Estudio de la actividad enzimtica de la enzima polifenoloxidasa del mango en la

oxidacin del catecol.

Montserrat Granados, Minerva Valencia, Esteban Vega
Universidad Nacional Autnoma de Mxico, Facultad de Qumica. Laboratorio Unificado de Fisicoqumica.
Prof. Dr. Luis Fernando Olgun Contreras.
ABSTRACT
The process of enzimatic browning is a problem that mainly affects the agro-food industry, that is
why it is necessary the understanding of the kinetic behavior of this phenomenon. In this work the
affinity constant between the poliphenoloxidase (PPO) and the catechol was estimated using the
Michaelis-Menten equation(MME) and lineweaver-Bruk equation(LBE), finding the numbers of
3mM (MME) and . Besides it was found that the maximm speed of the substrate (catechol)
conversion by the PPO is of 9.707E-8M. However, to distinguish the complete kinetic profile the
number of rechange is needed, which in this moment it is not possible to be determined.
RESUMEN
El proceso de pardeamiento enzimtico es un problema que afecta principalmente a la industria
agroalimentaria por lo cual es necesaria la comprensin del comportamiento cintico de este
fenmeno. En ste estudio se calcul con la Ecuacin de Michaelis-Menten la constante de
afinidad de la polifenoloxidasa (PPO) por catecol (KM), encontrando un valor=3.40mM. Adems
se encontr que la velocidad mxima de conversin del sustrato (catecol) por la PPO es de
9.707E-8M. Sin embargo para dar un perfil cinetico completo se requiere del nmero de
recambio, por el momento aun no se puede calcular.

ANTECEDENTES
Mxico es uno de los pases que exporta frutos como limn, naranja, pltano, aguacate y mango
a diferentes sectores de comercio en el extranjero, estos cultivos representan el 63 por ciento de
la produccin nacional, detall el organismo de la Secretara de Agricultura, Ganadera,
Desarrollo Rural, Pesca y Alimentacin (SAGARPA). Cabe sealar que nuestro pas es el
principal proveedor de mango, aguacate y limn a Estados Unidos, ya que cubre ms de dos
terceras partes de su cuota de importacin. [1]
Un fruto a primera vista puede ser enjuiciado, por ejemplo si este ha adquirido una variacin de
color y tonalidad en comparacin con uno recin cosechado, dicho color es consecuencia de la
descomposicin estructural de las clulas de las frutas que en lo siguiente conlleve a un aspecto
poco agradable al consumidor, signo de la disminucin del aporte nutricional e inocuidad del
mismo.
La causante de ste fenmeno es la accin de la enzima polifenoloxidasa (PPO) conocida
tambin como monofenol monooxigenasa) es una enzima tetramrica que contiene cuatro
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tomos de cobre por molcula, y posee sitios de unin para compuestos aromticos y oxgeno [3].
La enzima cataliza la O-hidroxilacin de monofenoles para convertirlos en O-difenoles. Esta
misma enzima puede, posteriormente, catalizar la oxidacin de los O-difenoles para formar Oquinonas las cuales son muy reactivas y atacan a una gran variedad de componentes celulares.
La rpida polimerizacin de las O-quinonas produce pigmentos de color negro, marrn o rojo, lo
que a su vez es la causa del pardeamiento enzimtico. Existe una mezcla de las enzimas
monofenol y catecol oxidasa en prcticamente todos los tejidos vegetales, y tambin pueden ser
encontradas en bacterias, animales y hongos. Los polmeros producidos por la reaccin de las
quinonas son los responsables del oscurecimiento de tejidos vegetales cuando se daan
fsicamente.
Esto se observa fcilmente en pltanos, papas o mangos que tienen altos niveles de PPOs.
Cuando las clulas vegetales se encuentran sanas e intactas, las PPOs y sus sustratos
fenolicos, se encuentran en compartimientos separados (cloroplastos y vacuolas,
respectivamente). Sin embargo, cuando la clula se desorganiza al envejecer, o como resultado
de dao fsico o infeccioso, las enzimas y sustratos se juntan y sucede la reaccin descrita. El
oscurecimiento producido por estas enzimas causa grandes prdidas a la industria agropecuaria.
Por esto, el contenido de polifenoloxidasas, y su nivel de actividad son muy importantes para
determinar la calidad de frutos y vegetales. Se ha utilizado a la tentoxina en recientes
investigaciones para eliminar la actividad polifenoloxidasa en algunas plantas superiores. [5] La
tropolona es un inhibidor de las polifenoloxidasas presentes en las uvas. [6] Y otro inhibidor de
esta enzima es el pirosulfito de postasio (K 2S2O5). [7] La presencia de PPO se ha podido
determinar y caracterizar utilizando hojas y frutos de numerosas especies vegetales como fuente
enzimtica. Los niveles de PPO varan dependiendo de la especie, estado de maduracin y
estado fenolognico [8].
Uno de los principales fenoles presentes en los frutos es el Catecol, tambin conocido como
pirocatecol o 1,2-dihidroxibenceno, es un compuesto orgnico con la frmula molecular C 6H6O2.
Es el ismero orto de los tres bencenodioles isomricas. Fue descubierto por primera vez por
destilacin destructiva de la catequina extracto de la planta. Cerca de 20 millones de kg estn
sintticamente producidas anualmente como qumica orgnica bsica, principalmente como un
precursor de los plaguicidas, sabores y fragancias, como antioxidante en las industrias del
caucho, qumica, fotografa, colorantes, grasas y aceites, as como en cosmticos y en algunos
productos farmacuticos.[9]

Fig. 1 Estructura del

catecol

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Para poder identificar la cintica de reaccin de la PPO presente en el fruto del mango frente al
catecol es necesario determinar sus caractersticas fsicas, qumicas y bioqumicas del fruto ya
que, dichas caractersticas se vern afectadas dependiendo de la fuente de donde es extrada la
PPO. En el presente estudio de investigacin se establecieron las condiciones de mayor
velocidad de reaccin de la PPO presente en el fruto del mango, para evaluar el tiempo ptimo
con el cual este producto puede ser exportado y vendido con cierta calidad al consumidor.
MATERIALES Y MTODOS.
Sustancias
Catecol
Marca: Sigma Aldrich
Pureza: 99%
F.W. 110.11
Presentacin 100g
Fosfato de potasio monobsico
Marca: J.T.Baker
Pureza: 99%
F.W. 136.09
Lote: k26462
Presentacin 500g
Fosfato de potasio dibsico
No presenta informacin

Equipos
Balanza Analtica

Espectrofotmetro
Marca: Thermo Scientific
Modelo: Genesys 10S UV-Vis
No. De Serie: 840-20810

Centrifuga

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La reaccion a estudiar es:

Anlisis preliminares:
1. Caractersticas fsicas de mango para anlisis. Se estandarizar detalladamente el
estado del fruto de mango a travs del anlisis de los siguientes parmetros:
o Especie: mango manila.
o Volumen de pulpa: se midieron 60 mL. y posteriormente se aadieron 20 mL de agua
destilada.
o Fecha de obtencin: Los mangos analizados fueron adquiridos un da antes.
o Apariencia inicial y final: Se obtendrn mangos con apariencia agradable, sin marcas
aparentes por golpes o por exposicin al sol, ya que este servir como parmetro de
anlisis de calidad en el mango. Llevando un registro de su apariencia en el intervalo de
conservacin del mango.
o Coloracin inicial y final: el extracto al inicio es un poco turbio, con el paso de los das la
turbidez en el extracto aumenta.
2. Preparacin de disoluciones.
o Disolucin 0.05 M de Catecol
Pesar 0.1376 g en balanza analtica y transferir cuantitativamente a un vaso de
precipitados de 50 mL disolver en la mnima cantidad de agua destilada. Trasvasar a un
matraz volumtrico de 25.0 mL y llevar al aforo con agua destilada.
25 mL .

C catecol=

0.05 mmol 110.1 mg

=137.6 mg
1000 mL
1 mmol

139.1 mg
=0.056 mM
25 mL

Nota: si el trabajo experimental requiere de ms de una sesin la disolucin deber ser fresca,
pues despus de un da sta se oxida.
o Disolucin amortiguadora de fosfatos 0.5 M con fuerza inica 0.1 M.

Pesar 4.3545 g de K2HPO4 y 3.402 g de KH2PO4 en balanza analtica y transferir

cuantitativamente a un vaso de precipitados de 50 mL disolver en la mnima cantidad de agua
destilada. Trasvasar a un matraz volumtrico de 100.0 mL y llevar al aforo con agua destilada.
FI =
+

1
2
c i Zi

2
2

K ( +1 ) + c HPO (2 )

2
4

H 2 PO 4 (1 ) + c
c
1
F I=
2

FI =

1
[ 0,5 3 (+1 )2 +0,5 ( 1 ) +0,5 ( 4 ) ]=2
2
3. Evaluacin cualitativa de la presencia de PPO en la pulpa del mango manila

o Lave y seque perfectamente el fruto, retire la cscara y con ayuda de una esptula retire la
mayor cantidad de pulpa.
o Introducir la pulpa obtenida en el extractor de jugos y aadir aproximadamente 20 mL de
agua destilada; recolecte el extracto en un vaso de precipitados de 100 mL. repita el
procedimiento mnimo 5 veces, para asegurar una mezcla homognea y la ruptura de la
mayor cantidad de vacuolas.
o En tubos Eppendorf colocar porciones iguales de la pulpa para posteriormente introducirlo
en la centrfuga por 30 min. A 17000 rpm. Una vez transcurrido el tiempo deseche la parte
slida y vierta la fase liquida en un vaso de precipitados de 50 mL.

Fig.1 Pulpa de mango centrifugada

o Una vez obtenido el extracto colocar aproximadamente 5 mL. de extracto en 3 tubos de
ensayo, agregar volmenes de catecol diferentes, 2,4 y 6 mL a cada tubo de ensayo.
Esperar aproximadamente 2 min. Preparar otros 3 tubos de ensaye pero ahora adicione 2

mL. de amortiguador, la concentracin del amortiguador es 10 veces mayor para asegurar

un pH=7.
o Si se observa un cambio en la coloracin, de amarillo a marrn significa que la enzima
est presente y se puede realizar la siguiente prueba.

Fig.2 Coloracin del jugo segn la oxidacin de Catecol

4. Estandarizacin de parmetros de medicin ideal en espectrofotmetro
Se debe seleccionar la longitud de onda ms adecuada para realizar las mediciones posteriores,
por lo que se deben realizar unos barridos cinticos, tomar el volumen indicado en la tabla,
verter las alcuotas en una celda para espectrofotmetro y medir absorbancias de 350nm700nm, segn las siguientes condiciones.
Tabla 1. Volmenes en mL utilizados en barridos cinticos
Extracto de Mango Catecol
Agua
Buffer
Vol. final
0mL
0.5 mL
1.5 mL
1mL
2.5 mL
0.2mL
0.5 mL
1.3 mL
1mL
2.5 mL
0.4mL
0.5 mL
1.1 mL
1mL
2.5 mL
0.6 mL
0.5 mL
0.9 mL
1mL
2.5 mL
08 mL
0.5mL
.0.7mL
1mL
2.5mL
Los grficos obtenidos nos permitirn ver un mximo de absorcin, donde el mtodo tendr
mayor sensibilidad y es la longitud de onda a la que se eligi trabajar.
5. Comportamiento de presencia y ausencia de concentraciones de sustrato

Se prepararn las siguientes disoluciones (tabla 2) en una celda de plstico para

espectrofotmetro marca Thermo. (Ntese que lo que se busca variar es la concentracin
de catecol presente en la disolucin), el t 0 se considera como la adicin de catecol.

Muestra
Blanco
1
2
3
4
5

Tabla 2. Volmenes en mL utilizados en espectrofotometra

Enzima (mL) Buffer (mL) Agua (mL) Catecol (mL) Volumen final (mL)
0.5
1
2.5
0
2.5
0.5
1
2.3
0.1
2.5
0.5
1
2.1
0.3
2.5
0.5
1
1.9
0.5
2.5
0.5
1
1.7
0.7
2.5
0.5
1
1.5
1
2.5
Trazar las grficas concentracin vs tiempo, transformando la absorbancia en
concentracin con la ecuacin de Lambert-Beer

Calculo de la concentracin de O-Quinona en Celda

Para el clculo de la concentracin de O-Quinona se hace referencia a la relacin existente entre
la concentracin del analito (O-Quinona) y la absorbancia en el equipo espectrofotomtrico tal
relacin est regida por la ley de Lamber-Beer denotada en la siguiente ecuacin

A=lc
Donde
o = Coeficiente de absortividad molar (13.00 cm-1mM-1 para la O-Quinona)
o L=paso ptico de celda (1 cm)
o C=Concentracin del analito (O-Quinona)

Elegir en base a estas la concentracin ideal de acuerdo a la mayor absorbancia

observada para la siguiente parte de la cintica.
En base a eso calcular los volmenes necesarios de cada disolucin para tener un
total de 2.5 mL en cada celda, manteniendo el volumen de buffer en 0.5 mL en cada
caso, considere tambin que el volumen de enzima debe ser la misma para todos los
casos.
Utilice el modelo de Michaelis-Menten para calcular la cintica de esta reaccin.

Basndonos en el estado estacionario del complejo enzima-sustrato se deduce la Ecuacin de

MichaelsMenten

v=

V max ( S )
Km+ (S )

Donde
o
o
o
o

V es la velocidad de conversin de la enzima

Vmax es la velocidad mxima de conversin de la enzima
Km es la constante de afinidad de la enzima por el sustrato
S es la concentracin de Sustrato.

Dobles recprocos
Realizando un intercambio de orden en la ecuacin de Michaelis-Menten se tiene la siguiente
ecuacin con un comportamiento lineal
KM
1
1
=
+
v V max ( S ) V max

6. Comportamiento de presencia y ausencia de concentraciones de enzima

Tabla 3. Volmenes en mL utilizados en espectrofotometra
Muestra
Blanco
1
2
3
4
5

Catecol
(mL)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5

Buffer
(mL)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0

Enzima
(mL)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0

Agua
(mL)
1.5
1.3
1.1
0.9
0.7
0.5

Volumen
total (mL)
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5

Se realiz un grfico de tiempo vs. Absorbancia para observar el comportamiento de la

enzima, segn el da de extraccin del jugo.
De estas mediciones tambin se puede obtener la actividad especfica enzimtica.

DISCUSIN Y RESULTADOS
1. Estandarizacin de parmetros de medicin ideal en espectrofotmetro

2. Comportamiento de presencia y ausencia de concentraciones de enzima

3. Actividad de la enzima

4. Tratamiento de los resultados

Prueba de la presencia de PPO en la pulpa de mango.

Al observar un cambio de coloracin aparente en las pruebas cualitativas de Catecol en

presencia de extracto de jugo, y la permanencia en el Catecol sin extracto de jugo, se obtuvo
informacin de la presencia de la enzima PPO en la pulpa de mango.
Barrido de longitudes de onda
Con base en los resultados del barrido de longitud de onda del amortiguador de fosfatos del
extracto de pulpa. Del Catecol, as como del Catecol en presencia del extracto se observa que
las tres muestras no presentan una absorbancia considerable en la zona de mayor absorbancia
de la O-Quinona, por lo cual la longitud de onda seleccionada para esta fue de 390 nm.

Tipos de mango

Con base en los perfiles cinticos de la conversin de Catecol en O-Quinona para los diferentes
mangos se puede afirmar que para mangos verdes o inmaduros la enzima PPO del mago no

est activa, a diferencia de esta actividad cuando se tiene mangos maduros que al ser extrada
tiene actividad, primeramente al realizar el anlisis el mismo da de obtencin se obtiene un perfil
como el de la grfica en donde se puede observar la actividad de la enzima al pasar el tiempo, y
finalmente realizando el anlisis 5 das despus de su obtencin la enzima posee mayor
actividad enzimtica, convirtiendo ms Catecol en menor tiempo. Esto se puede deber adems a
los diferentes tipos de extraccin de la enzima con el extractor de jugo y la licuadora ya que al
molerlo ms se liberan de las vacuolas celulares de los cloroplastos, por lo que e necesario
romper estas estructuras para acceder a la enzima.

Absorbancia de O-Quinonas con diferentes concentraciones de Catecol

Con base en los resultados de C vs t se puede deducir que a mayores concentraciones de

sustrato, la enzima trabaja ms rpido -pendientes de cada grafica-, lo cual es consistente con
los perfiles de las ecuaciones de Michaels Menten y de Los doble recprocos.

Perfiles cinticos de Michaels-Menten y recprocos

Como se puede observar el perfil cintico de la oxidacin del Catecol con la PPO del mango
sigue un comportamiento de Michaels Menten, propio de las enzimas, al observarse el perfil
recto hiperblico caracterstico. As al realizar las regresiones de curva hiperblica y de regresin
lineal para las ecuaciones de Michaels mente y de la curva de dobles recprocos
respectivamente se puede observar que las Km y las Vmax son similares, por una parte de tiene
un valor de Km de 0.01082mM y Vmax de 1.3999E-7 mM/s para la ecuacin de Michaels
Menten y para la curva lineal de Km de 0.086 mM y Vmax de 5.84E-7 mM/s esto puede deberse
a que los puntos de mayor concentracin de Catecol fueron eliminados del estadstico de
regresin lineal al encontrarse fuera de esta tendencia lineal.

CONCLUSIN
Se logr observar la oxidacin de Catecol a O-quinona gracias a la presencia de la enzima
PPOen la pulpa del mango, por lo cual, los polifenoles presentes en su composicin tales como
el Catecol pueden ser oxidados por esta enzima, los valores de .0861 mM de Km y Vmax= 5.843
nos indican que la enzima convierte fcilmente el Catecol en O-Quinona al ser de rpida
evolucin dicha transformacin, as mismo, la enzima sigue un perfil cintico tipo Michaels
Menten.
REFERENCIAS

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[9] http://campodocs.com/articulos-informativos/article_76258.html
[10] Hernndez C. (2009)Accinn y efectos de la Polifenoloxidasaa en alimentos. Universidad
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