UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS

EFECTO DEL ÁCIDO CLOROGÉNICO SOBRE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS

ANTIOXIDANTES EN ENTEROCITOS DE RATA

POR
JONATHAN ALONSO TREJO VILLALOBOS

TESIS

LICENCIATURA EN QUIMICA

CD. JUÁREZ, CHIHUHUA, MÉXICO DICIEMBRE, 2009

 EFECTO DEL ÁCIDO CLOROGÉNICO SOBRE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS
ANTIOXIDANTES EN ENTEROCITOS DE RATA

POR

JONATHAN ALONSO TREJO VILLALOBOS

TESIS

_____________________________________________________
DRA. LAURA ALEJANDRA ARDILLA DE LA ROSA CARRILLO
DIRECTOR DE INVESTIGACIÓN

_____________________________________________________
DR. EMILIO ALVAREZ PARRILLA
DIRECTOR DE INVESTIGACIÓN

_____________________________________________________
M. en C. KATYA AIMEE CARRASCO URRUTIA
COORDINADOR DEL PROGRAMA

_____________________________________________________
DR. ALEJANDRO MARTINEZ MARTINEZ
JEFE DEL DEPARTAMENTO

_____________________________________________________
M.C. HUGO SALVADOR STAINES OROZCO
DIRECTOR DEL INSTITUTO

FECHA:___ DICIEMBRE 2009______

ii
A todos aquellos sin nombre ni pronombre,
a la temporalidad inexistente que está entre nosotros
y a los seres libres presos de la soledad.

A los muertos que siguen vivos,

con la esperanza que un día
hayan vivido sin estar muertos.

A la palabra que trastoca y al silencio que sana…

Por un Universo en equilibrio,

por que el humano respete y honre:
la naturaleza de su divinidad,
la divina naturalidad,
la naturaleza divina,
la divinidad de su naturaleza,
la naturalidad de su divinidad…

A los locos incomprendidos,

a los soñadores,
a los sonrientes,
a los que creen…
a los que se atreven a sentir.

A Morfeo, padre de todos los posibles imposibles, guía de sabiduría, almacén de respuestas,
consejos, avisos, visiones, periplos, descansos y desvaríos…

A Lucio, Ramona y Socorrito…

iii
iv
 AGRADECIMIENTOS

Carmen y Saúl (mis padres), ETERNAMENTE agradecido.

A los directores de esta tesis por creer en mis capacidades a pesar de todo.

A todos los que con su presencia y ausencia, palabra, obra y omisión,

han estado a lo largo de este recorrido.

MIYOTU… gracias!

v
 TABLA DE CONTENIDO

AGRADECIMIENTOS.............................................................................................................................v
TABLA DE CONTENIDO ....................................................................................................................... vi
ÍNDICE DE FIGURAS.......................................................................................................................... viii
INDICE DE TABLAS .............................................................................................................................. ix
INTRODUCCIÓN................................................................................................................................... 1
CAPÍTULO 1 ......................................................................................................................................... 3
1.1 Antecedentes ............................................................................................................................... 3
1.1.1 Estrés oxidativo ..................................................................................................................... 3
1.1.2 Especies reactivas de oxigeno (ROS).................................................................................... 3
1.1.3 Antioxidantes ......................................................................................................................... 5
1.1.4 Enzimas antioxidantes ........................................................................................................... 8
1.1.5 Polifenoles ........................................................................................................................... 18
1.2 Hipótesis. ................................................................................................................................... 27
1.3 Objetivo ...................................................................................................................................... 28
CAPITULO 2 ....................................................................................................................................... 29
2.1 Reactivos y materiales ............................................................................................................... 29
2.1.1 Buffer o solución reguladora de Krebs ................................................................................. 29
2.1.2 Buffer o solución reguladora de fosfatos ............................................................................. 29
2.1.3 PBS 1X ................................................................................................................................ 30
2.1.4 Pirogalol .............................................................................................................................. 30
2.1.5 Peróxido de hidrógeno ......................................................................................................... 30
2.1.6 Tioéter glutatión dinitrobenceno ........................................................................................... 30
2.1.7 Ratas ................................................................................................................................... 30
2.2 Obtención del intestino ............................................................................................................... 30
2.3 Diseño del experimento.............................................................................................................. 31
2.4 Extracto proteico ........................................................................................................................ 31
2.5 Cuantificación de proteína total .................................................................................................. 32
2.6 Cuantificación de actividad enzimática ....................................................................................... 34
2.6.1 Catalasa .............................................................................................................................. 34
2.6.2 Superóxido dismutasa (SOD) .............................................................................................. 35

vi
 2.6.3 Glutatión tio-tranferasa (GST) .............................................................................................. 36
2.6.4 Análisis estadístico .............................................................................................................. 38
CAPÍTULO 3 ....................................................................................................................................... 39
3.1 Resultados ................................................................................................................................. 39
3.1.1 Proteína total ....................................................................................................................... 39
3.1.2 Actividades enzimáticas....................................................................................................... 40
3.2 Discusión y Conclusión .............................................................................................................. 42
3.3 Recomendaciones ..................................................................................................................... 44
Referencias bibliográficas. ................................................................................................................... 46

vii
ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estructura química de los polifenoles. Los polifenoles se dividen en flavonoides y no

flavonoides (Manach, Sacalbert et al.2004). ............................................................................19

Figura 2. Estructura química del ácido caféico. El 3,4 ácido dihidroxicinámico, mejor conocido

como ácido caféico ...................................................................................................................24

Figura 3. Estructura química del ácido clorogénico. Es el éster del ácido caféico con ácido

quínico ......................................................................................................................................25

Figura 4. Cuantificación GST. Reacción en la que se fundamenta la técnica para la

cuantificación de GST ..............................................................................................................37

Figura 5. Gráfico de calibración. A partir de esta recta se determinó la concentración de

proteína de cada muestra analizada. .......................................................................................39

Figura 6. Actividad enzimática relativa. La actividad de cada enzima está representada en

porcentaje ± el coeficiente de variación. Con referencia a las muestras control se observa que

la actividad de GST y SOD aumentó en presencia del ácido clorogénico en contraste con la

catalasa, la cual disminuyó su actividad. ..................................................................................42

viii
INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Sistema de defensa in vivo contra el daño oxidativo (Noguchi y Niki 1999).................7

Tabla 2. Concentración de proteína total. La columna control muestra las concentraciones de

las muestras que no llevaron el tratamiento con ácido clorogénico; la columna CGA, de las

que fueron tratadas con ácido clorogénico. La concentración se expresa en mg/mL. .............40

Tabla 3. Actividades enzimáticas. Las actividades enzimáticas se presentan en Unidades de

enzima por miligramo de proteína ± el error estándar, en tanto que los valores relativos

reportan porcentaje de actividad enzimática ± coeficiente de variabilidad. La columna de ácido

clorogénico indica que son los valores obtenidos de las muestras tratadas con ácido

clorogénico. La columna control representa los valores obtenidos de las muestras en ausencia

de acido clorogénico .................................................................................................................41

ix
 INTRODUCCIÓN

En el presente trabajo se estudiará el efecto de la absorción del ácido clorogénico en el

intestino de rata sobre las enzimas superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y

glutatión tio-transferasa (GST). Por lo tanto se habla de compuestos fenólicos, especies

reactivas de oxígeno, radicales libres y la absorción de polifenoles en el intestino de la

rata.

El ácido clorogénico es uno de los polifenoles más abundantes en la dieta humana, es

por ello la importancia de conocer el efecto que este compuesto pueda ejercer sobre las

enzimas SOD, CAT y GST.

Conocer si la actividad de estas enzimas es modificada o no, es fundamental para abrir

paso porque se puede relacionar el efecto del consumo de café o cualquier alimento

rico en polifenoles, con el desencadenamiento de las reacciones de los antioxidantes

endógenos, evityo así el daño causado por el estrés oxidativo.

El estrés oxidativo inducido por las especies reactivas de oxígeno producidas por

acción metabólica normal, además de varios factores como el hábito de fumar, el

exceso o falta de ejercicio y una mala alimentación, contribuyen de manera importante

al desarrollo de enfermedades crónicas como el cáncer, diabetes, enfermedades

cardiovasculares, así como las crónico degenerativas (Rao y Rao 2007).

El cuerpo humano utiliza varios antioxidantes para defenderse del ataque de los

radicales libres, muchos de los cuales obtiene de la dieta. Una alimentación basada en

el consumo de antioxidantes juega un importante papel en el mantenimiento de la salud

1
porque los antioxidantes endógenos no proveen suficiente protección contra las

especies reactivas de oxígeno (Benzie 2003) .

Los radicales libres son neutralizados por acción enzimática y no enzimática. La acción

enzimática es ejercida por enzimas como superóxido dismutasa, catalasa, GST, entre

otras. En cambio la neutralización no enzimática la realizan numerosos antioxidantes

como las vitaminas A, C y E, glutatión, compuestos fenólicos, etcétera (Urso y Clarkson

2003).

Sin embargo el mecanismo de acción de los antioxidantes no se ha descrito

claramente y el propósito de este trabajo es el de averiguar si el ácido clorogénico

influye en la actividad antioxidante de las enzimas superóxido dismutasa, catalasa y

glutatión tio-transferasa (Manach, Sacalbert et al. 2004).

2
 CAPÍTULO 1

1.1 Antecedentes

1.1.1 Estrés oxidativo

El estrés oxidativo se define como el desequilibrio que ocurre entre el sistema de

antioxidantes y los radicales libres y/o las especies oxidantes, favoreciendo a estos

últimos (Bonnefoy, Drai et al. 2002; Mayne 2003; Barbosa, Bressan et al. 2008). La

generación de radicales libres, así como de especies reactivas de oxígeno en grandes

cantidades e incluso una baja velocidad de neutralización de los mismos, propicia la

oxidación de biomoléculas como lípidos, proteínas y ADN, lo cual trae como

consecuencia el daño oxidativo a células y tejidos (Jacob y Burri 1996; Bonnefoy, Drai

et al. 2002; Barbosa, Bressan et al. 2008).

Se ha sugerido que el estrés oxidativo, que conlleva a la oxidación a biomoléculas,

contribuye etiológicamente al desarrollo de diversas enfermedades crónicas como lo

son el cáncer, enfermedades cardiovasculares, cataratas, diabetes, obesidad,

aterogénesis, trastornos neurodegenerativos, entre otras enfermedades relacionadas a

la edad (Mayne 2003; Barbosa, Bressan et al. 2008).

1.1.2 Especies reactivas de oxigeno (ROS)

La transferencia de electrones es uno de los procesos fundamentales en la química, el

paso de un electrón o un par de ellos de un donante a un receptor resulta en el cambio

de las propiedades para ambas partes de la reacción (Larson 1997).

3
La oxidación se definió inicialmente como la incorporación de un oxígeno a una

sustancia, sin embargo esta definición es obsoleta, ya que se sabe que una oxidación

es la conversión de una sustancia química a una con menos electrones. Entonces, la

oxidación es la pérdida de uno o más electrones, estos electrones perdidos son

ganados por otra especie química, la cual se reduce (Larson 1997).

Los radicales libres son especies químicas con electrones desapareados y ejemplos de

ello son: el anión superóxido (O2●-), el radical nitrilo (NO●) y el radical hidroxilo (OH●); así

como las especies derivadas del oxigeno como el peróxido de hidrogeno (H 2O2) y el

hipoclorito ácido (HClO), las cuales se encuentran en el cuerpo humano por ser

productos del metabolismo común (Jacob y Burri 1996; Noguchi y Niki 1999). En las

moléculas, los electrones generalmente están presentes en pares; bajo ciertas

condiciones, estas moléculas llegan a tener desapareados los electrones,

convirtiéndose en radicales libres (Noguchi y Niki 1999). Los radicales libres están en

constante búsqueda de electrones para aparearse con ellos y así estabilizar la

molécula, no obstante al aparearse estos radicales libres condicionalmente desaparean

a los electrones de la molécula de la cual tomaron el electrón para estabilizarse

(Noguchi y Niki 1999).

Los radicales libres así como las especies reactivas de oxígeno son parte integral de

nuestro metabolismo, de hecho estas moléculas son producidas naturalmente ya que

sirven para importantes funciones biológicas (Noguchi y Niki 1999).

Los fagocitos activados utilizan a las especies reactivas de oxigeno para matar algunas

bacterias y hongos invasores; el superóxido sirve en la regulación del crecimiento

celular y la señalización intracelular (Papas 1999). A pesar de sus beneficios, las

4
especies reactivas de oxígeno y los radicales libres, al ser producidos en exceso o en

momentos que no son requeridos por el organismo, es cuyo el daño celular por

oxidación se hace presente, ya que los radicales libres y las especies reactivas de

oxígeno son moléculas extremadamente reactivas y atacan al instante a las moléculas

que se encuentran más próximas a ellas, provocando así el inicio de una serie de

eventos desfavorables para la célula, mediante una cadena de reacciones como lo es la

peroxidación de lípidos, así también se presenta el daño a ADN y otras biomoléculas

como proteínas y carbohidratos (Papas 1999).

Para prevenir el daño causado por estas especies químicas, el organismo (humano,

entre otros), ha desarrollado un complejo y potente sistema de defensa como lo son los

antioxidantes (Papas 1999).

1.1.3 Antioxidantes

Existen varios tipos de antioxidantes con diferentes funciones que desempeñan un

papel muy importante en la defensa contra la oxidación (Noguchi y Niki 1999). Los

organismos aerobios se protegen del estrés oxidante y de las especies reactivas de

oxigeno (ROS, por sus siglas en ingles) con los antioxidantes (Noguchi y Niki 1999).

En la primera línea de defensa se encuentran los antioxidantes preventivos, los cuales

impiden la formación de radicales libres y especies reactivas de oxigeno (Noguchi y Niki

1999). Los responsables de la siguiente línea defensiva son los antioxidantes de barrido

o rescate, cuya función consiste en inhibir la iniciación de la cadena de propagación o

en su caso frenarla (Noguchi y Niki 1999). La responsabilidad de la tercera y última

línea de defensa se encuentra en las enzimas antioxidantes como las fosfolipasas,

5
proteasas, reparadoras de ADN y transferasas (Noguchi y Niki 1999). Una

especialización de este mecanismo de defensa es la adaptación de poder generar y

transferir los antioxidantes adecuados, al lugar indicado, en la concentración necesaria

y en el momento preciso (Noguchi y Niki 1999). En la Tabla 1 se muestran de manera

más detallada el sistema defensivo celular contra el daño oxidativo.

6
Tabla 1.- Sistema de defensa in vivo contra el daño oxidativo (Noguchi y Niki 1999).

1. Antioxidantes preventivos. Supresión de la formación de radicales libres

a) Descomposición de hidroperóxidos y peróxidos de hidrogeno

Catalasa Descomposición de peróxido de hidrogeno

2H2O2  2H2O + O2
Glutatión peroxidasa Descomposición de peróxido de hidrogeno e hidroperóxidos
(celular) de ácidos grasos libres
H2O2 + 2GSH  H2O + GSSG
LOOH + 2GSH  LOH + H2O + GSSG
Glutatión peroxidasa Descomposición de peróxido de hidrogeno y fosfolípidos
(plasma) Hidroperoxidados
PLOOH + 2GSH  PLOH + H2O + GSSG
Peroxidasa Descomposición del peróxido de hidrogeno y lípidos
hidroperoxidados
LOOH + AH2  LOH + H2O + 2
H2O2 + AH2  2H2O + A
Glutatión tio-transferasa Descomposición de lípidos hidroperoxidados

b) Secuestro de metales por quelación

Transferrina, lactoferrina Secuestro de hierro (fierro)

Haptoglobina Secuestro de hemoglobina
Hemopexina Estabilización del grupo hemo
Ceruloplasmina, albumina Secuestro de cobre

c) Amortiguamiento de especies reactivas de oxigeno

Superóxido dismutasa Desproporción molecular de superóxido
(SOD)
•- +
2O2 + 2H  H2O2 + O2
Carotenoides, vitamina E Amortiguamiento de oxigeno singulete

2. Antioxidantes de rescate de radical: radicales que actúan por inhibición del inicio y
rompimiento de la cadena de propagación
Hidrofílicos Vitamina C, ácido úrico, bilirrubina, albumina
Lipofílicos Vitamina E, ubiquimol, carotenoides, flavonoides

3. Enzimas de reparación: reparación del daño y reconstitución de membranas

Lipasa, proteasa, enzimas reparadoras de ADN, transferasa

4. Adaptación: generación de las enzimas antioxidantes y las transfieren al sitio adecuado en

el momento indicado a la concentración necesaria.

7
1.1.4 Enzimas antioxidantes

Los radicales libres liberados por los seres vivos que emplean el oxígeno para la

obtención de energía no serian compatibles con la vida de no existir los mecanismos

celulares de defensa que trabajen en su neutralización (Zorrilla 2002). Este sistema de

defensa son los antioxidantes, mismos que son clasificados en endógenos y exógenos

(Zorrilla 2002).

Los antioxidantes endógenos son las enzimas encargadas de neutralizar los radicales

libres y las fundamentales son: catalasa, superóxido dismutasa (SOD), glutatión

peroxidasa (GPX) y glutatión reductasa (GR) (Zorrilla 2002; Gałecka, Jacewicz et al.

2008; Ugartondo 2009).

Los antioxidantes enzimáticos o endógenos son la primer línea defensiva antioxidante

que actúa contra el daño oxidativo por medio de la interacción de las ROS; actúan

como catalizadores y para ejercer su desempeño no son necesarias grandes

cantidades, además de ser reciclados con gran eficiencia luego de haber desempeñado

su función (Ugartondo 2009).

1.1.4.1 Superóxido dismutasa (SOD)

La familia de las enzimas superóxido dismutasas son un grupo de metaloenzimas que

con frecuencia se presentan en organismos aerobios, aerotolerantes y algunos

anaerobios obligados (García, Onel et al. 1995). Estas metaloenzimas han sido

clasificadas en cuatro grupos con base al metal que actúa como cofactor, teniendo así:

MnSOD, FeSOD, CuZnSOD y NiSOD (Díaz 2006), esta última, Lynch y Kiramitsu la

describieron recientemente en su trabajo titulado “Expression y role of superoxide

8
dismutases (SOD) in pathogenic bacteria” en el año 2000 (Díaz 2006). Entre los cuatro

grupos no existe homología de secuencias ni de estructuras en lo que a orden superior

se refiere, lo cual denota una evolución independiente en respuesta a la amenaza del

oxígeno con su toxicidad (García, Onel et al. 1995). Estos grupos de enzimas son

esenciales para afrontar el daño causado por la producción de metabolitos parcialmente

reducidos, mismos que son generados por la acción metabólica regular del organismo

al momento de reducir el oxigeno molecular (García, Onel et al. 1995; Díaz 2006).

En organismos eucariontes existen tres tipos de SOD localizados en diferentes regiones

celulares que trabajan conjuntamente para controlar los niveles de concentración del

radical peróxido (O2.-), estos tres tipos de SOD son: Mn-SOD ubicado en la mitocondria;

CuZn-SOD, en el citosol y CuZn-SOD, en la zona extracelular (García, Onel et al.

1995). Estas enzimas se encargan de catalizar la conversión del radical anión

superóxido (O2.-) en peróxido de hidrógeno (H2O2) y oxígeno molecular (O2), siendo

esta una de las reacciones catalizada por enzimas (Ecuación 1) más rápidas de las que

se conocen (García, Onel et al. 1995; Díaz 2006). Cabe mencionar que el peróxido de

hidrógeno producido por la SOD es eliminado por la catalasa y glutatión peroxidasa

(García, Onel et al. 1995). La velocidad de asociación del anión superóxido se ve

favorecida por el campo eléctrico de la SOD favoreciéndola 30 veces (García, Onel et

al. 1995).

O2.- + O2 - 2H+  H2O2 + O2 Ecuación 1.

La reacción depende de la difusión del anión superóxido y en la normalidad sus

concentraciones son bajas, empero, el acoplamiento de la enzima con el sustrato no es

9
sólo cuestión de difusión y colisión (García, Onel et al. 1995). Los factores que pueden

afectar la difusión del anión superóxido, así como la asociación con la enzima resultan

ser la estructura submolecular de la enzima, la distribución de carga electrostática,

interacciones de apantallamiento por disolventes inter e intramoleculares, y las

interacciones hidrodinámicas (García, Onel et al. 1995).

La función fundamental de la SOD consiste en eliminar el radical superóxido antes de

que éste pueda reaccionar con moléculas biológicas susceptibles o produzca otros

agentes tóxicos (García, Onel et al. 1995). La actividad de la SOD esta acoplada al

ciclo de oxido reducción al reducir el glutatión, que es una molécula que aporta

radicales sulfhidrilo (-SH), esta acción la hace merecedora del título de agente reductor

más efectivo que el organismo almacena (García, Orts et al. 2003).

La SOD fue descubierta por McCord y Fridovich en 1968 (Díaz, 2006 - difiere en la

fecha del descubrimiento, ella acota que fue en 1972); fue la primera enzima de la que

se tuvo conocimiento que ejercía acción sobre un radical libre, lo cual constituyó una

evidencia de que los radicales están presentes en los organismos vivos. Este

descubrimiento puso sobre la mesa de discusión la paradoja del oxígeno (García, Onel

et al. 1995; Díaz 2006; Gałecka, Jacewicz et al. 2008),

En el cromosoma 21 se encuentra el gen codificante de la SOD citosólica (CuZn-SOD)

y específicamente es en el segmento extra (21q22.11), el mismo cromosoma donde se

presenta el síndrome de Down, de ahí que los niveles de SOD se encuentren elevados

en la generalidad de estos casos (García, Onel et al. 1995; Ferreira 2000).

10
Las diferencias estructurales de la CuZn-SOD humana son mínimas al comparar su

secuencia aminoacídica, comportamiento electroforético y espectrofotométrico con

respecto a la SOD bovina. Las dos actúan por igual, lo que hace posible que en

estudios experimentales, puedan emplearse indistintamente (García, Onel et al. 1995).

La forma nativa de la SOD citosólica se constituye por dos subunidades idénticas

unidas por puentes disulfuro, cada subunidad cuenta con un peso aproximado de

16KDa y 152 aminoácidos. El peso molecular que se reporta de la unidad dimérica es

31.2KDa (García, Onel et al. 1995). La característica aminoacídica es que un sexto del

total de aminoácidos de cada subunidad está constituido por veinticinco residuos de

glicina distribuidos uniformemente a lo largo de la secuencia, lo que provoca que la hoja

 destaque en la estructura secundaria; así mismo, son característicos los cuantiosos

cambios direccionales del esqueleto peptídico, la presencia de ocho residuos

aromáticos de fenilalanina, solo dos residuos de tirosina y la falta de triptófano (García,

Onel et al. 1995). En la estructura de cada subunidad se encuentra un átomo de cobre

(Cu+2) y uno de zinc (Zn+2), el primero es vital para la acción catalítica y el segundo

desempeña un rol estructural, ambos situados entre dos asas de cadena polipeptídica

al extremo de un largo canal, de manera que el cobre queda expuesto parcialmente

hacia el disolvente (García, Onel et al. 1995). En el sitio activo se localizan cuatro

residuos de histidina, los cuales, mediante los nitrógenos imidazólicos se coordinan con

el ion cúprico y una molécula de agua. Esta coordinación alcanza al Zn +2 ya que uno de

los imidazoles que se encuentra unido al Cu+2 está desprotonado, provocando una

coordinación con el ion zinc; esto permite que sea utilizado como puente entre los iones

mencionados (García, Onel et al. 1995). Además, el Zn+2 se coordina con otros dos

11
imidazoles de residuos de histidina y a un residuo de ácido aspártico mediante el grupo

el carboxílico (García, Onel et al. 1995). La pérdida de todos o algunos de estos

metales, trae como consecuencia la disminución o ausencia de la actividad enzimática,

lo cual es un factor a considerar al momento de purificar la enzima (García, Onel et al.

1995).

1.1.4.2 Catalasa (CAT)

En la naturaleza, el grupo de las catalasas es uno de los más abundantes ya que están

presentes en todas las células eucariotas y procariotas que cuenten con un sistema de

citocromos (Martínez 2005). En el organismo humano, la catalasa se encuentra

distribuida ampliamente (Céspedes, Hernández et al. 1996). La actividad de la catalasa

varía en función del tejido, así tenemos que en hígado y riñones su actividad es más

elevada; más baja, en tejido conectivo y epitelios; nula, prácticamente en tejido nervioso

(Céspedes, Hernández et al. 1996). A nivel celular, la catalasa se halla en las

mitocondrias, peroxisomas y retículo endoplasmático; en el citoplasma, en células del

hígado, riñón, de la sangre y medula ósea (Céspedes, Hernández et al. 1996; Gałecka,

Jacewicz et al. 2008).

La catalasa es una metaloproteína homotetramérica constituida por cuatro

subunidades, cada una con un grupo prostético de proporfirina IX, las cuales se unen

por interacciones no covalentes; el peso molecular de este homotetrámero

metaloprotéico oscila entre los 210 y 350 kD, de los cuales el contenido protohémico

representa 1.1% y el de hierro 0.09% (Céspedes, Hernández et al. 1996; Gałecka,

Jacewicz et al. 2008).

12
Un importante rol que desempeña la catalasa al momento de que el organismo

presenta estrés oxidativo, es ser reservorio de nicotinamín adenín dinucleótido

fosfatado en su forma reducida (NADPH) (Céspedes, Hernández et al. 1996; Gałecka,

Jacewicz et al. 2008). Algunas especies de catalasa tienen ligada 1 molécula de

NADPH en cada subunidad, lo cual da 4 moléculas por homotetrámero metaloprotéico,

las cuales están ligadas estrechamente a la enzima (Céspedes, Hernández et al. 1996;

Gałecka, Jacewicz et al. 2008). Sin embargo, el NADPH no está involucrado en la

actividad catalítica o peroxidativa propia de la enzima, pero si puede intervenir en la

reversión parcial de la inactivación de la catalasa por su propio sustrato tóxico e incluso

prevenirla, además de estabilizar a la enzima por su efecto alostérico (Céspedes,

Hernández et al. 1996).

Una de las características de la catalasa es su gran capacidad de reacción, dentro de la

catalasa se descomponen 6 millones de moléculas de H 2O2 en un minuto, y su relativa

baja afinidad por el sustrato (Céspedes, Hernández et al. 1996; Gałecka, Jacewicz et al.

2008). La función de la catalasa como parte del sistema de defensa antioxidante

consiste en catalizar la descomposición del peróxido de hidrógeno, que se genera

durante el metabolismo celular, en oxígeno molecular y agua (Céspedes, Hernández et

al. 1996; Gałecka, Jacewicz et al. 2008). Su actividad tiene dos funciones, una catalítica

y otra peroxidativa, que se representan en la Ecuación 2 (Céspedes, Hernández et al.

1996).

H2O2 + H2R  2H2O + R Ecuación 2

13
En la Ecuación 2 se puede observar la reducción del sustrato por los átomos de

hidrógeno que aporta el donador (H2R) y como resultado de la reacción el sustrato

queda reducido y el donador oxidado (Céspedes, Hernández et al. 1996). El donador

(R) en la función de catálisis es otra molécula de peróxido de hidrógeno Ecuación 3) y

sólo es llevada a cabo por la enzima cuyo se encuentra en su forma tetramérica

(Céspedes, Hernández et al. 1996).

H2O2 + H2O2  2H2O + +O2 Ecuación 3

En cambio, en la función peroxidativa el donador de hidrógeno puede ser: metanol,

etanol, ácido fórmico, fenol y formaldehido; esta reacción la enzima la puede llevar a

cabo con monómeros, dímeros y tetrámeros (Céspedes, Hernández et al. 1996).

Si bien el mecanismo completo de la catalasa no es conocido, se sabe que la reacción

química se produce en dos etapas:

La primera etapa es la reducción del peróxido de hidrógeno en agua, donde participan

los iones de fierro (Fe III) del grupo hemo y como resultado de esta reacción aparece el

compuesto Fe(V)-Ez (Ecuación 4) (Gałecka, Jacewicz et al. 2008). La segunda etapa es

la reacción de oxidación del Fe(V)-Ez por otra molécula de peróxido de hidrógeno

(Ecuación 5) (Gałecka, Jacewicz et al. 2008).

H2O2 + Fe(III)-Ez  2H2O + O=Fe(V)-Ez Ecuación 4

H2O2 + O=Fe(IV)-Ez  H2O + Fe(III)-Ez + O2 Ecuación 5

En ambas ecuaciones el Fe(x)-Ez representa al núcleo de fierro del grupo hemo que

está unido a la enzima actuyo como cofactor.

14
La actividad de la catalasa puede ser inhibida por: cianuro, azida, sulfurola

hidroxilamina, paracetamol, bleomicina, adriamicina, benzidina y paraquat (Céspedes,

Hernández et al. 1996).

1.1.4.3 Glutatión S-Transferasa (GST)

Las Glutatión S-transferasa, son una de las principales familias de enzimas

destoxificantes que se ven involucradas en el metabolismo de diversos xenobióticos,

compuestos tóxicos electrofílicos y propios del organismo catalizyo la conjugación del -

glutamil-L-cisteinil-glicina (GSH), mejor conocido como glutatión, en productos no

tóxicos de fácil eliminación (Fritz-Wolf, Becker et al. 2003; Castillo, Contreras et al.

2007; Zapata 2007).

El Glutatión es un tripéptido antioxidante soluble en agua que está compuesto de

glicina, ácido glutámico y moléculas de cisteína; es sintetizado de novo en células de

mamíferos. La particularidad de este péptido es que el enlace peptídico que se

encuentra entre los residuos de glutamato y el residuo de cisteína, es formado con el

grupo G-carboxilato en contraste con la mayoría que se forma con el grupo a-

carboxilato.

Se sabe que el GSH actúa como agente reductor no específico, con el fin de mantener

la forma reducida del tiol en las proteínas, de tal manera que se impida la oxidación en

los residuos de cisteína y el entrecruzamiento entre sí para formar puentes disulfuro. La

conjugación del glutatión es considerado un mecanismo de protección innato, mismo

que fue desarrollado para proteger al organismo de compuestos dañinos en potencia.

Existen dos tipos de reacción de la conjugación con glutatión:

15
 1. Reacción de desplazamiento.- en esta reacción el glutatión desplaza a un grupo

de electrones como halógenos, nitrilos y ácidos carboxílicos.

2. Reacción de adición: el glutatión es adicionado para activar estructuras de doble

enlace o sistemas cíclicos, por ejemplo la adición nucleofílica.

La reacción general de la GST que proporciona protección mediante la conjugación del

glutatión (RX + GSH –GST HX + GSR Ecuación 6) radica en el ataque nucleofílico por

parte del glutatión hacia el sustrato electrofílico mediante el poder de catálisis de la

GST, esto produce un enlace tioéter entre la cisteína del glutatión y el compuesto

electrofílico. El resultado, una molécula con mayor solubilidad en el agua para su

eliminación y así disminuir la reactividad. En algunos casos el resultado es inverso, el

glutatión termina por activar compuestos reactivos como haloalcanos y haloalquenos.

RX + GSH –GST HX + GSR Ecuación 6

De la RX + GSH –GST HX + GSR Ecuación 6 se desprende que R puede ser un

grupo alifático, aromático o heterocíclico, en tanto que X puede ser un grupo sulfato,

nitrato o un halógeno (Zapata 2007). La adición de epóxidos alifáticos y óxidos de

arenos al glutatión esta catalizada por la enzima, así como la reducción del nitrato de

poliol y algunas reacciones de intercambio de enlaces disulfuro e isomerización (Zapata

2007).

En la actualidad, se conoce de la existencia de 13 clases de enzimas en la familia de

las GST, de las cuales, las que más han tenido atención por parte de los investigadores

son las pertenecientes a los mamíferos; estas, las de clase alfa (), mu (µ) y pi (π),

tienen una capacidad de procesar distintas especies de sustratos (Zapata 2007). La

16
GST puede presentarse en su estado nativo como un monómero, dímero e incluso

como trímero; el estado nativo será determinado por la localización de la enzima en la

célula y la familia a la que pertenece (la enzima) (Zapata 2007).

Las GSTs de los mamíferos se diferencian en tres tipos: citosólica, mitocondrial y

microsomal (Zapata 2007). La del tipo citosólica es la GST principal y más abundante,

se han identificado 8 clases de GST citosólica, es soluble, y es altamente polimórfica.

La parte mitocondrial es soluble en tanto que la microsomal es conocida como MAPEG

(proteínas de membrana asociadas en metabolismo de eicosanoides y glutatión). Estas

enzimas son de membrana pequeña y desempeñan un rol clave en el metabolismo

endógeno de leucotrienos y prostaglyinas; ambas fracciones (mitocondrial y

microsomal), dependiendo del tejido, constituyen entre el 10 y 30% de la actividad

catalíca cuyo es expresada en actividad por cantidad de proteína (Zapata 2007).

La inducción de la actividad de la GST tanto a nivel de sitio especifico como genético,

es producida por una amplia variedad de estímulos naturales y sintéticos que han sido

identificados. Estos agentes inductores van desde barbitúricos, hidrocarburos

aromáticos policíclicos, hasta antioxidantes y productos naturales. Donde se ha podido

observar esta inducción ha sido en hígado, esófago, estómago e intestino.

Para el estudio enzimático de GST, tanto para conocer su especificidad como la

cinética enzimática, existe una gran cantidad de sustratos que pueden ser empleados,

sin embargo el 1-cloro 2,4-dinitrobenceno (CDNB) ha sido catalogado como el sustrato

universal para GST en lo que a estudios enzimáticos con fines prácticos se refiere

(Habig y Jakoby 1981; Zapata 2007).

17
1.1.5 Polifenoles

El término polifenol o fenólico, se define como una sustancia que posee un anillo

aromático con uno o más hidroxilos como sustituyentes, además de los cuales se

puede incluir derivados funcionales como ésteres, metil éteres, glucósidos, entre otros

(Figura 1) (Shahidi y Ho 2005).

Los compuestos fenólicos y polifenólicos se encuentran en los alimentos como

metabolitos secundarios, donde se puede encontrar una gran variedad de clases de

compuestos fenólicos con propiedades benéficas para la salud por su poder

antioxidante, mismo que genera un efecto anticarcinogénico, entre otros (Shahidi y Ho

2005).

Los compuestos fenólicos tienen la capacidad de actuar como agentes protectores

contra los radicales libres, causantes de diversas patologías en el hombre (Carbonaro y

Grant 2005).

18
Figura 1. Estructura química de los polifenoles. Los polifenoles se dividen en flavonoides y no
flavonoides (Manach, Sacalbert et al. 2004).

1.1.5.1 Flavonoides

Los flavonoides son polifenoles con un esqueleto C6-C3-C6; con alrededor de 5000

diferentes compuestos identificados, constituyen parte de nuestra dieta no energética

(Carbonaro y Grant 2005). Los datos actualizados acerca de la biodisponibilidad de los

flavonoides son aun contradictorios y los mecanismos de absorción, inciertos

(Carbonaro y Grant 2005). La actividad antioxidante de una dieta rica en flavonoides

últimamente ha llamado mucho la atención por su aparente papel preventivo en las

19
enfermedades crónicas relacionadas al estrés oxidativo como diabetes y enfermedades

del corazón. Los flavonoides están ampliamente distribuidos en el reino de los

vegetales (plantas) y están divididos en categorías como flavonoles, flavanoles,

flavononas, flavonas, antocianinas e isoflavonas (Murota y Terao 2003).

Los flavonoides son encontrados normalmente en su forma glucosilada, es decir, uno o

más grupos de azúcar esta unido al grupo fenólico mediante enlace glucosídico (Murota

y Terao 2003). De manera general los glucósidos de quercetina contienen el grupo

azúcar en la posición 3, como ejemplo esta la isoquercetina (quercetina 3-O-β-

glucósido;Q3G), encontrándose comúnmente distribuidos en una amplia variedad de

vegetales. El estimado total de flavonoides tomados en la ingesta diaria es de varios

cientos de miligramos por día (Murota y Terao 2003).

Puesto que los compuestos (flavonoides) se presentan principalmente como

conjugados glucosídicos, tienen una mayor importancia ya que pueden ser absorbidos

en el intestino delgado sin que el enlace β-glucosídico sea cortado (Carbonaro y Grant

2005).

La quercetina (3,3’,4’,5,7-pentahidroxiflavona) es el flavonoide mas común presente en

frutas y verduras (Murota y Terao 2003). En estudios anteriores se ha observado que

las formas intactas glucosiladas de la quercetina fueron absorbidas en el intestino

delgado, sin embargo los glucósidos de quercetina difieren ampliamente en su

biodisponibilidad, y en conjugación con la glucosa aumenta la absorción en el intestino

delgado, por lo que se cree que la entrada de los flavonoides glucosilados hacia los

enterocitos es por medio del transportador de glucosa dependiente de sodio (Carbonaro

y Grant 2005).

20
Numerosos estudios in vitro dan cuenta de los diversos efectos biológicos de la

quercetina, donde se incluyen la inducción de apoptosis, antimutagénesis, inhibición de

la proteína-quinasa C (PKC), inhibición de la lipoxigenasa, inhibición de la liberación de

histamina, actividad de la superóxido dismutasa (SOD), modulación del ciclo celular,

inhibición de la angiogénesis, y la inhibición de la enzima II convertidora de

angiotensina (Murota y Terao 2003).

Los grupos hidroxilos de la estructura fenólica en los flavonoides, son los que actúan

como donadores de electrones, es por ello que hacen de los flavonoides compuestos

antioxidantes con actividad radical de rescate (Murota y Terao 2003). El poder

antioxidante de los flavonoides puede ser explicado por su acción quelante, porque los

iones de metales de transición como lo es el ión fierro, juegan un papel crucial en la

generación de especies reactivas de oxígeno por la reacción Fenton (Murota y Terao

2003).

La estructura del catecol dentro de los flavonoides tiene una importancia relevante,

porque posee dos grupos hidroxilos en posiciones vecinas, que lo hace notablemente

superior a disposiciones en la capacidad donante de electrones, por lo tanto, quercetina

y otros flavonoides que contienen la estructura catecol pueden ejercer una actividad

más potente como radical rescate (Murota y Terao 2003).

1.1.5.2 No flavonoides

De las estructuras de polifenoles que no hacen referencia a los flavonoides se encontró

que existen tres grupos: los estilbenos, los lignanos y los ácidos fenólicos. Los

estilbenos son estructuras que a pesar de no ser muy numerosas (200

aproximadamente), se encuentran en varias especies de vegetales. En especies

21
arbóreas como el pino y eucalipto se encuentran en la médula troncal. En la dieta

humana se encuentran en bajas cantidades (Manach, Sacalbert et al. 2004). La forma

molecular más extendida de los estilbenos es el resveratrol, característico de las

familias Pinaceae y Vitaceae. El resveratrol es acumulado principalmente en la

epidermis de la uva, vital razón de que las uvas y el vino signifiquen en la dieta una

fuente casi exclusiva de este antioxidante (Palazón, Cusidó et al. 2001).

Los lignanos son estructuras que tienen la función de fitohormonas en las plantas pero

que en el metabolismo del hombre funcionan como antioxidantes (Morris 2007). Se

componen por dos unidades de fenilpropano (Manach, Sacalbert et al. 2004).La gran

mayoría de plantas ricas en fibra son fuente confiable de lignanos (Morris 2007). Sin

embargo, la linaza es la principal fuente de lignanos vegetales, especialmente de

secoisolariciresinol diglicósido (SDG), aunque también presenta otros como el

matairesinol, pinoresinol, lariciresinol, isolariciresinol y secoisolariciresinol (SECO)

(Manach, Sacalbert et al. 2004; Morris 2007). En el colon humano, los lignanos

mencionados, a excepción del isolariciresinol, son transformados por las bacterias

propias de dicho órgano en los lignanos mamíferos enterodiol y enterolactona (Manach,

Sacalbert et al. 2004; Morris 2007).

Los ácidos fenólicos tienen mención en la siguiente sección.

1.1.5.2.1 Ácidos fenólicos

El anillo fenólico único es la característica que distingue a los ácidos fenólicos de los

flavonoides, además de contar en su estructura química con el anillo aromático y el

grupo hidroxílico, posee una función carboxílica (Farmacéuticos 2009 ; Martínez 2002).

22
Los ácidos fenólicos están divididos en dos tipos básicamente: los ácidos

hidroxibenzoicos y los ácidos hidroxicinámicos (Farmacéuticos 2009 ; Vila 2002). Los

ácidos hidroxibenzoicos están compuestos por un fenol unido a un grupo carboxílico

que le da función ácida (Vila 2002). De los ácidos benzoicos se desprende que su

unidad básica estructural es el ácido gálico, son abundantes en la naturaleza tanto en

su forma libre, acidificada o aldehídica como en formas heterosídicas; perteneciendo a

esta ultima los taninos hidrolizables (Farmacéuticos 2009).

1.1.5.2.2 Ácidos hidroxicinámicos

Los ácidos hidroxicinámicos se componen de un fenol portador de una cadena lateral

insaturada (Vila 2002). Son encontrados en la naturaleza generalmente en su forma

esterificada, ya sea con azúcares, alcoholes alifáticos, ácido quínico (ácido

clorogénico), flavonoides e incluso amidas (Farmacéuticos 2009). Los principales

ácidos hidroxicinámicos son los esteres de los ácidos caféico, cumárico y ferúlico (Vila

2002).

1.1.5.2.3 Ácido caféico

El 3,4 ácido dihidroxicinámico, mejor conocido como ácido caféico (CA por sus siglas en

inglés), es un compuesto fenólico que se encuentra en plantas, frutas y vegetales

(Figura 2). Su fórmula molecular es C9-H8-O4 con un peso molecular de 180.16

gramos.(Medicine 2003). Actúa como antioxidante e inhibe la síntesis de leucotrienos

implicados en la inmunorregulación, inflamación y alergia; a pesar de sus posibles

beneficios como agente antioxidante, varios artículos clasifican a este compuesto como

cancerígeno (Medicine 2003). El ácido caféico es un producto de la hidrólisis del éster

23
del ácido tartárico (Leighton, Urquiaga et al. 1997), sin embargo, la forma en que el

ácido cafeico es encontrado naturalmente es a manera de éster con el ácido quínico, el

cual lleva por nombre ácido clorogénico (Marques y Farah 2009).

Figura 2. Estructura química del ácido caféico. El 3,4 ácido dihidroxicinámico, mejor conocido como
ácido caféico.

1.1.5.2.4 Ácido clorogénico

Es uno de los polifenoles más cuantiosos dentro de la dieta humana, ya que se

encuentra en el café, frutas y vegetales. El ácido 5-O-cafeoilquínico (5-CQA), mejor

conocido como ácido clorogénico (CGA), es el éster del ácido caféico con ácido quínico

(Figura 3) (Olthof, Hollman et al. 2001). Su peso molecular es de 354.3087 gramos/mol,

en tanto que su fórmula molecular es C16H8O9 (Pubchem 2007). La nomenclatura del

ácido clorogénico, con base en la IUPAC es (1R, 3S, 4S, 5S)–3–[(E)–3–(3, 4-

dihidroxifenil) prop-2-enoil] oxi–1, 4, 5–trihidroxiciclohexano–1–ácido carboxílico

(Pubchem 2007). Su punto de fusión 205 a 209 grados Celsius (ChemBlink 2005).

24
Figura 3. Estructura química del ácido clorogénico. Es el éster del ácido caféico con ácido quínico.

1.1.5.2.4.1 Actividad biológica del ácido clorogénico

El café es la mayor fuente de ácido clorogénico en la dieta humana, aporta de 0.5 a 1

gramos a los bebedores de café (Olthof, Hollman et al. 2001). Los polifenoles son

metabolizados principalmente en el hígado, sin embargo los riñones y la mucosa

intestinal también se ven implicados en este proceso ya que contienen enzimas

esenciales para metabolizar a estos compuestos (Martínez-Valverde, Periago et al.

2000). Por otro lado, Claudine Manach y colaboradores dicen que los fluidos biológicos

como plasma, jugo gástrico y fluido duodenal, así como el hígado y la mucosa intestinal,

no poseen esterasas capaces de hidrolizar el ácido clorogénico, esto ha sido observado

también en ratas, únicamente la microflora del colon sería capaz de llevar a cabo la

hidrólisis (Manach, Sacalbert et al. 2004).

A pesar de los efectos potencialmente benéficos para los seres humanos, los datos

sobre su contenido y su distribución en plantas, alimentos y bebidas son escasos.

Además, la mayoría de los datos existentes si no miden el total del contenido de

compuestos fenólicos (incluido CGA), simplemente miden el contenido de 5-CQA, que

es el CGA más abundante en la naturaleza (Marques y Farah 2009).

Los fenoles presentes en la dieta, a través de diversos y muy variados estudios, han

25
demostrado ser excelentes antioxidantes in vitro, empero su capacidad antioxidante in

vivo es incierta (Olthof, Hollman et al. 2003). Por otro lado Viviane Marques (Marques y

Farah 2009) indica que las propiedades potencialmente benéficas para los seres

humanos derivados de ácidos hidroxicinámicos, como actividades antioxidantes,

hipoglucemiantes, antivirales y hepatoprotectoras son imputadas al ácido clorogénico,

basyo su expresión en estudios epidemiológicos, in vitro e in vivo. Las lactonas

clorogénicas que se forman durante la deshidratación de la molécula de ácido quínico y

la formación de un enlace éster intramolecular también han demostrado tener efectos

biológicos como la inhibición del transporte de adenosina, afinidad por el receptor µ-

opioide y actividad hipoglucemiante (Marques y Farah 2009).

En un estudio realizado con humanos, se observó que la concentración máxima en

plasma de ácido caféico se alcanzó una hora después de la ingesta de café, cabe

mencionar que en el café el ácido cafeico no aparece en su forma libre sino esterificada

con ácido quínico (ácido clorogénico) (Manach, Sacalbert et al. 2004). En la

investigación se demostró que el ácido clorogénico representa solamente el 30% del

ácido caféico la hidrólisis alcalina del café, lo cual brinda la posible explicación de que

otras formas del acido cafeico fueron hidrolizadas en la parte alta del intestino (Manach,

Sacalbert et al. 2004). Aun y con esta evidencia se siguen planteyo dudas sobre la

incapacidad de los tejidos para hidrolizar los ácidos fenólicos esterificados (Manach,

Sacalbert et al. 2004).

En insectos se ha demostrado que el ácido clorogénico actúa como pro-oxidante creyo

especies reactivas de oxígeno, lo que provoca un aumento de la peroxidación lipídica,

oxidación de las proteínas y la disminución del nivel de ácido ascórbico (Lukasik 2007).

26
1.2 Hipótesis.

El ácido clorogénico modifica la actividad enzimática de SOD, GST y catalasa en los

enterocitos de rata.

27
1.3 Objetivo

Determinar el efecto del ácido clorogénico sobre la actividad de las enzimas Superóxido

dismutasa (SOD), Glutation tio-transferasa (GST) y catalasa (CAT) en enterocitos de

rata.

28
 CAPITULO 2

2.1 Reactivos y materiales

Para la preparación de soluciones reguladoras como el buffer de Krebs y los buffer de

fosfatos se utilizaron los siguientes reactivos:

Cloruro de sodio (NaCl) 100%, J.T. Baker; cloruro de potasio (KCl) 99%, Jalmek; fosfato

de potasio dibásico (K2HPO4) ≥98%, Sigma – Aldrich; fosfato de potasio monobásico

(KH2PO4), J.T. Baker; fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4●7H2O), Mallinckrodt; fosfato

de sodio monobásico anhidro (NaH2PO4) 99.0%, Sigma; cloruro de calcio (CaCl2)

aproximadamente 95%, Spectrum; cloruro manganoso (MgCl2●H2O), Analytyka;

bicarbonato de sodio (NaHCO3) 100.2%, J.T. Baker; dextrosa (C6H12O6), Difco; agua

inyectable Pisa, Irrigadual; pirogalol (C6H6O3) 99%, Sigma – Aldrich; peróxido de

hidrógeno (H2O2) 30%, Fluka; glutatión en su forma reducida (C10H17N3O6S) 98%,

Sigma; ácido clorogénico (C16H18O9), Sigma.

2.1.1 Buffer o solución reguladora de Krebs

NaCl 115mM, KCl 5.9mM, MgCl2 1.2mM, NaH2PO4 1.2mM, CaCl2 2.5mM, NaHCO3

25mM, C6H12O6 10mM. Se ajustó el pH a 7.4 con ácido clorhídrico. ¿con qué?

2.1.2 Buffer o solución reguladora de fosfatos

Se tomaron 80.2mL de K2HPO4 1M y 19.8mL de KH2PO4 1M; se diluyó la mezcla a una

proporción 1:10 para luego volver a diluir 1:2 y de esta manera obtener una

concentración final de 0.05M. El pH debe quedar ajustado a 7.

29
2.1.3 PBS 1X

NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 10mM, KH2PO4 2mM. Se ajusta el pH a 7.4.

2.1.4 Pirogalol

C6H6O3 3.6mM en agua inyectable

2.1.5 Peróxido de hidrógeno

Se tomaron 15µL de H2O2 y se afora a 10mL con PBS 1X. Con este procedimiento el

peróxido de hidrógeno alcanza una concentración de 15mM.

2.1.6 Tioéter glutatión dinitrobenceno

Se tomó 1mLde cloro-dinitro-benceno (CDNB) 0.1M en etanol y se le agrego 43.3mL de

solución reguladora de fosfatos 0.1M pH 6.5, así se logra una concentración 2.25mM

del CDNB. Así mismo se prepara glutatión reducido 2.25mM (C10H17N3O6S) con buffer

de fosfatos 0.1M pH 6.5.

2.1.7 Ratas

Las ratas sacrificadas fueron de la cepa Sprague-dawley, con una edad de 50 días de

nacidas y un peso aproximado de 115gr.

2.2 Obtención del intestino

Se obtuvo el intestino de 7 ratas, a las cuales se les sacrificó por decapitación de

acuerdo a lo especificado en la Norma Oficial Mexicana -NOM-062-ZOO-1999,

Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de

laboratorio, en su apartado 9 Eutanasia.

30
Se extrajo el intestino delgado, más específicamente la sección del yeyuno, el cual fue

cortado desde aproximadamente 5 centímetros después del ligamento que une el

intestino con el estómago (ligamento de Treitz), hasta antes de llegar al intestino

grueso. De esta sección se cortaron cuatro pedazos de 2 centímetros cada uno. A

continuación , procedió a limpiarlos de toda materia fecal y posteriormente fueron

volteados para exponer el lumen a las soluciones en las que se estuvieron sumergidos,

y colocados en vasos de precipitados, de la siguiente manera:

2.3 Diseño del experimento

2 segmentos de intestino fueron dispuestos en un vaso de precipitado con 25mL de

ácido clorogénico 50µM en buffer de Krebs.

2 segmentos de intestino se dispusieron en un vaso de precipitados con 25mL de buffer

de Krebs pH 7.4, la cual sirvió como muestra control

. Ya con el lumen expuesto, y limpios de toda materia fecal (los pedazos de intestino),

se incubaron durante 15 minutos a 37oC en los mismos contenedores donde fueron

colocados los segmentos de intestino.

2.4 Extracto proteico

Después de la incubación, cada porción de intestino se raspó con un hisopo, al que se

le retiró todo rastro de algodón, con la intención de obtener el mayor número de

enterocitos. El producto que se obtuvo de este raspado fue depositado en tubos

Eppendorf que contenían 600µL de buffer de fosfatos 10mM a pH 7. Todos los tubos

Eppendorf, con sus respectivos raspados se mantuvieron en contacto con hielo para

mantener una temperatura de 4oC.

31
El siguiente paso que se llevó a cabo fue la obtención del extracto proteico crudo

mediante la técnica de sonicación, la cual consiste en someter a los enterocitos a altas

frecuencias de sonido para que las membranas colapsen y las proteínas sean liberadas

al medio. Se utilizaron dos pulsos de 2 segundos cada uno para cada tubo. Ya

sonicadas las muestras, se procedió a centrifugar a 14,000 rpm durante 10 minutos a

4oC, con la finalidad de quitar impurezas del extracto proteico que puedan contaminar e

interferir en las mediciones. Se trasladó el sobrenadante a un tubo Eppendorf nuevo,

previamente etiquetado, y de cada muestra se realiza una dilución relación 1:10.

Realizadas las diluciones, ambas muestras con sus respectivas diluciones son llevadas

a -80oC para la posterior medida de las actividades enzimáticas y la cuantificación de

proteína total.

La medición de las actividades enzimáticas se realizó en un mismo día, así como la

cuantificación de proteína. Todo ensayo, cuantificación y/o experimento llevado a cabo

se realizó por triplicado.

2.5 Cuantificación de proteína total

El método de Bradford fue utilizado en la determinación de proteína total (Bradford

1976). Para ello fue necesario realizar una curva de calibración, la cual se hace con

soluciones estándar de albúmina bovina sérica (BSA) de concentraciones 0, 100, 200,

300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 y 1000 µg/mL a partir de una solución stock de BSA

10 mg/mL. Una vez hechas las diluciones pertinentes para obtener las soluciones

estándar, se vertieron 20µL de cada estándar y 20µL de agua destilada, misma que fue

usada como blanco, en los pozos de la microplaca. Además, se adicionó en cada pozo

32
200µL del reactivo de Bradford. Se dejó reaccionar la mezcla por 5 minutos a

temperatura ambiente, pasado este tiempo se introdujo la microplaca en el

espectrofotómetro para leer la absorbancia a 595nm. Con los datos de absorbancia y

concentración se hizo el gráfico de calibración con su respectiva regresión lineal.

Para realizar la cuantificación total de proteína de las muestras, se tomaron 20µL de

muestra diluida en una proporción de 1:10 con buffer de fosfatos 10mM pH 7.4 se

depositaron en los pozos de la microplaca y se les agregaron 200µL de reactivo de

Bradford. Se dejó incubar la reacción por espacio de 5 minutos a temperatura ambiente

y se midió su absorbancia a 595nm. La concentración de proteína total se obtuvo a

partir de la ecuación de la recta de calibración.

La fórmula empleada para el cálculo de la concentración de proteína total en mg/mL fue

la siguiente:

x = {[(y – b) ÷ m] x 10} ÷ 1000 Ecuación 7

donde:

x es la concentración de proteína;

y es la absorbancia de la mu

b es la ordenada al origen de la recta de calibración

m es la pendiente de la recta de calibración;

10 el factor de dilución

33
1000 para obtener las unidades en mg/mL

2.6 Cuantificación de actividad enzimática

2.6.1 Catalasa

Para medir la actividad enzimática de catalasa, se empleó el espectrofotómetro con la

lámpara UV. El blanco utilizado para el instrumento fue PBS 1X a un pH de 7, una vez

establecido el blanco, se midió el blanco experimental, el cual es la desaparición

espontánea del peróxido de hidrógeno, luego se midieron las muestras llevyo a cabo el

siguiente procedimiento: en la celdilla de cuarzo se depositaron 600µL de peróxido de

hidrógeno y se añadieron 60µL de muestra, inmediatamente se agitó una vez y se midió

en el espectrofotómetro lo antes posible. Todas las lecturas se hicieron a una longitud

de onda de 240nm, ya que a dicha longitud de onda se puede observar la desaparición

del peróxido de hidrógeno; cada lectura se efectuó por 3 minutos.

Siendo que la técnica está basada la desaparición del peróxido de hidrógeno y que esta

desaparición se puede medir a 240nm, la acción de la catalasa se pudo observar al

graficar los resultados que arrojados de las lecturas contra el tiempo, es decir, se

graficó la absorbancia leída a 240nm contra tiempo, a partir de aquí se calculó la

diferencia de absorbancia por minuto (ΔAbs240) como la pendiente de la regresión lineal

de la gráfica. Una vez calculada la pendiente se emplea la siguiente fórmula para

calcular las unidades de catalasa por mililitro:

UCAT/ml = (ΔAbs240/0.0394) x 100 Ecuación 8

Sin embargo, como es preciso obtener los resultados en unidades de catalasa por

miligramo de proteína total, el resultado obtenido de la fórmula anterior, se dividió entre

34
la concentración de proteína total en mg/ml; la concentración de proteína se determinó

por el método de Bradford.

Entonces, una unidad de catalasa equivale a la cantidad de enzima necesaria para

reducir un µmol de H2O2 por minuto (Aebi 1984).

2.6.2 Superóxido dismutasa (SOD)

En la medición de la actividad de la enzima superóxido dismutasa se utilizó el mismo

espectrofotómetro empleado para medir la actividad enzimática de la catalasa, con la

única diferencia que para este ensayo se ocupó la lámpara de tungsteno (luz visible).

En una celdilla de cuarzo se depositaron 40µL de muestra diluida relación 1:10 o agua

destilada (en el caso del blanco), 60µL de pirogalol y 1000µL de T RIS 50mM y dietilen-

triamino-penta acetato (DTPA) 1mM pH 8.2; se leyó a una longitud de onda de 420nm

por tres minutos en intervalos de 0.5 segundos. Realizado el proceso de las lecturas se

determinó el cambio de absorbancia a 420nm en los tres minutos obteniendo así

ΔAbs420.

El porcentaje de inhibición se calculó de la siguiente manera:

% de inhibición = [(100)(ΔAbsblanco – Δabsmuestra)] ÷ ΔAbsblanco Ecuación 9

La diferencia entre el cambio de absorbancia del blanco con el de la muestra es el

porcentaje de auto-oxidación del pirogalol.

Ya obtenido el porcentaje de inhibición se determinaron las unidades de SOD/ml

empleyo la siguiente fórmula:

USOD/mL= (% de inhibición ÷ 50) x 10 Ecuación 10

35
Para establecer las unidades especificas, el valor obtenido con la fórmula anterior se

dividió entre la concentración de proteína total en mg/mL obtenida por el método de

Bradford.

Una unidad de SOD es la cantidad de enzima necesaria para inhibir la reacción en un

50% con base a lo publicado por Paoletti y sus colaboradores en 1986 (Paoletti,

Aldinucci et al. 1986).

2.6.3 Glutatión tio-tranferasa (GST)

Para medir la actividad de la enzima GST se recurrió al método establecido por Habig

en 1974, por lo cual fue necesario preparar una solución de 1-cloro 2,4-dinitrobenceno

(CDNB) 2.25mM y otra de glutatión reducido (GSH) 2.25mM, de las cuales se tomaron

volúmenes iguales para mezclarlas (procurar no generar burbujas) y así obtener una

solución equimolar de 1.125mM de cada sustrato (Habig y Jakoby 1981). La

preparación de esta mezcla es imprescindible realizarla antes de iniciar el experimento

ya que sólo permanece estable por 20 minutos a 37oC.

La preparación de la solución de CDNB 2.25mM se llevó a cabo de la siguiente manera:

se preparó un extracto con 0.1M de CDNB en etanol, de esta solución se tomó 1mL

para diluirlo en 43.3mL de solución reguladora de fosfatos (KH2PO4/K2HPO4) 0.1M pH

6.5 y así obtener la solución de CDNB 2.25mM.

Para la preparación de la solución de GSH 2.25mM, se pesaron 0.0076gr de GSH y se

depositaron en un matraz aforado de 10mL, se lleno hasta el aforo con la misma

solución reguladora de fosfatos utilizada para la solución de CDNB.

36
Se tomaron 25µL de solución reguladora de fosfatos (blanco) o de muestra y se

depositaron en los pozos correspondientes de la microplaca, así mismo se añadieron

200µL de mezcla CDNB-GSH 1.125mM; la concentración final de los sustratos resultó

de 1mM. El lector de microplaca se configuró de la siguiente manera: se establecieron

90 lecturas a una longitud de onda de 340nm en intervalos de 15 segundos con un

mezclado de 5 segundos previo a cada lectura; y se mantuvo una temperatura de 37 oC

a lo largo de todas las lecturas.

La Figura 4 muestra esquemáticamente el fundamento en el que está basada la técnica

para la cuantificación de la actividad enzimática de GST, es decir, está basada en la

formación del complejo tioéter glutatión dinitrobenceno, el cual es posible medir su

aparición en el espectrofotómetro ya que absorbe a 340nm.

Figura 4.- Cuantificación GST. Reacción en la que se fundamenta la técnica para la cuantificación de
GST

El reporte de los resultados se expresó en unidades de GST por miligramo de proteína

total, mismas que serán determinadas como a continuación se menciona: al graficar

absorbancia contra tiempo, se calculó el valor de la pendiente de la regresión lineal del

37
blanco (ΔAbsB) y de cada muestra (ΔAbsM) para emplear los datos obtenidos en la

fórmula siguiente:

UGST/mL = (ΔAbsB - ΔAbsM) ÷ [(225/25)(0.82549)] Ecuación 11

De la fórmula anterior se desprende que 225/25 es el factor de dilución, lo cual quiere

decir que 225µL es el volumen total de la reacción y 25µL el volumen de muestra

empleada en la reacción. El número 0.82549 es el coeficiente de extinción molar del

complejo tioéter glutatión dinitrobenceno (mmol-1cm-1). Se mencionó que los resultados

se expresarían en unidades de GST por miligramo de proteína total y para lograrlo fue

necesario dividir el resultado de la fórmula anterior entre la concentración de proteína

total en mg/ml obtenida mediante el método de Bradford.

Una unidad de GST se entiende como el equivalente a la cantidad de enzima que

cataliza 1µmol de CDNB con 1µmol de GSH por minuto a 37oC.

2.6.4 Análisis estadístico

Los resultados obtenidos fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA) y la

comparación de medias por la prueba de Tukey a un α 0.05. Además se llevó a cabo

una prueba T de Student de datos apareados. El análisis estadístico se realizó

mediante el programa computacional SPSS (Statical Packege for the Social Sciences,

SPSS Inc. Chicago, III) versión 15.0, proporcionado por la Universidad Autónoma de

Ciudad Juárez (UACJ) a través del Centro de Cómputo del Instituto de Ciencias

Biomédicas (ICB).

38
 CAPÍTULO 3

3.1 Resultados

La actividad enzimática, así como la concentración de proteína total se obtuvieron de

siete ratas a los 50 días de edad de la cepa Sprague-Dawley. Solamente para la

actividad de la enzima catalasa se realizaron siete repeticiones, en tanto que para

superóxido dismutasa y glutatión S-transferasa sólo se hicieron seis repeticiones.

3.1.1 Proteína total

La proteína total se cuantifico de acuerdo al método de Bradford. La curva de

calibración empleada para calcular la concentración de proteína total de cada muestra

se muestra en la Figura 5.

Figura 5.- Gráfico de calibración. A partir de esta recta se determinó la concentración de proteína de
cada muestra analizada.

39
La Tabla 2 muestra los valores obtenidos de proteína de total de cada muestra para

cada tratamiento más/menos (±) la desviación estándar.

Tabla 2.- Concentración de proteína total. La columna control muestra las concentraciones de las
muestras que no llevaron el tratamiento con ácido clorogénico; la columna CGA, de las que fueron
tratadas con ácido clorogénico. La concentración se expresa en mg/mL.
Concentración mg/mL
Muestra Control CGA
R1 1.903 ± 0.1080 1.298 ± 0.0150
R2 1.316 ± 0.0220 1.728 ± 0.0156
R3 3.835 ± 0.0561 1.858 ± 0.0156
R4 2.160 ± 0.0115 1.069 ± 0.0231
R5 1.728 ± 0.0090 2.632 ± 0.0697
R6 2.288 ± 0.1107 1.920 ± 0.0582
R7 1.289 ± 0.0156 1.319 ± 0.0811

3.1.2 Actividades enzimáticas

Las actividades enzimáticas que presentó cada enzima en ambos tratamientos (con y

sin ácido clorogénico) son mostradas en la Tabla 3 con sus respectivos errores

estándar, así mismo aparece el valor relativo de las actividades. Se tomó el valor de la

actividad enzimática control como el 100% ya que es la actividad de la enzima que no

se encuentra afectada por la acción del ácido clorogénico. A partir de esta premisa se

calculó el valor relativo de las actividades enzimáticas y los coeficientes de variación,

mismos que son presentados en la Tabla 3.

40
Tabla 3. Actividades enzimáticas. Las actividades enzimáticas se presentan en Unidades de enzima
por miligramo de proteína ± el error estándar, en tanto que los valores relativos reportan porcentaje de
actividad enzimática ± coeficiente de variabilidad. La columna de ácido clorogénico indica que son los
valores obtenidos de las muestras tratadas con ácido clorogénico. La columna control representa los
valores obtenidos de las muestras en ausencia de acido clorogénico

Control Ácido clorogénico

Enzima Actividad enzimática Valor relativo Actividad enzimática Valor relativo

a b
38.8978 ± 21.0691 85.3315 ± 29.3748
SOD 100% ± 54.2% 219.37% ± 34.4%
U SOD/mg proteína U SOD/mg proteína

c d
85.0553 ± 19.2431 62.6893 ± 13.2348
Catalasa 100% ± 22.6% 73.70% ± 21.1%
U catalasa/mg proteína U catalasa/mg proteína

e f
3.0098E-05 ± 0.6751E-05 4.8009E-05 ± 0.8087E-05
GST 100% ± 22.4% 159.51% ± 16.8%
U GST/mg proteína U GST/mg proteína
a-b; c-d; e-f
Indica que existe diferencia significativa (p<0.05)

Dentro de la Tabla 3 se indica que los dos tratamientos tienen una diferencia

significativa para las tres enzimas. La Figura 6 representa esquemáticamente los

valores relativos de la actividad de las tres enzimas. En esta figura se aprecia

claramente el cambio en la actividad de cada enzima. Así, se observa que para GST la

actividad aumentó en más de un 55% con la presencia del ácido clorogénico y SOD

aumentó en más de un 115% con el mismo tratamiento. En cambio, el ácido

clorogénico tuvo un efecto contrario en la actividad de la catalasa ya que la disminuyó

en casi un 30% con respecto a la actividad de la enzima sin tratamiento con el ácido

clorogénico.

41
Figura 6. Actividad enzimática relativa. La actividad de cada enzima está representada en porcentaje ±
el coeficiente de variación. Con referencia a las muestras control, se observa que la actividad de GST y
SOD aumentó en presencia del ácido clorogénico en contraste con la catalasa, la cual disminuyó su
actividad.

3.2 Discusión y Conclusión

El efecto que el acido clorogénico produjo en la enzima catalasa se cree que fue debido

a que el ácido clorogénico disminuyó el efecto oxidante del peróxido de hidrógeno. La

catalasa disminuye su actividad cuyo la concentración de peróxido de hidrógeno es

menor, es ahí que entra en acción la enzima glutatión peroxidasa, ya que esta enzima

posee mayor afinidad por el sustrato en bajas concentraciones (Carreras 2004).

El aumento de la actividad de GST en un 59.51% se relaciona con lo publicado por

Rentian Feng et al en 2005, donde el ácido clorogénico con una concentración de 40µM

aumentó la actividad de GST un 46.8%. Ellos mismos atribuyen este cambio a que el

ácido clorogénico activa GST a través de elementos antioxidantes de respuesta (AREs),

42
es decir, que el ácido clorogénico puede estimular la expresión de los genes GST

marcyo el promotor GSTA1 en los AREs (Feng, Lu et al. 2005)

En cuanto a la actividad reportada para SOD, se propone que el aumento en un

119.37% se debe a la actividad antioxidante del ácido clorogénico que coadyuva a

neutralizar el peróxido de hidrógeno, permitiendo así a la enzima aumentar su actividad

al no dejar que se retroalimente negativamente con el producto de la reacción propia de

la enzima, el peróxido de hidrógeno. Siendo de este modo que al encontrarse una

elevada generación de ion superóxido, la actividad enzimática de SOD aumenta, sin

embargo esto no puede prolongarse por mucho tiempo debido a que el producto de la

reacción inhibe la actividad de la enzima, (Bravo, Araujo et al. 2007).

La catalasa se vio afectada de manera decreciente en su actividad enzimática, en

contraste con la actividad de las enzimas SOD y GST que se vieron favorecidas por

acción del ácido clorogénico a una concentración de 50µM, lo que lleva a concluir que

el efecto antioxidante del ácido clorogénico se manifiesta al aumentar la actividad de

estas dos enzimas. Sin embargo no se puede asegurar que sea el único mecanismo de

acción del ácido clorogénico ya que en su ingesta, la hidrólisis del ácido clorogénico

genera otros antioxidantes que podrían ser los que lleven a cabo ese mecanismo de

defensa.

A partir de los resultados obtenidos y después del análisis de los mismos, se puede

concluir que el acido clorogénico tiende a modificar la actividad de las tres enzimas que

fueron evaluadas, dos de ellas (SOD y CAT) por inhibición del efecto oxidante del

peróxido de hidrógeno y la otra (GST) a través de la activación del los AREs. Por lo

43
anterior, la hipótesis planteada al inicio de la investigación no es rechazada, toda vez

que los resultados arrojaron evidencia suficiente a un nivel de confianza del 95%.

3.3 Recomendaciones

Dado que en esta investigación el ácido clorogénico se dispuso de manera directa a los

intestinos, es recomendable evaluar el desempeño del mismo a través del metabolismo

de la rata, es decir, a través de una dieta rica en acido clorogénico con el fin de evaluar

cual es el porcentaje de ácido clorogénico que realmente llega al intestino y observar el

efecto de las estructuras hidrolizadas de este antioxidante.

La actividad de la enzima glutatión peroxidasa no fue evaluada en esta investigación,

por lo que se recomienda su valoración para comparar los resultados con el efecto

causado por el ácido clorogénico en la catalasa.

Otra recomendación a evaluar es ver la diferencia en las actividades enzimáticas con el

mismo tratamiento, con la diferencia de que se añada un grupo de ratas previamente

estresadas.

La edad de las ratas también es una variable que resultaría interesante trabajar con ella

para la valoración del desempeño de antioxidantes sobre las enzimas estudiadas en

esta investigación.

Si bien, ya se hicieron las observaciones para modificar las variables de la dieta, edad y

estrés pre-mortem, la variedad en la cepa de ratas es un factor que no debe pasar

desapercibido.

A la par de estas modificaciones para futuras investigaciones, se debe investigar de

cada familia enzimática la especificación de cual clase de enzima tiene mayor

44
participación, esto ayudaría bastante a la compresión del sistema de defensa

antioxidante por enzimas.

Por último, evaluar cuál es la concentración de ácido clorogénico más eficiente para

aumentar la actividad enzimática de las enzimas evaluadas.

45
Referencias bibliográficas.

Aebi, H. (1984). "Catalase in vitro." Methods in ezymology 105(Oxygen radicals in

biological systems): 121 - 126.
Barbosa, K. B. F., J. Bressan, et al. (2008). "Influencia de la dieta sobre marcadores
plasmáticos de estrés oxidativo en humanos." 31: 259 - 280.
Benzie, I. (2003). "Evolution of dietary antioxidants." Comparative Biochemistry y
Physiology Part A 136: 113 -126.
Bonnefoy, M., J. Drai, et al. (2002). "Antioxidants to slow aging, facts y perspectives."
1174 - 84.
Bradford, M. (1976). "A Rapid y Sensitive Method for the Quantitation of Microgram
Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding." Analytical
Biochemistry 72: 248 - 254.
Bravo, A., S. Araujo, et al. (2007). "Actividad de la enzima antioxidante superóxido
dismutasa y niveles de cobre y zinc en pacientes con diabetes Mellitus tipo 2."
Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica 26: 1 - 8.
Carbonaro, M. y G. Grant (2005). "Absorption of quercetin y rutin in rat small intestine."
Annals of Nutrition & Metabolism 49: 178-182.
Carreras, I. (2004). Influencia de la suplementación de antioxidantes y la administracion
de enrofloxacina en la calidad y seguridad de la carne de ave. Química. Girona,
Universitat de Girona. Master: 316.
Castillo, J., S. Contreras, et al. (2007). "Actividad de la enzima Gluation S-transferasa
T1 en floricultores expuestos a plaguicidas." Bioquímia 32: 138.
Céspedes, E., I. Hernández, et al. (1996). Enzimas que participan como barreras
fisiológicas para eliminar los radicales libres: II. Catalasa. Revista Cubana de
Investigaciones Biomédicas. La Habana, Cuba, Rev Cubana Invest Bioméd. 15.
ChemBlink (2005). Chlorogenic acid, Online Database of Chemicals from Around the
World.
Díaz, P. (2006). Papel de las actividades superóxido dismutasa y catalasa en la
virulencia de Photobacterium damselae subsp. piscicida. Estrategias para la

46
 estimulación del estallido respiratorio en fagocitos de lenguados cultivados.
Microbiología. Málaga, Universidad de Málaga. Doctoral: 276.
Farmacéuticos., C. G. d. C. O. d. "Compuestos fenólicos." Retrieved 7/11/2009, 2009,
from
http://www.portalfarma.com/pfarma/taxonomia/general/gp000011.nsf/0/4DE2A20
30B26B6F0C1256A790048D68C/$File/web_fenolicos.htm.
Feng, R., Y. Lu, et al. (2005). "Inhibition of Activator Protein-1, NF-B, y MAPKs y
Induction of Phase 2 Detoxifying Enzyme Activity by Chlorogenic Acid
" THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 280(July 29): 27888 - 27895.
Ferreira, R. (2000). "Enzimas antioxidantes y prooxidantes: características principales y
su ubicación en el genoma humano." Antioxidantes, vitaminas y nutrientes.
Fritz-Wolf, K., A. Becker, et al. (2003). "X-ray structure of glutathione S-transferase from
the malarial parasite Plasmodium falciparum." PNAS 100(Biochemistry): 13821-
13826.
Gałecka, E., R. Jacewicz, et al. (2008). "Enzymy antyoksydacyjne – budowa,
właściwości, funkcje." Pol. Merk. Lek. 147.
García, B., G. Onel, et al. (1995). Enzimas que participan como barreras fisiológicas
para eliminar los radicales libres: I. Superóxido dismutasas. Revista Cubana de
Investigaciones Biomédicas. Ciudad de la Habana, Rev Cubana Invest Bioméd.
14.
García, F., M. Orts, et al. (2003). "Variaciones de la superóxido dismutasa salivar en la
infección amigdalar." Acta Otorinolaringológica Española 54: 78 -80.
Habig, W. y H. Jakoby (1981). "Glutathione S-Transferases (Rat y Human)." Methods in
ezymology 77.
Jacob, R. y B. Burri (1996). "Oxidative damage y defense." American Journal of Clinical
Nutrition 63: 985S - 90S.
Larson, R. (1997). Naturally occurring antioxidants. Boca Raton, Florida, USA, Lewis
Publishers.
Leighton, F., I. Urquiaga, et al. (1997). Propiedades antioxidantes del vino y sus
componentes. XXII Congreso Mundial de la Vid y del Vino, Buenos Aires,
Argentina.

47
Lukasik, I. (2007). "Changes in activity of superoxide dismutase y catalase within cereal
aphids in response to plant o-dihydroxyphenols." Journal of Applied Entomology
131(Entomology): 209-214.
Manach, C., A. Sacalbert, et al. (2004). "Polyphenols: food sources y bioavailability."
The American Journal of Clinical Nutrition 79: 727-747.
Marques, V. y A. Farah (2009). "Chlorogenic acids y related compounds in medicinal
plants y infusions." Food Chemestry 113: 1370 - 1376.
Martínez-Valverde, I., M. J. Periago, et al. (2000). "Significado nutricional de los
compuestos fenólicos de la dieta." Archivos Latinoamericanos de Nutrición
50(Nutricion): 14.
Martínez, F. (2002). Viticultura de calidad: factores que afectan al contenido de
compuestos fenólicos ACE Revista de enología. Barcelona, ACE. 21.
Martínez, S. (2005). Influencia de la catalasa y de la β-toxina en la patogénesis de
Stapfhylococcus aureus. Departamento de Sanidad Animal. Madrid, Universidad
Complutense de Madrid. Doctoral: 127.
Mayne, S. (2003). "Antioxidant Nutrients y Chronic Disease: Use of Biomarkers of
Exposure y Oxidative Stress Status in Epidemiologic Research." The Journal of
Nutrition: 933S - 940S.
Medicine, N. L. o. (2003). Caffeic Acid, CASRN: 331-39-5, Hazardous Substances
DataBank.
Morris, D. (2007). Linaza - Una Recopilación sobre sus Efectos en la Salud y Nutrición
Canada, Flax Council of Canada.
Murota, K. y J. Terao (2003). "Antioxidative flavonoid quercetine: implication of its
intestinal absorption y metabolism." Archives of Biochemistry y Biophysics 417:
12-17.
Noguchi, N. y E. Niki (1999). Chemistry of active oxygen species y antioxidants.
Antioxidant status, diet, nutrition, y health. A. Papas. Boca Raton, Florida, USA,
CRC Press: 3-20.
Olthof, M., P. Hollman, et al. (2001). "Chlorogenic Acid y Caffeic Acid Are Absorbed in
Humans." The Journal of Nutrition 131: 66 - 71.

48
Olthof, M. R., P. Hollman, et al. (2003). "Chlorogenic Acid, Quercetin-3-Rutinoside y
Black Tea Phenols Are Extensively Metabolized in Humans." The Journal of
Nutrition 133(Nutrition): 1806–1814.
Palazón, J., R. Cusidó, et al. (2001). Metabolismo y significación biológica de los
polifenoles del vino. ACE Revista de Enología. Barcelona, RUBES. 9.
Paoletti, F., D. Aldinucci, et al. (1986). "A sensitive spectrophotometric method for the
determination of superoxide dismutase in tissue extracts." Analytical Biochemistry
154: 536-541.
Papas, A. (1999). Determinants of antioxidant status in humans. Antioxidant status, diet,
nutrition, y health. A. Papas. Boca raton, Florida, USA, CRC Press: 21-36.
Pubchem, C. (2007). Chlorogenic Acid - Compound Summary (CID 12310830), National
Center for Biotechnology Information.
Rao, A. V. y L. G. Rao (2007). "Carotenoids y human health." Pharmacological
research: 207-216.
Shahidi, F. y C.-T. Ho (2005). Phenolics in Food y Natural Health Products: An
Overview. Phenolic Compounds in Foods y Natural Health Products. F. Shahidi y
C.-T. Ho. Washington, DC, American Chemical Society: 1 - 8.
Ugartondo, V. (2009). Caracterización de derivados polifenólicos obtenidos de fuentes
naturales. Citotoxicidad y capacidad antioxidante frente a estrés oxidativo en
modelos celulares. Fisiologia. Fac. Farmàcia. Barcelona, Universitat de
Barcelona. Doctor: 217.
Urso, M. L. y P. M. Clarkson (2003). "Oxidative stress, exercise, y antioxidant
supplementation." Toxicology 189: 41-54.
Vila, H. (2002). Efecto del tiempo de maceración sobre el color, la composición tánica y
la astrigencia de vinos Cabernet Sauvignon y Malbec Viticultura y enología,
Universidad Nacional de Cuyo;Ecole Nationale Supériure Agronomique de
Montpellier; Estación Experimental Agropecuaria Mendoza del Instituto Nacional
de Tecnología Agropecuaria. Master Scientiae: 67.
Zapata, R. (2007). Evaluación de glutation s-transferasa (GST) en zona tonsilar, en
población expuesta a emisiones de los hornos ladrilleros en Juárez. Ciencias

49
 Basicas. Ciudad Juárez, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Licenciatura:
45.
Zorrilla, A. (2002). El envejecimiento y el estrés oxidativo. Revista Cubana de
Investigación Biomédica. La Habana, Cuba, Rev Cubana Invest Biomed. 21: 178-
85.

50