ANEXO PRCTICAS BACTERIOLOGA

PRCTICA 4: TINCIN DE GRAM.

La Tincin de Gram se trata de una tincin compuesta que nos permite obtener
informacin acerca de la estructura del microorganismo. Presenta distintos pasos una
vez que la muestra ya se encuentra en el portaobjetos:

Aadir cristal de violeta (2 minutos). En el caso de que el microorganismo se

tia en ese momento, adquiriendo color purpura, indica que presenta una capa de
peptidoglicano que retiene el colorante y, por ello, se tie. Por lo tanto, se
tratara de un microorganismo Gram positivo.

Tirar el colorante y aadir lugol (2 minutos). El lugol acta como mordiente,

facilitando la fijacin del colorante.

Acetona (20-30 segundos). Sirve para eliminar el colorante no fijado.

Lavar con agua y aadir safranina. Se trata de un colorante de contraste que tie
de color rojo a aquellos microorganismos que por sus caractersticas no se han
teido con el cristal de violeta. Por lo tanto, se tratan de Gram negativos.

Lavar con agua y secar al aire. Tras esto, se puede visualizar al microscopio.

RESUMEN
GRAM POSITIVO

GRAM NEGATIVO

Se tie con el cristal de violeta

Se tie con safranina

Adquiere color prpura

Adquiere color rojo

Gruesa capa de
peptidoglicano

Fina capa de peptidoglicano y

gruesa membrana externa

PRCTICA 5: TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN

La Tincion de Ziehl-Neelsen es otra tincin compuesta que sirve para teir aquellos
microorganismos que se tien mal con el Gram pero que presentan en su estructura
determinados elementos como los cidos miclicos que hace que adquieran color con
esta tincin. Los distintos pasos son los siguientes:

Aadir fucsina. Aquel microorganismo que sea acido-alcohol resistente, se

teir de color rojo con la fucsina.

Aplicar calor. Acta como mordiente para flamear hasta la emisin de vapores.

Lavar la preparacin, administrar HCl y volver a lavar con agua.

Aadir azul de metileno. Se trata de un colorante de contraste que hace que

aparezca todo de azul excepto los microorganismos teidos con la fucsina.

Lavar, dejar secar y observar al microscopio.

TINCION DE
GRAM
TINCION DE
ZIEHL-NEELSEN
NEELSEN

Cristal de violeta (Gram positivo).

Mordiente: Lugol.
Colorante de contraste: Safranina.
Fucsina (cido-alcohol resistente).
Mordiente: Calor.
Colorante de contraste: Azul de metileno.

PRCTICA 6:: MEDIOS DE CULTIVO BACTERIANOS

Los medios de cultivo se pueden clasificar segn diferentes criterios:
1. Segn el contenido: Vivos, sintticos y semisintticos. Por ejemplo, los medios
vivos contienen clulas las cuales son necesarias para la multiplicacin del
microorganismo en cuestin.
2. Segn su utilizacin: Es ell criterio ms importante y, por ello, se van a explicar
los distintos medios en base a dicho criterio.
criterio
a. Comunes. Son aquellos en los que crecen un elevado nmero
nme de
microorganismos.
b. Selectivos. Son aquellos en los que slo interesa que crezcan algunos
microorganismos. Para ello, se impide el crecimiento de otros.
c. Diferencial. Consiste en la adiccin de un elemento al medio para que
un microorganismo determinado responda o no. Nos sirve para
diferenciar ciertas caractersticas.
d. De transporte y De conservacin.
3. Segn el estado fsico: lquido, slido y semislido.

MEDIOS COMUNES.

1. Peptonas.
Consiste en la presencia de peptonas obtenidas por digestin enzimtica de protenas.
2. Caldo comn.
Se hierve carne y al lquido obtenido, se le aade una cierta cantidad de peptonas,
NaCl
3. Agar comn (mezcla de los 2 anteriores).

MEDIOS ENRIQUECIDOS.

1. Agar sangre (Agar comn + sangre).

La sangre utilizada no es humana ya que no se puede desperdiciar y podra presentar
anticuerpos que compliquen el crecimiento del microorganismo, por lo que se utiliza
sangre de cordero. Hay microorganismos que pueden producir hemolisis de la sangre y,
segn la reaccin, se clasifican en:

Hemolisis . Hay hemolisis parcial. Se lisan los hemates y se produce una

liberacin de bilirrubina, quedando alrededor de la colonia, dando un aspecto de
halo verdoso.

Hemolisis . La hemolisis es total y se produce la metabolizacin de la

bilirrubina y otros elementos. Se observa un halo transparente.

Hemolisis . No hay hemolisis.

2. Agar chocolate.
Similar al Agar sangre pero se diferencia en que los hemates se encuentran lisados.
3. Medio de CLED.
Contiene: C (cistina), L (lactosa) y ED (electrn deficiente). Tiene un indicador de pH
que es el azul de bromotimol que segn sea el pH presenta un color distinto:

pH cido: amarillo.
pH neutro: verde claro.
pH alcalino: azul.

MEDIOS SELECTIVOS.

1. Agar MacConkey.
Se trata de un medio para bacilos Gram negativos que est compuesto por Agar comn,
cristal de violeta, sales biliares, lactosa y rojo neutro (indicador de pH).
2. Agar sal manitol.
Contiene gran cantidad de sal, manitol y rojo fenol (indicador de pH). Con esa cantidad
de sal permite el crecimiento slo de Estafilococos. El indicador de pH es el siguiente:

pH cido. Color amarillo. Sera manitol positivo y podra S. Aureus.

pH bsico. Color rojizo. Sera manitol negativo y podra S. epidermidis.

3. Agar Sabouraud.
Contiene cloranfenicol (antibitico) que impide el crecimiento de las bacterias,
favoreciendo el de los hongos.

4. Agar Salmonella-Shigella (SS). Para coprocultivos.

5. Medios cromognicos. Para identificacin de hongos.
6. Agar Granada. Se utiliza para Streptococcus B.

PRCTICA 9: IDENTIFICACIN BIOQUMICA.

Hay pruebas especficas para Gram positivos y otros para Gram negativos.

GRAM POSITIVO.
1. CATALASA.
Se basa en una reaccin enzimtica que consiste en la transformacin de agua
oxigenada en agua y oxgeno, apareciendo burbujas en la reaccin. Esto ocurre si el
microorganismo tiene la enzima catalasa.

2. NITRATOS.
Consiste en saber si la bacteria tiene la enzima nitrato-reductasa que reduzca los nitratos
en nitritos. Los pasos son los siguientes:

Tubo con el microorganismo y un medio lquido cuyo componente son los

nitratos.

Tras 24 horas a 37C, se aaden unos reactivos que son ortotoluidina+potasa

para detectar la presencia de nitritos.
o Positivo. Hay nitritos y tiene color rojo ladrillo.
o Negativo. No hay nitritos y es incoloro.
Sin embargo, puede ocurrir que las bacterias hayan metabolizado tambin los
nitritos, por lo que habra dado un falso negativo. Por ello, se hace una 2 lectura
con unos polvos determinados.
o Positivo. No hay nitrato y es incoloro.
o Negativo. Hay nitratos y es rojo.
Por lo tanto, la prueba ser positiva si primero aparece rojo y en la 2 lectura es
incolora o, bien, ambas lecturas son incoloras.

3. FERMENTACION GLUCOSA.
Consiste en determinar si el microorganismo oxido y/o fermenta la glucosa. Se requiere
un tubo con un medio de cultivo slido, un asa de platino y un indicador de pH que es el
azul de bromotimol cuyo color vara:

pH cido. Color amarillo y se produce porque el microorganismo ha consumido

glucosa.
pH neutro. Color verde.
pH alcalino. Color azul.

Uno de los tubos se le aade parafina para aislarlo del oxgeno del ambiente con el
objetivo de que tenga lugar la fermentacin en caso de que el microorganismo pueda.
Los resultados posibles son los siguientes:
OXIDACIN

FERMENTACIN

RESULTADO

+
+
-

+
+
-

Amarillo Amarillo
Amarillo Verde
Verde Amarillo
Verde - Verde

4. COAGULASA.
Se utiliza suero animal y, en caso, de que el microorganismo presente la enzima, ste
ser capaz de formar aglutinaciones como sucede con S. aureus.

5. BACITRACINA Y OPTOQUINA.
Se realiza en Agar Sangre. Consiste en impregnar a un disco de un dimetro inferior a 1
cm con bacitracina y otro con optoquina. Tras 24 horas a 37C, se observa:

Halo de inhibicin en bacitracina (positivo): S. Pyogenes.

Halo de inhibicin en optoquina (positivo): S. Pneumoniae.

GRAM NEGATIVO.
1. OXIDASA.
Consiste en determinar la presencia de la enzima citocromo-oxidasa en el
microorganismo. Se observa si ste es capaz de ennegrecer el disco presente en el medio
de cultivo y nos permite diferenciar entre algunas Enterobacterias y otras bacterias
Gram negativas.

2. MEDIO DE KLIGLER.
Esta prueba consiste en un calentador con un imn que va agitando al mismo tiempo.
Cuando se enfre (<50C) se inclina el tubo y se favorece su posterior obtencin de la
muestra. Luego, se utiliza el asa de punta con el que pinchamos el medio de cultivo en
la zona intermedia hasta el fondo del tubo.
Este medio mide el consumo de lactosa y glucosa con produccin o no de gas, consumo
de peptonas y produccin de sulfhdrico. Para ello, es necesario un indicador de pH que

es el rojo fenol que en medio cido se vuelve amarillo, en medio alcalino rojo intenso y
a pH neutro es rojo. Con todo esto, vamos a interpretar los distintos resultados:

Consume glucosa en anaerobiosis (aparecen burbujas) y (aerobiosis), por lo que

el tubo es amarillo.

Se agota la glucosa, consume peptonas porque la lactosa es ms dificultosa de

consumir. Lo hace en aerobiosis, apareciendo el tubo de color rojo intenso.

Consume lactosa en aerobiosis, dando color amarillo.

Produccin de sulfhdrico, por lo que se ennegrece el tubo. Cuando ms

produzca, ms oscuro.

3. ONPG.
Esta prueba se realiza de manera paralela al Kligler para valorar si el microorganismo es
lactasa positiva lenta o lactasa negativa. Si es lactasa positiva aparece de color amarillo
y si no lo es, no vara el color.

4. IMViC.
a) Indol.
Permite detecta la presencia de la enzima triptofanasa que reduce el triptfano presente
en los medios de cultivo de peptona. Se tiene un tubo de un caldo nutritivo con
peptonas, se emulsiona e incube a 37C durante 24 horas. Luego, el indol aparece
cuando se aade 1 reactivo con 2 componentes en el que uno hace que flote y el otro
revele el indol. Los resultados son los siguientes:

Positivo: Aparece color rojo guinda (E. Coli).

Negativo: Aparece color amarillo claro (Proteus).

b) Rojo-Metilo.
Permite determinar si el microorganismo asimila la glucosa y qu cantidad.
c) Voges.
Determina la capacidad de consumir glucosa por la va 2-3 butilenglicolica. La
descompone en acetoina y se observa tras 24 horas a 37C.
d) Citrato de Simon.
Permite detecta la capacidad de consumir citrato como nica fuente de carbono. Para
ello, se usa un asa de platina en redondo y se siembra en la superior de la lengeta. Si se
consumen los citratos, queda libre Na+ y el pH aumenta. La variacin del pH la detecta
el azul de bromotimol:

Positivo. Consume citratos y el pH aumenta, aparece color azul.

Negativo. No consume citratos, el pH no vara y el color ser verde.

5. LAO.
Se trata de una prueba que se realiza sobre bacterias que sabemos que consumen
glucosa. Consiste en 3 pruebas simultneas que detectan la presencia de una enzima.
Consiste en la adicin de glucosa y lisina a un medio liquido. Se utiliza como indicador
de pH el azul de bromocresol para valorar los resultados:

pH cido: Amarillo.
pH neutro: Prpura.
pH alcalino: Prpura ms intenso.

En paralelo, se cogen 2 tubos, uno con slo lisina y otro sin l durante 24 horas a 37C.
Los resultados son:

Consume glucosa: Tubo amarillo.

Se agota glucosa y consume lisina: Tubo prpura.
2 tubos amarillos (no consume lisina): Prueba negativa.

6. FDA (Fenolamina + Agar)

Nos permite saber si el microorganismo tiene fenilalamina desaminasa que produce
pirvico. Mediante el indicador de pH se determina que es positivo si aparece color
verde y negativo si es amarillo.
7. UREASA
Esta prueba se basa en la deteccin de si el microorganismo presenta o no la enzima
ureasa. El fundamento es el siguiente:
+  CO + NH OH CO + NH ! + OH " $% ('()(* *(+()