PCR

Real-time thermal cycler

Standard thermal cycler

Tpicos (1)
Estratgias gerais de estudo de sequncias de DNA especficas em
populaes de DNA complexas
Requisitos da reaco de polimerizao em cadeia (PCR)
Construo de primers
Descrio da tcnica de PCR
Anlise dos produtos de PCR
Caractersticas das polimerases de DNA utilizadas em PCR
Clonagem de produtos de PCR
Estratgias de clonagem de produtos de PCR

Tpicos (2)
Variantes da tcnica de PCR
RT-PCR
RT-PCR modificado
RACE-PCR
Nested PCR
PCR alelo-especfico
Linker-primed PCR
PCR inverso
Meta-PCR
PCR mutagnico
PCR multiplex
PCR e RT-PCR em tempo real

Aplicaes da tcnica de PCR

Triagem de bibliotecas aleatrias (shotgun)
Diagnstico clnico (deteco de mutaes RFLPs, delees)
Diagnstico forense (amplificao de diferentes regies polimrficas)
Deteco de vrus e organismos patognicos (primers especficos)
Clonagem de genes por PCR com primers degenerados
Determinao do sexo de fetos em risco de adquirir uma doena ligada ao cromossoma X

Estratgias gerais de estudo de sequncias de DNA especficas em populaes de DNA

complexas

Descrio da tcnica de PCR (1)

N Novas cadeias de DNA

Descrio da tcnica de PCR (2)

Descrio da tcnica de PCR (3)

Anlise dos produtos de PCR

Caractersticas das polimerases de DNA utilizadas em PCR

Clonagem de produtos de PCR

Estratgias de clonagem de produtos de PCR

Adio de locais de restrio aos produtos de PCR

Sistema de clonagem T-A

Os produtos de PCR frequentemente tm uma

adenosina projectada nas extremidades 3.
O sistema de clonagem T-A envolve um polylinker
com timinas complementares projectadas para facilitar
a clonagem.

Vector pT-Adv

Sistema de clonagem TOPO-TA

Vector pCR4-TOPO

Vector pCR4Blunt-TOPO

RT-PCR

Permite detectar baixos nveis de expresso gnica.

Facilita a construo de bibliotecas de cDNA ou a clonagem de cDNAs especficos.

RT-PCR modificado (primer oligo dT modificado)

Clulas em estdios fisiolgicos ou de desenvolvimento diferentes
Dias

As diferenas nas bandas entre as

fontes de RNA (A e B) comparadas
indicam expresso diferencial.
Identificao de genes diferencialmente expressos
em diferentes estdios de desenvolvimento do
corao de ratinho.

Triagem multiplex da expresso gnica pelo mtodo do mRNA differential display

3 RACE-PCR (1)

A tcnica de RACE
(amplificao
rpida
das extremidades do
cDNA)
facilita
o
isolamento de sequncias
das extremidades 5 e 3
dos cDNAs, permitindo
obter cDNAs completos.
uma variante da
tcnica de RT-PCR em
que um dos primers tem
uma sequncia ncora
adequada (muitas vezes
>15 nts.) na extremidade
5.

A sequncia extra 5
pode ser:
um local de restrio
adequado para a clonagem
do cDNA
uma
componente
funcional, por exemplo
um promotor para a
regulao da expresso
um
nucletido
modificado contendo um
grupo reprter (nucletido
biotinilado) ou um grupo
marcado (fluorforo).

5 RACE-PCR (2)
Quando no se conhece parte
da sequncia do gene so
utilizados primers aleatrios.

Nested PCR

Este tipo de PCR aumenta

especificidade da amplificao.

PCR alelo-especfico (1)

A PCR alelo-especfico ou PCR baseada no sistema ARMS (sistema de mutao refractrio

amplificao) depende do emparelhamento perfeito das bases dos nucletidos da extremidade 3 dos
primers, permitindo a distino entre alelos que diferem num nico nucletido, isto , a deteco de
mutaes pontuais especficas associadas a doenas.

PCR alelo-especfico (2)

So tambm adicionados primers de controlo que amplificam
sequncias no relacionadas para testar a reaco de amplificao.

CON Primer conservado

Linker-primed PCR

Esta tcnica permite a

amplificao indiscriminada
de sequncias de DNA.

PCR inverso
As extremidades 3 dos primers tm
direces opostas.

Ligase de DNA
Baixas concentraes de
DNA favorecem a formao
de molculas de DNA circular
por ligao intramolecular.

Esta tcnica permite a clonagem de sequncias de DNA adjacentes a uma sequncia

conhecida a partir de um molde circularizado.

Meta-PCR (PCR de ligao de DNAs)

Primers com linkers que emparelham

nas extremidades 5.

2-5 exes com cerca de 20

pb de intro flanqueante

Os linkers permitem a formao de

conctemeros quando os primers se
esgotam.

A tcnica de meta-PCR permite ultrapassar a

disparidade entre a dimenso mdia dos exes
humanos (145 pb) e a dimenso ptima do produto
de sequenciao (500-800 pb) no estudo do DNA
genmico.

PCR mutagnico

A introduo de um local de
restrio artificial de diagnstico
permite
detectar
mutaes
pontuais associadas a doenas.
N - Homozigtico normal
H - Heterozigtico
M - Homozigtico mutante

PCR multiplex (1)

(A)

Produtos de PCR multiplex de nove exes do gene da distrofina

Os primers foram seleccionados de modo a que os exes com as sequncias intrnicas
flanqueantes origininassem produtos de PCR com dimenses diferentes.
Indivduos do sexo
masculino

Tcnica que envolve amplificaes simultneas na mesma reaco para detectar delees
homozigticas ou hemizigticas porque a sequncia deletada no amplifica por PCR.

PCR multiplex (2)

Mutaes no gene da distrofina em indivduos do sexo masculino

Interpretao dos resultados obtidos em 1: as linhas slidas representam exes deletados, as linhas a
tracejado representam possveis extenses das delees nos exes no testados.

PCR em tempo real (1)

PCR em tempo real (2)

Clonagem de genes por PCR com primers degenerados

A partir da sequncia de 32 aminocidos da
oxidase de urato foram construdos primers
degenerados, utilizados em RT-PCR de
mRNAs extrados de fgado de porco.

Determinao do sexo de fetos em risco de adquirir uma doena

ligada ao cromossoma X