1.

Objetivos
Atravs da anlise espectrofotomtrica obter a absorbncia e construir uma
curva padro para determinao da concentrao de leveduras em amostras
desconhecidas e o clculo da absortividade.

2. Introduo
a) Espectrofotometria:
A espectrofotometria um dos mais utilizados mtodos no somente para
anlises (bio)qumicas como tambm para identificao de propriedades fsicas de
vrios objetos e suas classificaes. A aplicao da espectrofotometria inclui tpicos
variados na indstria de alimentos, na qumica forense, na medicina, na biotecnologia,
na indstria txtil e controle de qualidade em geral.
b) Indstria de alimentos:
A Espectrofotometria um "avano" cientfico por assim dizer, e
atualmente a tcnica mais precisa e exata para a medio, controle
de qualidade e formulao de cores em produtos alimentcios. de
extrema importncia para essa indstria, pois possuem rigorosas
fiscalizaes, em especial para coloraes dos alimentos, o que no
caso de um no atendimento, lotes inteiros podem ser descartados.
Os espectrofotmetros oferecem maior especificidade, sendo os
instrumentos ideias para a formulao de cor, especificao de
normas e tolerncias, comunicao inter-laboratorial e controle de
qualidade no processamento de produtos alimentcios.
Durante a ltima dcada, os espectrofotmetros foram cada vez mais
adotados nas indstrias alimentcias para a padronizao de cor e
inspeo de controle de qualidade de entrada de ingredientes. Eles
contribuem para a especificao de cor do produto final, como por
exemplo, em compotas, gelias, conservas, bebidas, etc, em pesquisa
e desenvolvimento de novos alimentos e bebidas, e para o

rastreamento ocasional de alimentos e triagem tcnica como por

exemplo classificao de qualidade de carnes, aves e peixes.

c) Indstria de alimentos associada medicina:

A comercializao da maior parte dos alimentos precedida por
um processamento complexo, o qual necessita de ser devidamente
monitorizado, de forma a controlar a presena de substncias
nocivas. No entanto, estas substncias, designadamente antibiticos,
so necessrias no combate de diversas patologias.
O leite um lquido produzido pela secreo das glndulas mamrias
das fmeas dos mamferos e por ser um alimento de elevado
potencial nutritivo, muito susceptvel atividade microbiana.
Devido

esta

contaminao,

leite necessita

de processos

industriais, tais como a elevao da temperatura, para destruir os

agentes patognicos e permitir a sua conservao (Matos et al.,
2007).

No

entanto,

esses

microrganismos

so

excepcionais

produtores de substncias com poder antibitico.

A classificao do leite efetuada com base na quantidade de
microrganismos presentes. Existem diversos tipos de leite. O leite
pasteurizado pode ser classificado em tipo A, b ou c, de acordo com o
grau de qualidade que apresenta. O tipo A pasteurizado logo aps a
ordenha mecnica executada na explorao com o mximo de
higiene. O tipo b transportado at 6 horas aps a ordenha, para que
seja pasteurizado e o tipo c obtido por ordenha manual (Popelka et
al., 2004).
Os antibiticos so utilizados tanto em medicina humana, como
veterinria. Para controlar as concentraes destes resduos em
produtos

alimentares

utiliza-se

entre

espectrofotometria (Guedes catia et al, 2009)

d) Medicina - Oftalmologia:

outros

mtodos

Diante da progressiva destruio da camada de oznio, com

uma perda estimada de 12% por dcada, aumenta a preocupao em
prescrever lentes filtrantes (Alves, 1989). A relao de causa e efeito
entre a radiao UV, luz visvel e a ocorrncia de danos oculares vm
sendo descrita em vrios estudos realizados nos ltimos anos
(Bergmanson et al., 1995).
Doenas

oculares

como

ptergio,

fotoceratites,

uvetes

anteriores e catarata esto associadas exposio s radiaes UVA

e UVB, enquanto alteraes retinianas como degenerao macular
relacionada idade (DMRI) parecem estar relacionadas alm da
radiao UVA e UVB, a uma poro do espectro da luz visvel (luz
azul)(Silva et al., 2000).
O uso de filtros de raios ultravioleta (UV) veio incorporar-se ao
crescente aprimoramento dos materiais utilizados na fabricao de
lentes oftlmicas. Assim, a cada dia, a indstria ptica procura lanar
uma nova lente com maior capacidade de filtrao (Matsuhara et al.,
2004).
Atravs do estudo espectrofotomtrico pode-se analisar a presena e
intensidade do poder de filtrao dos raios UV e transmitncia da luz
visvel em lentes incolores de viso simples atualmente disponveis
no mercado nacional, com o propsito de qualificar e orientar
oftalmologistas na escolha da melhor lente a ser prescrita (Matsuhara
et al., 2004)
e) Controle de qualidade - Anlise de sistemas qumicos gua:
A espectrofotometria nas gamas ultravioleta e visvel (UV-Vis)
permite a obteno de informao de extrema relevncia (Van der
Broeke et al., 2006). uma tcnica rpida e simples de implementar,
usada para avaliao da qualidade de guas residuais (Thomas et al.,
2005), nomeadamente para identificao de componentes da matriz
orgnica, uma vez que a maioria dos compostos orgnicos e alguns
compostos minerais solveis (como os nitratos) absorvem radiao na
regio UV-Vis (Loureno et al., 2006).

O princpio da medida assenta na incidncia, numa amostra de

gua residual com uma espessura bem determinada (contida numa
janela tica), de um feixe de radiao abrangendo a gama UV-Vis, que
corresponde aos comprimentos de onda entre 190 e 800 nm. Ao
atravessar a amostra de gua residual, a radiao incidente vai sofrer
fenmenos de disperso (mudana de direo por coliso com
partculas slidas em suspenso) e de absoro (incorporao da
radiao nas molculas presentes na gua, de acordo com os
diferentes nveis energticos que aquelas podem assumir).
Depois de atravessar a amostra, a radiao remanescente
analisada num detector e comparada com a radiao incidente. Para
cada comprimento de onda, calculado um grau de atenuao da
radiao, obtendo-se um espectro. O espectro , assim, uma
impresso

digital

da

qualidade

da

amostra,

refletindo

sua

composio qumica e fsica. (Brito et al, 2010)

f) Anlises clnicas:
Com alguma frequncia necessrio quantificar substncias em
misturas complexas, ou que no absorvem significativamente a luz a
nenhum comprimento de onda, assim, utiliza-se os chamados
mtodos colorimtricos. Neles uma determinada substncia entra em
contato com um reagente especfico produzindo ento uma cor, cuja
intensidade, diretamente proporcional concentrao da substncia
na mistura original (Gordon,1996)
Neste contexto, ao longo das pesquisas na rea da Bioqumica,
vrias

reaes

foram

especificamente,

desenvolvidas

presena

de

das

quais

biomolculas

em

detectam,
solues

desenvolvendo cores variadas. Assim, tais reaes puderam ser

utilizadas

para

determinao

qualitativa

quantitativa

de

biomolculas em diversas amostras, sendo ento aplicadas s

anlises

clnicas

para

diagnsticos

de

diabetes,

lipidemias,

colesterolemias, proteinrias e produtos nitrogenados como cido

rico, uria e amnia, enzimas como amilase, lpase, fosfatase
alcalina, fosfatase cida, aminotransferases, lactato desidrogenas
entre outras, alm de ons como clcio, sdio e potssio. (Oliveira,
2011).
g) Indstria txtil:
As indstrias txteis so grandes consumidoras de gua e de
corantes sintticos. No Brasil cerca de 20ton/ano de corantes so
consumidos pelo setor txtil dos quais cerca de 20% so descartados
como

resduos

ou

efluentes.

principal

fonte

dessa

perda

corresponde fixao incompleta dos corantes durante a etapa de

tingimento. Devido a sua prpria natureza, eles so altamente
detectveis a olho nu, afetando a transparncia e solubilidade dos
gases nos rios, mares e outros corpos aquticos, causando danos
flora e a fauna (Barreto et al., 2004)
As determinaes simultneas de multi-elementos utilizando tcnicas
espectrofotomtricas so difceis na ausncia de processos de
separao devido sobreposio dos espectros de absoro. No
entanto, a aplicao de tcnicas de calibrao multivariada permite a
anlise espectral de multi-elementos com seletividade, sensibilidade
e preciso (Barreto et al., 2004). Dessa forma, a anlise de corantes
de uma indstria txtil pode ser eficiente tanto pelo tratamento de
seu efluente como para quantificar a perda de corantes em seu
processo.
3. Materiais e Reagentes

Balo Volumtrico de 50 mL; 100 mL; 250 mL; 500 mL; 1000 mL
Cubetas retangulares de 1 cm de largura
Pipeta Graduada de 1 mL; 10 mL
Espectrofotmetro

Fermento Biolgico
Bquer
gua

4. Procedimentos
Para o preparo da suspenso pesou-se aproximadamente 15,0 g de fermento
biolgico em um bquer e adicionou-se 10 mL de gua. Com o auxlio de uma pipeta
colocou-se 1 mL da suspenso previamente preparada em 5 bales volumtricos sendo o
primeiro de 50 mL, o segundo de 100 mL, o terceiro de 250 mL, o quarto de 500 mL e o
quinto de 1000 mL e adicionou-se gua at completar o volume .
Utilizou-se gua como branco em uma das cubetas para zerar o espectrofotmetro
e nas outras cubetas foram colocadas as cinco solues diludas e duas solues
desconhecidas. A absorbncia a um comprimento de onda de 570 nm de cada soluo
foi anotada.

5. Resultados e Discusses

I.

Preparo da Suspenso Padro:

A suspenso preparada a partir do fermento biolgico deve ser

utilizada sob a forma de concentrao comum (g/L), no qual:

C=

m soluto
V (L)
Foram pesados aproximadamente 15,0g de fermento e este foi

diludo em 10mL de gua, logo tem-se:

C=

15 g
C=1500 g/ L
0,01 L
A suspenso padro de 1500 g/L foi ento diluda para

diferentes volumes gerando novas concentraes.

II.

Diluio da Suspenso Padro

O clculo da diluio pode ser feita aplicando a frmula:

C . V =C ' . V '
Da suspenso padro foi retirada uma alquota de 1 mL para ser
diluda nos seguintes volumes 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1000
mL. A tabela 1 mostra as novas concentraes aps os valores serem
substitudos na frmula.
Tabela 1 - Valores de concentrao em g/L referentes as suas respepectivas
diluies

Diluio
1/50
1/100
1/250
1/500
1/1000

III.

Obteno da Absorbncia

Concentrao (g/L)
30,0
15,0
6,0
3,0
1,5

Para medir a absorbncia, o espectrofotmetro, foi ajustado

para o comprimento de absoro mxima do fermento que de 570
nm. A tabela 2 mostra os resultados obtidos.
Tabela 2 - Valor de absorbncia obtido de acordo com a concentrao em g/L

Concentrao (g/L)
1,5
3,0
6,0
15,0
30,0

Absorbncia
0,666
0,962
1,457
2,029
2,504

A tabela 3 exibe os valores obtidos durante a leitura para

amostras com concentrao desconhecida.
Tabela 3 - Valor de absorbncia para amostras desconhecidas

Amostra Desconhecida
A
B

IV.

Absorbncia
2,282
2,044

Construo da Curva Padro

Os pontos descritos na tabela 2 so utilizados para contruo

da curva padro, no qual a concentrao encontra-se no eixo das

abcissas e a absorbncia no eixo das ordenadas. O objetivo da curva
obter a equao da reta que permite determinar as concentraes
de fermento desconhecidas.
vlido ressaltar que esta curva de calibrao vlida somente
para o fermento utilizado no procedimento cve que as concentraes
desconhecidas devem estar dentro faixa da curva, ou seja, no deve
ultrapassar nem o limite inferior nem o superior.
O grfico 1 mostra a curva com uma linha de tedncia linear
enquanto o grfico 2 mostra a curva com uma tendncia logartimica.

Grfico 1 - Grfico da Absorbncia x Concentrao (g/L) com ajuste linear

Aplicando o ajuste linear, a equao da reta dada por:

y=a+bx y =0,853+0,0604 x (1) R2=0,946

A lei de Lambert-Beer estabelece uma relao linear entre

absorbncia e concentrao. O grfico 1 apresenta um R2 igual a
0,946, o que significa que os pontos no esto muito bem ajustados
ao modelo de regresso linear. Esse desvio pode ser resultado de
erros, como falta de tcnica no preparo das suspenses, o uso de
balana desregulada ou com pouca preciso e gua encanada ao
invs de gua destilada.
Alm desses fatores, relevante mencionar que absorbncia e
concentrao podem no obedecer a Lei de Beer atravs de relaes
no lineares denotando um desvio. A principal causa de desvios da lei
a utilizao de solues concentradas. O aumento da concentrao
pode seguir a proporcionalidade linear com a absorbncia at um
ponto limite no qual essa proporo deixa de existir [2].

Grfico 2 - Grfico da Absorbncia x Concentrao (g/L) com ajuste logartmico

Aplicando o ajuste logartmico, a equao logartimica natural

dada por:
2

y=a+bln ( x ) y =0,346+0,628 ln ( x ) (2)R =0,998

Observando o grfico os pontos no se comportam de fomar

linear sendo a linha de tendncia mais confivel aquela cujo valor de
R2 est mais prximo de 1, assim, aparentemente, a linha de
tendncia logartmica representa o melhor ajuste.
V.

Concentrao das Amostras Desconhecidas

De acordo com a tabela 3 e a equao 1 tem-se:

Amostra A

2,282=0,853+ 0,0604 x

x=23,659 g / L
Amostra B
2,044=0,853+0,0604 x
x=19,718 g / L

De acordo com a tabela 3 e com a equao 2 tem-se:

Amostra A:
2,282=0,346+ 0,628 ln ( x )
x=21,820 g / L

Amostra B
2,044=0,346+0,628 ln ( x )
x=14,937 g/ L

VI.

Clculo do Coeficiente de Absortividade

O coeficiente de absortividade calculado seguindo a frmula:
||KCd

(3)

Em que Abs a absorbncia, d o caminho ptico, C a

concentrao e

a absortividade especfica, pois a concentrao

se encontra em g/L [1]. O caminho ptico de 1 cm.

||

( gcmL )

k=

cm. g/ L
||
k =
Cd
k=

A absortividade obtida substituindo os respectivos valores na

equao 3. A tabela 4 mostra a absortividade correspondente a cada
valor especfico de absorbncia e concentrao.
Tabela 4 - Valores da absortividade referente aos pares absorbncia e
concentrao

Absorbncia

Concentrao (g/L)

0,666
0,962
1,457
2,029
2,504
2,282
2,044
2,282
2,044

1,5
3,0
6,0
15,0
30,0
23,220
19,369
21,820
14,937

Absortividade
(L/g.cm)
0,444
0,321
0,243
0,135
0,0835
0,0983
0,105
0,104
0,137

6. Concluses
O espectrofotmetro um instrumento cujo funcionamento se
baseia na emisso e absoro de ondas eletromagnticas que
compreende

uma

gama

de

comprimentos

de

onda

desde

infravermelho ao ultravioleta. Um espectrofotmetro que opera no

espectro visvel no fornece, por exemplo, informaes estruturais,
mas muito til qualitativa e quantitativamente [1].
Essa utilidade est relacionada com a capacidade que as
substncias tem de absorverem luz e esta absoro dependente da
concentrao do composto. Atravs da tabela 2 percebe-se que
quanto

maior

for

concentrao

maior

ser

absoro.

concentrao, por sua vez, tambm proporcional intensidade da

cor da soluo. Assim, a colorao pode ser usada como uma medida
de concentrao na espectrofotometria.

O espectrofotmetro tem uso muito variado que vai desde a

medicina, passando pela indstria de alimentos at a indstria textil.
Tambm est intimamente ligado a microbiologia experimental sendo
utilizado em diversas prticas como determinao da densidade
celular de bactrias e fungos, avaliao do crescimento de microorganismos,etc [3].

7. Referncias

1. Apostila de Anlise Instrumental /Espectrofotometria Molecular

<http://www.ifrj.edu.br/webfm_send/547>

Acesso

em

Acesso

em

20/02/2016.
2. <http://www.ifrj.edu.br/webfm_send/547>
20/02/2016.
3. Dos Santos, Telma; Rodrigues, Denise - Manual de Prticas de
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