA e evitar a amplificao conjunta de NS.
Para evitar a co- amplificao de HA e NS, desenhamos oligonucleotdeos pouco
maiores que os BM-HA-1 e que o BM-NS-890R. As bases nitrogenadas adicionadas na
regio 3 do iniciador eram especficas somente para o gene de NS, o gene de NS menos
varivel que HA, o que facilita a adio de bases sem que se perca especificidade. Alm da
adio de bases, adicionamos tambm um espaador do tipo C3 (C3 spacer). O espaador
do tipo C3 tem a propriedade de bloquear a elongao feita pela polimerase. Com isso
espervamos bloquear a amplificao do gene de NS, sendo amplificado somente o gene
codificante de HA. A reao de PCR seguiu a mesma metodologia descrita no item 3.4 com
a exceo de que foram adicionados 10 pmol de cada iniciador modificado. Os iniciadores
foram denominados de BM-HA-1-C3 e BM-NS-890R-C3, e suas seqncias so, 5 tat tcg
tct cag gga gca aaa gca ggg tga caa a C3 spacer 3 e 5 ata tcg tct cgt att agt aga aac aag ggt
gtt ttt ta C3 spacer 3 respectivamente.

5.6 Design de iniciadores modificados

Vrios procedimentos de anlise computacional foram adotados no auxlio para o

design de primers que foram utilizados no intuito de bloquear a amplificao de NS em
conjunto com HA. Como primeiro passo, fizemos o alinhamento de todas as seqncias
completas de NS integrantes de vrus avirios disponveis no banco de dados de influenza
no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html). Foram obtidas no
dia 23/04/2009 o total de 473 seqncias de nucleotdeos completas. O tamanho das
seqncias de NS foi de 890 nucleotdeos. Para o alinhamento destas seqncias utilizamos
46

dois programas computacionais; o "BioEdit Sequence Alignment Editor" (verso 7.0.9.0)

(Hall, 1999) e o Muscle Multiple sequence comparison by log-expectation (verso 3.6)
(Edgar, 2004). Com os alinhamentos pudemos assim identificar que as regies mais
similares eram as regies das extremidades 5 e 3 das seqncias de nucleotdeos de NS.
Para identificarmos de corretamente as regies mais conservadas em 5 e 3 selecionamos
100 nucleotdeos de ambas as regies de todas as seqncias e fizemos novos
alinhamentos. Dentro dessas anlises desenhamos dois primers, Bm-HA-1-C3 e Bm-NS890R-C3: 5 tat tcg tct cag gga gca aaa gca ggg tga caa a C3 spacer 3 e 5 ata tcg tct cgt att
agt aga aac aag ggt gtt ttt ta C3 spacer 3 respectivamente. Dentre os bloqueadores que
podem ser acoplados a extremidade 3 dos iniciadores, optamos pelo espaador C3 por ser
de boa eficincia, por ser de uso comercial e devido seu relativo baixo custo (Dames e col.,
2007).

6 Determinao do Subtipo da Hemaglutinina

6.1 Reaes de PCR para a amplificao de HA inteira

Foram realizados diversos testes para a amplificao do gene codificante de HA

completo.

Nestes

testes

utilizamos

(TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG)

os

primers
e

BM-HA-1
BM-NS-890R

(ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT) (Hoffman e cols., 2001). Para

estes testes utilizamos 3 L ou 4 L de cDNA para volumes finais de 25 L ou 50 L.
Tambm variamos a concentrao dos iniciadores de 10 a 25 pMoles. As concentraes de
cloreto de magnsio tambm foram objeto de testes e suas concentraes variaram de 1 a
3 mM. E por ltimo, dentro dos vrios testes realizados, variamos a concentrao de DNTP
entre 10 e 20 mM. O programa de ciclagem tambm foi modificado na tentativa de
obteno de produto amplificado da regio HA inteiro. A quantidade de ciclos variou entre
35 e 45 vezes. A temperatura de anelamento variou de 55 a 68 oC com tempos de 30
segundos ou 1 minuto. E a temperatura de extenso utilizada em alguns testes foi de 68 oC
e outros de 72 oC com tempos de 2 a 4 minutos. Os testes foram submetidos s reaes de
ciclagem no termociclador GeneAMP PCR system 9700 (Applied Biossystems) e
analisados em eletroforese horizontal em gel de agarose.

47

7 Resultados

7.1 Deteco viral atravs de PCR em tempo real

Foram realizadas reaes de PCR em Tempo Real como descrito para as amostras 1649
a 1748 (Apndice A). O total de 100 amostras foram testadas para o vrus da influenza
tipo A e para o subtipo H5. Todas as amostras foram negativas (Figuras de 16 a 18).

Figura 16. Resultado da PCR em Tempo Real para o tipo A. Amostras de 1728 a 1748.
Somente os controles positivos mostraram curva de amplificao. As demais
amostras tiveram o mesmo perfil.

Figura 17. Resultado do PCR em Tempo Real para o subtipo H5. Amostras de 1728 a 1748.
Somente os controles positivos mostraram curva de amplificao. As demais
amostras tiveram o mesmo perfil.

48

Figura 18. Controle interno para cada uma das 48 reaes (20 amostras testadas para o Tipo A e
subtipo H5 mais controles positivos e negativos). As curvas de amplificao
mostram que as reaes tiverem xito e, portanto no continham nenhum inibidor.
As outras amostras tiveram o mesmo perfil.

7.2 Deteco viral atravs da tcnica de GeneScan

Foram realizadas reaes de PCR com iniciador marcado para a deteco viral por
GeneScan, utilizando a metodologia descrita. As amostras testadas foram as de nmero de
779 a 875, de 1749 a 1856, de 2308 a 2450 e de 2510 a 2530 (Apndice B). O total de
amostras testadas pelo mtodo de GeneScan foi de 368 amostras. Da totalidade das
amostras testadas, 7 foram positivas e 5 amostras suspeitas de serem positivas pelo mtodo
de GeneScan, como mostra a figura 19. As amostras positivas foram as de nmero 1803,
1820, 2408, 2409, 2410, 2412, 2413 e as suspeitas de positividade so 842, 1755, 1835,
1850 e 2527. O restante das amostras testadas foi negativo pela tcnica de GeneScan.

49

Figura 19. Perfil das amostras testadas pela tcnica de GeneScan, amostras positivas mostram pico
em azul na regio de 192 pares de bases, o peso molecular mostrado com picos em
vermelho. A - amostra 1803. B - amostra 1820. C - amostra 2408. D controle positivo,
este perfil de dois picos evidenciam uma quantidade grande de produtos de PCR
marcado. E controle negativo.

7.3 Deteco viral por Duplex Nested-PCR e RT-PCR tradicional com visualizao
das bandas em gel de agarose

Foram realizadas reaes de PCR para a deteco viral em gel de agarose,

utilizando a metodologia descrita. As amostras testadas foram as de nmero de 2531 a 2679
e as amostras 2579 e 2581 (numerao repetida) (Apndice C). Nenhuma amostra foi
positiva. Outras 52 amostras foram testadas atravs da tcnica de Duplex Nested-PCR nos
Estados Unidos da Amrica, no Laboratrio do Dr. Robert G. Webster. As amostras
testadas nos EUA foram as de nmero 971 a 975, 1031 a 1039, 2393 a 2407, 2482 a 2491,
2511 a 2514 e 2519 a 2527 (Apndice C). Destas amostras testadas, obtivemos 6 positivas,
so elas, as amostras 974, 975, 1039, 2395, 2484 e 2486, infelizmente no dispomos das
fotos. O total de amostras testadas foi de 203 amostras.

50

As amostras 2393 a 2467, 2511 a 2514 e 2519 a 2527 foram testadas tambm no
Brasil e obtivemos resultados positivos para a amostra 2527 com a tcnica de GeneScan,
mas um resultado negativo com a tcnica de PCR e visualizao em gel de agarose. A
amostra 2395 foi positiva no Laboratrio do Dr. Webster, mas negativa no Laboratrio do
Dr. Edison Luiz Durigon.
No total foram obtidas 18 amostras positivas (Tabela 2). A amostra positiva 842
foi coletada de um pato (Cairina moschata), no Estado do Par, as amostras 974 e 975
foram coletadas tambm de patos e de uma mesma residncia, dentro de um universo de 5
patos apenas. A amostra positiva 1039 foi coletada de um peru (Meliagres gallopavo), no
distrito de Marabitanas, municpio de So Caetano de Odivelas. As amostras 1755 e 1803
foram obtida de patos de uma granja comercial no Par. As amostras de nmero 1820 e
1835 foram coletadas de uma mesma propriedade, a 1820 foi obtida de um pato e a 1835 de
uma galinha caipira (Gallus gallus). A amostra de nmero 1850 foi obtida de outra galinha
que ficava em contato com outras aves em um ambiente aberto. A amostra 2395 foi obtida
de um trinta-ris-boreal (Sterna hirundo) que migratrio. As amostras 2408, 2409, 2410,
2412 e 2413 foram coletadas de pingins-de-Magalhes (Spheniscus magellanicus) que
habitavam o aqurio de Santos. As amostras 2484 e 2486 tambm foram obtidas de
pingins-de-Magalhes que estava no aqurio do Guaruj. E por fim, a amostra 2527 foi
obtida de um pato.
O total de amostras testadas neste trabalho de 671 amostras. Sendo 203 por
visualizao de banda em gel de agarose, 368 testadas por geneScan e 100 testadas por
Real Time.

51

Tabela 2. Amostras positivas.

N da

Nome Popular

Nome Cientfico

Mtodo

Local

842

Pato domstico

Cairina moschata

GeneScan

Granja - PA

23/07/2005

974

Pato domstico

Cairina moschata

PCR

D. Cleonce - PA

25/07/2005

975

Pato domstico

Cairina moschata

PCR

D. Cleonce - PA

25/07/2005

1039

Peru

Meleagris gallopavo

PCR

1755

Pato domstico

Cairina moschata

GeneScan

1803

Pato domstico

Cairina moschata

GeneScan

1820

Pato domstico

Cairina moschata

GeneScan

1835

Galinha

Gallus gallus

GeneScan

1850

Galinha

Gallus gallus

GeneScan

Amostra

2395
2408

2409

2410

2412

2413

2484

2486
2527

Trinta-reis-boreal Sterna hirundo

Pingim-de-

Spheniscus

Magalhes

magellanicus

Pingim-de-

Spheniscus

Magalhes

magellanicus

Pingim-de-

Spheniscus

Magalhes

magellanicus

Pingim-de-

Spheniscus

Magalhes

magellanicus

Pingim-de-

Spheniscus

Magalhes

magellanicus

Pingim-de-

Spheniscus

Magalhes

magellanicus

Pingim-de-

Spheniscus

Magalhes

magellanicus

Pato domstico

Cairina moschata

Data

Isaura - Marab. - PA 25/07/2005

Granja Beto - Terra
Alta - PA
Granja Beto - Terra
Alta - PA
S. Par - S. Caet.
Odivelas - PA
S. Par - S. Caet.
Odivelas - PA

13/07/2006

13/07/2006

14/07/2006

14/07/2006

Rubem Barbalho- PA 14/07/2006

PCR

Ilha da Canela - PA 02/11/2006

GeneScan

Aqurio de Santos

16/10/2006

GeneScan

Aqurio de Santos

16/10/2006

GeneScan

Aqurio de Santos

16/10/2006

GeneScan

Aqurio de Santos

16/10/2006

GeneScan

Aqurio de Santos

16/10/2006

PCR

Aqurio do Guaruj 23/10/2006

PCR

Aqurio do Guaruj 23/10/2006

GeneScan

Praia Ajuruteua - PA 03/11/2006

52

7.4 Alinhamento das seqncias de nucleotdeos

Para comparao das seqncias das amostras 2408, 2409, 2410, 2412 e 2413 foi
feito um alinhamento das seqncias de nucleotdeo e de aminocidos (Fig. 20)

Figura 20 - Comparao entre as seqncias parciais de nucleotdeos e peptdicas de NS1.

Pontos (.) indicam similaridade entre as seqncias obtidas, somente os
nucleotdeos diferentes da seqncia da amostra 2408 esto representados. A
ordem das seqncias foi determinada pela similaridade entre as seqncias e
arranjadas pelo programa de computador "ClustalX" (verso 1.83) (Thompson et
al., 1997).

De acordo com a figura apresentada (Fig. 20), na posio 32, onde todas as
demais seqncias apresentam uma timina seqncia da amostra 2410 apresenta uma
guanina. Esta mutao no silenciosa e resulta na mudana do aminocido apolar valina
para o aminocido polar neutro glicina. Na posio 101 da figura, a seqncia 2408
apresenta uma adenosina, a 2412 uma citosina enquanto as outras possuem nesta posio,
uma guanina. Estas mutaes so silenciosas.

53

7.5 Pesquisa das seqncias de nucleotdeos no "Genbank"

Ns utilizamos a tcnica de seqenciamento para validar a tcnica de GeneScan,

porm as aproveitamos para fazer algumas anlises. As seqncias de nucleotdeos obtidas
das amostras coletadas foram submetidas a uma pesquisa no "Genbank" com o objetivo de
verificar quais so as seqncias de nucleotdeos depositadas no banco, mais similares as
seqncias que obtivemos. As seqencias obtidas, foram do gene NS1 e possuem um
tamanho de 192 pares de bases.
A seqncia da amostra 2408, quando comparada com as seqncias do
Genbank, mostra similaridade de 100% com a seqncia A/Malaya/16/58(H2N2)
(nmero de acesso AY210156) e 99,5% com as seqncias A/Memphis/49/1983(H1N1)
(nmero de acesso CY019759), A/Baylor/11515/82(H1N1) (nmero de acesso CY010368)
e A/Baylor/11735/82(H1N1) (nmero de acesso CY009624).
As seqncias das amostras 2409 e 2413 tiveram 100% de similaridade com as
seqncias do Genbank A/Siena/9/1989(H1N1) (nmero de acesso CY036947),
A/Siena/10/1989(H1N1) (nmero de acesso CY036827), A/Texas/36/1991(H1N1) (nmero
de acesso CY033602) e (A/Beijing/262/1995(H1N1) (nmero de acesso CY033618) dentre
outras. As seqncias das amostras 2410 e 2412 apresentaram similaridade com as mesmas
seqncias do Genbank que as duas anteriores, porm com similaridade de 99%.

8 Aperfeioamento das Tcnicas de Transcrio Reversa e PCR

Durante o perodo que permaneci no Laboratrio do Dr. Robert G. Webster que

pertence a Diviso de Virologia do Saint Jude Childrens Research Hospital foram
realizados testes para desenvolver as tcnicas moleculares que utilizamos no estudo de
amostras clnicas coletadas de aves em vrias regies do Brasil.

8.1 PCR a partir de cDNA sintetizado com um, dois ou iniciadores randmicos

A comparao feita utilizando-se cDNA sintetizando a partir de iniciadores

randmicos, do iniciador Uni-12 e dos iniciadores Uni-12 e Uni-13 em conjunto se
mostraram equivalentes e nenhum dos mtodos de transcrio reversa citada se sobressaiu,
mesmo utilizando diluies do cDNA em at 1000x para as reaes de PCR (Fig.21).

54

8.2 Aperfeioamento da reao de PCR. Oxalato de amnia tetrametilada

A utilizao de oxalato de amnia tetrametilada no PCR se mostrou bastante

eficiente e ser utilizado em todas as nossas reaes de PCR (Fig. 22).

8.3 Reao de PCR otimizada para a obteno de apenas um produto

A utilizao de iniciadores desenvolvidos para bloquear a amplificao do gene

codificador do gene NS no se mostrou totalmente efetivo, mas os testes preliminares
foram promissores em determinadas condies. Outros testes esto sendo feitos para
aperfeioar a reao. Um dos motivos para o insucesso do bloqueio da amplificao de NS,
possivelmente ocorreu devido o tamanho do produto de NS ser quase 1.000 bases menor
que o produto de HA. Produtos menores tm uma taxa de produo mais eficiente e em
uma reao de PCR. Soma-se a isso, a competio por recursos existentes na mistura
utilizada para as reaes de PCR o que prejudica a amplificao de HA (Fig. 23).

Iniciadores randmicos
1

Uni-12 e Uni-13
5

10

PM

HA ~ 1800 pb
NS - 890 pb

Figura 21. Produtos de PCR feitos com cDNA sintetizado com iniciadores randmicos ou com
os iniciadores Uni-12 e Uni-13 em conjunto. Colunas de 1 a 4, diluies do cDNA
utilizado no PCR: sem diluio, 1:10, 1:100 e 1:1000. Colunas de 5 a 8, diluies do
cDNA utilizado no PCR: sem diluio, 1:10, 1:100 e 1:1000. Coluna 9, amostra 35 e
coluna 10, controle negativo e PM, peso molecular.

55

Sem OAT
1

Com OAT
4

PM

Peso molecular
HA ~ 1800 pb

2.000 pares de bases

NS - 890 pb

1.200 pares de bases

800 pares de bases

Figura 22. Produtos de PCR sem e com adio de oxalato de amnia tetrametilada (OAT)
(concentrao final de 2 mM). Colunas de 1 a 4, produtos sem adio de OAT,
diluies do cDNA utilizado no PCR: sem diluio, 1:10, 1:100 e 1:1000. Colunas
de 5 a 8, produtos com adio de OAT, diluies do cDNA utilizado no PCR: sem
diluio, 1:10, 1:100 e 1:1000. Coluna 9, controle negativo e peso molecular (PM).

10

11

12 13

14

15

PM

HA ~ 1800 pb
NS - 890 pb

Figura 23. Produtos de PCR. Colunas 1 e 2, produtos (H5N3) com adio de iniciadores
bloqueadores de NS, diluies do cDNA utilizado no PCR: sem diluio e 1:1000.
Colunas 3 e 4, produtos (H7N1) com adio de iniciadores bloqueadores de NS,
diluies do cDNA utilizado no PCR: sem diluio e 1:1000. Coluna 5, amostra 35.
Colunas 6 e 7, produtos (H5N3) com adio de iniciadores bloqueadores e de OAT,
diluies do cDNA utilizado no PCR: 1:100 e 1:1000. Colunas 8 e 9, produtos
(H7N1) com adio de iniciadores bloqueadores e de OAT, diluies do cDNA
utilizado no PCR: 1:100 e 1:1000. Coluna 10, amostra 35. Colunas 11 e 12, produtos
(H5N3) somente com adio de OAT, diluies do cDNA utilizado no PCR: 1:100 e
1:1000. Colunas 13 e 14, produtos (H7N1) somente com adio de OAT, diluies
do cDNA utilizado no PCR: 1:100 e 1:1000. Coluna 15, amostra 35. PM, peso
molecular, primeira banda de 2.000 pares de bases (pb), a segunda com 1200 pb.

56

9 Discusso

A metodologia empregada neste trabalho seguiu uma estratgia que permitiu a

coleta de um grande nmero de amostras clnicas de aves em quatro regies do Brasil e
continente Antrtico. Na regio Norte as amostras foram coletadas nos Estados do Par
e Rondnia, na regio Nordeste, foram coletadas amostras no Maranho e Pernambuco,
na regio Sudeste, foram feitas coletas no estado de So Paulo e na regio Sul, as
coletas se realizaram em Santa Catarina.
Os critrios de escolha das localidades de coleta de amostras levaram em conta
as rotas de migrao aviria.
Pelo Brasil passam duas rotas migratrias vindas da Amrica do Norte, a rota
atlntica, que segue a costa brasileira e a rota do Mississipi que passa pelo centro do
Brasil (Stotz et al., 1992). Grande parte das espcies que chegam ao Brasil, vindas do
hemisfrio Norte, pousa na regio Norte e Nordeste do Brasil para se alimentar e
descansar, antes de prosseguir a migrao pelo pas ou a migrao de retorno as suas
localidade de origem.
No Norte do Brasil, nossas coletas foram realizadas regio de Belm e na Ilha do
Maraj no estado do Par. A escolha desta regio se deu no somente devido s rotas
migratrias, mas tambm pelo aspecto cultural da populao paraense. Nas festividades
que ocorrem na semana do dia 12 de outubro, chamadas de Srio de Nazar, existe o
hbito do consumo de pratos tpicos a base de carne de pato. Devido a isso, existem na
regio inmeros criadores de patos comerciais e, virtualmente, todas as casas da regio
possuem em seu quintal criaes amadoras de patos domsticos. Alm da criao de
patos domsticos, comum, em reas rurais, a captura de patos selvagens que so
vendidos e consumidos na poca do Srio de Nazar.
Dentro das regies de invernada, tambm esto localidades do Nordeste
brasileiro, notadamente, na Coroa do Avio em Pernambuco e no pantanal maranhense
que se localiza ao norte do Estado. A Coroa do Avio, pertencente ao municpio de
Igarassu que faz parte da regio metropolitana do Recife, uma Ilhota com cerca de 25
mil metros quadrados, que visitada por 18 espcies de aves que pertencem s famlias
de Charadriidae, Scolopacidae e Laridae, devido riqueza e disponibilidade de
invertebrados marinhos que so consumidos quando a mar baixa (Telino-jnior et al.,
2003). Como na Coroa do Avio, o pantanal maranhense tambm foi escolhido para a
coleta devido abundncia de aves de diversas espcies de aves. O pantanal
57

maranhense uma extensa rea que fica alagada durante as chuvas que ocorrem nos seis
primeiros meses do ano e atrai uma imensido de aves em busca de alimentao que
farta na regio (Fig. 12B a 12E). Foram coletadas, no Maranho, cinco espcies de
anatdeos.
Em Santa Catarina, foram coletadas amostras nas cidades de Ararangu,
Navegantes, Tijucas e Barra Velha. A coleta em Santa Catarina foi motivada pela rota
migratria do Mississipi que cruza o interior do pas.
As amostras do Estado de So Paulo, que este trabalho contempla, so em sua
maioria de pingins coletados nos aqurios dos municpios do Guaruj e Santos. Estas
aves chegam ao Brasil esporadicamente, em sua maioria oriundas da Argentina,
carregadas pela corrente das Malvinas e em geral chegam magras e doentes devido
exausto ou pela contaminao com leo (Ederli et al., 2009).
Em nossas coletas priorizamos as aves da ordem dos Anseriformes que constitui
o principal grupo portador dos vrus da gripe do tipo A. Dentro deste grupo, o Cairina
moschata (pato domstico) foi o mais representativo com coletas feitas em 896 aves.
Outras cinco espcies de Anseriformes foram alvo de coletas, so elas Dendrocygna
viduata com 18 aves capturadas, Netta Erythrophthalma com duas aves capturadas,
Dendrocygna autumnalis com 44 aves capturadas, Amazonetta brasiliensis com quatro
aves capturadas e Anas bahamensis com trs aves capturadas, ainda, foram capturados
para amostragem outros 14 anseriformes no identificados. Nenhuma dessas espcies
migratria com origem setentrional, embora faam migraes locais pelo pas. Os
anseriformes em geral so aves que formam bandos principalmente nos locais de
forrageamento e, assim, os anatdeos do Brasil podem se misturar com anatdeos de
origem setentrional como a marreca-de-asa-azul (Anas discors) (Sick, 2001). As
espcies pertencentes ordem dos Charadriiformes tambm podem ser portadoras do
vrus da influenza. Esta ordem representada pelos maaricos, gaivotas, trinta-ris,
talha-mar entre outros. Ns coletamos amostras de 11 espcies que so divididas em 5
famlias da ordem dos Charadriiformes. Setes destas espcies de Charadriiformes so
migratrias: maarico-de-papo-vermelho (Calidris canutus), que um visitante do
rtico assim como o maarico-rasteirinho (calidris pusilla), o maariquinho (Calidris
minutilla), o maarico-pintado (Actitis macularia), o maarico-grande-de-perna-amarela
(Tringa melanoleuca). O trinta-ris-boreal (Sterna hirundo) uma espcie que visita o
Brasil regularmente, vindo principalmente da costa Leste americana, entre a Virgnia e
Massachusetts, incluindo Nova Iorque. Existem registros, tambm, de aves oriunda dos
58

Aores que fica entre a costa Norte da frica e Amrica do Norte e Ilhas Canrias,
localizadas prximas o litoral do Marrocos (Lima et al., 2005). A batura-de-bando
(Charadrius semipalmatus) outro visitante do hemisfrio Norte, vindo principalmente
dos Estados Unidos e Canad. Estas aves litorneas podem introduzir nas espcies
nativas vrus da influenza do tipo A, visto que j foram assinaladas como portadoras dos
subtipos de hemaglutinina de H1 a H13 e em relao neuraminidase foram
encontradas nestas espcies todos os nove subtipos em diversos arranjos com os
subtipos de hemaglutinina citados (Krauss et al., 2004). Outro fator agravante que
estas aves ao seguir suas rotas migratrias, a rota do atlntico e a rota do Mississipi, se
cruzam com outras trs rotas distintas, todas na regio do rtico, a rota do pacfico que
cruza todo o litoral do pacfico do continente, a rota do atlntico leste que passa por
parte da Europa, frica e sia, se unido as demais rotas na regio do rtico do
continente americano e, por fim, a rota do leste asitico/australiano que se cruza com a
rota do Mississipi tambm nas altas latitudes da Amrica, mais especificamente na
regio do Alaska. O cruzamento das rotas migratrias de diversas espcies facilita a
disperso de vrus da influenza de origens variadas pelo continente americano.
As aves silvestres regionais ou migratrias entram em contato com as aves
residentes e aves de fundo de quintal, o que possibilita a transmisso, caso sejam
portadoras, do vrus da gripe (Fig. 10C). Os patos domsticos pertencem mesma
espcie do pato selvagem (Cairina moschata) e comum o cruzamento dos patos
selvagens com os domesticados (Fig. 10A a 10C), mesmo a caa e a captura de
espcimes na natureza so comuns em reas prximas a rios. Estas prticas favorecem a
introduo do vrus da influenza e outros agentes infecciosos em granjas e em criaes
de fundo de quintal.
Outra prtica comum no Brasil a criao de aves em conjunto com porcos,
aves de estimao, galinceos, eqinos, cachorros e gatos (Fig. 10B). Os anseriformes
so os portadores principais dos vrus da gripe, os sunos domsticos, alm de poderem
servir de ponte entre diferentes subtipos de gripe (H1N1, H1N2, H3N2 e H3N1), os
frangos so aves extremamente suscetveis a gripe e morrem rapidamente quando se
infectam com influenza de alta patogenicidade, os cavalos so suscetveis vrus dos
subtipos H3N8 e H7N7 (Daly et al., 2004), os ces tambm possuem um subtipo viral
adaptado a ele, este subtipo um H3N8 derivado do vrus eqino (Dubovi e Njaa, 2008)
e os gatos so suscetveis ao vrus H5N1. Este ambiente de convivncia entre vrios

59

animais domsticos e em contato com animais silvestres favorece o surgimento de vrus

recombinantes com potencial infeccioso para animais ou seres humanos.
Existem 144 subtipos possveis do vrus da gripe A, mas somente os subtipos
que carregam o H5 e o H7, at o momento, causaram influenza aviria de alta
patogenicidade. Portanto, apesar de no ter sido registrado casos confirmados de
infeco com vrus de alta patogenicidade no Brasil, podem circular na regio, dentro
das criaes domsticas de pato e outras aves, vrus da gripe de baixa patogenicidade.
Ao todo foram coletadas 48 espcies entre passeriformes, marrecos selvagens,
aves costeiras, pingins e aves de fundo de quintal.
Neste trabalho foram analisados amostras de 41 espcies de aves.
Este trabalho pioneiro ao abranger regies distintas do Brasil e a coleta de
grande nmero de amostras e, portanto, desenvolvemos em nosso laboratrio todos os
procedimentos e padronizaes necessrias para que os objetivos fossem cumpridos.
Em nosso trabalho de campo, coletamos, atravs de zaragatoas, amostras de
traquia e de cloaca. O vrus da gripe se replica, nas aves, nos tecidos traqueais e
intestinais, podendo ser dispersos no ambiente por estas vias. A traquia um ambiente
menos contaminado com microorganismos podendo ser utilizado para o isolamento e a
extrao de RNA. No entanto, as amostras cloacais possuem maior carga viral e em
aves portadoras no tecido gstrico que o vrus da gripe se replica, e atravs das fezes
eliminado. Foram coletadas tambm amostras de sangue de todas as aves capturadas. O
objetivo desta coleta foi investigar se a ave entrou em contato com o vrus da gripe e
com quais subtipos virais foi este contato. Para isso utilizado tcnica de inibio da
hemaglutinao com a utilizao de padres virais inativados.
Para determinar a melhor metodologia de deteco viral, foram empregadas
quatro tcnicas distintas. A tcnica de Real Time PCR, a tcnica de GeneScan, a tcnica
de RT-PCR tradicional e a tcnica de Duplex Nested-PCR com a utilizao de gel de
agarose para a visualizao das bandas. A tcnica de Real Time PCR promissora, no
entanto, nenhuma das amostras utilizadas foi positiva para a tcnica. Esta tcnica ainda
cara e mais estudos de padronizao so necessrios para que seja empregada com alto
ndice de sucesso em amostras clnicas. Melhores resultados poderiam ser obtidos
atravs da utilizao de material gentico vindo de amostras cultivadas. Resultados
semelhantes foram encontrados com a utilizao da tcnica de RT-PCR com a deteco
de bandas em gel de agarose. No total, ns analisamos 671 amostras.

60

Os melhores resultados foram os encontrados pela tcnica de GeneScan. Por

este mtodo detectamos 7 amostras positivas e 5 amostras suspeitas, apesar destas
ltimas estarem com o tamanho de 192 pares de bases, o esperado para o teste, o pico
que produziram foi pequeno, ficando prximo ou abaixo de 150 unidades de
fluorescncia relativa (RFU em ingls), para que os resultados sejam confiveis,
segundo instrues do fabricante (Applied Biosystems), os picos devem estar entre 150
e 4000 RFU. Ainda que cinco amostras (842, 1755, 1835, 1850 e 2527) tenham ficado
prximo ou abaixo dos 150 RFU, podemos inferir, que estas amostras sejam positivas
devido qualidade de nossas reaes, picos de fundo originrios de restos de material
fluorescente originados por baixa qualidade de purificao foram praticamente
inexistentes em nossas reaes, os picos indesejveis ficaram abaixo dos 50 RFU. As
demais amostras positivas para a tcnica de GeneScan foram as de nmero 1803, 1820,
2408, 2409, 2410, 2412 e 2413. Para validar a tcnica de GeneScan, determinamos a
seqncia de nucleotdeos de 5 amostras positivas. As seqncias obtidas no so
suficientes para determinar o subtipo, o gene codificador da NS1 muito estvel entre
todos os subtipos do tipo A, alm do tamanho reduzido do produto de PCR que de 192
pares de bases, as cinco amostras que foram seqenciadas so de amostras coletadas de
pingins de Magalhes (Spheniscus magellanicus) do aqurio de Santos.
Foram obtidas ainda 6 amostras positivas no laboratrio do Dr. Webster. As
amostras positivas so as de nmero 974, 975, 1039, 2395, 2484 e 2486.
Das 18 amostras positivas, 7 foram coletadas de patos (Cairina moschata), 7
foram obtidas de pingins-de-Magalhes (Spheniscus magellanicus), 2 de galinhas
(Gallus gallus), 1 de peru (Meliagres gallopavo) e 1 de trinta-ris-boreal (Sterna
hirundo).
Trs das amostras (842, 1755 e 1803) foram obtidas de patos em granjas
comerciais, duas em uma nica granja. Na granja que se localiza no municpio do norte
paraense de Vigia de Nazar encontramos uma amostra positiva (842) de um total de 55
patos amostrados. Em uma granja localizada em Terra Alta, outro municpio do Par,
encontramos duas amostras positivas (1755 e 1803) de um total de 60 patos. Esta granja
aberta e as aves criadas entram em contato com aves silvestres (Fig. 10C).
As amostras positivas 974 e 975 foram coletadas de patos de fundo de quintal
no municpio de Vigia de Nazar. O total de patos nesta casa era de apenas 5 indivduos.
Ou seja, um alto ndice de infeco pelo vrus da gripe. Este cenrio preocupante no
caso do surgimento de vrus da gripe de alta patogenicidade, que pode trazer prejuzos
61

econmicos a regio ou mesmo problemas de sade. Outra casa que teve dois casos
confirmados de gripe localizada em So Caetano de Odivelas no Par, as amostras
positivas so a 1820 e a 1835, o total de aves amostradas nesta residncia foi de 19
indivduos. O chefe desta famlia pescador, em seu trajeto de pesca monta armadilhas
para a captura de anatdeos nas beiras dos rios e no mangue; as aves capturadas depois
que engordam no vo mais embora, enquanto no ficam mansos e gordos estes
anatdeos ficam com uma corda fina amarada em um dos ps e a uma estaca presa ao
solo. As aves depois da engorda so comercializadas vivas e em geral, depois de
compradas no so consumidas de imediato, ao contrrio, so introduzidas em meio a
outras aves domsticas, o que facilita a disperso viral.
A amostra 1850 foi coletada de uma galinha em uma residncia do municpio
de So Caetano de Odivelas no Par. Esta propriedade criava em conjunto tanto
anatdeos como galinceos, no detectamos vrus da gripe nos anatdeos, provavelmente
devido eliminao de baixa carga viral destes espcimes portadores, a galinha, apesar
de aparentemente no estar sintomtica, no portadora, e, portanto a carga viral
eliminada maior, o que facilita a deteco. Quando um Galliforme se infecta com
vrus da gripe de baixa patogenicidade, aps um perodo de alguns dias se curam e a
carga viral desaparece. Um vrus influenza de alta patogenicidade mata aves da ordem
dos Galliformes e pode acabar com um plantel inteiro em questo de horas.
Outra amostra de pato (2527) foi obtida em uma residncia localizada na praia
de Ajuruteua no municpio de Bragana PA. Nesta mesma praia foram coletadas
amostras de maaricos migratrios que podem ter infectado a ave em questo. Na
mesma localidade, na Ilha de Canela, que tambm pertence ao municpio de Bragana,
foi obtida uma amostra positiva (2395) de um trinta-reis-boreal (Sterna hirundo) que
migratrio e portador de vrus da gripe. Estas aves tm o potencial de infectar atravs
das fezes criaes comerciais com pouca infra-estrutura ou mesmo criaes de fundo de
quintal.
A amostra positiva 1039 foi coletada de um peru (Meleagris gallopavo) no
distrito de Marabitanas que pertence ao municpio paraense de So Caetano de
Odivelas, esta ave fazia parte de um pequeno plantel de 9 perus que eram criados
prximos a patos domsticos com acesso a um rio que existe a poucos metros da
residncia onde estas aves eram criadas. Os patos domsticos entram em contato com
aves silvestres ao freqentarem o rio, isto possibilita que vrus da gripe infectem estes
patos e, por conseguinte, infectem outras aves do distrito.
62

As amostras positivas 2408, 2409, 2410, 2412 e 2413 foram coletadas de

pingins do aqurio de Santos e as amostras 2484 e 2486 foram obtidas de pingins do
aqurio do Guaruj. Estas aves no so nativas do Brasil e acabam chegando ao litoral
por se perderem de seus grupos e chegam ao nosso litoral levadas pela corrente
martima das Malvinas. Estas aves normalmente chegam debilitadas e doentes. Os
pingins-de-Magalhes habitam a patagnia da Argentina e do Chile. O alto ndice de
infeco por vrus da influenza pode estar relacionada influenza humana onde os
pingins se infectam atravs de seus tratadores, ou, se infectam atravs de novos
pingins que so resgatados das praias. No se tem informao se o pingim-deMagalhes portador do vrus da gripe ou apenas se infecta com a influenza. Seja qual
o for motivo da infeco destes pingins pela gripe consistente nos dois aqurios, no
de Santos e no do Guaruj.
A quantidade de 18 amostras positivas, do total de 671 amostras testadas,
perfazendo quase 2,7% de positividade no pode ser considerado um nmero baixo,
ainda mais se tratando de um trabalho pioneiro como este. Um trabalho de
monitoramento semelhante ao nosso foi feito na Argentina, seus resultados mostram que
o porcentual de amostras positivas de apenas 0,41%, do total de 2895 amostras
testadas, conseguiram atravs de mtodos moleculares apenas 12 amostras positivas, do
total destas, apenas uma foi isolada com sucesso em cultura de ovos embrionados
(Pereda et al., 2008). Apesar da existncia de influenza em aves no Brasil e Argentina,
estes resultados indicam que a prevalncia baixa. Novos testes devero ser realizados
no intuito de aperfeioar as tcnicas de coleta e de laboratrio para melhorar estes
ndices.
Um lote de 88 amostras foram testadas em duplicatas, uma das duplicatas em
nosso laboratrio e outra no laboratrio do Dr. Webster, 87 destas amostras foram
negativas para ambos os laboratrios. No entanto, ns obtivemos como positiva a
amostra 2527, no laboratrio dos EUA essa amostra foi negativa, porm, eles obtiveram
como positiva a amostra 2395 e ns no obtivemos sucesso na deteco viral para esta
amostra. Estas diferenas ocorrem devido utilizao de materiais como kits de
extrao de RNA e de PCR distintos nos dois laboratrios ou devido baixa
concentrao viral nestas amostras o que pode resultar em falsos negativos. Isto
corrobora com a necessidade de se fazer novos testes para que a recuperao viral destas
amostras seja maior.

63

Para a determinao do subtipo viral, atravs de mtodos moleculares,

necessrio que se obtenha a seqncia do gene codificador da hemaglutinina e da
neuraminidase. No obtivemos sucesso em nossas tentativas de determinar a seqncia
do segmento genmico 4 inteiro. A obteno da seqncia inteira do gene que codifica a
hemaglutinina foi o mtodo de escolha, como todos os segmentos gnicos da influenza
possuem uma regio conservada na regio 5 e 3, a utilizao dessas regies para a
amplificao do gene da hemaglutinina vivel. A alternativa a este mtodo a
realizao de 16 reaes separadas para cada amostra positiva. Uma reao para cada
subtipo de hemaglutinina. As causas para os insucessos foram, provavelmente,
quantidade insuficiente de material gentico obtido das amostras clnicas e/ou mutaes
na regio que se pareia com a poro 3 do iniciador, ainda que a regio seja
conservada, mutaes podem ocorrer, a tcnica funciona bem para amostras onde os
vrus foram cultivados.
Para melhorar a deteco viral das amostras clnicas e favorecer a amplificao
do gene codificador da hemaglutinina fizemos alguns aperfeioamentos e escolhemos
materiais que podem melhorar nossas tcnicas moleculares.
A escolha do kit de extrao como primeiro passo, deve ser feita com ateno, o
melhor kit que testei foi o High Pure Viral RNA Extraction Kit da Roche inc. Este kit
consegue eliminar os inibidores, comuns em amostras de campo, das reaes de
transcrio reversa e PCR.
Para a reao de transcrio reversa utilizamos dois iniciadores especficos para
as regies conservadas, 12 nucleotdeos em 5 e 13 na regio 3 do gene. Como a
transcriptase reversa possui tambm a atividade de polimerase, o esperado que o
produto gerado fosse cDNA dupla fita. A reao de transcrio reversa tambm foi
feita com a utilizao apenas do iniciador Uni 12, para efeito de comparao. Depois de
feito o PCR, o resultado com a utilizao de cDNA sintetizado em ambos os mtodos de
transcrio reversa foi semelhante, no tendo vantagem, neste teste, da utilizao de
dois primers na reao de transcrio reversa.
Outro teste que realizamos para melhorar a especificidade e quantidade do
produto de PCR foi a adio de oxalato de amnia tetrametilada nas reaes em cadeia
da polimerase. A utilizao do aditivo proporcionou um aumento significativo na
quantidade de produto do gene codificador da hemaglutinina, sem aumento expressivo
do produto do gene codificador da protena no estrutural (NS). Devido similaridade
existente entre as seqncias 5 e 3 dos genes da hemaglutinina e da NS, que so alvos
64

dos iniciadores, os dois genes so amplificados conjuntamente, sendo necessrio que

seja feita uma purificao em gel de agarose para a obteno apenas do produto da
hemaglutinina (Fig. 21). O aumento na quantidade de produto de PCR do gene da
hemaglutinina, sem aumento do NS, facilita a purificao em gel de agarose do produto
desejado. esperado que a adio de oxalato de amnia tetrametilada auxilie na
obteno de produto do gene codificador da hemaglutinina proveniente de vrus de
amostras clnicas. Alm da utilizao do oxalato de amnia tetrametilada, utilizamos
uma abordagem para inibir a produo de amplificado do gene de NS, que por ser
menor, tem uma taxa de produo mais eficiente nas reaes de PCR e se torna um
competidor pelos recursos da mistura utilizada na reao de PCR. Apesar da adio de
oxalato de amnia tetrametilada melhorar a quantidade de produto de PCR do gene da
hemaglutinina, a eliminao do produto de NS eliminaria a etapa de purificao em gel
de agarose, que apesar de ser eficiente gera perda de na quantidade de amplificado.
Como a carga viral de amostras clnicas baixa, em relao aos cultivados, qualquer
alterao no protocolo que evite perda na quantidade de produto pode ser o diferencial
entre o sucesso ou o fracasso na utilizao deste produto para a subtipagem viral atravs
de tcnicas de determinao de seqncia. Para inibir a produo de amplificados do
gene da NS, utilizamos um par de iniciador com um espaador do tipo C3, na regio 3
do iniciador, para bloquear a sntese de produto de NS. Para tanto, utilizamos os
iniciadores sem o espaador (BM-HA-1 e BM-NS-890R) e outros dois iniciadores que
foram elongados em 6 nucleotdeos para o BM-HA-1 e de 3 nucleotdeos para o BMNS-890R. Os nucleotdeos adicionais so especficos apenas para o gene codificador de
NS, e como so maiores, esperado que se combinem com o cDNA antes dos
iniciadores sem os nucleotdeos adicionais. Os iniciadores maiores possuem em sua
extremidade 3 espaadores do tipo C3 e so denominados de BM-HA-1-C3 e BM-NS890R-C3. Os resultados iniciais no foram promissores, no entanto, algumas
modificaes podero ser feitas para a obteno do efeito desejado. Entre elas, a troca
do espaador C3 por dideoxinucleotideos e mais testes para determinar a concentrao
tima de cada iniciador.

65

10 Concluso

Com base nos resultados obtidos podemos concluir:

1 Que a metodologia de coleta e de anlise empregada foi adequada visto
porcentagem de positivos detectados. Em particular a tcnica de GeneScan se
mostrou, de todos os testes realizados, a melhor em relao aos resultados
positivos. Esta tcnica alm de ser de fcil utilizao no possui custo proibitivo e
foi validada por determinao da seqncia de produtos positivos. A alternativa,
vista neste trabalho, a utilizao da tcnica de Duplex Nested-PCR, que tambm
foi bastante sensvel e seu custo tambm no proibitivo embora necessite de
mais horas de trabalho humano para o processamento das amostras que a tcnica
de GeneScan.
2 Que existe influenza aviria no Brasil, notadamente as de baixa
patogenicidade. E que por isso, a vigilncia epidemiolgica deve ser feita de
modo constante para detectar possveis focos futuros, principalmente de vrus da
influenza de alta patogenicidade.
3 Que aves migratrias que visitam o Brasil, como o trinta-reis-boreal
(Sterna hirundo), podem ser fontes de introduo viral em populaes silvestres
ou domsticas.
4 Que o monitoramento deve ser continuado devido possibilidade de
introduo de vrus de alta patogenicidade via aves migratrias e a possibilidade
de recombinao gentica gerada pela convivncia estreita de diversas espcies
animais.

66

Referncias Bibliogrficas*

Alexander, D. J. (2000). A review of avian influenza in different bird species. Vet.

Microbiol., 74(1-2): 3-13.
ABEF.
(2008).
Relatrio
anual
2008/2009.
Disponvel
em:
<http://www.abef.com.br/portal/_clientes/abef/cat/Abef%20RA_4021.pdf>. Acesso
em: 13 nov. 2009.
Boere, G.C., Stroud, D. A. (2006). The flyway concept: what is is and what it isnt.
In: Boere GC, Galbraith CA, Stroud DA, editors. Waterbirds around the world. pp.
40-47. The Stationary Office, Edinburgh, UK. 2006. Disponvel em:
<http://www.jncc.gov.uk/PDF/pub07_waterbirds_part1_flywayconcept.pdf>.
Acesso em: 10 setembro. 2009.
Braakman, I., Anken, E. (2000). Folding of viral envelope glycoproteins in the
endoplasmic reticulum. Traffic 1: 533-539.
Bridges, C. B., Kuehnert, M. J., Hall, C. B. (2003). Transmission of influenza:
implications for control in health care settings. Clin Infect Dis., 37(8): 1094-1101.
Brown, E. G. (2000). Influenza virus genetics. Biomed. Pharmacother., 54(4): 196209.
Bchen-Osmond, C. (2003). Orthomyxoviridae. In: ICTVdB - The Universal Virus
Database, version 3. ICTVdB Management. Columbia University, New York, USA.
Capua, I., Alexander, D. J. (2002). Avian influenza and human health. Acta Trop.,
83(1): 1-6.
Capua, I., Alexander, D. J. (2004). Avian influenza: recent developments. Avian
Pathol., 4: 393-404.
Chambers, T. M., Yamnikova, S., Kawaoka,Y., Lvov,D. K., Webster,R.G. (1989).
Antigenic and molecular characterization of subtype H13 hemagglutinin of
influenza virus. Virology, 172(1): 180-188.
Chen, Z., Krug, R. M. (2000). Selective nuclear export of viral mRNAs in influenzavirus-infected cells. Trends Microbiol., 8(8): 376-383.
Claas, E. C. J., Sprenger M. J. W., Kleter G. E. M., van Beek R., Quint W. G. V.,
Masurel N. (1992). Type-specific identification of influenza viruses A, B and C by
the polymerase chain reaction. J. Virol. Methods, 39: 113.
Cox, N. J., Subbarao, K. (2000). global epidemiology of influenza: past and present.
Annu. Rev. Med., 51: 407-421.
* De acordo com:
American Psychological Association (2001). Publication Manual of the American Psychological Association (5th
ed.). Washington, DC: Author.

67

Daly, J. M., Newton. J. R., Mumford, J. A. (2004). Current perspectives on control of

equine influenza. Vet. Res., 35: 411423.
Dames, S., Margraf R. L., Pattison D. C., Wittwer C. T., Voelkerding K. V.(2007).
Characterization of Aberrant Melting Peaks in Unlabeled Probe Assays. J. Mol.
Diag., 9(3): 290-296.
Dubovi, E. J., Njaa, B. L. (2008). Canine Influenza. Vet. Clin. N. Am.: Small Anim.
Pract., 38(4): 827-835.
Ederli, N. B., Oliveira, F. C. R., Monteiro C. M., Silveira L. S., Rodrigues M. L. A.
(2009). Ocorrncia de Contracaecum pelagicum Johnston & Mawson, 1942
(Nematoda, Anisakidae), em pinguim-de-magalhes (Spheniscus magellanicus
Forster, 1781) (Aves, Spheniscidae) no litoral do Esprito Santo. Arq. Bras. Med.
Vet. Zootec., 61(4): 1006-1008.
Edgar, R. C. (2004). MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and
high throughput Nucleic Acids Research, 32(5): 1792-1797.
Fouchier, R. A. M., Schneeberger, P. M., Rozendaal, F. W., Broekman, J. M., Kemink,
S. A. G., Munster, V., Kuiken, T., Rimmelzwaan, G. F., Schutten, M., Doornun, G.
J. J., Koch G., Bosman, A., Koopmans, M., Osterhaus, A. D. M. E. (2004). Avian
influenza (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute
respiratory distress syndrome. P.N.A.S., 101(5): 1356-1361.
Fouchier, R. A., Munster, V., Wallensten, A., Bestebroer, T. M., Herfst, S., Smith, D.,
Rimmelzwaan, G. F., Olsen, B., Osterhaus, A. D. (2005). Characterization of a
novel influenza a virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed
gulls. J. Virol., 79(5): 2814-2822.
Hall, T. A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and
analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser., 41: 95-98.
Hay, A. J. (1998). The virus genome and its replication. p. 43-53. in K. G. Nicholson,
R. G. Webster, and A. J. Hay (ed.), Textbook of influenza. Blackwell Science,
London, England.
Hilleman, M. R. (2002). Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis,
epidemiology and control. Vaccine, 20: 3068-3087.
Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G., Perez, D. R. (2001). Universal
primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. Archives
Virol., 146(12): 2275-2289.
Honda, A., Endo, A., Mizumoto, K., Ishihama, A. (2001). Differential roles of viral
RNA and cRNA in functional modulation of the influenza virus RNA polymerase.
J. Biol. Chem., 276(33): 31179-31185.
Horimoto, T., Kawaoka, Y. (2001). Pandemic threat posed by avian influenza A
viruses. Clin. Microbiol. Rev., 14(1): 129-149.
Kaiser, J. (2006). A one size fits all flu vaccine. Science, 312: 380-382.
68

Katz, J. M. (2003). The impact of avian influenza viruses on public health. Avian
Dis., 47(3): 914-920.
Kovrov, M., Drber, P. (2000). New specificity and yield enhancer of polymerase
chain reaction. Nucleic Acid Res., 28(13): i-iv.
Klumpp, K., Ruigrok, R. W., Baudin, F. (1997). Roles of the influenza virus
polymerase and nucleoprotein in forming a functional RNP structure. EMBO J.,
16(6): 1248-1257.
Koenig, M., Kosha, S., Hickman, M., Heath, D., Riddell, S., Aldous, W. (2003).
Detection of influenza virus from throat and pharyngeal swabs with a nested
duplex light cycler RT-PCR. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 46(1): 35-37.
Krauss, S., Walker D., Pryor, P. S., Niles, L., Chenghong, L., Hinshaw, V. S., Webster,
R. G. (2004). Influenza A viruses of migrating wild aquatic birds in North
America Vector-Born Zoon. Dis., 4(3): 177-189.
Kuszewski, K., Brydak, L. (2000). The epidemiology and history of influenza.
Biomed. Pharmacother., 54(4):188-195.
Laver, G., Garman, E. (2002). "Pandemic influenza: its origin and control." Microbes
Infect., 4(13): 1309-1316.
Lima, P. C., Hays, H., Lima R. C. F. R., Cormons T., Cormons G., DiCostanzo J.,
Santos, S. S. (2005) Recuperaes de Sterna hirundo (Linnaeus, 1758) na Bahia,
Brasil, entre 1995 e 2004. Revista Brasileira de Ornitologia, 13(2): 177-179.
Itzstein, M. (2007). The war against influenza: discovery and development of sialidase
inhibitors. Nat. Rev. Drug Discovery, 6: 967-974.
Mena, I., Jambrina, E., Albo, C., Perales, B., Ortin, J., Arrese, M., Vallejo, D., Portela,
A. (1999). Mutational analysis of influenza A virus nucleoprotein: identification of
mutations that affect RNA replication. J. Virol., 73(2): 1186-1194.
Mould, J. A., Li, H. C., Dudlak, C. S., Lear, J. D., Pekosz, A., Lamb, R. A., Pinto, L. H.
(2000). Mechanism for proton conduction of the M2 ion channel of influenza A
virus. J. Biol. Chem., 275(12): 8592-8599.
MS. (2009). Situao epidemiolgica da Influenza Pandmica (H1N1) 2009 no Mundo
e no Brasil, at semana epidemiolgica 40 de 2009. Disponvel em:
<http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/informe_40_influenza_pandemica__
19out2009_atual.pdf> Acesso em: 14 de Nov. 2009.
Nakagawa, Y., Oda, K., Nakada, S. (1996). The PB1 subunit alone can catalyze cRNA
synthesis, and the PA subunit in addition to the PB1 subunit is required for viral
RNA synthesis in replication of the influenza virus genome. J. Virol., 70(9): 63906394.
Nakajima, S., Nobusawa, E., Nakajima, K. (2000). Variation in response among
individuals to antigenic sites on the HA protein of human influenza virus may be

69

responsible for the emergence of Drift strains in the human population. Virology,
274: 220-231.
Neumann, G., Watanabe, T., Kawaoka, Y. (2000). Plasmid-driven formation of
influenza virus-like particles. J. Virol., 74(1): 547-551.
Nicholson, K. G. (1998). Human influenza. p. 219-264. in K. G. Nicholson, R. G.
Webster, A. J. Hay (ed.), Textbook of influenza. Blackwell Science, London,
England.
OIE. (2009). Outbreaks of Avian Influenza (subtype H5N1) in poultry. From the end
of
2003
to
5
November
2009.
Disponvel
em:
<http://www.oie.int/downld/AVIAN%20INFLUENZA/Graph%20HPAI/graphs%20
HPAI%2005_11_2009.pdf>. Acesso em: 15 nov. 2009.
Offringa, D. P., Tyson-Medlock, V., Ye, Z., Levandowski, R. A. (2000). A
comprehensive systematic approach to identification of influenza A virus genotype
using RT-PCR and RFLP. J. Virol. Meth., 88: 15-24.
O'Neill, R. E., Talon, J., Palese, P. (1998). The influenza virus NEP (NS2 protein)
mediates the nuclear export of viral ribonucleoproteins. Embo J., 17(1): 288-296.
Pereda, A. J., Uhart, M., Perez, A. A., Zaccagnini, M. E., Sala, L., Decarre, J., Goijman,
A., Solari, L., Suarez, R., Craig, M. I. (2008). Avian Influenza Virus Isolated in
Wild Waterfowl in Argentina: Evidence of a potentially unique phylogenetic
lineage in South America. Virology, 378(2): 363-370.
Potter, C. W. (2001). "A histroy of infuenza" J. Appl. Microbiol., 91(4): 572-579.
Rajakumar, A., Swierkoszt, E. M., Schulze, I. T. (1990). Sequence of an influenza
virus hemagglutinin determined directly from a clinical sample. Proc. Natl. Acad.
Science, 87: 4154-4158.
Sick, H. (2001). Composio da avifauna brasileira. In J. F. Pacheco (Ed.),
Ornitologia brasileira (pp. 129-135). Rio de Janeiro, Brasil: Nova Fronteira.
Skehel, J. J., Wiley, D. C. (2002). Influenza haemagglutinin. Vaccine, 20(2): 51-54.
Soares, P. B., Demetrio, C., Sanfilippo, L., Kawanoto, A. H, Brentano, L., Durigon, E.
L. (2005). Standardization of a duplex RT-PCR for the detection of Influenza A
and Newcastle disease viruses in migratory birds. J. Virol. Methods, 123(2): 125130.
Steininger, C., Kundi, M., Aberle, S. W., Aberle, J. H., Popow-Kraupp T. (2002).
Effectiveness of reverse transcription-PCR, virus isolation, and enzyme-linked
immunosorbent assay for diagnosis of influenza A virus infection in different age
groups. J. Clin. Microbiol., 40(6): 2051-2056.
Stotz, D. F., Bierregaard, R. O., Cohn-Haft, M., Petermann, P., Smith, J., Whittaker, A.,
Wilson, S., V. (1992). The status of North American migrants in central
Amazonian Brazil. The Condor, 94: 608-621.

70

Taubenberger, J. K., Reid, A. H., Janczewski,T. A., Fanning, T. G. (2001). Integrating

historical, clinical and molecular genetic data in order to explain the origin and
virulence of the 1918 Spanish influenza virus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol.
Sci., 356(1416): 1829-1839.
Telino-Jnior, W. R., Azevedo-Jnior, S. M., Lyra-Neves, R. M. (2003). Censo de
aves migratrias (Charadriidae, Scolopacidae e Laridae) na Coroa do Avio,
Igarassu, Pernambuco, Brasil. Rev. Bras. de Zool,. 20(3): 451456.
Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. (1997).
"The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence
alignment aided by quality analysis tools." Nucleic Acids Research, 24: 4876-4882.
Webster, R. G., Bean, W. J., Gorman, O. T., Chambers, T., M., Kawaoka, Y. (1992).
Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol. Rev., 56(1): 152-179.
Webster, R. G., Shortridge, K. F., Kawaoka, Y. (1997). Influenza: interspecies
transmission and emergence of new pandemics. FEMS Immunol Med Microbiol.,
18(4): 275-279.
Webster, R. G., Yakhno, M., Hinshaw, V. S., Bean, W. J., Murti, K. G. (1978).
Intestinal influenza: replication and characterization of influenza viruses in ducks.
Virology, 84(2): 268-278.
World Health Organization (WHO) (1999). Influenza Fact Sheet 211. Disponvel em:
<http://nzdl.sadl.uleth.ca/cgi-bin/library?e=d-00000-00---off-0cdl--00-0----0-10-0--0---0direct-10---4-------0-1l--11-en-50---20-help---00-0-1-00-0-0-11-1-0utfZz-800&a=d&c=cdl&cl=CL1.242&d=HASH7dea2e7362b7935d478d4a.2>. Acesso em:
25 out. 2009.
WHO. (2005). Ten concerns if avian influenza becomes a pandemic. Disponvel em:
<http://www.who.int/csr/disease/influenza/pandemic10things/en/index.html>.
Acesso em: 01 nov. 2009.
WHO.
(2006).
Avian
influenza
("
bird
flu").
Disponvel
em:
<http://www.who.int/mediacentre/factsheets/avian_influenza/en>. Acesso em: 30
out. 2009.
WHO. (2009a). H5N1 avian influenza: Timeline of major events. Disponvel em:
<http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/ai_timeline/en/index.html>.
Acesso em: 28 out. 2009.
WHO. (2009b). Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza
A/(H5N1)
Reported
to
WHO.
Disponvel
em:
<http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2009_09_24/
ee/index.html>. Acesso em: 29 out. 2009.
WHO. (2009c). Areas with confirmed cases of H5N1 avian influenza since 2003.
Disponvel em:<http://gamapserver.who.int/mapLibrary/Files/Maps/Global_H5N1
inHumanCUMULATIVE_FIMS_20090924.png>. Acesso em: 02 nov. 2009
71

WHO. (2009d). Influenza A (H1N1): WHO announces pandemic alert phase 6, of

moderate severity. Disponvel em: <http://www.euro.who.int/mediacentre/PR/
2009/20090611_1>. Acesso em: 02 nov. 2009.
WHO. (2009e). Pandemic (H1N1) 2009 - update 74. Disponvel em:
<http://www.who.int/csr/don/2009_11_13/en/index.html>. Acesso em: 14 nov.
2009.
Yewdell, J., Garcia-Sastre, A. (2002). Influenza virus still surprises. Cur.
Opin.Microbiol., 5: 414-418.
Zambon, M. C. (1999). Epidemiology and pathogenesis of influenza. J. Antimicrob.
Chemother., 44(B): 3-9.

72

Apndices
Apndice A Tabela das amostras testadas pelo mtodo de Real Time PCR.
No da

Nome

Amostra

Popular

1649

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

1650

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

1651

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

1652

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

1653

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

1654

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

1655

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

1656

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

1657

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

1658

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

1659

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

1660

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

1661

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

Nome Cientfico

Data da
Coleta

Local
GranjaGalinhaVigia-PA
GranjaGalinhaVigia-PA
GranjaGalinhaVigia-PA
GranjaGalinhaVigia-PA
GranjaGalinhaVigia-PA
GranjaGalinhaVigia-PA
GranjaGalinhaVigia-PA
GranjaGalinhaVigia-PA
GranjaGalinhaVigia-PA
GranjaGalinhaVigia-PA
GranjaGalinhaVigia-PA
GranjaGalinhaVigia-PA
GranjaGalinhaVigia-PA

Resultado

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

73

No da

Nome

Amostra

Popular

1662
1663
1664
1665
1666
1667
1668
1669
1670
1671
1672
1673
1674
1675
1676
1677
1678
1679
1680
1681
1682
1683

Galinha
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico

Nome Cientfico

Data da
Coleta

Gallus gallus

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Local
GranjaGalinhaVigia-PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA

Resultado

Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

74

No da

Nome

Amostra

Popular

1684
1685
1686
1687
1688
1689
1690
1691
1692
1693
1694
1695
1696
1697
1698
1699
1700
1701
1702
1703
1704
1705

Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico

Nome Cientfico

Data da
Coleta

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Local
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
Stio AaiVigia- PA
KlebersonVigia- PA
KlebersonVigia- PA
KlebersonVigia- PA

Resultado
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

75

No da

Nome

Amostra

Popular

1706
1707
1708
1709
1710
1711
1712
1713
1714
1715

Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico

Nome Cientfico

Data da
Coleta

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

Cairina moschata

11/07/2006

1716

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

1717

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

1718

Galinha

Gallus gallus

11/07/2006

1719

Pato
Cairina moschata
domstico

12/07/2006

1720

Pato
Cairina moschata
domstico

12/07/2006

1721

Pato
Cairina moschata
domstico

12/07/2006

1722

Pato
Cairina moschata
domstico

12/07/2006

1723

Galinha

Gallus gallus

12/07/2006

1724

Galinha

Gallus gallus

12/07/2006

Local
KlebersonVigia- PA
KlebersonVigia- PA
KlebersonVigia- PA
KlebersonVigia- PA
KlebersonVigia- PA
KlebersonVigia- PA
KlebersonVigia- PA
KlebersonVigia- PA
KlebersonVigia- PA
KlebersonVigia- PA
KlebersonVigia- PA
KlebersonVigia- PA
KlebersonVigia- PA
Pio XIID.Gertrudes
- Vigia- PA
Pio XIID.Gertrudes
- Vigia- PA
Pio XIID.Gertrudes
- Vigia- PA
Pio XIID.Gertrudes
- Vigia- PA
Pio XIID.Gertrudes
- Vigia- PA
Pio XIID.Gertrudes
- Vigia- PA

Resultado
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

76

No da

Nome

Amostra

Popular

Nome Cientfico

Data da
Coleta

1725

Galinha

Gallus gallus

12/07/2006

1726

Galinha

Gallus gallus

12/07/2006

1727

Galinha

Gallus gallus

12/07/2006

1728

Galinha

Gallus gallus

12/07/2006

1729

Galinha

Gallus gallus

12/07/2006

1730

Pato
Cairina moschata
domstico

12/07/2006

1731

Pato
Cairina moschata
domstico

12/07/2006

1732

Galinha

Gallus gallus

12/07/2006

1733

Galinha

Gallus gallus

12/07/2006

1734

Galinha

Gallus gallus

12/07/2006

1735

Galinha

Gallus gallus

12/07/2006

1736

Galinha

Gallus gallus

12/07/2006

1737

Galinha

Gallus gallus

12/07/2006

1738

Galinha

Gallus gallus

12/07/2006

1739
1740

Pato
Cairina moschata
domstico
Pato
Cairina moschata
domstico

12/07/2006
12/07/2006

Local
Pio XIID.Gertrudes
- Vigia- PA
Pio XIID.Gertrudes
- Vigia- PA
Pio XIID.Gertrudes
- Vigia- PA
Pio XIID.Gertrudes
- Vigia- PA
Pio XIID.Gertrudes
- Vigia- PA
PioXIID.AdelinaVigia PA
PioXIID.AdelinaVigia PA
PioXIID.AdelinaVigia PA
PioXIID.AdelinaVigia PA
PioXIID.AdelinaVigia PA
PioXIID.AdelinaVigia PA
PioXIID.AdelinaVigia PA
PioXIID.AdelinaVigia PA
PioXIID.AdelinaVigia PA
Jaime-Terra
Alta- PA
Jaime-Terra
Alta- PA

Resultado

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo
Negativo
Negativo
77

No da

Nome

Amostra

Popular

1741
1742
1743
1744
1745
1746
1747
1748

Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico
Pato
domstico

Nome Cientfico

Data da
Coleta

Cairina moschata

12/07/2006

Cairina moschata

12/07/2006

Cairina moschata

12/07/2006

Cairina moschata

12/07/2006

Cairina moschata

12/07/2006

Cairina moschata

12/07/2006

Cairina moschata

12/07/2006

Cairina moschata

12/07/2006

Local
Jaime-Terra
Alta- PA
Jaime-Terra
Alta- PA
Jaime-Terra
Alta- PA
Jaime-Terra
Alta- PA
Jaime-Terra
Alta- PA
Jaime-Terra
Alta- PA
Jaime-Terra
Alta- PA
Jaime-Terra
Alta- PA

Resultado
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

Apndice B Tabela das amostras testadas pelo mtodo de GeneScan.

No da
Amostra
779
780
781
782
783
784
785
786
787
788
789
790
791
792
793
794

Nome Popular

Nome Cientfico

Ave
Ave
Ave
Ave
Ave
Ave
Ave
Ave
Ave
Ave
Ave
Choquinha-degarganta-clara
Choquinha-deasa-comprida
Choca-preta-ecinza
Choca-preta-ecinza

------------------------------------------------------------------Myrmotherula
hauxwelli
Myrmotherula
longipennis
Thamnophilus
nigrocinereus
Thamnophilus
nigrocinereus
Mionectes
macconnelli

Abre-asa-da-mata

Data da

Local

Resultado

----------------------------------

-------------------------------------------------------------------

Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

24/07/2005

Mosqueiro-PA

Negativo

24/07/2005

Mosqueiro-PA

Negativo

24/07/2005

Mosqueiro-PA

Negativo

24/07/2005

Mosqueiro-PA

Negativo

24/07/2005

Mosqueiro-PA

Negativo

Coleta

78

No da

Nome Popular

Nome Cientfico

795

Choca-preta-ecinza

796

Tangar-falso

797

Udu-de-coroa-azul

798

Tangar-falso

Thamnophilus
nigrocinereus
Chiroxiphia
pareola
Momotus momota
Chiroxiphia
pareola
Thamnophilus
nigrocinereus
Phaethornis
hispidus
Phaethornis
hispidus
Phaethornis
hispidus
Ramphocelus
carbo
Formicivora
grisea
Thamnophilus
aethiops
Thryothorus
genibarbis
Thryothorus
genibarbis
Cnemotriccus
fuscatus
Tolmomyias
poliocephalus
Formicivora
grisea
------Formicivora
grisea
Ramphocelus
carbo
Nyctidromus
albicollis
Thamnophilus
schistaceus
Pipra fasciicauda
Ramphocelus
carbo
Ramphocelus
carbo

Amostra

799
800
801
802

Choca-preta-ecinza
Rabo-branco-ecinza
Rabo-branco-ecinza
Rabo-branco-ecinza

803

Pipira-vermelha

804

Papa-Formigapardo

805

Choca-lisa

806
807
808
809
810
811
812

Garrincho-paiav
Garrincho-paiav
Guaracavuu
Bico-chato-decabea-cinza
Papa-Formigapardo
Ave
Papa-Formigapardo

813

Pipira-vermelha

814

Curiango

816

Choca-de-olhovermelho
Uirapuru-laranja

818

Pipira-vermelha

819

Pipira-vermelha

815

Data da

Local

Resultado

24/07/2005

Mosqueiro-PA

Negativo

24/07/2005

Mosqueiro-PA

Negativo

24/07/2005

Mosqueiro-PA

Negativo

24/07/2005

Mosqueiro-PA

Negativo

24/07/2005

Mosqueiro-PA

Negativo

12/07/2005

Clemires-RO

Negativo

12/07/2005

Clemires-RO

Negativo

12/07/2005

Clemires-RO

Negativo

12/07/2005

Clemires-RO

Negativo

12/07/2005

Clemires-RO

Negativo

12/07/2005

Clemires-RO

Negativo

12/07/2005

Clemires-RO

Negativo

12/07/2005

Clemires-RO

Negativo

12/07/2005

Clemires-RO

Negativo

12/07/2005

Clemires-RO

Negativo

12/07/2005

Clemires-RO

Negativo

----

-------

Negativo

12/07/2005

Clemires-RO

Negativo

12/07/2005

Clemires-RO

Negativo

13/07/2005

Clemires-RO

Negativo

13/07/2005

Clemires-RO

Negativo

13/07/2005

Clemires-RO

Negativo

13/07/2005

Clemires-RO

Negativo

13/07/2005

Clemires-RO

Negativo

Coleta

79

No da

Data da

Nome Popular

Nome Cientfico

820

Pipira-vermelha

Ramphocelus
carbo

13/07/2005

821

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

822

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

823

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

824

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

825

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

826

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

827

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

828

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

829

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

830

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

831

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

832

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

833

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

834

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

835

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

836

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

837

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

838

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

839

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

840

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

841

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

Amostra

Coleta

Local

Resultado

Clemires-RO

Negativo

Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA
Granja-Vera-VigiaPA

Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

80

No da

Data da

Nome Popular

Nome Cientfico

842

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

843

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

844

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

845

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

846

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

847

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

848

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

849

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

850

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

851

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

852

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

853

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

854

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

855

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

856

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

857

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

858

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

859

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

860

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

861

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

862

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

863

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

Amostra

Coleta

Local

Resultado

Granja-Vera-Vigia- Suspeita de
PA
Positividade
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA

81

No da

Data da

Nome Popular

Nome Cientfico

864

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

865

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

866

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

867

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

868

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

869

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

870

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

871

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

872

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

873

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

874

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

875

Pato domstico

Cairina moschata

23/07/2005

1749

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1750

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1751

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1752

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1753

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1754

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1755

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1756

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1757

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1758

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

Amostra

Coleta

Local

Resultado

Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja-Vera-VigiaNegativo
PA
Granja Beto- Terra
Negativo
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Negativo
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Negativo
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Negativo
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Negativo
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Negativo
Alta-PA
Granja Beto- Terra Suspeita de
Alta-PA
Positividade
Granja Beto- Terra
Negativo
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Negativo
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Negativo
Alta-PA

82

No da

Data da

Nome Popular

Nome Cientfico

1759

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1760

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1761

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1762

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1763

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1764

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1765

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1766

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1767

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1768

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1769

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1770

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1771

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1772

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1773

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1774

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1775

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1776

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1777

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1778

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1779

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1780

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

Amostra

Coleta

Local
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA

Resultado
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

83

No da

Data da

Nome Popular

Nome Cientfico

1781

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1782

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1783

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1784

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1785

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1786

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1787

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1788

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1789

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1790

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1791

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1792

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1793

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1794

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1795

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1796

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1797

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1798

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1799

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1800

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1801

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1802

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

Amostra

Coleta

Local
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA

Resultado
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

84

No da

Data da

Nome Popular

Nome Cientfico

1803

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1804

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1805

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1806

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1807

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1808

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1809

Peru

1810

Peru

1811

Galinha

Gallus gallus

13/07/2006

1812

Galinha

Gallus gallus

13/07/2006

1813

Galinha

Gallus gallus

13/07/2006

1814

Galinha

Gallus gallus

13/07/2006

1815

Galinha

Cairina moschata

13/07/2006

1816

Galinha

Cairina moschata

13/07/2006

1817

Peru

Meliagres
gallopavo

13/07/2006

1818

Pato domstico

Cairina moschata

13/07/2006

1819

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1820

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1821

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1822

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1823

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1824

Pato selvagem

Cairina moschata

14/07/2006

Amostra

Meleagris
gallopavo
Meleagris
gallopavo

Coleta

13/07/2006
13/07/2006

Local
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
Granja Beto- Terra
Alta-PA
D.Alda-MatupiriPA
D.Alda-MatupiriPA
D.Alda-MatupiriPA
D.Alda-MatupiriPA
D.Alda-MatupiriPA
D.Alda-MatupiriPA
D.Alda-MatupiriPA
D.Alda-MatupiriPA
D.Alda-MatupiriPA
D.Alda-MatupiriPA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA

Resultado
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

85

No da

Data da

Nome Popular

Nome Cientfico

1825

Pato selvagem

Cairina moschata

14/07/2006

1826

Pato selvagem

Cairina moschata

14/07/2006

1827

Pato selvagem

Cairina moschata

14/07/2006

1828

Pato selvagem

Cairina moschata

14/07/2006

1829

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1830

Galinha

Gallus gallus

14/07/2006

1831

Pato selvagem

Cairina moschata

14/07/2006

1832

Pato selvagem

Cairina moschata

14/07/2006

1833

Gaivota

1834

Pato selvagem

Cairina moschata

14/07/2006

1835

Galinha

Gallus gallus

14/07/2006

Egretta thula

14/07/2006

Ardea cocoi

14/07/2006

Amostra

1836
1837

Gara-brancapequena
Soc-Grande,
maguari

Coleta

14/07/2006

1838

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1839

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1840

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1841

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1842

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1843

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1844

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1845

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1846

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

Local
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
S.Par-So
Caeta.Odivelas-PA
Ruben BarbalhoEstr.Cach.PA
Ruben BarbalhoEstr.Cach.PA
Ruben BarbalhoEstr.Cach.PA
Ruben BarbalhoEstr.Cach.PA
Ruben BarbalhoEstr.Cach.PA
Ruben BarbalhoEstr.Cach.PA
Ruben BarbalhoEstr.Cach.PA
Ruben BarbalhoEstr.Cach.PA
Ruben BarbalhoEstr.Cach.PA

Resultado
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Suspeita de
positividade
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

86

No da

Data da

Nome Popular

Nome Cientfico

1847

Galinha

Gallus gallus

14/07/2006

1848

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1849

Galinha

Gallus gallus

14/07/2006

1850

Galinha

Gallus gallus

14/07/2006

1851

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1852

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1853

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1854

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1855

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

1856

Pato domstico

Cairina moschata

14/07/2006

2308

Pato domstico

Cairina moschata

29/10/2006

2309

Pato domstico

Cairina moschata

29/10/2006

2310

Pato domstico

Cairina moschata

29/10/2006

2311

Pato domstico

Cairina moschata

29/10/2006

2312

Pato domstico

Cairina moschata

29/10/2006

2313

Pato domstico

Cairina moschata

29/10/2006

2314

Pato domstico

Cairina moschata

29/10/2006

2315

Pato domstico

Cairina moschata

29/10/2006

2316

Galinha

Gallus gallus

29/10/2006

2317

Galinha

Gallus gallus

29/10/2006

Amostra

Coleta

Local

Resultado

Ruben BarbalhoNegativo
Estr.Cach.PA
Ruben BarbalhoNegativo
Estr.Cach.PA
Ruben BarbalhoNegativo
Estr.Cach.PA
Ruben BarbalhoSuspeita de
Estr.Cach.PA
positividade
PedroEstr.S.Caet.Odivel
Negativo
as-PA
PedroEstr.S.Caet.Odivel
Negativo
as-PA
PedroEstr.S.Caet.Odivel
Negativo
as-PA
PedroEstr.S.Caet.Odivel
Negativo
as-PA
PedroEstr.S.Caet.Odivel
Negativo
as-PA
PedroEstr.S.Caet.Odivel
Negativo
as-PA
Santo AmaroNegativo
Breves-Maraj- PA
Santo AmaroNegativo
Breves-Maraj- PA
Santo AmaroNegativo
Breves-Maraj- PA
Santo AmaroNegativo
Breves-Maraj- PA
Santo AmaroNegativo
Breves-Maraj- PA
Santo AmaroNegativo
Breves-Maraj- PA
Santo AmaroNegativo
Breves-Maraj- PA
Santo AmaroNegativo
Breves-Maraj- PA
Santo AmaroNegativo
Breves-Maraj- PA
Santo AmaroNegativo
Breves-Maraj- PA
87

No da

Data da

Nome Popular

Nome Cientfico

2318

Galinha

Gallus gallus

29/10/2006

2319

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2320

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2321

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2322

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2323

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2324

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2325

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2326

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2327

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2328

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2329

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2330

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2331

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2332

Galinha

Gallus gallus

30/10/2006

2333

Galinha

Gallus gallus

30/10/2006

2334

Galinha

Gallus gallus

30/10/2006

2335

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2336

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2337

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2338

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2339

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

Amostra

Coleta

Local
Santo AmaroBreves-Maraj- PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Vila GalvoBreves-Maraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA

Resultado
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

88

No da

Data da

Nome Popular

Nome Cientfico

2340

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2341

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2342

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2343

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2344

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2345

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2346

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2347

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2348

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2349

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2350

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2351

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2352

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2353

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2354

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2355

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2356

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2357

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2358

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2359

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2360

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2361

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

Amostra

Coleta

Local
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Taua-BrevesMaraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA

Resultado
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

89

No da

Data da

Nome Popular

Nome Cientfico

2362

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2363

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2364

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2365

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2366

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2367

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2368

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2369

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2370

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2371

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2372

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2373

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2374

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2375

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2376

Pato domstico

Cairina moschata

30/10/2006

2377

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

2378

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

2379

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

2380

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

2381

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

2382

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

2383

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

Amostra

Coleta

Local
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Escola EmanuelBreves-Maraj-PA
Escola EmanuelBreves-Maraj-PA
Escola EmanuelBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA

Resultado
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

90

No da

Data da

Nome Popular

Nome Cientfico

2384

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

2385

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

2386

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

2387

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

2388

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

2389

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

2390

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

2391

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

2392

Pato domstico

Cairina moschata

31/10/2006

2393

Maarico-depapo-vermelho

Calidris canutus

02/11/2006

2394

Trinta-ris-boreal

Sterna hirundo

02/11/2006

Amostra

Coleta

2395

Trinta-ris-boreal

Sterna hirundo

02/11/2006

2396

Trinta-ris-boreal

Sterna hirundo

02/11/2006

2397

Trinta-ris-boreal

Sterna hirundo

02/11/2006

2398

Maarico-pintado

Actitis macularia

02/11/2006

2399

Maaricorasteirinho

Calidris pusilla

02/11/2006

2400

Maarico Pintado

Actitis macularia

02/11/2006

2401

Maarico-pintado

Actitis macularia

02/11/2006

2402

Maariquinho

Calidris minutilla

02/11/2006

2403

Maarico-pintado

Actitis macularia

02/11/2006

2404

Maarico-pintado

Actitis macularia

02/11/2006

Local
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Rio dos MacacosBreves-Maraj-PA
Ilha de CanelaBragana-PA
Ilha de CanelaBragana-PA
Ilha de CanelaBragana-PA
Ilha de CanelaBragana-PA
Ilha de CanelaBragana-PA
Ilha de CanelaBragana-PA
Ilha de CanelaBragana-PA
Ilha de CanelaBragana-PA
Ilha de CanelaBragana-PA
Ilha de CanelaBragana-PA
Ilha de CanelaBragana-PA
Ilha de CanelaBragana-PA

Resultado
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
(Brasil)
Positivo PCR (EUA)
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

91

No da
Amostra
2405
2406
2407
2408
2409
2410
2411
2412
2413
2414
2415
2416
2417
2418
2419
2420
2421
2422
2423
2424
2425
2426

Nome Popular
Maaricorasteirinho
Maaricorasteirinho

Nome Cientfico

Data da
Coleta

Calidris pusilla

02/11/2006

Calidris pusilla

02/11/2006

Maarico-pintado

Actitis macularia

02/11/2006

Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes

Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus

16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006

Local
Ilha de CanelaBragana-PA
Ilha de CanelaBragana-PA
Ilha de CanelaBragana-PA
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP

Resultado
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

92

No da
Amostra
2427
2428
2429
2430
2431
2432
2433
2434
2435
2436
2437
2438
2439
2440
2441
2442
2443
2444
2445
2446

Nome Popular

Nome Cientfico

Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes

Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Anodorhynchus
leari
Anodorhynchus
leari

2447

Arara-azul-de-lear

2448

Arara-azul-de-lear

Data da
Coleta
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006
16/10/2006

Local
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Aqurio de SantosSP
Zoolgico de So
Paulo
Zoolgico de So
Paulo

Resultado
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

93

No da
Amostra

Nome Popular

Nome Cientfico
Anodorhynchus
leari
Anodorhynchus
leari

Data da
Coleta

2449

Arara-azul-de-lear

2450

Arara-azul-de-lear

2510

Maarico Pintado

Actitis macularia

02/11/2006

2511

Maarico Pintado

Actitis macularia

02/11/2006

2512

Maarico Pintado

Actitis macularia

02/11/2006

2513

Maarico Pintado

Actitis macularia

02/11/2006

2514

Gaivota

Larus sp.

02/11/2006

Calidris pusilla

03/11/2006

Calidris pusilla

03/11/2006

2515
2516

Maaricorasteirinho
Maaricorasteirinho

16/10/2006
16/10/2006

2517

Maarico Pintado

Actitis macularia

03/11/2006

2518

Maarico Pintado

Actitis macularia

03/11/2006

2519

Maarico Pintado

Actitis macularia

03/11/2006

2520

Maarico Pintado

Actitis macularia

03/11/2006

2521

Maarico Pintado

Actitis macularia

03/11/2006

2522

Pato domstico

Cairina moschata

03/11/2006

2523

Pato domstico

Cairina moschata

03/11/2006

2524

Pato domstico

Cairina moschata

03/11/2006

2525

Pato domstico

Cairina moschata

03/11/2006

2526

Pato domstico

Cairina moschata

03/11/2006

2527

Pato domstico

Cairina moschata

03/11/2006

2528

Pato domstico

Cairina moschata

03/11/2006

2529

Pato domstico

Cairina moschata

03/11/2006

Local

Resultado

Zoolgico de So
Negativo
Paulo
Zoolgico de So
Negativo
Paulo
Ilha de CanelaNegativo
Bragana-PA
Ilha de CanelaNegativo
Bragana-PA
Ilha de CanelaNegativo
Bragana-PA
Ilha de CanelaNegativo
Bragana-PA
Ilha de CanelaNegativo
Bragana-PA
Praia de AjuruteuaNegativo
PA
Praia de AjuruteuaNegativo
PA
Praia de AjuruteuaNegativo
PA
Praia de AjuruteuaNegativo
PA
Praia de AjuruteuaNegativo
PA
Praia de AjuruteuaNegativo
PA
Praia de AjuruteuaNegativo
PA
Praia de AjuruteuaNegativo
PA
Praia de AjuruteuaNegativo
PA
Praia de AjuruteuaNegativo
PA
Praia de AjuruteuaNegativo
PA
Praia de AjuruteuaNegativo
PA
Praia de Ajuruteua- Suspeita de
PA
Positividade
Praia de AjuruteuaNegativo
PA
Praia de AjuruteuaNegativo
PA

94

No da
Amostra
2530

Nome Popular

Nome Cientfico

Batura-de-bando

Charadrius
semipalmatus

Data da
Coleta
03/11/2006

Local

Resultado

Praia de AjuruteuaPA

Negativo

Apndice C Tabela das amostras testadas pelo mtodo de PCR com

visualizao em gel de agarose.
No da

Data da

Nome Popular

Nome Cientfico

971

Pato domstico

Cairina moschata

25/07/2005

972

Pato domstico

Cairina moschata

25/07/2005

973

Pato domstico

Cairina moschata

25/07/2005

974

Pato domstico

Cairina moschata

25/07/2005

975

Pato domstico

Cairina moschata

25/07/2005

1031

Peru

1032

Peru

1033

Peru

1034

Peru

1035

Peru

1036

Peru

1037

Peru

1038

Peru

1039

Peru

Amostra

Meleagris
gallopavo
Meleagris
gallopavo
Meleagris
gallopavo
Meleagris
gallopavo
Meleagris
gallopavo
Meleagris
gallopavo
Meleagris
gallopavo
Meleagris
gallopavo
Meleagris
gallopavo

Coleta

25/07/2005
25/07/2005
25/07/2005
25/07/2005
25/07/2005
25/07/2005
25/07/2005
25/07/2005
25/07/2005

Local
D. Cleonice- VigiaPA
D. Cleonice- VigiaPA
D. Cleonice- VigiaPA
D. Cleonice- VigiaPA
D. Cleonice- VigiaPA
Isaura-MarabitanaPA
Isaura-MarabitanaPA
Isaura-MarabitanaPA
Isaura-MarabitanaPA
Isaura-MarabitanaPA
Isaura-MarabitanaPA
Isaura-MarabitanaPA
Isaura-MarabitanaPA
Isaura-MarabitanaPA

Resultado
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo

2393
2394
2395
2396
2397
2398
2399
95

No da

Nome Popular

Nome Cientfico

2531
2532
2533
2534

Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Pinguim-demagalhes
Galinha
Galinha
Galinha
Galinha

2535

Peru

2536

Peru

2537

Peru

Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Spheniscus
magellanicus
Gallus gallus
Gallus gallus
Gallus gallus
Gallus gallus
Meleagris
gallopavo
Meleagris
gallopavo
Meleagris
gallopavo

Amostra

Data da
Coleta

Local

Resultado

2400
2401
2402
2403
2404
2405
2406
2407
2482
2483
2484
2485
2486
2487
2488
2489
2490
2491

2538
2539
2540
2541
2542

Maaricogrande-deperna-amarela
Talha-mar
Quero-quero
Talha-mar
Talha-mar

16/11/2006
16/11/2006
16/11/2006
16/11/2006

Aqurio do
Guaruja - SP
Aqurio do
Guaruja - SP
Aqurio do
Guaruja - SP
Aqurio do
Guaruja - SP
Aqurio do
Guaruja - SP
Aqurio do
Guaruja - SP
Aqurio do
Guaruja - SP
Aqurio do
Guaruja - SP
Aqurio do
Guaruja - SP
Aqurio do
Guaruja - SP
Ararangua - SC
Ararangua - SC
Ararangua - SC
Ararangua - SC

16/11/2006

Ararangua - SC

Negativo

16/11/2006

Ararangua - SC

Negativo

16/11/2006

Ararangua - SC

Negativo

Tringa
melanoleuca

17/11/2006

Tijuca - SC

Negativo

Rynchops niger
Vanellus chilensis
Rynchops niger
Rynchops niger

17/11/2006
17/11/2006
17/11/2006
17/11/2006

Tijuca - SC
Tijuca - SC
Tijuca - SC
Tijuca - SC

Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

23/10/2006
23/10/2006
23/10/2006
23/10/2006
23/10/2006
23/10/2006
23/10/2006
23/10/2006
23/10/2006
23/10/2006

Negativo
Negativo
Positiva
Positiva
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

96

No da
Amostra

Nome Popular

2552
2553
2554
2555
2556
2557
2558
2559

Caminheirozumbidor
Ganso
Ganso
Ganso
Pato domstico
Pato domstico
Pato domstico
Galinhadangola
Galinhadangola
Galinha
Galinha
Galinha
Pato silvestre
Pato domstico
Pato domstico
Pato domstico
Pato domstico

2560

Peru

2561

Peru

2562

Peru

2563
2564
2565
2566
2567
2568
2569
2570
2571
2572
2573
2574
2575
2576
2577
2578
2579
2580

Galinha
Galinha
Galinha
Pato domstico
Pato domstico
Pato domstico
Pato domstico
Pato domstico
Ganso
Ganso
Ganso
Ganso
Ganso
Pato silvestre
Pato silvestre
Pato silvestre
-----------------

2543
2544
2545
2546
2547
2548
2549
2550
2551

Nome Cientfico

Data da
Coleta

Local

Resultado

Anthus lutescens

17/11/2006

Tijuca - SC

Negativo

----------------Cairina moschata
Cairina moschata
Cairina moschata

18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006

Tijuca - SC
Tijuca - SC
Tijuca - SC
Tijuca - SC
Tijuca - SC
Tijuca - SC

Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

Numida meleagris

18/11/2006

Tijuca - SC

Negativo

Numida meleagris

18/11/2006

Tijuca - SC

Negativo

Gallus gallus
Gallus gallus
Gallus gallus
Anas sp.
Cairina moschata
Cairina moschata
Cairina moschata
Cairina moschata
Meleagris
gallopavo
Meleagris
gallopavo
Meleagris
gallopavo
Gallus gallus
Gallus gallus
Gallus gallus
Cairina moschata
Cairina moschata
Cairina moschata
Cairina moschata
Cairina moschata
----------------------------------------Anas sp.
Anas sp.
Anas sp.
-----------------

18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006

Tijuca - SC
Tijuca - SC
Tijuca - SC
Barra Velha - SC
Barra Velha - SC
Barra Velha - SC
Barra Velha - SC
Barra Velha - SC

Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

18/11/2006

Barra Velha - SC

Negativo

18/11/2006

Barra Velha - SC

Negativo

18/11/2006

Barra Velha - SC

Negativo

18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006
18/11/2006

Barra Velha - SC
Barra Velha - SC
Barra Velha - SC
Barra Velha - SC
Barra Velha - SC
Barra Velha - SC
Barra Velha - SC
Barra Velha - SC
Navegantes - SC
Navegantes - SC
Navegantes - SC
Navegantes - SC
Navegantes - SC
Navegantes - SC
Navegantes - SC
Navegantes - SC
Navegantes - SC
Navegantes - SC

Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
97

No da
Amostra
2579 repetido
2580 repetido

Nome Popular
Irer
Paturi-preta

2581

Paturi-preta

2582

Irer

2583

Marrecacabloca

2584

Irer

2585

Irer

2586

Irer

2587
2588

Marrecacabloca
Frango-daguacomum

2589

P-vermelho

2590

P-vermelho

2591

Irer

2592
2593

Marrecatoicinho
Marrecacabloca

2594

Irer

2595

Marrecatoicinho

2596

Irer

2597

Irer

2598
2599
2600

Frango-daguacomum
Marrecatoicinho
Marrecacabloca

Nome Cientfico
Dendrocygna
viduata
Netta
Erythrophthalma
Netta
Erythrophthalma
Dendrocygna
viduata
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
viduata
Dendrocygna
viduata
Dendrocygna
viduata
Dendrocygna
autumnalis
Gallinula
chloropus
Amazonetta
brasiliensis
Amazonetta
brasiliensis
Dendrocygna
viduata
Anas bahamensis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
viduata
Anas bahamensis
Dendrocygna
viduata
Dendrocygna
viduata
Gallinula
chloropus

Data da

Local

Resultado

10/04/2007

So Bento - MA

Negativo

10/04/2007

So Bento - MA

Negativo

10/04/2007

So Bento - MA

Negativo

10/04/2007

So Bento - MA

Negativo

10/04/2007

So Bento - MA

Negativo

10/04/2007

So Bento - MA

Negativo

10/04/2007

So Bento - MA

Negativo

10/04/2007

So Bento - MA

Negativo

10/04/2007

So Bento - MA

Negativo

10/04/2007

So Bento - MA

Negativo

Coleta

11/04/2007
11/04/2007
11/04/2007
11/04/2007
11/04/2007
11/04/2007
11/04/2007
11/04/2007
11/04/2007
11/04/2007

Anas bahamensis

11/04/2007

Dendrocygna
autumnalis

11/04/2007

So Bento - casa do
Padeiro-MA
So Bento - casa do
Padeiro-MA
So Bento - casa do
Padeiro-MA
So Bento - casa do
Padeiro-MA
So Bento - casa do
Padeiro-MA
So Bento - casa do
Padeiro-MA
So Bento - casa do
Padeiro-MA
So Bento - casa do
Padeiro-MA
So Bento - casa do
Padeiro-MA
So Bento - casa do
Padeiro-MA
So Bento - casa do
Padeiro-MA
So Bento - casa do
Padeiro-MA

Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

98

No da
Amostra

Nome Popular

2601

P-vermelho

2602

P-vermelho

2603
2604
2605
2606
2607

Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca

Nome Cientfico
Amazonetta
brasiliensis
Amazonetta
brasiliensis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Meleagris
gallopavo

Data da
Coleta
11/04/2007
11/04/2007
11/04/2007
11/04/2007
11/04/2007
11/04/2007
11/04/2007

2608

Peru

2609

Marrecacabloca

Dendrocygna
autumnalis

11/04/2007

2610

Marrecacabloca

Dendrocygna
autumnalis

11/04/2007

2611

Marrecacabloca

Dendrocygna
autumnalis

11/04/2007

2612

Irer

Dendrocygna
viduata

11/04/2007

2613

Irer

Dendrocygna
viduata

11/04/2007

2614

Marrecacabloca

Dendrocygna
autumnalis

11/04/2007

2615

Irer

Dendrocygna
viduata

11/04/2007

2616

Marrecacabloca

Dendrocygna
autumnalis

11/04/2007

Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca

Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis

2617
2618
2619

11/04/2007

12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007

Local
So Bento - casa do
Padeiro-MA
So Bento - casa do
Padeiro-MA
So Bento - casa do
Padeiro-MA
So Bento - casa do
Padeiro-MA
So Bento-irmo
do Ademar-MA
So Bento-irmo
do Ademar-MA
So Bento-irmo
do Ademar-MA
So Bento-irmo
do Ademar-MA
So Bentosecretrio da
Agricultura-MA
So Bentosecretrio da
Agricultura-MA
So Bentosecretrio da
Agricultura-MA
So Bentosecretrio da
Agricultura-MA
So Bentosecretrio da
Agricultura-MA
So Bentosecretrio da
Agricultura-MA
So Bentosecretrio da
Agricultura-MA
So Bentosecretrio da
Agricultura-MA
Bacurituba-(Seu
Maruim)-MA
Bacurituba-(Seu
Maruim)-MA
Bacurituba-(Seu
Maruim)-MA

Resultado
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
99

No da

Data da

Nome Popular

Nome Cientfico

2620

Irer

Dendrocygna
viduata

12/04/2007

2621

Irer

Dendrocygna
viduata

12/04/2007

2622

Irer

Dendrocygna
viduata

12/04/2007

Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca

Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis

Amostra

2623
2624
2625
2626
2627
2628
2629
2630
2631
2632
2633
2634
2635
2636
2637
2638
2639
2640

Coleta

12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007

Local
Bacurituba(vizinha do
Maruim)-MA
Bacurituba(vizinha do
Maruim)-MA
Bacurituba(vizinha do
Maruim)-MA
So Bento- centroMA
So Bento- centroMA
So Bento- centroMA
So Bento- centroMA
So Bento- centroMA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA

Resultado

Negativo

Negativo

Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

100

No da
Amostra
2641
2642
2643
2644
2645
2646
2647

Nome Popular

Nome Cientfico

Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca
Marrecacabloca

Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
viduata
Dendrocygna
viduata
Dendrocygna
viduata
Dendrocygna
autumnalis
Dendrocygna
autumnalis
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2648

Irer

2649

Irer

2650

Irer

2651
2652
2653
2654
2655
2656
2657
2658
2659
2660
2661
2662
2663
2664
2665
2666
2667
2668
2669
2670
2671
2672
2673

Marrecacabloca
Marrecacabloca
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico

Data da
Coleta
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
12/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007

Local

Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Cajapi-MA
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE

Resultado
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
101

No da
Amostra
2674
2675
2676
2677
2678
2679

Nome Popular

Nome Cientfico

Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico
Maarico

-------------------------------------------------

Data da
Coleta
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007
19/04/2007

Local

Resultado

Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE
Recife - PE

Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo

102