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ORIGINALES
Actividad de la telomerasa en leucocitos
de sangre perifrica de pacientes con
hipertensin arterial esencial

48.509

Antonio Tristanoa, Mara Eugenia Cholleta, Mara L. Willsona, Haroution


Adjouniana, Mara Fernanda Correab y Adolfo Borgesc
a

Servicio de Medicina Interna. Hospital Dr. Domingo Luciani. Caracas.


Laboratorio de Biologa Molecular de Agentes Infecciosos. Universidad Central de Venezuela
(UCV). Caracas.
c
Seccin de Biomembranas del Instituto de Medicina Experimental (IME). Universidad Central
de Venezuela (UCV). Caracas. Venezuela.
b

FUNDAMENTO Y OBJETIVO: La activacin primaria o secundaria de mecanismos inmunes, que lleva


a una disfuncin y/o proliferacin de poblaciones celulares especficas, se ha implicado en la
patogenia y/o complicaciones de la hipertensin arterial esencial. En vista de que la longitud
de los telmeros determina el perodo de vida de una clula y que se han observado alteraciones replicativas en los leucocitos de sangre perifrica de pacientes con hipertensin arterial
esencial, investigamos la relacin entre la actividad de la telomerasa en los leucocitos de sangre perifrica, como un indicador del acortamiento telomrico, y la presencia de hipertensin
arterial.
PACIENTES Y MTODO: Determinamos la actividad de la telomerasa en leucocitos de sangre perifrica aislados de controles normales, pacientes con hipertensin esencial controlada y no controlada. Los leucocios de sangre perifrica se aislaron por gradiente de densidad, se lisaron y
su ADN se amplific por el mtodo de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La actividad
de la telomerasa se midi por un ELISA especfico.
RESULTADOS: El recuento de leucocitos fue significativamente mayor en los pacientes con hipertensin esencial en comparacin con el de los individuos sanos (p < 0,05). La actividad de la
telomerasa fue significativamente mayor en pacientes menores de 45 aos con hipertensin no
controlada, comparada con la de los individuos sanos y con los pacientes menores de 45 aos
con hipertensin controlada (p < 0,05). En este ltimo grupo, la actividad de la telomerasa fue
significativamente menor con respecto a los otros dos (p < 0,05).
CONCLUSIONES: Nuestros resultados indican que existe una relacin entre la actividad de la telomerasa en los leucocitos de sangre perifrica, la proliferacin de estos leucocitos y la presencia
de hipertensin arterial esencial.
Palabras clave: Hipertensin arterial. Leucocitos. Telomerasa. Telmero.

Telomerase activity in peripheral blood leucocytes from patients with essential


hypertension
BACKGROUND AND OBJECTIVE: Primary or secondary activation of the immune mechanisms that lead
to proliferation and dysfunction of specific cellular groups appears to be involved in the pathogenesis and complications of essential hypertension. In view of the evidence that, on one
hand, telomeric length determines the replicative capacity and life span of cells and, on the other
hand, idiopathic hypertensive patients have peripheral white cell replicative disorders, we decided to investigate the relationship between the influence of telomerase activity in peripheral leukocytes as an indirect marker of telomeric length and the presence of arterial hypertension.
PATIENTS AND METHOD: Telomerase activity in peripheral white blood cells was measured in healthy individuals, in effectively treated hypertensive patients and in a non-well controlled hypertensive group. White blood cells were separated through a density gradient, then lysed and
their DNA amplified by a polimerase chain reaction (PCR). Telomerase activity was determined
with an ELISA specific kit.
RESULTS: The white blood cell count was higher in the hypertensive than the control group (p <
0.05). Telomerase activity was positive in all three groups but higher in patients under 45 yearold with bad controlled hypertension as compared with healthy individuals and patients under
45 year-old with well controlled hypertension (p < 0.05); in the latter group, telomerase activity was significantly lower than in the other groups (p < 0.05).
CONCLUSIONS: Our results indicate that there exists a relationship between telomerase activity in
peripheral leukocytes, the proliferation of these white blood cells and the presence of essential
arterial hypertension.
Key words: Arterial hypertension. Leukocytes. Telomerase. Telomere.

Correspondencia: Dr. A. Tristano.


Poba International, 1-20255. P.O. Box 02.5255. Miami.
Florida. 33102-5255 USA.
Correo electrnico: mjtristano@cantv.net
Recibido el 24-5-2002; aceptado para su publicacin el 26-11-2002.

Se han involucrado mecanismos inmunes en la patogenia de la enfermedad hipertensiva, implicando tanto a la inmunidad celular como a la humoral1. Los
leucocitos han sido objeto de gran inters
en estudios sobre la patogenia de la hipertensin arterial (HTA)2. Se ha encontrado una asociacin entre un nmero
alto de leucocitos y mayor incidencia de
hipertensin3-5. Igualmente, se ha demostrado un incremento de la adhesin
de los leucocitos a la pared endotelial6-11
y el papel de las citocinas, tales como la
interleucina 1 beta (IL-1), interleucina 6
(IL-6) y el factor de necrosis tumoral alfa
(TNF-) en el desarrollo de la aterosclerosis12-14. Tambin se han encontrado alteraciones de la inmunidad humoral y del
sistema del complemento en pacientes
con HTA, principalmente hipergammaglobulinemia15-28.
Por otro lado, existen evidencias experimentales que apuntan a que un reloj
biolgico, el telmero, podra desempear un papel crtico en el control del lapso de vida celular in vitro y probablemente in vivo. Los telmeros son estructuras
especializadas que se encuentran al final
de los cromosomas de clulas eucariotas
y actan en la proteccin de los genes localizados en regiones subtelomricas y
en el posicionamiento y replicacin de los
cromosomas. La hiptesis telomrica del
envejecimiento celular podra explicar la
enigmtica expresin de la HTA esencial,
incluyendo la dependencia que sta tiene con la edad y su expresin fenotpica
inestable.
Los individuos que heredan telmeros
acortados son ms propensos a desarrollar en edades ms jvenes disfunciones
relacionadas con el acortamiento del telmero, incluyendo la expresin de variaciones genticas que causan HTA28-30. Ya
sea de forma primaria o secundaria, el
acortamiento telomrico puede formar
parte del curso clnico de la HTA esencial, bien sea aumentando la presin arterial o acelerando el envejecimiento mediado por la hipertensin de los rganos
implicados en la patogenia de ese trastorno.
Med Clin (Barc) 2003;120(10):365-9

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TRISTANO A, ET AL. ACTIVIDAD DE LA TELOMERASA EN LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFRICA


DE PACIENTES CON HIPERTENSIN ARTERIAL ESENCIAL

Las evidencias presentadas constituyen


pruebas slidas de que en la HTA aumenta la tasa de recambio de tipos celulares especficos, incluyendo los leucocitos de sangre perifrica, y que dentro de
la fisiopatologa de la HTA hay anomalas
inmunolgicas como resultado de la disfuncin y/o proliferacin de poblaciones
celulares especficas. En vista de que los
telmeros de las clulas con potencial replicativo se acortan con la edad y de que
se han observado alteraciones replicativas en clulas de sangre perifrica en individuos hipertensos, estudiamos si la actividad de la telomerasa (como marcador
de la longitud telomrica) en los leucocitos de sangre perifrica de individuos con
HTA esencial difera de la encontrada en
leucocitos de individuos normotensos.
Pacientes y mtodo
Pacientes
Se tomaron 31 voluntarios, divididos en tres grupos:
9 con HTA esencial controlada (4 mujeres y 5 varones); 11 con HTA esencial no controlada (9 mujeres
y dos varones), y 11 controles sanos (5 mujeres y
6 varones); todos fueron divididos en grupos etarios
(tabla 1). Los sujetos hipertensos fueron reclutados
de la consulta externa de Medicina Interna del Hospital Dr. Domingo Luciani de Caracas (Venezuela),
mientras que los sujetos sanos fueron escogidos entre el personal que trabaja en la institucin. Se elabor una ficha para la recoleccin de datos de todos los
sujetos que participaron en el proyecto previa autorizacin escrita de los mismos. El criterio para diagnosticar HTA esencial fue una cifra de presin arterial
sistlica igual o superior a 140 mmHg y/o una presin diastlica igual o superior a 90 mm Hg31, determinada mediante un esfigmomanmetro de mercurio
(ALP K2); siempre se us el mismo instrumento para
todos los sujetos. El diagnstico de HTA se realiz
despus de dos lecturas de presin arterial en dos visitas sucesivas, tras la valoracin inicial31. Para la lectura de la presin arterial el paciente se coloc sentado en una silla con soporte para los brazos, situados
stos a nivel del corazn. No deba haber ingerido
caf ni fumado por lo menos 30 min antes de la lectura. La lectura se realiz despus de 5 min de reposo.
Se utiliz un manguito adecuado a la circunferencia
del brazo, que cubri al menos el 80% del mismo.
Los pacientes hipertensos no controlados se clasificaron segn valor de la presin arterial en estadios 1 (n
= 3), 2 (n = 3) y 3 (n = 5)31. Se excluyeron los pacientes con diabetes mellitus, enfermedad arterial coronaria, enfermedad cerebrovascular, neoplasias y
enfermedad arterial obstructiva. Los pacientes seleccionados fueron aquellos que no tenan diagnstico
previo o hipertensos con y sin tratamiento. A todos
los sujetos se les practicaron un examen de orina,
determinacin de urea y creatinina, electrocardiograma (ECG), radiografa de trax posteroanterior y examen de fondo de ojo, para determinar el grado de lesin en los rganos diana.
Mtodo
Se tomaron 10 ml de sangre de cada sujeto usando
una inyectadora heparinizada y la muestra se coloc
de inmediato en hielo. Se tomaron 8 ml de cada
muestra y se colocaron en un tubo estril; a cada uno de estos tubos se le aadieron 6 ml de Histopaque y fueron centrifugados a 2.500 rpm durante 30 min. Una vez obtenida la separacin de los
diferentes grupos celulares, se procedi a tomar la
capa de leucocitos, que se transfiri a un nuevo
tubo estril. Se agreg a cada tubo 1 ml de solucin
salina buffer fosfato (PBS) y se procedi a una
nueva centrifugacin durante 5 min a 2.500 rpm.
Posteriormente se descart el sobrenadante y se resuspendi. Se realiz el recuento de clulas de

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Med Clin (Barc) 2003;120(10):365-9

TABLA 1
Distribucin de los pacientes segn grupos de edades
Edad (aos)

HTA no controlada (n)

HTA controlada (n)

Normotensos (n)

Total (n)

6
5
11

4
5
9

6
5
11

16
15
31

45
> 45
Total
HTA: hipertensin arterial.

cada muestra en un hemocitmetro y los leucocitos


se colocaron luego en microtubos de centrfuga de
1,5 ml de capacidad, libres de DNasa y RNasa y
congelados a 80 C. Todo este procedimiento se
realiz en el Laboratorio del Banco de Sangre del
Hospital Dr. Domingo Luciani de Caracas (Venezuela).
Para la determinacin de la actividad enzimtica se
utiliz un kit diagnstico de telomerasa PCR ELISA
(Boehringer Mannheim), el cual contiene todos los
reactivos para el anlisis, de acuerdo con el mtodo
de Kim et al32. Para la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliz un equipo GeneAmp PCR
System 9600 Thermal Cycler (Pekin Elmer Corporation, Foster City, CA, EE.UU.). Para la purificacin de
leucocitos, se utiliz Histopaque de una densidad
de 1.077 (SIGMA Diagnostics, St. Louis, MO, 63178
EE.UU.). Para las lecturas del enzimoinmunoanlisis
se emple un espectrofotmetro Multiskan MCC/340
(Lab Systems, Helsinki).
La actividad de la telomerasa se midi en los leucocitos extrados de sangre perifrica obtenidos como se
ha descrito anteriormente. Se determin la actividad
de la enzima por enzimoinmunoanlisis utilizando un
ensayo basado en la PCR designado como TRAP
(protocolo de amplificacin para repeticiones telomricas) desarrollado por Boehringer Mannheim, el cual
es una modificacin del mtodo descrito por Kim et
al32, en 1994, que se describe brevemente a continuacin.
En el primer paso, la telomerasa aade repeticiones
telomricas (TTAGGG) al extremo 3 del oligonucletido sinttico P1-TS marcado con biotina. En un segundo paso, esos productos de elongacin son amplificados por PCR usando los oligonucletidos P1-TS
y P2, generando productos de PCR con incrementos
especficos de 6 nucletidos. A diferencia de otros
ensayos TRAP, la telomerasa PCR ELISA contiene todos los componentes requeridos para la reaccin de
la telomerasa y la PCR, en una reaccin buffer lista
para usar combinando ambas reacciones en unpaso/un-tubo-reaccin.
A continuacin, una alcuota del producto de PCR se
somete a desnaturalizacin y es hibridizada a una
digoxigenina-(DIG)-marcada. El producto resultante
es inmovilizado en una placa cubierta de estreptavidina a travs del oligonucletido marcado con biotina, incorporado al producto de PCR. Las condiciones de la prueba de deteccin e hibridacin se han
optimizado para obtener la mayor sensibilidad y especificidad. Los productos de PCR inmovilizados
son luego detectados con un anticuerpo contra la
digoxigenina (anti-DIG-POD) que est conjugada a
una peroxidasa. Finalmente, el resultado de la prueba es visualizado en virtud de la capacidad de la
peroxidasa conjugada para generar un producto de
reaccin coloreado. Se incorporan controles experimentales positivos y negativos con el fin de demostrar que una seal positiva en el ensayo es indicativa de la presencia de una ribonucleoprotena capaz
de extender el oligonucletido TS con tres o ms repeticiones TTAGGG; la incorporacin de tales controles valida el ensayo para la deteccin especfica
de la actividad de telomerasa. La telomerasa requiere de la integridad de su componente ARN interno
para adicionar la secuencias de repeticiones telomricas al primer especfico32. De esa forma, la
preincubacin de clulas con RNasa destruira
completamente la actividad de la telomerasa contenida en el extracto y ofrecera un control de especificidad conveniente.
Se incuban 5 l de extracto celular, que corresponden a 5.000 clulas con RNasa libre de DNasa a una
concentracin de 1 g/ml durante 20 min a 37 C.
Para la telomerasa PCR ELISA, se utiliza una alcuota
de 1-3 l del extracto tratado; en nuestro caso utiliza-

mos 2 l del extracto (correspondiente a 200 clulas). El control positivo es parte del kit de diagnstico
y est constituido por clulas inmortalizadas de rin
humano, a una concentracin de 1.000 clulas/l. El
valor de absorbancia obtenido para el control positivo
(A450nm-A690nm) fue de 2,364 por encima del valor de
1,5 dado como referencia, lo que validaba el procedimiento realizado. Igualmente se realizaron controles
positivos a diferentes diluciones partiendo de la
muestra original, obtenindose absorbancias menores a menores diluciones, indicativo de una menor
actividad de la telomerasa, ya que progresivamente
se disminuy la concentracin inicial de 1.000 clulas/l. Para el control negativo, se obtuvieron valores
de absorbancia de 0,055 que estn por debajo del
valor requerido para asegurar la eliminacin de la telomerasa.
Preparacin de las muestras. Se transfirieron 2
105 clulas por reaccin a un tubo de Eppendorf, se
centrifug a 3.000 g durante 10 min a 4 C, posteriormente se elimin el sobrenadante, las clulas se
resuspendieron en PBS y se repiti la centrifugacin. Se retir de nuevo cuidadosamente el sobrenadante y se resuspendieron las clulas en 200 l
de reactivo de lisis; se retropipete al menos tres
veces y se incub en hielo durante 30 min, posteriormente se centrifug el lisado a 16.000 g durante
20 min a 4 C. Se tomaron 180 ml del sobrenadante y se transfirieron a un tubo limpio que se congel
a 80 C hasta su utilizacin.
Reaccin TRAP. Para cada muestra que deba ser
analizada se transfirieron 25 l de la mezcla de reaccin (solucin 2 del kit) a un tubo para PCR, se
aadieron 2 l del extracto celular (corresponden a
2.000 clulas) y se complet hasta 50 l con agua
estril. Todos los pasos se realizaron en hielo. Posteriormente se transfirieron los tubos a un ciclador
trmico en el cual se efectu la reaccin combinada
de elongacin/amplificacin.
Hibridacin y enzimoinmunoanlisis. Se tomaron 20
l de reactivo de desnaturalizacin (solucin 3 del
kit) y se colocaron en una placa, se agregaron 5 l
del producto de amplificacin y se incub a temperatura ambiente durante 10 min. Posteriormente se
agregaron 225 l de buffer de hibridacin (solucin
4 del kit) y se mezcl (todo este proceso se realiz
para cada muestra). Se transfirieron 100 l de la
mezcla para una placa suministrada por el kit, se
cubri a fin de prevenir la evaporacin y se incub
durante 2 h a 37 C mientras se agitaba a 300 rpm.
Una vez realizada la incubacin, se retir la solucin
completamente y se lav con 250 l de solucin buffer
(solucin 5 del kit) durante 30 s cada una y se retir el buffer cuidadosamente. Con posterioridad se
aadieron 100 l de anti-DIG-POD (solucin 11 del
kit), se cubri la placa y se incub a temperatura
ambiente durante 30 min mientras se agitaba a 300
rpm. Se retir la solucin completamente, se lav
nuevamente con buffer 5 veces, se retir el buffer
y se agregaron 100 l de solucin TMB (solucin
8 del kit), se cubri la placa y se dej a temperatura
ambiente durante 20 min mientras se agitaba a 300
rpm. Sin retirar el sustrato, se agregaron 100 l de
reactivo con el fin de detener la reaccin (solucin
9 del kit). Posteriormente con un lector de enzimoinmunoanlisis se midi la absorbancia de las muestras a 450 nm con un valor de referencia de 690
nm dentro de los 30 min despus de haber detenido la reaccin (A450nm-A690nm). Estos anlisis se llevaron a cabo en el Laboratorio de Biologa Molecular
de Agentes Infecciosos del Instituto de Medicina Experimental (IME) y en el Instituto de Inmunologa de
la Universidad Central de Venezuela (UCV).

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TRISTANO A, ET AL. ACTIVIDAD DE LA TELOMERASA EN LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFRICA


DE PACIENTES CON HIPERTENSIN ARTERIAL ESENCIAL

0,09
Actividad de la telomerasa

Actividad de la telomerasa

0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00

HTA no controlada

0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00

45
> 45
Grupo de edad (aos)

HTA controlada
Actividad de la telomerasa

Sanos
0,08

45
> 45
Grupo de edad (aos)

0,10
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00

45
> 45
Grupo de edad (aos)

Fig. 1. Actividad de la telomerasa en pacientes con hipertensin arterial (HTA) controlada, no controlada y normotensos, agrupados por edades.

Resultados
La mediana del recuento de leucocitos
de los pacientes sanos (n = 11) fue de
8.100 clulas/l (IC del 95%, 6.850-8.950)
mientras que los pacientes con HTA (n = 20)
presentaron una mediana de 23.250 clulas/l (IC del 95%, 12.100-32.050), diferencia que es estadsticamente significativa (p 0,05).
Se midi la absorbancia de todas las
muestras (tabla 2; figs. 1 y 2) y se calcul
la mediana de las mismas en cada grupo
obtenindose los siguientes resultados:
para el grupo con HTA controlada y edad
menor o igual a 45 aos fue de 0,056;
para el mismo grupo pero con edad mayor
de 45 aos fue de 0,081, diferencia estadsticamente significativa (p = 0,00049).
Para el grupo de HTA no controlada se
obtuvo una mediana de la absorbancia
de 0,08 para una edad de 45 aos o superior mientras que para los mayores de
45 aos fue de 0,0725, con un valor de p
0,05, diferencia estadsticamente significativa. Finalmente, para el grupo de pacientes sanos (sin HTA), obtuvimos una
mediana de la absorbancia de 0,071 para
los de edad menor o igual a 45 aos y de
0,0725 para los mayores de 45 aos, diferencia no significativa (p = 0,79) (fig. 1).
Cuando comparamos los grupos con una
edad menor o igual a 45 aos obtuvimos
los siguientes resultados (fig. 2): la absorbancia para el grupo de HTA controlada
fue de 0,056, mientras que en el grupo

de HTA no controlada fue de 0,08, siendo la diferencia estadsticamente significativa (p = 0,00032). La absorbancia en
el grupo de sujetos sanos fue de 0,071,
siendo la diferencia estadsticamente significativa tanto con el grupo con HTA
controlada (p = 0,00972) como con el
grupo de HTA no controlada (p 0,05,
prueba de Mann-Whitney). Sin embargo,
cuando comparamos los grupos de edad
mayor de 45 aos, encontramos que la

absorbancia en el grupo con HTA controlada fue de 0,081, mientras que en el


grupo con HTA no controlada fue de
0,0725, diferencia que no es estadsticamente significativa (p = 0,097). A su vez,
la absorbancia en el grupo de sujetos
sanos fue de 0,0725, siendo la diferencia
estadsticamente significativa con respecto
al grupo de HTA controlada (p = 0,0156),
pero no fue significativa con respecto al
grupo de HTA no controlada (p = 0,81).

TABLA 2
Actividad de la telomerasa de los diferentes grupos estudiados
y distribuidos por edad
Edad (aos)

45
> 45

HTA controlada (n)

HTA no controlada (n)

Sanos (n)

Mediana (intervalo)

Nmero

Mediana (intervalo)

Nmero

Mediana (intervalo)

Nmero

0,056 (0,05-0,064)
0,081 (0,0725-0,0875)

8
10

0,08 (0,073-0,095)
0,0725 (0,065-0,082)

12
10

0,071 (0,065-0,078)
0,073 (0,065-0,082)

12
10

Los datos se expresann como mediana con el intervalo de confianza del 95%. Anlsis de la variancia de Krustal y Wallis (p =
0,015, 5 grados de libertad).

Edad 45 aos
0,10
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00

Edad > 45 aos


0,09
Actividad de la telomerasa

Se compararon los grupos utilizando anlisis estadsticos no paramtricos (anlisis de variancia de Kruskall y Wallis). Los valores de p inferiores a 0,05 se
consideraron significativos. Se calcul la mediana
con un intervalo de confianza (IC) del 95% por el
mtodo de Hodges y Lehman, y se utiliz tambin la
prueba de Mann-Whitney (Wilcoxon). Se emple el
programa EST.exe. del entorno MS WINDOWS 98
(Microsoft, Redmont, EE.UU.).

Actividad de la telomerasa

Anlisis estadstico

HTA
HTA no
PA
controlada controlada normal
Grupo de pacientes

0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00

HTA
HTA no
PA
controlada controlada normal
Grupo de pacientes

Fig. 2. Actividad de la telomerasa en pacientes con edades menores o iguales a 45 aos y mayores de 45
aos en los diferentes grupos estudiados. *Significacin con respecto a hipertensin arterial (HTA) no controlada; **significacin con respecto a normotensos.
Med Clin (Barc) 2003;120(10):365-9

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TRISTANO A, ET AL. ACTIVIDAD DE LA TELOMERASA EN LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFRICA


DE PACIENTES CON HIPERTENSIN ARTERIAL ESENCIAL

Actividad de la telomerasa

0,12
0,11
0,10
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
10

20

30

40
50
60
Edad (aos)

Al calcular la mediana de la absorbancia


de los grupos sin tener en cuenta la
edad, no encontramos diferencias estadsticamente significativas (tabla 3). En la
tabla 4 y figura 3 se aprecia que existe
una tendencia a la disminucin de la actividad de la telomerasa con la edad en
todos los grupos estudiados, con ciertas
variaciones despus de los 40 aos de
edad. No hubo diferencias estadsticamente significativas al comparar las medianas de la absorbancia entre los grupos
divididos segn el estadio de la HTA.
Iguales resultados se obtuvieron al comparar pacientes con o sin complicaciones
de la HTA.
Discusin
En el presente estudio se aislaron leucocitos de sangre perifrica de pacientes
con HTA esencial controlada, no controlada y en pacientes sin HTA (sanos). Se
lisaron las clulas y se determin la actividad de la telomerasa por el mtodo de
TABLA 3
Actividad de la telomerasa determinada
sin tener en cuenta la edad de los
pacientes
Grupos

Mediana (intervalo)

HTA controlada
0,07 (0,0635-0,076)
HTA no controlada 0,0725 (0,0645-0,082)
Normotensos
0,069 (0,0625-0,0755)

Nmero

18
22
22

Los datos se expresan como mediana con el intervalo de confianza del 95%. Anlisis de la variancia de Kruskal y Wallis.

70

80

Fig. 3. Tendencia de la
actividad de la telomerasa
a disminuir con la edad.
La lnea indica la curva de
regresin determinada por
anlisis de regresin polinomial. Se incluye a todos
los pacientes estudiados.

enzimoinmunoanlisis, despus de amplificar por PCR las secuencias elongadas in vitro por la telomerasa presente en
los extractos. Se observ que los pacientes con HTA tienen mayor cantidad de
leucocitos (p 0,05) que los individuos
sanos. Este hallazgo concuerda con estudios realizados por Schmid-Schonbein et
al5, quienes encontraron un aumento
significativo del nmero de leucocitos en
ratas hipertensas. Igualmente Gillum y
Mussolino3 observaron una asociacin
entre la presencia de un alto nmero de
leucocitos y la mayor incidencia de HTA;
de ah que se involucre a los mecanismos inmunolgicos en la patogenia y
complicaciones de la HTA.
Otro hallazgo importante fue que la actividad de la telomerasa en los leucocitos de
la sangre perifrica tuvo tendencia a disminuir con la edad, independientemente
de la presencia o no de HTA (tabla 4,
fig. 3); sin embargo, esta disminucin no
fue lineal, en vista de que se detectaron
variaciones importantes despus de los
40 aos de edad, y en algunos casos con
una actividad de telomerasa muy baja o
ausente. Cuando slo se determin la relacin entre la edad y la actividad de la
telomerasa en los pacientes sanos, se observaron una mayor tendencia de disminucin de dicha actividad antes de los
40 aos y una mayor variacin, incluso
con aumento de la actividad, despus de
los 40 aos de edad, lo cual hizo evidente el efecto que tiene la HTA sobre la actividad de la telomerasa (datos no ex-

TABLA 4
Actividad de la telomerasa segn la edad de los pacientes
HTA controlada (n)

Edad (aos)

30
31-40
41-50
51-60
> 60

Media

Nmero

0,0535
0,048
0,0758
0,0825
0,0697

2
2
8
2
4

Datos expresados como media.

368

Med Clin (Barc) 2003;120(10):365-9

HTA no controlada (n)


Media

0,0725
0,09
0,0776
0,068
0,07

Sanos (n)

Nmero

Media

Nmero

2
6
8
2
4

0,074
0,0686
0,0617
0,0667
0,0745

4
6
4
4
4

puestos). Estos datos concuerdan con el


estudio de Iwama et al33, quienes describieron (en pacientes sanos) que el 65%
de los sujetos mayores de 40 aos tenan
una muy baja actividad de la telomerasa
en leucocitos, mientras que en el grupo
restante no se midi actividad alguna.
Todo esto afianza el conocimiento de que
el acortamiento del telmero lleva a un
envejecimiento celular y se traduce en
una menor actividad de la telomerasa (hiptesis telmero-telomerasa).
La actividad de la telomerasa fue mayor
en los grupos con HTA no controlada
(p 0,05) y en los sanos con edad menor o igual a 45 aos, siguiendo la tendencia de una mayor actividad de la telomerasa en pacientes ms jvenes, la cual
disminuy progresivamente con la edad
(tabla 2, fig. 1). As mismo, los pacientes
con HTA controlada pertenecientes a este
mismo grupo etario tuvieron la menor actividad de la telomerasa (p = 0,0004), inclusive al compararla con los mayores de
45 aos. Esta variacin pudo deberse al
efecto que pudiera tener el tratamiento
(dos pacientes reciban captopril, otros
dos losartn y 6 enalapril) que recibieron
estos pacientes sobre la actividad de la
telomerasa, probablemente inhibiendo
directa o indirectamente su accin y llevando a una disminucin de la proliferacin y activacin de los leucocitos, y que
sta sea ms pronunciada en el grupo de
edad con mayor actividad de la misma,
como son los pacientes menores de 40
aos. Esto concuerda con lo referido por
Chisi et al34, quienes encontraron que el
tratamiento in vitro e in vivo con el antihipertensivo captopril reduce la tasa proliferativa de una serie de clulas hematopoyticas mediante su accin en protenas
crticas para la progresin durante el ciclo celular.
Cuando comparamos la actividad de la
telomerasa entre los pacientes con HTA
controlada, no controlada y sanos (fig. 2),
encontramos que en el grupo de edad
menor o igual a 45 aos la actividad de la
telomerasa fue mayor en los pacientes
con HTA no controlada. Esto hace pensar
que los factores que determinan la aparicin de la HTA podran igualmente activar la expresin de la telomerasa en los
leucocitos de sangre perifrica de estos
pacientes. Alternativamente, la expresin
de esta enzima podra ser un acontecimiento posterior una vez instalada la HTA.
Sea como causa o efecto, sta es la primera evidencia experimental que relaciona la HTA esencial con la actividad de la
telomerasa a travs del sistema inmunolgico. Ello planteara la existencia de un papel del sistema inmune en la patogenia y/o
complicaciones de la HTA4-24,27,28. Sin embargo, est an por estudiar el curso temporal de la activacin de la telomerasa en
pacientes con HTA con el fin de determi-

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TRISTANO A, ET AL. ACTIVIDAD DE LA TELOMERASA EN LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFRICA


DE PACIENTES CON HIPERTENSIN ARTERIAL ESENCIAL

nar si tal activacin puede ser el resultado de la produccin de factores dependientes de la HTA.
Otra consideracin a tener en cuenta es
que si la HTA llevara a un aumento de la
actividad de la telomerasa en los leucocitos, y por ende a una proliferacin de stos, podra igualmente conducir a un aumento de la telomerasa en otras clulas
afectadas durante el proceso, como las
del endotelio vascular y msculo liso, y
por tanto a una hiperproliferacin de las
mismas y de esa manera participar en la
patogenia de la HTA esencial. Chang y
Harlery35 presentaron evidencias que
apuntan a que otras clulas del sistema
cardiovascular podran estar involucradas; as encontraron que clulas endoteliales de los vasos en humanos, como
otras clulas replicativas, presentan una
reduccin en la longitud del telmero dependiente de la edad35. Por su parte Cao
et al37 encontraron un aumento de la actividad de la telomerasa en aorta de ratas
hipertensas espontneas, tanto in vivo
como in vitro. La inhibicin de la telomerasa produjo en estas ratas una reduccin en la proliferacin incrementada de
las clulas del msculo liso vascular e indujo apoptosis de las mismas. La apoptosis se redujo al incrementar la expresin
de la protena supresora de tumor p53. A
su vez, Minamino y Kourembanas37 describieron que la telomerasa se expresa en
clulas del msculo liso vascular y que el
incremento de la actividad de la telomerasa se correlaciona con proliferacin de
estas clulas. En otro estudio, Minamino
et al38, por medio de la hipoxia crnica,
indujeron la proliferacin de clulas musculares lisas y el remodelado de la pared vascular pulmonar, esto como consecuencia del aumento, en estas clulas,
de la actividad de la telomerasa y de la
estabilizacin del telmero.
Existen algunas evidencias, basadas en
experimentos in vitro, que demuestran
que la senescencia de las clulas del endotelio vascular, mediada por el telmero, puede provocar disfuncin endotelial,
particularmente en regiones aterosclerticas. Este efecto puede estar mediado por
uno de los pocos factores que aceleran el
acortamiento del telmero en estas clulas y en los leucocitos, como son las molculas resultantes del estrs oxidativo. A
su vez, la inflamacin produce un incremento del estrs oxidativo y del recambio
de leucocitos. Estas evidencias estn en
lnea con el concepto de que la inflamacin es un factor importante que incrementa el riesgo de enfermedad cardiovascular asociado con la edad39.
Cuando comparamos la actividad de la telomerasa en los pacientes mayores de 45
aos, encontramos muy poca diferencia
entre los grupos; slo hubo diferencia es-

tadsticamente significativa entre el grupo


con HTA controlada y los sanos. Sin embargo, como ya hemos sealado, la actividad de la telomerasa es muy variable en
este grupo de edad, oscilando entre valores muy bajos a nulos.
Al comparar la actividad de la telomerasa
en los pacientes con HTA no controlada
segn el estadio, no encontramos diferencias significativas, lo que plantea la
posibilidad de que el grado de HTA no
determine el grado de actividad de la telomerasa en los leucocitos y, por tanto,
que la relacin entre el sistema inmunolgico y la HTA se establece independientemente del grado de esta ltima.
Con respecto a los pacientes con complicaciones de la HTA, no se pudo establecer una comparacin entre la actividad
de la telomerasa y la presencia de complicaciones crnicas de la HTA, dado el
bajo nmero de la muestra en estudio.
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