Endosporas : espora presente en el interior de la bacteria. Destinada a germinar originando la forma vegetativa de la que deriva.

Es un
cuerpo de pared gruesa muy refringente y sumamente resistente. Son producidas por especies Bacillus, clostridium y Sporosarcina.
Las endoesporas resisten las condiciones ambientales adversas de desecacin, calor y mal suministro de nutrientes ( agentes qumicos
como desinfectantes)
Tincin de esporas (Wirtz-Conklin)
Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas
endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas,
radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la
clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma
vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patgenas para el
hombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inters.

OBJETIVOS
1
2

1.
Observar las endosporas y su disposicin en las formas
vegetativas.
2.
Comparar las distintas morfologas y disposiciones que
adoptan las endosporas en las especies empleadas.

MATERIAL NECESARIO
- Portaobjetos con frotis bacterianos previamente preparados.
- Colorantes:
a) Solucin de verde malaquita (5%)
b) Solucin de safranina (0,5%)
- Pinzas de madera
- Mechero Bunsen o de alcohol
- Microscopio y aceite de inmersin
FUNDAMENTO
Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Adems, estas cubiertas
hacen que las esporas aparezcan en el microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin.
La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes:
1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente.
2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que
quedarn teidas con el segundo colorante.
REALIZACIN Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas. Esta tincin es
delicada en su realizacin y para poder obtener unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones.
1
2.

Preparar los frotis bacterianos indicados.

Teir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del mechero de forma que el

colorante humee durante 5 min.

Nota: evitar que la muestra hierva. Aadir ms colorante si ste se evapora; es importante que la muestra no se seque.
3.

Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

4.

Teir con safranina 1 min.

5.

Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

6.

Secar la preparacin.

7.

Observar la preparacin al microscopio. Anotar la disposicin y la morfologa de las tres especies del gnero Bacillus.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

La posicin y la morfologa de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carcter taxonmico til para diferenciar
especies dentro de un mismo gnero.

Localizacin y morfologa de las esporas en Bacillus

Las tres bacterias empleadas en esta prctica difieren en la disposicin y morfologa de las endosporas. B. sphaericus posee una
endospora esfrica con localizacin terminal y deformante de la clula vegetativa, por lo que suele ser denominada "en palillo de

tambor". B. thuringiensis tiene localizada la endospora elipsoidal en el centro de la clula vegetativa, lo que provoca un abombamiento
caracterstico denominado "en huso". B. subtilis forma una espora cilndrica subterminal no deformante.
tincin cido-resistente: para los gneros Mycobacterium y Nocardia.
Extensin.
Fijacin a la llama.
Colorante bsico, fucsina fenicada o carbo fucsina, que penetra en la clula. Todo al calor.

Lavado con decolorante de cido clorhdrico y etanol que decolora a las clulas cido-alcohol no resistentes, las que mantengan
el color, rojo, sern de los gneros Mycobacterium y Nocardia.

Secado.
Visionado a 100X.
Tincin diferencial
Tincin diferencial- es una gran herramienta para separar y clasificar los microorganismos observados de acuerdo a sus caractersticas.
Es mayormente utilizada para visualizar las estructuras como los flagelos, cpsulas y esporas.
Para ser clasificado como tincin diferencial debe tener al menos tres tintes
Tincin Acido-Resistente
Las familias Mycobacteriae y Nocardiaceae son cido resistente. Los microorganismos cido-resistentes se caracterizan por tener
una pared celular gruesa de cera (lipoidal) que contiene cido miclico. Los organismos que son decolorizados por el alcohol cido no
son cido resistente.
Tinte primario- Carbolfucsina-tinte rojo fenlico (5%). Puede penetrar la pared
Agente decolorizante- alcohol cido (3% HCl +95% alcohol etlico)
Contratinte-Azul de metileno- se utiliza para teir de azul las bacterias que quedaron incoloras
Preparacin de la tincin cido-resistente
Preparar un frotis
Carbolfucsina (3 minutos) Utilizar un papel toalla bien impregnado del reactivo.
Lavar con agua
Decolorizar con alcohol etlico
Lavar con agua
Azul de metileno por 2 minutos
Lavar con agua
Secar con bibolous paper
Tincin de esporas
Mtodo de Schaffer-Fulton
Clula vegetativa- forma metablicamente activa = bacterias
Esporas- forma metablicamente inactiva y altamente resistente
Los miembros del gnero anaerobio Clostridium, Desulfotomaculum y Bacillus pueden existir metablicamente activos o inactivos.
Tincin de esporas
Tinte primario-Verde Malaquita- Requiere calor para la penetracin de este tinte.
Agente decolorizante- Agua- remueve el exceso de tinte, decoloriza la clula vegetativa
Contratinte-Safranina- Tie las clulas vegetativas
Preparacin de la tincin de esporas
Preparar el frotis
Verde Malaquita (2-3 minutos) en calor
Dejar enfriar la laminilla y enjuagar con agua
Safranina (30 segundos)
Lavar con agua
Secar con bibulous paper

Tincin de cpsula
Cpsula-estructura gelatinosa secretada por algunas bacterias
Las clulas que tienen cpsula son virulentas y causan enfermedades ya que protegen a la clula de la accin fagoctica del hospedero.
La mayora de las cpsulas estn compuestas de polisacridos, por lo que son solubles en agua.
Tincin de cpsula
Tinte primario- Cristal Violeta 1%- tie todo el frotis color oscuro
Decolorizante y Contratinte- Sulfato de Cobre 20%-se usa para enjuagar el tinte primario
No se enjuaga con agua por que la cpsula es soluble en agua.- funcin de decolorizante
El CuSO4 es absorbido en el material de la cpsula que ha sido decolorizada - funcin de contratinte
Tincin negativa
Ideal para poder observar la estructura de la cpsula La tincin se logra mediante una mezcla del tinte y el cultivo de bacteria
El tinte utilizado es India Ink
Se le conoce como efecto de cielo estrellado
Tincin negativa
Electronografa mediante tincin negativa de un virus.
Tincin negativa es una tcnica de microscopa que permite contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los fotones
(microscopa ptica) o a los electrones (microscopa electrnica). En el primer caso, se emplea nigrosina o tinta china; para el caso de
bacterias que esporulan, esta tcnica permite visualizar las esporas como entes refringentes sobre un campo de fondo oscuro. [1] En caso
de microscopa electrnica de transmisin, se emplean sustancias de alto nmero atmico que, por tanto, resultan opacas a los
electrones transmitidos. Tpicamente, estas sustancias son acetato de uranilo, citrato de plomo o molibdato de amonio. Al eletrnico,
esta tcnica permite visualizar virus, flagelos, bacterias y otros entes de escaso tamao.
3.- Tincin diferencial: Se usan para distinguir diferentes grupos bacterianos. Hay diferentes tipos:
Tincin de GRAM (Gram 1884).- Clasifica las bacterias en Gram+ y Gram- Tincin 1: Se usa cristal violeta (Bsica, +). Con este colorante se tien todas las clulas.
- Mordiente: Lugol (I2-IK). Forma un complejo con el cristal violeta dentro de la clula.
- Lavado: con etanol que es un agente decolorante. Las clulas GRAM+ no pierden coloracin. Las GRAM- quedan incoloras.
- Tincin 2: Con colorante de contraste que es la safranina que tie las clulas incoloras.
GRAM+ : Violetas. Pared gruesa que se deshidrata con etanol y no sale el complejo lugol-colorante. Son Bacilos, Cocos, etc.
GRAM- : Rojas. Pared ms laxa, con mayor n de lpidos, el tratamiento con alcohol desorganiza la pared y pierden el colorante. Ms
porosidad. Son Bacilos no esporulados.
Si a las GRAM+ se las trata con lisoenzima pierden la capa del polisacrido y se convierten en GRAM-.
Tincin cido alcohol resistencia (Ziehl-Noelsen).- Se usa para determinar la presencia de bacterias de los gneros Mycobacterium y
Nocardia. Se basa en la resistencia de estas bacterias a ser decoloradas con una mezcla cido-alcohol, se debe a la alta concentracin de
lpidos de su pared, cidos miclicos. Pasos:
.- Tincin 1: con fucxina (bsica) en presencia de calor porque no tomaran el colorante. .- Lavado con agente decolorante: cido
alcohol. Si la prueba es positiva da color en caso contrario sale sin color.
.- Tincin 2: con colorante de contraste como el azul de metileno.
Prueba positiva: Fucsia
Prueba negativa: Azul.
Se piensa que los cidos miclicos forman una barrera lipdica que no deja salir el colorante.
3.- Tinciones especiales: Para ver estructuras especficas:
Tincin de cpsulas.- Indicador de probable patogeneidad. La cpsula es una cubierta altamente hidratada, fija mas los colorantes. Se
hace por los pasos siguientes: 1.- Tincin negativa seguido de tincin simple, fondo oscuro y clula con halo. 2.- Tincin simple con
cristal violeta, se lava con sulfato cprico, as se consigue que la clula aparezca teida y alrededor de ella se ve un halo azul brillante
debido al sulfato.
Tincin de endosporas.- Formas de resistencia, con pared muy gruesa (de tincin difcil). Se tien por una tincin diferencial llamada
tincin de SHAFFER-FULTON: 1.- Tincin 1: con verde malaquita y calor.
2.- Agua como agente decolorante, una vez que la endospora coge el colorante ya no lo suelta. Slo queda teida la endospora y la
clula vegetativa est incolora. 3.- Se usa safranina para teir la clula, se ve la clula roja con la endospora verde dentro. Tincin de
flagelos.- El dimetro de los flagelos es muy pequeo, < de 20 micras. Se aade un mordiente que se fija al flagelo y lo engrosa
artificialmente. Posteriormente se hace una tincin simple con fucxina.
Tincin de Auramina

Consiste en teir con Auramina (Colorante

fluorocrmico), decolorar con cido alcohol,
contracolorear con permanganato potsico, lavar con
agua abundante y dejar secar

Al observar la preparacin al microscopio de Fluorescencia con objetivo de

25 X los microorganismos cido alcohol resistentes (Micobacterias)
aparecen con fluorescencia amarillo-naranja

La tincin fluorescente es mas rpida ya que la

observacin se realiza sin objetivo de inmersin,
utilizandose por tanto campos de observacin
mas amplios con lo que se gana tiempo, por lo
que su utilizacin esta plenamente justificada
en aquellos laboratorios que deben realizar mas
de 10 examenes al da

El examen microscpico debe realizarse rastreando la

preparacin observardo aproximadamente 100 campos
microscpicos y contando los BAAR observados, ya que es
necesario informar del n de BAAR presentes

Tincin negativa.
Para esta coloracin, se utilizan sustancias que no penetran en la clula y por lo tanto se tie el fondo quedando los
microorganismos incoloros. Normalmente el tamao de las bacterias observadas por esta tcnica es mayor que el real y no debe
utilizarse para la medicin de microorganismos.
Los agentes ms utilizados son la nigrosina y la tinta china y los microorganismos quedan incluidos en el colorante que
forma una capa relativamente gruesa.
Con este mtodo pueden observarse morfologa y agrupacin as como tambin estraucturas extracelulares como la cpsula.
Tcnica.
1- Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de un ansa, una gota de una solucin acuosa de nigrosina al 10 %.
2- Tomar una porcin del cultivo, suspender en la gota de nigrosina y extender en forma de
valo.
3- Dejar secar (no exponer al calor) y observar con objetivo de inmersin.