UNIVERSIDAD AUTONMA

DEL ESTADO DE MORELOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

PROFESORA: Dra. Ma. Del Carmen Beltrn Nez

EQUIPO 2: Daz Villeda Karina Vianey

Posadas Garca Odalys Grisell
Jimnez ngel Roberto
MATERIA: Fsico-qumica de macromolculas

GRUPO: BE-51

FECHA: 01/marzo/2016

CICLO ESCOLAR ENERO-JUNIO 2016

DETERMINACIN DE PROTENAS CON COOMASSIE R250

EN PAPEL FILTRO
OBJETIVO.Determinar la concentracin de protena de las muestras problema de
manera semicuantitativa (a ojo), con la ayuda de una curva estndar
(empleando una protena patrn BSA, Suero-albmina bovina), a partir de
la observacin en papel filtro con Coomassie R250.
OBJETIVOS PARTICULARES.

Identificar (investigar), las diferencias entre los dos colorantes

existentes de Coomassie; Coomassie G250 (utilizado en el mtodo de
Bradford) y Coomassie R250 (utilizado en la determinacin de

protenas por papel filtro).

Con dicha prctica, se pretende corroborar que la determinacin de
protenas solubles por este mtodo, puede llegar a ser inclusive,

igual de confiable que por el mtodo de Bradford.

Llevar a cabo, la manipulacin correcta del equipo, material del
laboratorio y de las instalaciones, as como el uso correcto de los

reactivos a disposicin.
Acatar el protocolo de seguridad, con la utilizacin del equipo de
proteccin necesaria, como bata, guantes, googles, etc.

FUNDAMENTO.En muchas circunstancias, el volumen total de muestra es mnimo, por lo

que

no

se

dispone

de

cantidades

suficientes

para

realizar

una

determinacin de la concentracin de protena en paralelo por mtodos

espectrofotomtricos convencionales. Se han propuesto varios mtodos
para tratar de resolver este problema, pero la mayora de los mismos son
relativamente poco sensibles y/o laboriosos.
El fundamento de la determinacin de protenas en papel filtro con
Coomassie R250,

que aqu se describe,

es un procedimiento utilizado

frecuentemente para la valoracin semicuantitativa de protenas en

fracciones cromatogrficas, las cuales permiten la determinacin de la

concentracin de protena dentro de un rango 0.1-1 mg/mL, un rango
similar al abarcado por el ensayo de Bradford, el ms utilizado en la
actualidad, aunque el pequeo volumen requerido permite la deteccin de
cantidades de protena tan pequeas como 0.2-2 g.

INTRODUCCIN.La determinacin de protenas en los laboratorios de investigacin clnica y

biomdica se realiza en general mediante espectrofotometra UV-V, o bien
analizando la absorbancia de la solucin proteica, o bien mediante
pruebas colorimtricas, de las cuales las ms empleadas son las del
biuret, el ensayo de Lowry, el ensayo de Bradford, entre otras.
La reaccin del biuret para la determinacin de protenas fue uno de los
primeros mtodos desarrollados para el anlisis colorimtrico de las
mismas y se usa todava hoy extensamente en aplicaciones que requieren
rapidez pero no una elevada sensibilidad. Se basa en el complej amiento
del cobre en una disolucin alcalina con el enlace peptdico de las
protenas, y tambin con los residuos de tirosina. Su principal
inconveniente, es el gran nmero de sustancias que interfieren con la
misma, entre ellas numerosos tampones utilizados frecuentemente en
biologa (Tris, Hepes, Pipes, Mes, etc.).
El ensayo de Lowry ha sido la tcnica ms empleada para la determinacin
de protenas hasta hace relativamente poco tiempo. Es una ampliacin del
procedimiento del biuret en la que se forma un complejo de cobre-protena
en solucin alcalina, que a su vez reduce un reactivo fosfomolbdicofosfotngstico para dar un color azul intenso. A pesar de ser una tcnica
sensible (0.005 a 0.1 mg/mL) y muy especfica, presenta varias
desventajas que la han desplazado: Los reactivos utilizados son inestables;
la cintica de la reaccin es lenta, y numerosas sustancias interfieren con
la reaccin.
El ensayo de Bradford es un mtodo rpido para la determinacin de la
concentracin de protenas. Su rango de sensibilidad va de 0.1 a 2 mg/mL
(en su formulacin estndar) o de 0.01 a 0.2 mg/mL (formulacin
micromtodo). La base de la tcnica es la formacin de un complejo
insoluble azulado entre el colorante y la protena que es cuantificado

posteriormente en base a su absorbancia a 595 nm. La posibilidad de

determinar la concentracin de protena en micromuestras con las tcnicas
espectrofotomtricas mencionadas, est condicionada al volumen mnimo
necesario para realizar la lectura de la absorbancia, que es de 1.5 mL para
las cubetas estndar, 0.5 mL para las cubetas semimicro, y 0.1 mL para
las microcubetas, lo cual nos induce, a que existe una cantidad mnima de
muestra requerida para la lectura.
En este procedimiento, las muestras con cantidades nfimas son aplicadas
directamente sobre una tira de papel filtro Whatman 3MM, tras lo cual son
teidas simplemente con el colorante Azul brillante de Coomassie R-250 en
metanol-actico, y desteidas con la solucin de destincin estndar.
Papel filtro
En la seleccin de papel filtro se debe considerar la disponibilidad de un
papel estndar de calidad que sea de fuente confiable y tenga
caractersticas tales como: flujo de aire, parmetros especiales para la
retencin de partculas, velocidad de absorcin, calidad de filtracin y
propiedades de superficie, se fabrican de celulosa alfa al 98% se usan en
aplicaciones generales de filtracin con retencin de partculas tan baja
como 2.5 m. la variedad de filtros de papel favorece el continuo aumento
de grado de puridad, dureza y resistencia qumica existen diferentes tipos
de papel filtro cualitativos; con grados contra humedad, grados estndares
entre los cuales encuentran de grado 1, grado 2, grado 3, grado 4, grado 5,
grado 6, grado 591, grado 595, grado 597, grado 598, grado 602. Grados
plegados los cuales ahorran tiempo por la forma, la velocidad de flujo
estable por la reduccin de contacto del papel filtro. Tambin se
encuentran papel filtro cuantitativos que son diseados para anlisis de
gravimetra, preparacin de muestras para el anlisis de instrumentos.

Diferencias entre Coomassie R250 y G250

Los colorantes de Coomassie (tambin conocidos como azul de Coomassie
Coomassie Brilliant Blue), son los colorantes ms populares de tipo
aninico, utilizados para la determinacin de protenas, ya que
proporcionan una buena linealidad y una sensibilidad media,
cuantitativamente hablando. Existen dos variantes de Coomassie;
Coomassie R-250 y Coomassie G-250. Bsicamente, son dos formas

qumicas de un compuesto llamado trifenilmetano disulfonado, la nica

diferencia, es que la G250 presenta dos grupos de metilo adicionales.

La unin del complejo protena-colorante, se lleva a cabo a travs de

interacciones inicas entre los grupos de cido sulfnico del colorante y
las cargas positivas de los grupos amino de las protenas, formando
complejos no covalentes a travs de interacciones de Van Der Waals.
Entre los dos, el Coomassie R250 es la variante ms utilizada, debido a la
deteccin de cantidad mnima de hasta 0.1 g de protena, esta tcnica es
relativamente barata, presenta un protocolo simple y compatible con otras
pruebas, como la espectrofotometra. Las desventajas, es que presenta una
reproducibilidad baja y en ocasiones, la visualizacin de las protenas
puede ser difcil.
Por otra parte, el Coomassie G250, tambin ofrece una sensibilidad
relativamente alta, y consiste en un protocolo ms simple, ofreciendo una
rpida tincin y eliminando la necesidad de decoloracin (en el caso de
bandas de gel), adems, la G250 se puede utilizar en la cuantificacin de
protenas solubles mediante el ensayo de Bradford, en el cual tras la unin
de las protenas con el colorante, se mide la absorbancia y a travs de una
graficacin se determina la concentracin de protena de una solucin
dada (como se realiz en la prctica anterior).

RESULTADOS.-

La cantidad de protena qued seala por la concentracin observable

decoomassie R250. Se obtuvo lo siguiente.

>papelito<

Tras comparar las muestras problema con el control (de concentraciones

conocidas) se obtuvieron los datos mostrados en la tabla.
BSA g (2
l)
Muestra
Concentra
cin
Muestra
Concentra
cin

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

A
2

B
1

C
0.9

D
0.8

E
0.7

F
0.6

G
0.5

H
0.4

I
0.3

J
0.2

K
0.1

A
0.3

B
0.5

C
0.9

D
0.8

E
0.2

F
0.6

G
0.1

H
1.0

I
2.0

J
0.4

K
0.7

Es importante mencionar que aunque se percibi una mancha de

coomassie fuera de lugar el control se mantuvo coherente y sta no se
sobrepuso sobre los resultados.

CONCLUSIONES.Se puede concluir que dicha tcnica es de utilidad general como mtodo
para microdeterminacin de protenas, en muestras de pequeo volumen.
Es de destacar su utilidad en casos de muestras que contengan sustancias
que interfieran con los mtodos estndar de determinacin de protenas
(concentracin elevada de sales, presencia de detergentes o colorantes), ya
que stas son eliminadas durante la fijacin/lavado en metanol cido.

Resulta especialmente aplicable en un sondeo de varias muestras, al

permitir evaluar de un modo rpido y sencillo la concentracin de protena
de las muestras, previamente a su caracterizacin espectrofotomtrica.
BIBLIOGRAFA.-

What is the difference between your Coomassie G250 and R250

products and how much protein can they detect in the gel?
(2011).Proteabio. (Internet) 17 de marzo de 2011. Disponible en:
https://proteabio.com/resources/techtips/What+is+the+difference+
between+your+Coomassie+G250+and+R250+products+and+how+mu
ch+protein+can+they+detect+in+the+gel%3F.
(27 de febrero de
2016).
R-250 Vs. G-250: Wich one should you use? (2015). Info gBiosciences.
(Internet)
22
de
abril
de
2015.
Disponible
en:
http://info.gbiosciences.com/blog/how-to-choose-between-g250-orr250-coomassie-dyes. (27 de febrero de 2016).