Cuantificacin de Oligonucletidos y cidos Nucleicos por Espectroscopia de

UV
Los cidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia de bases aromticas
nitrogenadas a lo largo de las cadenas de DNA. La absorcin de UV de DNA es una caracterstica de la
molcula, que es usada eficientemente para determinar su concentracin. Cada una de las bases tiene su
propio y nico espectro de absorcin y por lo tanto contribuye de manera diferente a la propiedad total de
absorcin de UV de una molcula de DNA. Para muchas aplicaciones, el porcentaje de contribucin de cada
una de las bases al espectro de absorcin de UV de una molcula de DNA de doble cadena de alto peso
molecular (dsDNA) puede ser ignorado . Sin embargo, esas contribuciones son mas significativas cuando se
trata de oligonucletidos y deben ser consideradas si se requiere determinar correctamente la concentracin.

Concentracin de Oligonucletido en pmol/l

Los cidos nucleicos tiene un mximo de absorcin a una longitud de onda de 260 nm. A esta longitud por lo
tanto, la absorcin es proporcional a la concentracin.
C (pmol/l)= (A260 * 100 * Factor de dilucin) / (1.54*nA + 0.74*nC + 1.15*nG + 0.87*nT)

En la frmula:
C, es la concentracin calculada en picomolas por microlitro (pmol/l).
A260 es la absorbancia a 260nm.
El denominador consiste de la suma de los coeficientes de cada base multiplicados por el nmero de veces
que aparece en el oligonucletido.
El factor de dilucin es igual a el volumen final de la dilucin dividido entre la cantidad alicuotada para la
dilucin.
Protocolo para medir la absorbancia de un oligonucletido.
1.
2.

3.
4.

Encender 20 min la lmpara de UV en el espectrofotmetro para su calentamiento y seleccionar la

longitud de onda a 230 y 260nm
Usar agua destilada en una celda de cuarzo y utilizarla como blanco de referencia (una celda de
plstico no trasmite eficientemente la luz ultravioleta y por lo tanto NO debe utilizarse para
este procedimiento).
A 990 l de agua destilada en un tubo de 1.5ml, agregar 10l de solucin de oligonucletido,
mezclar bien y transferir a la celda de cuarzo que se utiliz para el blanco.
Leer la absorbancia a 260nm de la muestra

NOTA:
- A 260nm, el DNA debe mostrar una absorbancia mxima.
Ejemplo.
Se tiene un 21mero con la secuencia 5' ACT CCT GGC CAG GAC TTA TTG 3' . El oligo se diluy 100l +
900l de agua. La lectura de absorbancia a 260nm= 0.285736. Cul es la concentracin del oligo?

C = 0.286 x 100 x (1000/10) / [(1.54 x 4) + (0.74 x 6) + (1.15 x 5) + (0.87 x 6)]

C = 2860/21.57
C = 132.6pmol/l

Concentracin de Oligonucletido en Unidades de Densidad ptica

(O.D.'s)
La cantidad de oligonucletido tambin se expresa como Unidades de Densidad ptica (O.D.); esto es, la
cantidad de Oligo disuelto en 1ml de agua con un valor de A260 igual a 1.00 en una celda de 1cm de longitud,
y se calcula por la ecuacin:
Unidades O.D.= (A260) (volumen del stock) (factor de dilucin)
Para el ejemplo anterior tenemos que la solucin stock es de 1.2ml.
Unidades O.D.= 0.286 x 1.2ml x (1000/10l) = 34.32 O.D.'s

Concentracin de Oligonucleotido en g/ml

El valor de A260 se convierte a g/ml usando el coeficiente de extincin para ssDNA la cual es 1ml/33g para
una celda de 1cm de longitud. Por lo tanto, para un valor de O.D. de 1.0, en principio la muestra contiene
33g de ssDNA por ml o en la ecuacin:
1unidad de O.D.de ssDNA=33g

Nuevamente para el ejemplo anterior:

33g/ml/1.0 O.D. = g/ml/0.286 = 9.43g/ml/
Multiplicando por el factor de dilucin la concentracin en la solucin stock
9.43g/ml/ x (1000l/10l) = 943g/ml

Concentracin en g/ml de ssDNA de Alto Peso Molecular.

La concentracin de ssDNA de alto peso molecular puede expresarse como pmol/l, tomando en cuenta el
promedio del peso molecular de un nucletido en la molcula de DNA. que para ssDNA es 330 daltons. (el
termino "dalton" es una unidad definida como 1/12 de la masa atmica del 12C. El cual es utilizado como peso
molecular expresado cuantitativamente como g/mol).

Ejemplo:
El Bacterifago de ssDNA M13mp18 consiste de 7250 nucleotidos. Para expresar esto como g/pmol:
(7250nts) 330g/mol x 106g x _1mol___
nt
g
1012pmol

=2.39g/mol

Si diluyes tu stock de ss DNA M13mp18 a razon de 10l/1000l y da una lectura de A260 = 0.163, la
concentracin es:
(xg/l) / (0.163) = (33g/l) / (1.0 OD) x= 5.38 g/l multiplicando por (1000 l/10 l) = 538 g ssDNA/ml
Para convertir a pmol / l:
(538g / ml ) (1pmol / 2.39g )( 1ml / 1000l ) = 0.225 pmol/l

Concentracin en g/ml de dsDNA de Alto Peso Molecular.

Para determinar la concentracin de ssDNA de Alto Peso Molecular, plsmidos o productos de PCR, se
realizan mediciones a 260 y 280 nm. Concentraciones tan bajas como 2.5g/ml pueden ser detectadas. A pH
neutro, una solucin de DNA a 1 mg/ml tiene una absorcin mxima a 260nm de 20 cuando se lee en una
celda de 1cm. (este valor es para molculas de dsDNA con un contenido G+C de 50%. Sin embargo para
muchas aplicaciones en Biologa Molecular el contenido de G+C no es necesario considerarlo a menos que
sea muy extremo). En principio una solucin de dsDNA con una concentracin de 50 g /ml debe tener una
A260 igual a1.0.
1 (A260) unidad de dsDNA=50 g /ml
Ejemplo: de una solucin del plsmido pUC19 se diluyo una alcuota a razn de 5l / 1000l en agua, las lecturas de
absorbancia son: 260 = 0.395; 280 = 0.2237
(xg/ml) / (0.395) = (50g / ml) / (1.0 OD) x= 19.74 g/ml multiplicando por (1000 l / 5 l) = 3950g dsDNA/ ml
La relacin A260 /A280 del dsDNA es 0.395 / 0.2237 = 1.76

Las protenas tienen un mximo de absorcin a A280 (principalmente por residuos de triptfano) las lecturas a
esta longitud pueden mostrar si existe algn contaminante proteico. El clculo de la relacin A260 /A280 es una
manera comn para expresar la pureza del DNA. Dependiendo de la composicin nucleica, un valor de 1.65
a 1.9 indican una muestra pura.
Debido a otros contaminantes una muestra con una relacin alta de A260 /A280 puede no necesariamente
producir buenos datos de secuencia. A veces tambin, una muestra con una baja relacin A260 /A280 puede
secuenciarse bien.
El mtodo mas comn de purificacin de DNA es extrayendo la preparacin con fenol para remover la
protena contaminante. El fenol tiene una absorcin mxima a 270nm. Las preparaciones que contienen
residuos de fenol pueden dar lecturas artificiales altas a A260 y la concentracin de DNA ser sobrestimada.

Midiendo la Concentracin de RNA en g/ml.

La concentracin de RNA de determina por el mismo protocolo que el utilizado para la medicin de DNA.
Sin embargo se aplica la siguiente relacin:
1 unidad A260 de ssRNA = 40g / ml

Las preparaciones puras de RNA tienen una relacin A260 /A280 de 2.0

Cuantificacin de protenas
a) Absorbancia a 205-210nm
La mayor parte de las protenas poseen un pico de absorcin mxima a 280 nm. Los grupos responsables de
tal caracterstica son los aminocidos aromticos (Tirosina y Triptfano).
Las protenas poseen coeficientes de extincin molar (E280nm) que puede variar de acuerdo a su composicin
aminoacdica entre 0,4-1,5. Como aproximacin se puede considerar que una unidad de absorbancia se
corresponde con una concentracin (C) de 1mg/ml de protenas:
Abs280nm / E280nm = C, si E280nm se considera = 1 mg-1 ml cm-1
Abs280nm = 1 mg/ml

Si la solucin de protenas contiene DNA y/o RNA se introduce un error en la medicin, dado que estos
absorben a 280 nm.

b) Absorbancia a 205-215nm
A dicha longitud de onda absorbe la unin peptdica (grupo amida), por lo tanto es un mtodo ms sensible y
no dependiente de los aminocidos que componen la protena en estudio.

La limitacin de esta tcnica esta dada por que la mayora de los buffers utilizados tambin absorben a esa
longitud de onda y otros compuestos con el grupo amida.