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" I have a theory, my theory is about moments, moments of impact. My theory is that these
moments of impact, these flashes of high intensity that completely turn our lives upside down
actually end up defining who we are.
The Vow
AGRADECIMIENTOS
Dios mo gracias a ti estoy una vez ms en al camino. A mi mama y a mi papa gracias a ellos soy
la persona que soy hoy en da, me ensearon constancia y perseverancia los amo, soy a su imagen
y semejanza, mis hermanitos Eduardo y Francisco gracias por los momentos de complicidad,
especialmente quiero agradecer a mi hermanita Carmen, porque sin ella no hubiese culminado,
este trabajo de investigacin, eres mi pilar y mi orgullo, pasaste de ser una nia a una adolescente
y ahora una gran mujer y profesional.
A mi esposo Otto, porque gracias a su apoyo he cumplido una meta ms, este logro tambin es
tuyo, representas mi pasado, presente y futuro, te amo.
A la Universidad del Zulia, por la formacin recibida en ella
A FONACIT por el apoyo financiero brindado para el desarrollo de esta tesis.
A la Dra. Marinela Colina y a la Dra. Nelly Daz, gracias por las oportunidades brindadas.
Es difcil llegar a esta recta final sin esa familia a la que decidi tener a nuestros amigos
hermanos de cuaderno en fin, esos seres especiales que sirven de pilar. Quiero empezar
agradeciendo a mis amigos de hace ms de 10 aos, que se han mantenido intactos para mi
durante todo este tiempo y me han dado apoyo incondicional, Lurayni (brujita), Patricia (mi pa)
gracias por ser mi persona, Mara (maryita) gracias por escuchar siempre mis gritos de ayuda,
Solsiret amiga ma eres mi ejemplo a seguir algn da quisiera tener tu fortaleza y valenta, me
quito el sombrero ante ti, Johanna (bruja) lo nico que le pido a dios todos los das es ser como
tu cuando sea grande, Alexis (gordo) gracias por ponerme una sonrisa en mi boca en cada uno de
nuestros encuentros.
A mis compaeros de Laboratorio de qumica ambiental, Adrian, Josu, Erwin, Gerine, Andrs,
Brinolfo y Jos Alejandro. Muy especialmente a mis hijos acadmicos Carlos, Luis y Beltriz,
aunque el camino ha sido difcil continuamos en el sin desfallecer, los aprecio mucho.
A la familia de Agricultura y Soberana Alimentaria del Instituto de Estudios Avanzados (IDEA)
deje una familia a quien visitar cada vez que vaya a Caracas, Diamarys, Alan (malpi), Laura,
Cindy, Sandy, Daynet, Hctor, Mara Alejandra (maz), Daro (vida), Sr. Jos, Jos A., Juan M.,
Sra. Mara muy especialmente a mi Ta Esperanza y para finalizar a las personas que nos sacaron
de su corazn, gracias por hacer tan maravillosa nuestra estada por all.
A mis amigos del Laboratorio de Electrnica Molecular (LEM) y del Departamento de
Investigacin y Tecnologa de Materiales y Ambiente (DITeMA), por adoptarme y hacerme
10
sentir como un integrante ms del laboratorio, Miguel (Mickey), Miguel I., Atilio, Nstor, Jelem
y Joan, en especial al Dr. Ysaas Alvarado por permitirme culminar parte de mi trabajo
experimental en su laboratorio, infinitas gracias.
11
NDICE DE CONTENIDO
Pg.
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS
RESUMEN
14
ABSTRACT
15
1. INTRODUCCIN
16
2. FUNDAMENTOS TERICOS
18
18
18
2.1.2. Obtencin
19
2.1.3. Aplicaciones
20
20
23
26
26
27
30
3. OBJETIVOS
33
33
33
4. PARTE EXPERIMENTAL
34
34
4.2. Equipos
34
12
35
35
35
desacetilacin
4.3.3. Preparacin de Iminas de baja masa molecular
4.4. Caracterizacin del Quitosano y Derivados
36
36
36
36
37
37
37
37
38
39
5. RESULTADOS Y DISCUSIN
42
5.1
42
5.2
42
42
44
45
46
56
61
13
73
Grados de Desacetilacin
6. CONCLUSIONES
78
7. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
79
8. NDICE DE FIGURAS
86
NDICE DE TABLAS
89
14
15
Valbuena I, Ana C.. Obtencin de derivados de quitosano con posibles propiedades fungicidas y
bactericidas Trabajo de Grado. Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias.
Divisin de Estudios para Graduados. Laboratorio de Qumica Ambiental. Maracaibo, Venezuela,
2013, 89p
ABSTRACT
Nine different degree of deacetylation chitosans comprised between 73 97 % were synthesized.
The degree of deacetylation was determined by FTIR and it was confirmed by elemental analysis.
The crystallinity index determination was performed by X-Ray diffraction, observing decreasing
of its index with increasing of degree of deacetylation. High and middle molecular masses were
found in the chitosans obtained which were characterized by viscosimetric measurements. An
oxidative degradation of the samples 82%, 88 % and 97% degree of deacetylation , was done
subsequently using H2O2 activated with HCl . The fractions obtained were characterized by XRD
and FTIR techniques. It was found that the degraded fractions can maintain the chitosan
characteristic signals at high degrees of deacetylation and high index of crystallinity and, also, the
spectral level showed a new band corresponding to a deformation outside the plane of NCHCOO- group. It was established the importance of the degree of deacetylation chemical
depolymerization using H2O2 systems, Low molecular weight chitosans can be obtained from
high degrees of deacetylation chitosans. Likewise, imines were synthesized from low molecular
weight chitosan and characterized by FTIR. A broad spectrum antimicrobial activity to E. Coli, S.
Aureus, S. Cerevisiae and N. Crassa, was found for different degrees of deacetylation chitosans.
However, only bactericidal activity was showed for E. Coli and S. aureus, and fungistatic
activity for S.Cerevisiae and N. Crassa. Imines were synthesized from low molecular weight
chitosan this type of derivative behaved as fungicide and bactericide.
Keywords: Chitosan, degree of deacetylation, imines, antifungal, bactericidal, degradation
16
1. INTRODUCCIN
Un gran nmero de agentes fungicidas y bactericidas disponibles en el mercado presentan
caractersticas no compatibles con el medio ambiente y generan problemas de salud en los seres
humanos, es por esta razn que diversos grupos de investigacin estn desarrollando estrategias
alternativas para la obtencin de fungicidas y bactericidas a partir de biomasa especficamente a
travs de uno de los componentes importantes de sta como lo es el quitosano.1,2
La quitina es el segundo polisacrido ms abundante en la naturaleza despus de la celulosa.
Es un tipo de recurso natural renovable, que presenta un nmero especfico de propiedades, como
biocompatibilidad, biodegradabilidad y actividad no toxica hacia ciertas aplicaciones, por lo que
constituye una materia prima en potencia para obtencin de agentes antifngicos y bactericidas.2
Se encuentra en los crustceos, en el exoesqueleto de algunos insectos y en las paredes celulares
de muchos hongos y algas. El quitosano es su derivado, su principal fuente de produccin es a
partir de la hidrlisis de la quitina en medio alcalino; el quitosano es un heteropolisacrido y es la
forma desacetilada de la quitina. Est compuesto de dos subunidades D-glucosamina y N-acetilD-glucosamina, las cuales estn conectadas por la unin (14) glicosdica.3,4
Actualmente, numerosos autores1-4 han establecido que la actividad del quitosano ante entes
biolgicos depende de su distribucin de masa molecular, grado de desacetilacin, modificacin
qumica, grado de sustitucin, pH, longitud y posicin de los sustituyentes en las unidades
repetitivas de glucosamina y por supuesto del organismo objetivo. Estas variaciones podran
conllevar dos mecanismos diferentes de interaccin del quitosano con el microorganismo
especifico, el primero es la adsorcin del quitosano en las paredes celulares formando un
revestimiento de quitosano, rompimiento de la membrana y filtracin de este a travs de la pared;
el segundo es la penetracin del quitosano dentro de las paredes conllevando a la inhibicin de
varias enzimas y la interferencia con la sntesis del ARN y protenas.1-3
La variedad de grupos funcionales presentes en el quitosano tales como: grupos aminos y
grupos del tipo hidroxilo, ha hecho del quitosano uno de los materiales ms verstiles que se
pueden estudiar, por la posibilidad de realizar una amplia variedad de modificaciones qumicas,
obtenindose derivados que mejoran el desempeo del quitosano como agente antifngico y
17
bactericida.5-6 Entre los derivados del quitosano se encuentran: N-(sulfonados), N(sulfobenzoilos), N,N,N-trimetil, N,O-(acilos), O-(acilos), dimetilpiperazinas, carboximetilados,
N heterociclos, complejos de quitosano con metales de transicin; adems de derivados a partir
de la degradacin oxidativa para la obtencin de fracciones ms pequeas de baja masa
molecular.1,2
Basados en las caractersticas estructurales y la aplicabilidad biocompatible de este
heteropolisacarido, en este trabajo se planteo la modificacin qumica del quitosano pudindose
generar productos con mejor desempeo fungicida y bactericida. Es importante resaltar, que el
uso del quitosano ha tomado mayor relevancia debido a que es un producto natural
biodegradable, no toxico y con propiedades antimicrobianas, por tanto este podra alcanzar las
necesidades mundiales de la agricultura sustentable.7
18
2. FUNDAMENTOS TERICOS
6
O
OH
2
3
H2N
HO
NH
6
OH
GA
100-GA
19
20
2.1.3 Aplicaciones
Debido a la variedad de grupos funcionales, en los que se encuentran grupos aminos en la
cadena polimrica y grupos del tipo hidroxilo, ha hecho del quitosano uno de los materiales ms
verstiles que se pueden estudiar, por la posibilidad de realizar una amplia variedad de
modificaciones qumicas que le confiere propiedades especficas que permiten aprovecharla en
diferentes campos, como se muestra en la Tabla 1.17
Tabla 1. Principales aplicaciones del quitosano.17
rea
Aplicacin
Mecanismos defensivas en plantas. Simulacin de crecimiento de
Agrcola
Tratamiento de aguas
Alimentos
para
salsas.
Revestimiento
para
frutas
como
Biofarmacuticas
21
comportamiento de los mismos.18 Para los dos copolmeros es esencial el estudio de sus
estructuras qumicas, es as como la caracterizacin espectroscpica por FTIR (Siglas en ingles
de: Infrarrojo con Transformada de Fourier) es una tcnica relativamente rpida para una
evaluacin cualitativa del GA a travs de la determinacin de las reas de absorcin.19 En la
Tabla 2 se muestran algunas bandas de absorcin en el infrarrojo correspondiente a la quitina y
quitosano.1,18-21
Tabla 2. Asignacin de seales en la regin infrarroja para el quitosano y quitina.
Numero de onda (cm-1)
Grupo funcional
3200-3500
(O-H y N-H)
2940-2930
1727-1690
1648
Amida I
~ 1623
1597
-NH2
1555
Amida II
1480
C=O de COCH3
1458
1425-1420
1254
O-H
1160-1140
1089
O-H
1044
1028
895 y 1153
777,5
: Estiramiento, : deformacin
22
23
4,62 4,85
H1 (H1 de GluNAc)
4,85 4,97
H1 (H1 de GluNH2)
3,18 3,24
H2 (H2 de GluNH2)
3,38 3,65
H2 (H2 de GluNH2)
3,52 3,87
H3 (H3 de GluNH2)
3,52 3,65
H3 (H3 de GluNAc)
3,74 4,34
1,95 2,09
HN-COCH3
2,09 2,11
CH3COOH (AcOH)
102,7 105,7
C1
55,2 57,6
C2
73,1 - 75,7
C3
80,9 85,7
C4
73,1 75,7
C5
59,6 60,8
C6
22,8 29,3
N-CH3 (C7)
173,6 173,8
N-C=O (C8)
v,
n y
w). Sin
una informacin ajustada del valor de masa molar. La viscosidad intrnseca de una solucin de
24
(1)
(2)
(3)
25
(4)
Donde f es el rea de los picos de cristalinidad, referentes a cada unidad del quitosano. De
esta manera, se puede calcular el grado de cristalinidad de una muestra.
26
27
CMI (ppm)
Gram Negativas
Escherichia coli
Salmonella enterica
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
CMI (ppm)
Gram Negativas
20, 100, 468, 650 y
1000
2000 y 3000
Xanthomonas
campestris
Samonella tiphymurium
>1000
>20 y 1700
Aeromonas hydrophila
1000
Gram Positivas
Bacillus cereus
Organismos Sensibles
500
Gram Positivas
<1000 y 1000
20, 100, >800, 700 y
Bacillus megaterium
Listeria monocytogenes
>1250
Hongos
800
150, 250 y
800
Hongos
Aspergillus fumigatus
>2000
Fusarium oxysporum
100
Aspergillus parasiticus
Botrytis cinerea
>2000
10
28
entender la efectividad del quitosano ante estos entes. La movilidad, la atraccin y la interaccin
inica de cadenas pequeas resulta ser ms eficiente a la hora de realizar protecciones de
membranas celulares con uniones eficaces en la superficie de los organismos, en comparacin
con cadenas ms largas y de conformaciones ms amplias. De manera similar, en lo que respecta
la accin del quitosano en presencia de hongos, este puede establecerse como un agente
fungisttico y no fungicida, con muchas potencialidades que pueden establecer cambios de
ordenacin, tanto en el hospedero como en el hongo.
Generalmente el quitosano tiende a ser eficaz en la inhibicin de la germinacin de esporas,
la elongacin del tubo germinativo y el crecimiento radial. La mayora de los estudios se han
realizado en levaduras y hongos asociados al deterioro de plantas y de alimentos. Para estos
microorganismos, en presencia de quitosano se activan varios procesos en el tejido vegetal, donde
las quitinasas inducen una intervencin sobre los micoparsitos biotrficos y necrotrficos, en
hongos entomopatgenos y en hongos micorricicos arbusculares. Los estudios realizados en
cultivos de R. solani y S. rolfsii en medios nutridos por agar, han indicado que el porcentaje de
germinacin del hongo disminuy con el aumento de la concentracin de quitosano en el
medio.40
Existen varios mtodos para degradar el quitosano y obtener fracciones de menor masa
molar en los que se incluye la hidrlisis enzimtica, hidrlisis cida, irradiacin de alta energa,
degradacin trmica y por tratamiento ultrasnico, el quitosano es sensible a una amplia variedad
de agentes oxidantes, los cuales ocasionan cambios estructurales significativos. 41
En la bsqueda de agentes oxidantes limpios y eficientes el perxido de hidrgeno surge
como una alternativa apropiada. En medio alcalino puede actuar como una especie nucleoflica
formando el anin hidroperxido (HOO-) y en medio cido el reactivo es estable (pH<6,0)
actuando electroflicamente45. En presencia de cidos orgnicos e inorgnicos oxidantes forma
percidos. Cuando se emplea el perxido de hidrgeno en condiciones cidas sin la formacin de
percidos (catlisis cida), pueden formarse diferentes productos de degradacin dependiendo de
las cantidades de reactivo empleadas, una propuesta alternativa es el uso de perxido en medio
neutro. Esto supone una forma de activacin del agente oxidante sin emplear otro reactivo, lo
cual asegura un proceso ms limpio y competitivo debido a que el principal subproducto de la
reaccin sera el agua.42 Esto mtodos de oxidacin con perxido se basan en la formacin de
29
radicales libres de gran alcance por la disociacin del H2O2, lo que efectivamente puede atacar a
los enlaces -(14)-D-glucosdicos y degradan el quitosano obtenindose as quitosano de
masas moleculares bajas. Sin embargo, estos mtodos son ineficientes cuando se utiliza solo
H2O2. Para mejorar la eficacia, se combina la degradacin con H2O2, en presencia de tcnicas
qumicas y fsicas.42-48
En el sistema de despolimerizacin del quitosano con H2O2, los reacciones existentes son
las mostradas en las ecuaciones (5) y (6), y la reaccin total es mostrada en la ecuacin (7).
R-NH3+
R-NH2 + H +
H2 O2
H2O2 + R-NH2 + H +
(5)
H + + HOO -
(6)
R-NH3 + + H + + HOO -
(7)
HOO- OH- + O
(8)
(9)
.
El radical hidroxilo es un oxidante muy potente. La principal accin del HO con el
(10)
(11)
30
H2O2 + hv 2 HO (12)
La degradacin oxidativa de quitosano con perxido de hidrgeno en microondas seria
otra condicin de oxidacin bastante factible, esta activacin conduce de forma rpida la ruptura
de los enlaces glicosdicos del quitosano ya que el calentamiento por microondas produce un
calentamiento dirigido directamente al seno molecular esta irradiacin hace que la tasa de algunas
reacciones orgnicas aumente 1240 veces en comparacin con los mtodos clsicos. El nivel de
energa de las microondas coincide con el nivel de energa de rotacin de molculas polares, lo
que implica que la energa de microondas puede absorberse rpidamente por enlaces polares lo
que poda llevar a cabo una interaccin directa de el agente oxidante al enlace C-O-C
glucosdico.49
31
cetona en la que ha sido sustituido el grupo carbonilo (C=O) por una imina o grupo azometina.
En los diferentes derivados del quitosano, existen diferentes tipos de grupos aminos como aminas
primarias (R-NH2), iminas (-C=N) en bases de Schiff de quitosano, aminas secundarias (R2-NH)
en quitosano N sustituido y sales amonio cuaternario (R3N+). Generalmente muchos de estos
productos derivados presentan actividades antifungicas o bactericidas para Btrytis cinerea Pers.
(B. cinerea Pers) y Colletotrichum lagenarium (Pass) Ell. et halts (C. lagenarium (Pass) Ell.et
Halts).18 En la Figura 3 se muestra la ruta de la sntesis.50-56
3
HO
4
H2 N
1
2
RCHO
N=CHR
1
2
OH
HO
4
OH
100-GA
100-GA
NaBH4
H3 C
3
HO
4
I
5
6
OH
CH3
+
NCH2R
1
2
O
CH3I,NaI/NaOH
HO
4
5
6
OH
NHCH2R
1
2
B
O
100-GA
100-GA
Figura 3. Ruta sinttica para la preparacin de los derivados de quitosano N sustituidos (A)
Iminas a partir de quitosanos (B) N-alquil quitosanos.
Estos microorganimos B. cinerea Pers y Colletotrichum lagenarium (Pass) Ell.et halst
representan las mayores enfermedades de vegetales y frutas en el mundo. La sntesis de
antifngicos para el control de estas enfermedades en especfico proporcionaran una gran ventaja
al mundo de los fungicidas y ms an si se lograrn obtener estos de forma ecoamigable.38
Los derivados de quitosano N- bencilados (ver Figura 4) son muy importantes para el control
patgeno de algunos microorganismos en las plantas como Agrobacterium tumefaciens,
Fusarium oxysporum hongo patgeno de la enfermedad Pythium debaryanum.
32
R
HO
4
H2N
1
2
6
OH
ArCHO, AcOH/H2O 1 %
N=CH
1
2
1 h, Temperatura ambiente
HO
4
OH
100-GA
100-GA
1.5 h,
Temperatura ambiente
NaBH4
(1.5 moles)
R
3
HO
4
NHCH2
1
2
OH
100-GA
O2S
3
HO
4
H2N
5
6
OR
HN
SO2Cl
HO
NH
5
6
OR1
O
O
100-GA
100-GA
HN
R=H , R1 = O
SO2Cl
R=R1=SO3-
R=R1=CH2COOH
33
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivos
3.1.1 Objetivo General
Obtener derivados de quitosano con posibles propiedades fungicidas y bactericidas; mediante,
hidrlisis alcalina, degradacin oxidativa con perxido de hidrogeno y por reacciones de
iminacin.
3.1.2 Objetivos Especficos
1. Obtener quitosano de diferentes grados de N-desacetilacin por hidrlisis alcalina de la
quitina extrada de los exoesqueletos de crustceos.
2. Obtener derivados de quitosano (fracciones), por medio de reacciones orgnicas de
degradacin oxidativa con perxido de hidrogeno.
3. Sintetizar derivados de quitosano tipo base de Schiff por reacciones de iminacin con
diversos aldehdos.
4. Caracterizar qumica y fisicoqumicamente los derivados de la quitina y del quitosano
(FTIR, anlisis elemental, difraccin de rayos X y viscosidad, entre otras).
5. Evaluar las propiedades fungicidas y bactericidas del quitosano y derivados, a travs del
uso de medios de cultivo lquido definidos.
34
4. PARTE EXPERIMENTAL
4.2 Equipos
Para medir las masas de los desechos industriales de cangrejos y NaOH durante la
extraccin de la quitina y obtencin del quitosano se us una balanza digital (Premier) con
sensibilidad 5 g, para el resto del proceso se utiliz una balanza analtica (Dhaus) con
sensibilidad 0,0001 g, para las reacciones de desproteinizacin, desmineralizacin y
desacetilacin se utiliz un reactor elaborado por la empresa Acerinox en acero inoxidable con
camisa de calentamiento a llama y provisto de agitacin. Las reacciones de degradacin se
llevaron a cabo en planchas de calentamiento (Cimarec) con agitacin magntica.
Espectrmetro IR marca Shimadzu modelo FTIR 8400; Difractmetro de Rayos X marca
Bruker modelo D8 Focus; Analizador Elemental marca Leco Modelo Truspec CHN y un
espectofotrometo Tecan con 96 pozos para multianalisis. DSC TA Instrument.
35
36
(13)20
(14)
(15)
37
(16)
38
durante 24 h. Para la
conservacin de las bacterias, se adicionaron 500 L del cultivo de bacterias crecido previamente
y 500 L de glicerol al 60% en tubos eppendorf estriles, se obtuvo como volumen final 1 mL del
cultivo bacteriano, posterior a ello, se llevo a un congelador a 80 C.
4.5.1.2 Cintica de crecimiento de E. coli CVCM2070 y S. aureus CVCM764.
Se activo nuevamente las bacteria E. coli CVCM2070 y S. aureus CVCM764 de acuerdo al
experimento de la seccin anterior, a diferencia de este se tomo como inoculo inicial, el cultivo
conservado y se sembr en 30 mL de LB Broth. Posteriormente, se sembr 3 ml del cultivo de
bacterias crecido y fueron diluidos en 30 mL de LB Broth estril, se llev a incubar con
agitacin a 100rpm durante 1h.
Fueron tomados 100 L del cultivo crecido durante 1h, y se mont por triplicado en tubos de
ensayo de 20ml los siguientes ensayos, para garantizar que los solventes empleados en las
proporciones mostradas en la Tabla 5 permitan la solubilidad del quitosano y a su vez no inhiban
el crecimiento de las bacterias. Posteriormente, se llevaron dichos ensayos a la incubadora con
agitacin 100 rpm, y se realiz un seguimiento durante cada hora, mediante el uso un
espectrofotmetro a 600 nm.
39
Tabla 5. Ensayo de crecimiento de las bacterias con los solventes a emplear en la solubilidad
del quitosano.
Cultivo de Bacterias
Solventes
100 L
100 L
4.5.1.3 Efecto del quitosano en el crecimiento bacteriano por difusin en medio lquido definido
(Antibiograma).
Para la construccin del Antibiograma, se realiz la cintica de crecimiento de E. coli y de S.
aureus, en presencia de diferentes concentraciones de quitosano (1,56; 3,12; 6,25; 12,5; 25; 50;
100 y 200 ppm), adems de un control representado por el agua y el acido actico al 1 % luego se
llev incubar con agitacin a 100 rpm durante el tiempo correspondiente a la cintica de
crecimiento de la bacteria estudiada, en este caso E. Coli y para S. aureus especficamente,
posterior a ello se midi la absorbancia a 600 nm.
40
caso de la S. Cerevisiae se obtuvo un aislamiento efectivo en ese medio de cultivo, para el caso
de C. Guilliermondii no hubo ningn resultado.
Se realizaron pruebas de solubilidad de las muestras de quitosano con el medio de cultivo
de levadura de panadera, estas muestras revelaron que ese medio estimula la precipitacin del
quitosano, indicando que este medio no es adecuado para realizar los ensayos de actividad
antimicrobiana. Por esta razn se modific el medio de cultivo ya optimizado, y se utiliz el
medio YPD y YPD2 (doble de concentracin del medio YPD) para la activacin y aislamiento, se
realiz la activacin de la cepas Saccharomyces Cerevisiae y Candida Guilliermondii en el
medio YPD y YPD2 a 30 C y 37 C, se observ la activacin de estas levaduras a partir de las
36 h, debido a una turbidez a 600 nm de 1.2456 para S. Cerevisiae y para C. Guilliermondii de
0.0025 lo que indic para el caso de C. Guilliermondii no hubo activacin en esos medio de
cultivos. As mismo, se procedi a realizar el aislamiento con los medios de cultivo YPD y YPD2
en Agar, para el caso de la S. Cerevisiae se obtuv un aislamiento efectivo en esos medios de
cultivo.
Luego del aislamiento se tomo una colonia individual se incub en los medios de cultivo
por 12 h luego se tomo 1 mL y 2 mL y se preincubaron por 1 hora, se tomaron placas de 96 pozos
y se evaluaron para ambos medios de cultivo los siguiente volmenes de inoculo 5, 10, 20 y 40
L en un volumen final de 200 L, se tomaron mediciones cada hora por 17 horas a 600 nm.
Se estableci entonces que la cintica de crecimiento para S. Cerevisiae presenta en todas su
condiciones una fase de latencia hasta las 10 horas, a partir de all empieza su fase de crecimiento
y a partir de 16 h inicia su fase estacionaria, se estableci como volumen de inoculo optimo 40
L, y volumen de inoculo optimo a preincubar 2 mL. Se realizaron las pruebas antimicrobianas
con quitosano desde (0 400) ppm.
41
42
5. RESULTADOS Y DISCUSIN
Tiempos de reaccin,
h
--6 + 4 (10)
4 + 4 + 4 + 4 (16)
4 + 4 + 4 (12)
6 + 4 (10)
6 + 6 + 6 (18)
6 + 3 + 3 (12)
6 + 4 + 4 (14)
4 + 4 + 4 + 4 (16)
4 + 4 + 4 + 5 (17)
[NaOH],
% m/v
--30
30
30
50
50
50
50
50
50
GDA, %
GDB, %
32,86
70,18
72,41
74,06
81,20
87,01
85,38
88,23
92, 08
95,76
30,03
73,07
75,51
78,02
82,56
86,01
88,09
89,22
90,12
97,04
GDA = Grado de desacetilacin obtenido por espectroscopia de FTIR a travs de la ecuacin (13) y (14)
GDB= Grado de desacetilacin obtenido por anlisis elemental (CHN) a travs de la ecuacin (16).
43
T (%)
OH y NH
80
CH de CH y CH 2
100
60
40
20
0
3300
2800
2300
1800
Nmero de Onda (cm -1 )
Quitosano (Q9)
Quitina
1300
800
T (%)
C-O de (1-4)
glucosidco
primario
-C-O Alcohol
secundario
-C-O Alcohol
-CH 3
-NH2
Amida II
80
Amida I
100
C=O de NHCOCH 3
60
40
20
0
1800
1700
1600
1500
Quitosano (Q9)
1400
1300
1200
Nmero de Onda (cm -1 )
1100
1000
900
800
Quitina
Figura 6. Espectros infrarrojos de la Quitina y Quitosano (Q9) (A) Espectro de infrarrojo entre
800 3900 cm-1 (B) Expansin del rea C-O-C. (Fuente Propia:2013)
44
AB
6600
Quitosano
5600
Quitina
(110)
4600
(020)
3600
2600
1600
600
5
10
15
20
25
30
35
40
94
89
84
79
74
69
30
40
50
60
70
80
90
100
Figura 7. (A) Difractogramas de Quitina y Quitosano. (B) ndice de cristalinidad en funcin del
Grado de desacetilacin (Fuente Propia:2013)
45
25
/ 1 = 1 + 1,19914 CQ+ 0,14105 CQ2
R2 = 0.99308
20
/ 1
15
10
0
0
10
C Q (g/L)
46
[], g/L
K, L/g
Mv ,KDa
Q1
Q2
Q3
Q4
Q5
Q6
Q7
Q8
Q9
QBMM
QMMM
QAMM
0,78265
0,56752
1,45697
0,52343
0,46634
1,34311
1,35064
2,24579
2,91413
0,10543
1,19914
3,38723
2,00E-07
2,92E-07
5,06E-07
1,02E-06
1,98E-06
2,74E-06
3,21E-06
3,75E-06
1,07E-05
5,10E-06
5,10E-06
5,10E-06
2,5461
2,5859
2,6156
2,6564
2,6972
2,7176
2,7278
2,7385
2,8094
2,5851
2,5851
2,5851
388,390
270,321
294,801
141,178
98,109
124,151
115,298
128,820
86,024
46,7017
119,601
178,732
47
inhibieron el crecimiento de dichas bacterias, por consecuencia de la acidificacin del medio por
parte del solvente.58,59
A
B
80
80
60
60
LB
T (%)
T (%)
LB
40
LBAcAc 1 %
40
LBAcAc 1 %
LBAcAc 2 %
LBAcAc 2 %
LBAcAc 3 %
20
LBAcAc 3 %
20
0
0
10
11
10
11
2.0
2.0
y = 1.0916x + 1.0346
R = 0.9907
y = 0.7843x + 1.213
R = 0.9833
1.8
Log(%T)
Log(%T)
1.5
1.6
1.4
1.0
1.2
1.0
0.5
0.0
0.2
0.4
Log(t)
0.6
0.8
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Log(t)
Figura 9. Curvas de crecimiento de S.aureus (A) y E.coli (B) a 37C en solucin de acido
actico-agua 1% a 37 C. Ajuste lineal de la curva de crecimiento de S.aureus (C) y E.coli (D)
(Fuente Propia:2013)
En la Figura 9 (C-D) se observa el ajuste de las curvas de crecimiento proporcionando a
partir de la pendiente la velocidad mxima especifica de crecimiento, para S. aureus de 1.09 h-1 y
para E. coli 0.78 h-1 . El quitosano inhibi el crecimiento de E. coli, S. aureus; los resultados de
inhibicin total se muestran en la Figura 10, dicha inhibicin dependi de varios aspectos como:
la especie bacteriana, grado de desacetilacin y concentracin de la solucin de quitosano.
Obtenindose que para E. coli no se presentan diferencia significativas (p< 0,05) entre Q9 y Q8
mientras que si se refleja diferencia (p < 0,0001) para los grados de desacetilacin Q7-Q4,
especficamente a partir de los rangos de concentraciones de 12.5 100 ppm. Por otra parte, el
quitosano reflejo una relacin dosis-dependiente inhibidora de crecimiento, as mismo se conoci
48
concentraciones mnima inhibitoria (CIM) con rangos que van desde 25-100 ppm; variando de
igual manera en funcin del los grados de desacetilacin como se observa en la tabla 8. 67-70
80
Q9
Q8
Q7
Q6
Q5
Q4
T (%)
60
40
20
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Q9
Q8
Q7
Q6
Q5
Q4
T (%)
60
40
20
0
0
25
50
75
100
125
Figura 10. (A) Efecto del quitosano con diferentes grados de desacetilacin en el crecimiento de
Escherichia coli (B) Expansin de la zona de concentraciones mnimas inhibitorias. (Fuente
Propia:2013)
49
50
80
Ampicilina
Q8
Q6
Q9
Q7
Q5
Q4
T (%)
60
40
20
0
0
25
50
75
100
125
200
400
80
Sulfato de cobre
Q9
Q6
Q5
Q8
Q7
Q4
T (%)
60
40
20
0
0
25
50
75
100
125
51
80
Estreptomicina
Q6
Q7
Q9
Q5
Q8
Q4
T (%)
60
40
20
0
0
50
100
200
300
400
Figura 12. Efecto de quitosano con diferentes grados de desacetilacin (GD %) en el crecimiento
de Escherichia coli. Efecto del control negativo Estreptomicina. (Fuente Propia:2013)
Q9
25
Q8
25
Q7
50
Q6
50
Q5
100
Q4
100
Estreptomicina
100
Ampicilina
25
Sulfato de Cobre
25
52
70
60
Q9
Q8
Q7
Q6
Q5
Q4
50
T (%)
40
30
20
10
0
1,56
6,25
12,5
25
50
100
200
300
400
Figura 13. Efecto del quitosano con diferentes grados de desacetilacin (GD %) en el
crecimiento de Staphylococcus aureus. (Fuente Propia:2013)
Tabla 9 Concentracin mnima inhibitoria de los compuestos antibacterianos, en el crecimiento
de Staphylococcus aureus. (Fuente Propia:2013)
Muestras
Q9; Q8
50 ppm
Q7; Q6
50 ppm
Q5; Q4
100 ppm
Estreptomicina
---
Ampicilina
---
Sulfato de Cobre
50 ppm
53
70
60
Ampicilina
Q9
Q8
Q7
Q6
Q5
Q4
50
T (%)
40
30
20
10
0
1,56
6,25
12,5
25
50
100
200
300
400
A
70
60
50
T (%)
40
30
20
10
Estreptomicina
Q9
Q8
25
50
Q7
Q6
Q5
Q4
0
1,56
6,25
12,5
100
200
300
400
Figura 14. Efecto del quitosano con diferentes grados de desacetilacin en el crecimiento
Staphylococcus aureus. A) Efecto del control negativo Ampicilina. B) Efecto del control negativo
Estreptomicina. (Fuente Propia:2013)
54
70
Sulfato de cobre
Q9
Q8
Q7
Q6
Q5
Q4
60
50
T (%)
40
30
20
10
0
1,56
6,25
12,5
25
50
100
200
300
400
Figura 15. Efecto de la molcula de quitosano con diferentes grados de desacetilacin (GD %)
en el crecimiento de Staphylococcus aureus. (Fuente Propia:2013)
Se ha demostrado que la actividad antibacteriana actu en funcin del microorganismo
objetivo, el grado de desacetilacin y la concentracin de solucin de quitosano.70 El efecto del
quitosano como agente antibacteriano aumenta en funcin al grado de desacetilacin, este ltimo
alusivo a la cantidad de grupos aminos libres NH3+; se sugiere que la estructura policatinica que
se forma en el proceso de desacetilacin de la quitina interactuo con los componentes anionicos
predominantes (lipo - polisacridos, protenas) de las bacterias Gram-negativas; as mismo, la
unin de quitosano a los cidos teicoicos presente en Gram-positivas, junto con un potencial de
extraccin de lpidos de membrana (predominantemente cido lipoteicoico), da como
resultado una secuencia de eventos que conduce a la muerte bacteriana. La presencia de grupos
NH3+, es lo que desempea el papel importante. En consecuencia quitosanos con mayor GD
mostraron un fuerte efecto inhibitorio. 76-83
55
80
Control +
Q9
Q8
Q7
Q6
Q5
Q4
T (%)
60
40
20
***
***
***
***
***
***
0
Control
Q9
Control ++ Q9
Q8
Q8
Q7
Q7
Q6
Q6
Q5
Q5
Q4
Q4
Muestras de Quitosano
Figura 16. Comparacin del crecimiento Escherichia coli con quitosanos de diferentes grados de
desacetilacin con las concentraciones mnimas inhibitorias respectivas p < 0,0001. (Fuente
Propia:2013)
56
80
Control +
Q9
Q8
Q7
Q6
Q5
Q4
T (%)
60
40
20
***
0
Control
Control ++ Q9
Q9
***
***
***
***
Q8 Q7
Q7
Q6
Q5
Q5
Q6
Q8
Muestras de Quitosano
***
Q4
Q4
Figura 17. Comparacin del crecimiento Staphylococcus aureus con quitosanos de diferentes
grados de desacetilacin con las concentraciones mnimas inhibitorias respectivas p < 0,0001.
(Fuente Propia:2013)
5.4 Pruebas antimicrobianas de quitosanos de distintos grados de desacetilacin frente
a Sacaromyces Cerviciae y Neurospora crassa
Se realiz la curva de crecimiento para S. Cerevisiae en medio de cultivo YPD y medio de
cultivo YPD mas acido actico como se puede observar en la Figura 18 (A), estas muestran una
fase de latencia hasta las 10 horas, a partir de all empieza su fase de crecimiento y a partir de 16
h inicia su fase estacionaria, se estableci como volumen de inculo ptimo 40 L, y volumen de
inculo ptimo a preincubar 2 mL. En la Figura 18 (B) se observa el ajuste de la curva de
crecimiento proporcionando a partir de la pendiente la velocidad mxima especfica de
crecimiento, para S. Cerviciae 2,25 h-1. El quitosano inhibi el crecimiento de S. Cerviciae, los
resultados de inhibicin total se muestran en la Figura 19. Sin embargo, dicha inhibicin se
observ a partir de concentraciones altas 200 ppm para Q9 y Q8 no se presentan diferencias
significativas (p< 0,05) con respecto a la capacidad inhibitoria de los fungicidas comerciales
Benomil y Ketoconazol, mientras que se refleja diferencia significativa (p < 0,0001) para los
grados de desacetilacin Q7-Q4, ya que se necesitaron concentraciones por encima de los 1000
ppm para observar un efecto.
57
En la Figura 20 se puede observar que no hay una amplia disminucin del porcentaje de
levaduras con respecto a la variacin del grado de desacetilacin, lo que indic que para ste tipo
de microorganismos es necesario realizar una modificacin estructural del quitosano, para
mejorar su desempeo frente a estos.
80
T (%)
60
40
YPD
YPDAcAc 1 %
20
0
0
12
16
20
24
Tiempo (h)
2.0
Log(%T)
1.5
1.0
y = 2.2585x + 0.4236
R = 0.9885
0.5
0.0
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Log(t)
58
100
Ketoconazol
Q8
Q9
80
Benomil
T (%)
60
40
20
0
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
Conce ntracin de quitosano (ppm)
100
Control + (Agua)
Q9
80
Q8
Q7
Q6
60
T (%)
Q5
Q4
40
20
0
Control
Q9
Q8
Q7
Q6
Q5
Q4
Figura 20. Comparacin del crecimiento Saccaromyces Cervisiae con quitosanos con diferentes
grados de desacetilacin. (Fuente Propia:2013)
Se realiz la curva de crecimiento para N. Crassa a travs de la determinacin de glucosa en
el medio de cultivo, de acuerdo a la curva de calibracin mostrada en la Figura 21, se obtuvieron
59
dos curvas en el medio de cultivo MPPY y en medio de cultivo MPPY ms cido actico Ver
Figura 22 (A), se estableci como consumo constate de glucosa a partir de las 24 h, tiempo
propicio para la evaluacin de las propiedades. El quitosano inhibi el crecimiento de N. Crassa,
los resultados de inhibicin total se muestran en la Figura 22 (B), dicha inhibicin se observ a
partir de concentraciones altas 400 ppm para Q9 y Q8, se observarn diferencias altamente
significativas (p < 0,0001) con respecto a la capacidad inhibitoria del fungicida comercial
Benomil, mientras que para los grados de desacetilacin Q7-Q4 hay inhibicin a partir de 400
ppm pero el porcentaje de micelio del hongo muerto es menor, en este caso tampoco se observa
una amplia disminucin del porcentaje micelio del hongo con respecto a la variacin del grado de
desacetilacin. Se verifico la capacidad fungisttica de estos quitosanos ya que luego de realizar
el mtodo de resiembra, el micelio del hongo contino en crecimiento (Ver Figura 22 (C).
1.0
2.0
y = 0.0021x - 0.0221
R = 0.9864
0.8
0.6
Absorbancia
Absorbancia
1.5
0.4
1.0
0.5
0.2
0.0
400
0.0
450
500
550
600
650
700
200
400
600
800
g/mL
Figura 21. (A) Espectros de las distintas concentraciones del complejo enzimtico de glucosa (B)
Curva de calibracin para consumo de glucosa del N. Crassa. (Valbuena,2013)
60
500
450
400
350
MPPY
MPPYAcAc1%
300
0
20
40
60
80
100
80
Q8
Q9
Q7
Q6
Q5
Benomil
Q4
60
40
20
0
50 100 150 250 350
400
450
600
800
Figura 22. (A) Curva de crecimiento de N. Crassa a 25 C (B) Efecto de quitosanos con
diferentes grados de desacetilacin (GD %) en el crecimiento de N. Crassa. (Fuente Propia:2013)
61
80
60
**
ns
ns
Q6
Q5
Q4
40
20
5
Q
Q7
Q8
Q9
on
tr
ol
+
Control +
Q uitosano
Figura 22. (C) Comparacin del control + con el efecto de la molcula de quitosano con
diferentes grados de desacetilacin (GD %) en el crecimiento N. Crassa; para las concentraciones
mnimas inhibitorias respectivas.Valor de P: < 0.05 (**).(Fuente Propia:2013)
5.5 Degradacin oxidativa de quitosano
La degradacin oxidativa del quitosano se llev a cabo con Q4, Q6 y Q9 cada una con un
grado de desacetilacin diferente, en este caso se vari solo el tiempo de reaccin como se
explica en la Seccin 4.3.2 . Durante el proceso de oxidacin se obtuvo una fraccin insoluble en
agua, a nivel espectral se muestran similitudes caractersticas de quitosano de alto grado de
desacetilacin, sin embargo se muestra una variacin en el rea C-O-C, atribuido quizs a la
formacin de nuevos grupos durante el proceso de degradacin, as mismo se muestra una seal a
aproximadamente a 1623 cm-1 la cual se puede asignar a la absorcin C=O, probablemente a
nuevos grupos formados durante la oxidacin, a 777,5 cm-1 se muestra una seal para el caso de
las fracciones degradadas a 150 min y 240 min, esta seal es correspondiente a la deformacin
fuera del plano del grupo N=CHCOO- (Ver Figuras 23-25).
62
A
30minQ4
90minQ4
150minQ4
240minQ4
100
T (%)
80
60
40
20
0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
B
30minQ4
90minQ4
150minQ4
240minQ4
100
60
40
20
0
2000
C=O de degradacin
T (%)
80
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
-1
Figura 23. (A) Espectros de FTIR de las fracciones de Q4(B) Expansin del rea C-O-C. (Fuente
Propia:2013)
63
A
100
90minQ6
30minQ6
150minQ6
240minQ6
1500
500
T (%)
80
60
40
20
0
4000
3500
3000
2500
2000
1000
-1
30minQ6
150minQ6
C=O de degradacin
T (%)
80
90minQ6
60
40
20
0
2000
1800
1600
240minQ6
100
1400
1200
1000
800
600
-1
Figura 24. (A) Espectros de FTIR de las fracciones de Q6. (B) Expansin del rea C-O-C.
(Fuente Propia:2013)
64
A 100
30minQ9
90minQ9
150minQ9
240minQ9
T (%)
80
60
40
20
0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
30minQ9
90minQ9
150minQ9
240minQ9
100
40
60
C=O de degradacin
T (%)
80
20
0
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
Figura 25. (A) Espectros de FTIR de las fracciones de Q9. (B) Expansin del rea C-O-C de los
espectros de FTIR de las fracciones de Q9. (Fuente Propia:2013)
65
correspondiente a las vibraciones de los enlaces glicosdicos (14), se observa cmo hay una
disminucin en el rea de esas bandas, lo que es indicativo de una disminucin de esos grupos
dadas las condiciones de degradacin oxidativa a las cuales se sometieron las muestras. Para el
caso de Q9 se puede observar que hay una degradacin ms marcada a medida que el tiempo de
reaccin va en aumento, esto se debe a diferencias en entre ambas muestras la cual es para Q4.
Asi mismo, se pudo corroborar que el proceso de degradacin ocurri ya que hubo una
disminucin marcada en la masa molecular de las fracciones degradadas, para Q4
aproximadamente un 20 %, para Q6 aproximadamente un 55 % y para Q9 mas de 50 %, el
aumento en la degradacin se debe una degradacin marcada a medida que el tiempo de reaccin
va en aumento, esto se debe a diferencias en desacetilacin entre ambas muestras la cual es
mayor para Q4>Q6>Q9 (Ver Tabla 10).
20
A1153 Q9
A895 Q9
A1153 Q4
A895 Q4
15
10
0
0
100
200
300
Figura 26. reas de las bandas 1153 cm-1 y 895 cm-1 de los espectros FTIR de Q9 y Q4 en
funcin del tiempo de oxidacin. (Fuente Propia:2013)
66
QAMM as como de los quitosanos degradados de Q6 y 240minQ6. Como puede observarse las
curvas de los quitosanos QBMM y QAMM son caractersticas de este material a una temperatura
aproximada de 70 C aparece un pico relacionado a pequeos movimientos inducidos por el agua
enlace (agua que interacta con el quitosano). Luego a una temperatura alrededor de 200 C se
observa una temperatura de transicin vtrea (Tg) del polisacrido. Finalmente a 295 C
experimenta degradacin trmica antes de fundir.
De igual manera, se pueden analizar los quitosanos degradados Q6 y 240minQ6, a una
temperatura de 70 C se observa el pico asignable al agua enlace. La Tg del material se desplaza
a menores temperaturas respecto al quitosano comercial mientras que la degradacin trmica
muestra distintos comportamientos. El Q6 presenta un nico pico a temperaturas cercanas a
295C y el 240minQ6 presenta dos temperaturas de degradacin.
El quitosano Q6 muestra caractersticas al QAMM y el quitosano 240minQ6 se asemeja al
QBMM, debido probablemente a similitudes en la masa molar del polmero. Las dos primeras
presentan altas masas molares mientras que las ltimas muestras bajas masas molares32, como se
observa en la Tabla 10.
QAMM
Q6
QBMM
240minQ6
1
Endo
0
Exo
-1
-2
40
80
120
160
200
240
Tempe ratura (C)
280
320
Figura 27. Termogramas para las muestras de quitosano comerciales, degradadas y sin degradar.
(Fuente Propia:2013)
67
[], g/L
K, L/g
Mv, KDa
QBMM
QMMM
QAMM
Q4
30minQ4
90minQ4
150minQ4
240minQ4
Q6
30minQ6
90minQ6
150minQ6
240minQ6
Q9
30minQ9
90minQ9
150minQ9
240minQ9
0,10543
1,19914
3,38723
0,52343
0,49891
0,43262
0,35986
0,25698
1,34311
1,25897
1,16589
1,12569
0,15893
2,9141
2,0568
1,5624
0,5459
0,52343
5,10E-06
5,10E-06
5,10E-06
1,02E-06
1,02E-06
1,02E-06
1,02E-06
1,02E-06
2,74E-06
2,74E-06
2,74E-06
2,74E-06
2,74E-06
1,07E-05
1,07E-05
1,07E-05
1,07E-05
1,07E-05
2,5851
2,5851
2,5851
2,6564
2,6564
2,6564
2,6564
2,6564
2,7176
2,7176
2,7176
2,7176
2,7176
2,8094
2,8094
2,8094
2,8094
2,8094
46,7017
119,601
178,732
141,131
138,605
131,362
122,564
107,973
124,134
121,214
117,836
116,324
56,6000
86,0240
75,99069
68,90651
47,39213
47,78472
Desde el punto de vista del mecanismo de despolimerizacin del quitosano con perxido
de hidrogeno, en esta reaccin el radical OH ataca los enlaces glucosdicos, fragmentando la
cadena polimrica.
En este proceso el par de electrones libre del grupo amino ejerce un papel
importante, ya que es capaz de atraer al radical, el cual ataca al enlace glucosdico adyacente al
grupo amino. Es por eso que el grado de desacetilacin es un factor importante durante el proceso
de degradacin. El efecto del grado de desacetilacin en la degradacin oxidativa se puede
observar en la Figura 24, ya que a medida que hay un aumento en el grado de desacetilacin hay
un aumento en la cristalinidad, esto se puede observar en los aumentos de las seales en el pico a
20, para el caso de las fracciones no acuosas, este comportamiento es atribuido a que las
fracciones amorfas que se encuentran disponibles en la periferia del polisacrido estn ms
accesibles cuando hay mayor GD (Ver Figura 28 (A-C)).
.
68
9000
8000
7000
6000
5000
Q4
4000
240minQ4
3000
2000
1000
0
6
11
16
21
26
31
36
41
2
6000
5000
4000
3000
240minQ6
Q6
2000
1000
0
6
11
16
21
26
31
36
41
2
4000
3500
3000
2500
240minQ9
2000
Q9
1500
1000
500
0
6
11
16
21
26
31
36
41
Figura 28. Difractogramas de las muestras de Quitosano degradadas (A) Q4, (B), Q6, (C) Q9
(Fuente Propia:2013)
69
70
80
Sulfato de cobre
30minQ9
150minQ9
90minQ9
240minQ9
T (%)
60
40
20
10
14
18
22
26
30 40
50
60
70
80
Sulfato de cobre
150minQ9
240minQ9
90minQ9
30minQ9
T (%)
60
40
20
0
2
10
14
18
22
26
30 40 50 60 70
Figura 29. Efecto antimicrobiano de E. coli (A) y S. aureus (B) frente a las fracciones
degradadas de Q9. (Fuente Propia:2013)
71
80
Sulfato de cobre
30minQ6
90minQ6
150minQ6
240minQ6
T (%)
60
40
20
0
2
10
14
18
22
26
30 40 50 60 70
80
Sulfato de cobre
240minQ6
150minQ6
90minQ6
30minQ6
T (%)
60
40
20
0
2
10
14
18
22
26
30 40
50
60
70
Figura 30. Efecto antimicrobiano de E. coli (A) y S. aureus (B) frente a las fracciones
degradadas de Q6. (Fuente Propia:2013)
72
25
Q9
90minQ9
20
30minQ9
T (%)
15
150minQ9
240minQ9
10
0
Q9
30minQ9
90minQ9
150minQ9
240minQ9
Q6
90minQ6
T (%)
30
30minQ6
150minQ6
20
240minQ6
10
0
Q6
30minQ6
90minQ6
150minQ6
240minQ6
73
74
6.2
6.0
C/N
5.8
5.6
5.4
Q9DBA
5.2
Q9VN
5.0
0
10
12
14
16
18
20
Figura 33. Avance de la reaccin de iminacin para las muestras degradadas de Q9. (Fuente
Propia:2013)
Tabla 11. Anlisis de CHN de las muestras degradadas de las Iminas de las muestras degradadas
de Q9. (Fuente Propia:2013)
Muestra
%C
%N
C/N
Muestra
%C
%N
C/N
Q9DBA0h
43,874
8,411
5,217
Q9VN0h,
43,868
8,410
5,217
Q9DBA 2h
44,689
8,353
5,352
Q9VN 2h
44,168
8,413
5,250
Q9DBA 4h
44,769
8,268
5,420
Q9VN 4h
44,245
8,375
5,283
Q9DBA 6h
47,350
8,409
5,637
Q9VN 6h
44,590
8,399
5,309
Q9DBA 8h
49,777
8,382
5,940
Q9VN 8h
45,166
8,436
5,354
Q9DBA 10h
49,217
8,295
5,937
Q9VN 10h
45,579
8,425
5,410
Q9DBA 12h
50,031
8,427
5,942
Q9VN 12h
46,916
8,298
5,654
Q9DBA 14h
50,150
8,455
5,935
Q9VN 14h
48,583
8,439
5,757
Q9DBA 16h
49,581
8,348
5,945
Q9VN 16h
47,456
8,239
5,760
Q9DBA 18h
49,249
8,289
5,948
Q9VN 18h
48,604
8,431
5,765
Q9DBA 20h
50,006
8,421
5,939
Q9VN 20h
48,270
8,389
5,754
75
100
T (%)
80
60
40
20
0
4000
240minQ9
240minQ9DBA
3500
3000
2500
2000
1500
-1
Nmero de onda (cm )
240minQ9
1000
500
240minQ9DBA
20
0
2000
1800
-C-N
Amida I
1600
C-H Aromatico
40
-CH3
60
C=N de Im ina
T (%)
80
100
800
600
Figura 34. (A) Espectros de FTIR de las Iminas (240minQ9DBA) (B) Expasion del area C-O-C.
(Fuente Propia:2013)
76
100
T (%)
80
60
40
20
0
4000
240minQ9VN
240minQ9
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-C-N
Amida I
40
20
0
2000
C-H Aromatico
60
C=N de Im ina
T (%)
80
240minQ9VN
240minQ9
-CH3
100
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
Figura 35. (A) Espectros de FTIR de las Iminas (240minQ9VN) (B) Expasion del area C-O-C.
(Fuente Propia:2013)
77
Q9
40
240minQ9DBA-E.Coli
240minQ9VN-E.Coli
30
240minQ9DBA-S.Aureus
%T
240minQ9VN-S.Aureus
20
240minQ9DBA-S.Cervisie
240minQ9VN-S.Cervisiae
240minQ9DBA-N.Crassa
10
240minQ9VN-N.Crassa
0
Mue stras de N-Be ncil Q uitosanos
Figura 36. Efecto antimicrobiano de las Iminas de baja masa molecular frente a varios
microorganismos objetivos. (Fuente Propia:2013)
6. CONCLUSIONES
78
79
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86
8. NDICE DE FIGURAS
Pg
Figura 1. Unidades repetitivas quitina (derecha) y quitosano (izquierda). La quitina est 18
compuesta principalmente por la unidad N-acetil-glucosamina (GlcNAc) (n); el quitosano
est compuesto predominantemente por la unidad glucosamina (GlcN) (m).
Figura 2. Proceso de obtencin de quitina, quitosano y quitano.
19
32
87
55
a 34 C .(Valbuena,2013)
Figura 20. Comparacin del control + con el efecto del quitosano con diferentes grados de 56
desacetilacin (GD %) en el crecimiento Saccaromyces Cervisiae. (Valbuena,2013)
Figura 21. (A) Espectros de las distintas concentraciones del complejo enzimtico de 59
glucosa (B) Curva de calibracin para consumo de glucosa del N. Crassa..
(Valbuena,2013)
Figura 22. (A) Curva de crecimiento de N. Crassa a 25 C (B) Efecto de quitosanos con 60
diferentes grados de desacetilacin (GD %) en el crecimiento de N. Crassa.
(Valbuena,2013)
Figura 22. (C) Comparacin del control + con el efecto de la molcula de quitosano con 61
diferentes grados de desacetilacin (GD %) en el crecimiento N. Crassa; para las
concentraciones mnimas inhibitorias respectivas.Valor de P: < 0.05 (**).(Valbuena,2013)
Figura 23. (A) Espectros de FTIR de las fracciones de Q4(B) Expansin del rea C-O-C.
62
(Valbuena,2013)
Figura 24. (A) Espectros de FTIR de las fracciones de Q6. (B) Expansin del rea C-O-C.
63
(Valbuena,2013)
Figura 25. (A) Espectros de FTIR de las fracciones de Q9 (B) Expansin del rea C-O-C
64
88
66
degradar.
Figura 28. Difractogramas de las muestras de Quitosano degradadas (A) Q4, (B), Q6, (C) 68
Q9 (Valbuena,2013)
Figura 29. Efecto antimicrobiano de E. coli (A) y S. aureus (B) frente a las fracciones 70
degradadas de Q9. (Valbuena,2013)
Figura 30. Efecto antimicrobiano de E. coli (A) y S. aureus (B) frente a las fracciones 71
degradadas de Q6. (Valbuena,2013)
Figura 31. Efecto antimicrobiano de las fracciones degradadas de Q9 frente a S. Cervisiae. 72
(Valbuena,2013)
Figura 32. Efecto antimicrobiano de las fracciones degradadas de Q6 frente a S. Cervisiae. 72
(Valbuena,2013
Figura 33. Avance de la reaccin de iminacin para las muestras degradadas de Q9
74
Figura 34. (A) Espectros de FTIR de las Iminas (240minQ9DBA) (B) Expasion del area C- 75
O-C. (Valbuena,2013)
Figura 35. (A) Espectros de FTIR de las Iminas (240minQ9VN) (B) Expasion del area C- 76
O-C. (Valbuena,2013)
Figura 36. Efecto antimicrobiano de las Iminas de baja masa molecular frente a varios 77
microorganismos objetivos.
89
NDICE DE TABLAS
Pg
Tabla 1. Principales aplicaciones del quitosano.
20
21