TECNOLGICO NACIONAL DE MXICO

INSTITUTO TECNOLGICO DE RSULO GALVN

REPORTE FINAL DEL SERVICIO SOCIAL

PROGRAMA:
VARIACIN GENTICA Y PATOGNICA DE
HONGOS EN Vanilla planifolia Y Vanilla pompona
PRESENTA ALUMNO:
MARCOS SARED DE LA O HERNNDEZ
LICENCIATURA EN BIOLOGA
ESPECIALIDAD:
BIOTECNOLOGA Y MEDIO AMBIENTE

URSULO GALVAN, VER., MARZO DE 2015

Carretera Cardel-Chachalacas Km. 4.5,

C. P. 91667, rsulo Galvn, Veracruz.
Tel. (296) 962 50 29
www.itursulogalvan.edu

TECNOLGICO NACIONAL DE MXICO

INSTITUTO TECNOLGICO DE RSULO GALVN

REPORTE FINAL DEL SERVICIO SOCIAL

Nombre del
Estudiante:
Carrera
:
Semestre:

DE LA O HERNNDEZ MARCOS SARED

Especialida
BIOTECNOLOGA Y MEDIO
d:
AMBIENTE
N. De Control:
11881440

LICENCIATURA EN BIOLOGA
VIII

1. Dependencia u Organizacin Oficial Donde Realiz el Servicio Social

INSTITUTO TECNOLGICO DE RSULO GALVN
2. Fecha de
25 DE AGOSTO DE
Fecha de
Inicio:
2014
Terminacin:
3. Modalidad del Servicio Social:
X

Individual

Brigadas Disciplinarias

6 DE FEBRERO DE
2015

Brigadas Interdisciplinarias

4. Tipo de Empresa
Docencia
Actividades Culturales y Deportivas
Desarrollo de la Comunidad
Asistencia Tcnica
Administracin
Asesora y Consultora
X

Investigacin y Desarrollo

5. Principales Actividades Realizadas

1.- PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO PARA EL ESTABLECIMIENTO DE CEPAS MICROBIOLGICAS.
2.- MULTIPLICACIN DE CEPAS FNGICAS ANTE ESPECIES DE VAINILLA.
3.- ESTANDARIZACIN DE PROTOCOLOS DE EXTRACCIN DE ADN Y CARACTERIZACIN MOLECULAR.
Vo.Bo.
C.

MARCOS SARED DE LA O HERNNDEZ

SELLO

C.

DRA. JACEL ADAME GARCA

NDICE
CAPTULO

PGINA

I.
INTRODUCCIN.............................................................................................................1
II. DESARROLLO DE ACTIVIDADES.......................................................................2
III. RESULTADOS............................................................................................................5
IV. CONCLUSIONES......................................................................................................6
V. RECOMENDACIONES..............................................................................................6
VI. ANEXO FOTOGRAFAS .........................................................................................8

I. INTRODUCCIN
Uno de los principales factores que daan y reducen la produccin de vainilla son las
enfermedades. Las condiciones de temperatura y humedad bajo la cual crece sta
orqudea favorecen el desarrollo de patgenos, principalmente hongos. Estos hongos
provocan pudricin de tallo y raz, marchitamientos, roya, necrosis o antracnosis. Para
Mxico (centro de origen de la vainilla), los estudios de hongos que afectan a la vainilla
son realmente escasos. Se podra decir que no hay reportes sobre diversidad gentica o
patognica, los cuales coadyuven a integrar y entender el comportamiento de especies y
razas de hongos asociadas a enfermedades en vainilla.
Actualmente, con ayuda de los marcadores moleculares, se puede obtener informacin
de relevancia para estudios de gentica y ecologa poblacional. Adems, los marcadores
basados en ADN poseen ventajas sobre las tcnicas tradicionales para el reconocimiento
taxonmico. Cabe mencionar, que su aplicacin no se restringe a especies procariotas,
sino que tambin a organismos superiores como orqudeas y cactceas. Dentro de stas
ltimas, son de las familias vegetales menos estudiadas genticamente. Las cactceas
exhiben polimorfismos muy altos, fenmeno que inhibe y complica su caracterizacin
puntual. Asimismo, las condiciones bioqumicas de sus tejidos dificultan la extraccin de
cidos nucleicos de calidad y cantidad deseable.
Debido a la situacin planteada, el presente estudio pretende obtener una base amplia
sobre la diversidad y variacin gentica y patognica de hongos asociados a vainilla.
Tambin, revelar informacin gentica de cactceas y orqudeas de importancia
agronmica y ecolgica. Al conocer los patrones genticos y patognicos de los hongos
asociados a enfermedades en vainilla, se podran correlacionar los datos con respecto a
la problemtica del cultivo y en beneficio de la produccin. Con las caracterizaciones
genticas de especies vegetales de inters, se estableceran mejores estrategias para su
explotacin sustentable y posteriores estudios biotecnolgicos. Hoy en da, es
indispensable la estimacin de ndices de variacin y diversidad bioqumica y gentica
con propsito de lograr un manejo adecuado sobre los recursos fitogenticos.
1

II. DESARROLLO DE ACTIVIDADES

2.1. PRIMER BIMESTRE
Se realizaron actividades encaminadas al muestreo de materiales vegetales: Vanilla spp.
e Hylocereus spp. En el caso de vainilla, los individuos fueron recolectados con
antelacin en distintas divisiones de Veracruz, Mx. Los modelos fueron preservados en
las instalaciones del ITUG (Instituto Tecnolgico de rsulo Galvn). Para el tegumento se
emprendieron cortes en hojas sanas, cuales fueron resguardados en el Laboratorio de
Biologa Molecular (ITUG). Respecto a pitahaya, se recolect tejido cortical y radicular en
el Campo Experimental Cotaxtla, Ver. (INIFAP). Al igual que vainilla, se congelaron dichos
tejidos en tubos Eppendorf.
Ulteriormente, se hicieron inventarios en el Laboratorio de Biologa Molecular. Cada
artculo se registr convenientemente en una base de datos. Se inspeccion material
como cristaleras de laboratorio, micropipetas y puntas; tambin, equipo como
termociclador, fotodocumentador, cmaras electroforticas, microcentrifugas, vrtex y
parrillas elctricas; para reactivos, solventes orgnicos e inorgnicos, medios de cultivo,
sales, cidos, bases, alcoholes y componentes de biologa y gentica molecular.
Se aislaron microorganismos edficos, para ello, se colectaron muestras de suelo
originarias de sitios de actividad ganadera. Con auxilio de palas y bolsas de polietileno,
se

cogieron

ejemplares

de

tierra

oscura,

que

despus

fueron

etiquetados

adecuadamente. Se sustrajeron 100 muestras en total. En seguida de eso, se plantearon

los mtodos microbiolgicos a destinar. Pasando la esterilizacin de los materiales y
equipo, se pesaron 25 gramos de suelo por cada tratamiento. La diseminacin
microbiolgica se desenvolvi en medios de cultivos bsicos para bacterias y hongos
(PDA, rosa de bengala). Como tcnica de propagacin, se utilizaron series de diluciones
compuestas por agua destilada y suelo (a diferentes concentraciones). Al finalizar, los
cultivos fueron alojados en una estufa microbiolgica con intencin de sostener los
requisitos para el crecimiento y desarrollo de hongos y bacterias.

2.2. SEGUNDO BIMESTRE

Se pusieron en marcha los procesos de extraccin de ADN vegetal. En primer lugar, se
calcularon concentraciones y volmenes para cada buffer, solvente y dems soluciones
qumicas empleadas. Al tener las cantidades deseadas, se esteriliz la cristalera de
laboratorio dispuesta para las preparaciones. Algunas soluciones requieren de un ajuste
de pH, tal cual fue regulado aplicando diminutas dosis de hidrxido de sodio o cido
clorhdrico segn sea el caso.
Los tejidos vegetales fueron tratados en concordancia de sus caractersticas
morfofisiolgicas. En hojas de vainilla, se tomaron pequeos fragmentos tisulares que
fueron desinfectados con hipoclorito de sodio, lavados con agua corriente y secados con
papel higinico. En races y tallos de pitahaya, se les removi la corteza o cutcula y se
lavaron con agua destilada. Al presentar cotas cuantiosas de muclagos contaminantes,
los tallos de pitahaya se deshidrataron en horno de secado durante dos das (65 C). La
extraccin de ADN vari en ciertos aspectos, no obstante, coincide en lo siguiente:
1. Las paredes celulares se rompen en mortero. All mismo, se adiciona Bromuro de
hexadeciltrimetilamonio (CTAB).
2. El polvo fino conseguido se pasa a un tubo Eppendorf. Subsiguiente, se
homogeniza aadiendo mercaptoetanol (antioxidante biolgico).
3. Se incuban los tubos en bao mara. Concluido, la muestra se asocia con alcohol
isoamlico/cloroformo, se centrifuga, y se transfiere la fase acuosa.
4. Se aade isopropanol fro, que tras un nuevo centrifugado, permite descartar el
sobrenadante y produce la pastilla de ADN.
5. La pastilla de ADN se suspende en un buffer de conservacin y se incuba a bao
mara. Finalmente, se limpia por ltima ocasin en asistencia de sales.

2.3. TERCER BIMESTRE

Se procedieron los anlisis de ADN. Previamente, se observ la calidad, cantidad y
concentracin de ADN para cada muestra por espectrofotometra de absorcin UV-VIS.
Ah mismo, se calcularon las relaciones de absorbancias OD 260nm/OD 280nm. La
preparacin de una sola muestra consta de diluir 2 l de ADN en 998 l de agua destilada
estril (la dilucin se efecta en una celda o cubeta de espectrofotometra). Usualmente,
un ADN deseable estar entre un parmetro de 1.7 a 2.0. Lecturas inferiores a 1.6
indican una cantidad mayor de contaminantes presentes en la muestra. Al concluir, se
registran los datos arrojados y las diluciones fueron desechadas.
Para la determinacin cualitativa del ADN se aplic una separacin electrofortica. En la
tcnica se hace uso de los buffers TBE 1X y de carga. Adems, como matriz, un gel de
agarosa al 0,8%. Para el homogenizado se mezcla 2 l de ADN y 2 l de buffer de carga
por cada muestra. La electroforesis se corri a unos 90 V durante 45 minutos, terminada,
se tieron los geles durante 30 minutos con 1.5 mg/ml de bromuro de etidio. Despus, se
visualizaron y fotografiaron en un fotodocumentador.
Las muestras de ADN que resultaron de cantidad y calidad considerable fueron
sometidas a una PCR (siglas en espaol: reaccin en cadena de la polimerasa) basada
en primers (iniciadores) ISSR (siglas en ingls: inter simple sequence repeat). No
obstante, la amplificacin va PCR se ejecut bajo condiciones inadecuadas (alcuotas y
ciclos trmicos mal calculados) y no produjo resultados legibles.
Otra de las labores ejercidas fue la caracterizacin de hongos y bacterias edficas.
Despus de la incubacin de los microorganismos, se calificaron algunas de sus
propiedades principales, tales como: color, forma, radio, textura y nmero de colonias por
caja Petri. Los datos se anotaron en un registro convenientemente.

Vo.Bo.
C.

DRA. JACEL ADAME GARCA

JEFA DEL LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR

III. RESULTADOS
Del tejido foliar proveniente de 15 selecciones de vainilla, se extrajeron 9 muestras de
ADN de calidad y cantidad deseable de acuerdo a los anlisis de espectrofotometra de
absorcin UV-VIS. Todas las muestras pudieron observarse mediante la separacin
electrofortica, aunque algunas de ellas parcialmente degradadas.
En el caso del tejido radicular (raz) de pitahaya, no se logr extraer material gentico en
ninguna de las 25 selecciones. Se lleg a la deduccin de que se debe a la calidad del
mismo tejido. Al someter las muestras a precipitacin y centrifugacin, no se pudo
observar la separacin de la dilucin de acuerdo a la masa de los componentes
(protenas de cidos nucleicos).
Para las muestras de tejido cortical (tallo) de pitahaya, se logr extraer ADN de cantidad y
calidad deseable en 13 de 25 muestras (segn el mtodo de espectrofotometra de
absorcin UV-VIS). La separacin mediante electroforesis pudo revelar el patrn de 18
muestras de ADN (algunas de ellas de baja calidad, es decir, degradadas).
En cuestin de microorganismos, se obtuvieron inculos de gran diversidad bacteriana y
fngica. En relacin a las colonias microbianas, se pudo identificar morfolgicamente
bacterias pertenecientes a los gneros Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter, Rhyzobium
y Lactobacillus. Para hongos, se observaron en mayor medida los del gnero Penicillium,
Aspergillus y Fusarium.

IV. CONCLUSIONES
La metodologa de extraccin de ADN en vainilla permiti el aislamiento de material
gentico para todas las selecciones. Sin embargo, no siempre la calidad y concentracin
de ADN obtenido fue alta. A pesar de ello, el protocolo empleado en vainilla es mucho
ms prctico en comparacin con la tcnica ejecutada en pitahaya. El protocolo se
efecta de manera sencilla y veloz, no requiere del empleo de grandes cantidades de
reactivo, y en general, produce un material gentico en grandes cantidades.
La metodologa de extraccin de ADN aplicada en pitahaya no facilit el aislamiento del
material gentico a partir de tejido radicular. Lo anterior, posiblemente se debe a las
diferencias morfofisiolgicas y bioqumicas entre raz y tallo. Por el contrario, la tcnica
gener resultados ms favorecedores al ser utilizada en tejido cortical. La desventaja al
aplicar ste protocolo radica en degradar parcialmente el ADN, cosa que limita su
potencial de estudio. Las muestras de ADN degradas pudieron tambin haberse
generado por el uso desmedido de solventes y maceracin excesiva.
Para microorganismos, las bacterias ms abundantes son las pertenecientes al gnero
Pseudomonas;

para

hongos,

los

del

gnero

Fusarium.

Las

caracterizaciones

morfolgicas permitieron la identificacin a nivel de gnero de algunos hongos y bacterias

comunes en el suelo ganadero.

V. RECOMENDACIONES
Los cactos poseen mayor contenido de mucopolisacridos y muclagos que otros
grupos vegetales. Dichos residuos inhiben la amplificacin va PCR y afectan la
calidad del ADN blanco. Aunado a ello, las propiedades de stas biomolculas
varan entre gneros de cactceas (a causa de la heterogeneidad bioqumica entre
las mismas). A raz de ste planteamiento, se recomienda probar diferentes
metodologas de extraccin de ADN en cactceas, cules sean capaces de
obtenerlo en cantidad y calidad deseable.

Es factible seguir adecuando la amplificacin de cebadores ISSR va PCR. Como

se ha mencionado anteriormente, la reaccin es muy sensible y requiere de un
ajuste manual a partir de clculos previos (que sin duda, influyen gravemente en
las temperaturas y tiempos programados en el termociclador). Temperaturas y
tiempos de exposicin muy bajos pueden llegar a limitar la accin de la DNA
polimerasa, enzima clave para la reaccin de amplificacin. Por el contrario, al
someter las muestras temperaturas y tiempos de exposicin por encima de los
lmites, el DNA puede llegar a desnaturalizarse y quedar obsoleto.

El uso de bromuro de etidio, durante la tincin de geles de agarosa, resulta poco

seguro para el tcnico. El bromuro de etidio es una sustancia altamente
mutagnica, es decir, con capacidad de inducir tumores cancergenos. Al ser
absorbida por las mucosas y la piel, el tcnico es vulnerable ante su toxicidad.
Existen alternativas menos dainas que el bromuro de etidio, cuales resultan muy
viables para la visualizacin de ADN. No obstante, suelen ser ms costosas.

 Los microorganismos transforman los nutrientes para que puedan ser asimilados
por las plantas. Al tener una importancia ecolgica muy valiosa, se tiene la
obligacin de elaborar estrategias para su conservacin y estudio.

VI. ANEXO FOTOGRAFAS

IMAGEN 1: Muestreo de material vegetal en ITUG.

IMAGEN 2: Muestreo de material vegetal en Cotaxtla.

IMAGEN 3: Lavado y desinfeccin de muestras.

IMAGEN 4: Elaboracin de medio de cultivo microbiolgico.

IMAGEN 5: Sembrado de microorganismos edficos.

10

IMAGEN 6: Elaboracin de soluciones extractoras de DNA.

IMAGEN 7: Maceracin de tejido vegetal con mortero y pistilo.

11

IMAGEN 8: Adicin de reactivos en campana de extraccin de gases.

IMAGEN 9: Separacin de cidos

nucleicos de polisacridos.

12

IMAGEN 10: Equipo de espectrofotometra de luz UV-VIS.

IMAGEN 11: Homogenizado de

muestras para electroforesis.

13

IMAGEN 12: Inculo de Fusarium spp. en caja de Petri.

14