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GUIA DE PRCTICAS
BIOQUIMICA
2012-1
INTRODUCCION
La Bioqumica es una de las ciencias modernas que mayor auge ha alcanzado en los
ltimos tiempos, es el arma ms poderosa con que se cuenta para interpretar el fenmeno
biolgico, con una profunda incidencia en numerosas reas incluyendo la medicina
DISPOSICIONES GENERALES
En ninguna circunstancia
laboratorio.
ingiera alimentos
visitas
o tome bebidas
de otras
personas
en
el
ajenas
al
PRACTICA N1
BIOSEGURIDAD
OBJETIVO:
Proveer al alumno de conocimientos bsico sobre Bioseguridad que les permitan efectuar
una deteccin de los riesgos y prevencin de los mismos
FUNDAMENTO
La Bioseguridad es
la aplicacin del conocimiento, tcnicas y equipamiento para
prevenir la exposicin del personal, el laboratorio y el medio ambiente de agentes
potencialmente infecciosos.
Las Medidas de bioseguridad definen las condiciones
infecciosos se pueden manipular con seguridad.
MANDILONES
Definiciones
CUESTIONARIO
1.- Cuales son los principios de bioseguridad?
2.- Explique la eliminacin de desechos?
3.- Esquematice el lavado de manos
PRACTICA N2
MATERIALES DE LABORATORIO
OBJETIVO
10
PRACTICA N3
pH
FUNDAMENTO
El concepto de pH fue dado a conocer por primera vez en 1909 por SORENSEN, y lo
defini como el logaritmo negativo de la concentracin de iones de hidrgeno es decir:
pH = - log (H)
= [H + ] = 10 pH
= - log ( 1 )
H
Donde la concentracin del hidrogenin es dada en unidades moles.
La determinacin del pH es uno de los procedimientos analticos ms importantes y ms
utilizados en bioqumica puesto que esta medida determina caractersticas notables de la
estructura y la actividad de las macromolculas biolgicas, por consiguiente, la conducta
de las clulas y de los organismos.
CALCULO DEL PH DE UNA SOLUCION:
Procedimiento.Consiste en calcular la concentracin de iones hidrgeno [H+]
Calcular el logaritmo de base 10 de [H+]
El pH es el logaritmo negativo que ha sido encontrado en (1)
Soluciones Buffer, tampn o amortiguadores :
Son aquellas soluciones que se caracterizan por ser mezclas de ACIDOS y BASES
DEBILES y sus sales, las cuales impiden las variaciones bruscas de pH; permitiendo que
el cambio de este no sea el ms mnimo.
APLICACIONES:
En organismos vivientes, por ejemplo:
Para conocer las alteraciones producidas en la composicin qumica de la sangre.
Para conocer las alteraciones del pH de otros lquidos biolgicos: saliva, lagrimas, sudor,
lquido cefalorraqudeo, etc.
En ciertos fenmenos fisiolgicos: respiracin, aplicacin de enzimas (catalizadores), etc.
En qumica:
Para determinar el pH de una solucin.
Para determinar el punto final de una titulacin
Demostracin: reacciones qumicas con liberacin o consumo de iones H +.
Otros
11
Competencias
Aplica los conceptos fundamentales sobre el pH y la accin de los sistemas buffer.
Utiliza las tcnicas para medir el pH.
METODOS DE DETERMINACION DEL pH:
Existen varios procedimientos:
Mediante indicadores
Mediante cintas o papel de pH universal
Mediante el potencimetro o pHmetro
DETERMINACION DEL pH MEDIANTE EL USO DE INDICADORES:
Indicadores.-Son soluciones o cuerpos qumicos que se agregan a los lquidos para
dosar, con el fin de ver el momento preciso del trmino de la reaccin; manifestndose
por la aparicin, desaparicin o modificacin del color. Estas sustancias qumicas
pertenecen al grupo de los cidos y bases dbiles. Segn Glaser, se clasifican en tres
grupos:
1ero: Para valorar bases dbiles con cidos fuertes. Ejemplo: anaranjado de metilo, rojo
de congo, etc.
2do: Para valorar bases y cidos fuertes. Ejemplo : Tornasol, paranitrofenol, etc.
3ero: Para valorar cidos dbiles con bases fuertes. Ejemplo: fenolftaleina, etc.
Aplicacin:
1) En determinar el pH de una solucin deseada.
2) En determinar el punto final de una titulacin (volumtrica)
3) En determinar reacciones qumicas con liberacin o consumo de H
Comprende:
Eleccin de un indicador para una titulacin, para lo que se debe tener en cuenta
conceptos bsicos sobre disociacin de sales, la que est sujeta a una constante (pK) y a
una variacin de colores dependiente a su mayor o menor disociacin de pK; el pK se
emplea y se define como el log (1/Ka) el log Ka para definir la fuerza de un cido o de
una base.
indicadores, por ejemplo: el papel indicador universal (pH de 1 a 10); PH YDRIEN papel
(pH del 10 a 14)
Podemos observar la siguiente tabla de indicadores:
TABLA DE INDICADORES :
INDICADOR
Pk
LIMITES
COLOR
Azul de timol
1.50
0.5 2.8
rojo amarillo
Azul de bromofenol
3.98
3.0 5.0
amarillo azul
Verde de bromofenol
4.68
3.7 5.7
amarillo - azul
Anaranjado de metilo
4.00
3.5 4.5
anaranjadoamarillo
Rojo de clorofenol
5.98
5.0 7.0
amarillo rojo
Prpura de bromocresol
6.30
5.3 7.3
amarillo prpura
Azul de bromotimol
7.00
6.0 8.0
amarillo azul
Rojo de fenol
7.90
6.9 8.9
amarillo rojo
Fenolftalena
9.20
8.2 10.2
incoloro rojo
Rojo de metilo
5.10
4.4 - 6.0
rojo amarillo
quedando aislada dicha celda mediante un cierre hermtico constituido por un dielctrico
de cera o plstico y un casco de metal o plstico.
2.-Un electrodo de referencia externa de Calomell
3.-Un tablero de control con diales que regulan el funcionamiento del equipo.
PARTE OPERATIVA:
La calibracin consiste en darle informacin al equipo mediante el uso de estndares de
pH, o sea soluciones cuyo pH es conocido y certificado.
Pasos previos: Verificar la instalacin correcta del equipo, su conexin con la corriente
general. Calibrar la temperatura ambiente con la del equipo, lavando repetidas veces con
agua destilada y secando los electrodos con papel filtro.
Retirar cuidadosamente el jebe de seguridad del electrodo de vidrio.
La aplicacin se realiza luego, enjuagando los electrodos con agua destilada, secndolos
con papel absorbente y sumergindolos en la solucin problema, obtenindose su pH que
se leer en el lector en una escala de 0 a 14.
Actualmente se usan pHmetros porttiles, que funcionan con bateras o con una corriente
alterna de 100 a 200 voltios, digitales, otros.
DESCRIPCION:
1. Determinacin del pH:
El alumno deber medir el pH de las diferentes muestras solicitadas por el profesor
(leche, gaseosas, yogurt, saliva, orina, otras) empleando los mtodos descritos en la
prctica.
2. Titulacin Acido-Base:
2.1.-Titular una base (NaOH 0.1N) con un cido:
Colocar en un Beacker 10 mL de NaOH (hidrxido de sodio) 0.1N y tres gotas de
fenolftalena
Enrazar una bureta de 25mL con H2SO4 (cido sulfrico) 0.1N
Comience a titular dejando caer gota a gota el H2SO4 0,1N sobre NaOH 0,1N, agitando
constantemente hasta que cambie el color.
Anotar la cantidad (mL) de H2SO4 0,1N que se gast en la titulacin (gasto)
2.2.-Titular un cido (H2SO4 0,1 N) con una base:
Colocar en un Beacker 10mL de H2SO4 0,1N y tres gotas de anaranjado de metilo.
Enrazar una bureta de 25mL con NaOH 0,1N.
Comience a titular dejando caer gota a gota el NaOH 0,1N sobre el H2SO4 0,1N, agitando
constantemente hasta que cambie el color.
Anotar la cantidad (mL) de NaOH 0,1N que se gast en la titulacin (gasto)
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Cuestionario
1.-Mencione el pH normal de: Sangre, orina, lquido seminal, lquido cefalorraqudeo,
lquido amnitico, saliva y su correlacin con alguna patologa.
2.-Principales sistemas buffer orgnicos.
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PRCTICA N 04
ESPECTROFOTOMETRA
OBJETIVO
El alumno comprende los fundamentos de la espectrofotometra, adquiere habilidades y
destrezas en el manejo del espectrofotmetro, instrumento auxiliar y de apoyo en la
determinacin de los anlisis bioqumicos, valora la importancia de esta metodologa en la
prevencin y mantenimiento de una salud ptima.
FUNDAMENTO
Una de las propiedades de las molculas es que pueden absorber energa luminosa y
almacenarla en forma de energa interna. Esto se puede apreciar con se inicio de ciclos
vitales de muchos organismos, como es evidente el de la fotosntesis en plantas y
bacterias. La Mecnica Cuntica nos explica que la luz est compuesta de fotones cada
uno de los cules tiene una energa:
Efotn = h. = h.c/ ,
Donde c es la velocidad de la luz, es su frecuencia, su longitud de onda y h= 6.6 1034 Js es la constante de Planck. As si decimos que una sustancia qumica absorbe luz
de longitud de onda , significa que las molculas de esa sustancia absorben fotones de
esa longitud de onda.
En esta prctica estudiaremos la absorcin de luz en el ultravioleta cercano (325-420
nm) y en el visible (420-700 nm). Cuando una molcula absorbe un fotn en este
intervalo espectral, se excita pasando un electrn de un orbital del estado fundamental a
un orbital excitado de energa superior. De est manera la molcula almacena la energa
del fotn, y lo hace en sus enlaces:
A + h. A*
E(A*) = E(A) + Efotn 11
Como la energa se conserva, la diferencia de energa entre el estado fundamental de la
molcula (A) y su estado excitado (A*) debe ser exactamente igual a la energa del fotn.
Es decir, una molcula slo puede absorber fotones cuya energa h. sea igual a la
energa de un estado molecular excitado. Cada molcula tiene una serie de estados
excitados discretos (o bandas) que dependen de su estructura electrnica y que la
distinguen del resto de molculas. Como consecuencia, el espectro de absorcin, es
decir, la luz absorbida en funcin de la longitud de onda, constituye una verdadera sea
de identidad de cada sustancia o molcula.
En este sentido la Espectrofotometra es una de las tcnicas experimentales ms
utilizadas para la deteccin especfica de molculas. Se caracteriza por su precisin,
sensibilidad y su aplicabilidad a molculas de distinta naturaleza (contaminantes,
biomolculas, etc.) y estado de agregacin (slido, lquido, gas). Los fundamentos fsicoqumicos de la espectrofotometra son relativamente sencillos.
Se denomina fotocolormetra al mtodo ptico de absorcin que nos permite cuantificar
sustancias y esta basada en la medicin de la intensidad de la luz monocromtica
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La longitud de onda en la que las molculas de dichas sustancias absorbe con mayor
intensidad la luz, se denomina longitud de Mxima Absorcin o Lambda Mximo.
Si consideramos que cada molcula absorbe una determinada de luz, la intensidad de la
luz transmitida por una solucin disminuir en relacin con el nmero de molcula que se
interpongan entre la fuente luminosa y el observador. Este nmero vara de acuerdo con
la concentracin del soluto y el espesor del recipiente que contiene la solucin, estos
factores estn considerados en la Ley de Lambert y Beer, que rigen los principios de
la Colorimetra y cuyas formas de expresin son:
Log (lo / lt) = l c = A = D.O.
Donde:
Io = Intensidad de la Luz Incidente
lt = Intensidad de la Luz transmitida.
= Coeficiente de Extincin Molar. Valor constante dependiendo de la naturaleza de la
sustancia y de la longitud de onda.
l = Espesor del recipiente en cm.
C = Concentracin de la solucin.
A = D.O. = Absorbancia = Densidad ptica = Extincin.
La Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la tramitancia (T) y la relacin entre
ambas es logartmica.
CUESTIONARIO
1.- En que consiste la espectrofotometra?
2.- Cul es el significado de la luz en esta metodologa?
3.- Que factores alteran la ley de Lambert- Beer?
4.- Tiene alguna utilidad la espectrofotometra?.
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PRCTICA N 05:
DETERMINACION DE GLUCOSA
OBJETIVO
El alumno identifica los carbohidratos, determina, explica e interpreta a travs de mtodos
experimentales las propiedades los fundamentos en la comprobacin de carbohidratos,
valora la importancia de estas sustancias orgnicas, que forman parte de nuestras
estructuras, que nos proporciona la energa para nuestra subsistencia
FUNDAMENTO
Los hidratos de carbono, compuestos por carbono, hidrgeno y oxgeno, representan la
principal fuente de energa celular y son tambin constituyentes estructurales importantes
de las paredes celulares y de sustancias intercelulares. Los compuestos de carbono se
clasifican de acuerdo con el nmero de monmeros que contienen
En estos compuestos el carbono, hidrogeno y oxigeno se encuentran en proporcin de 2 a
1, los carbohidratos comprenden desde azucares simples con peso molecular bajo, como
la glucosa y la fructosa, hasta molculas grandes de peso molecular alto, como el almidn
y la celulosa.
Una prueba general para el reconocimiento de carbohidratos es la de Molish, en ella el
cido sulfrico con las pentosas y las hexosas en caliente dan furfural o 55-hidroximetil
furfural. Estos furfurales con el naftol se condensan formando cromgenos, que con el
cido sulfrico dan compuestos quinoides. Otras pruebas como la de Benedict da una
estimulacin semicuantitativa de la cantidad del azcar reductor existente y la prueba de
lugol indicara la presencia de almidn, glucgeno o de un monosacrido o disacrido.
MATERIALES Y REACTIVOS
Solucin de glucosa al 1 %
Solucin de almidn al 1 %
Jugo de naranja
Reactivo de Molish
Reactivo de Benedict
cido clorhdrico concentrado
Hidrxido de sodio al 10%
Lugol
5 tubos de ensayo
Gradillas
Pinzas de madera
PROCEDIMIENTO
Reaccin de Molish
En un tubo de ensayo se toman 2 ml. De la sustancia problema, se agrega 2 gotas del
reactivo de Molish recin preparado y se mezcla bien. Se inclina el tubo y se aade
cuidadosamente por las paredes aproximadamente 2 ml de cido sulfrico concentrado.
La formacin de un anillo violeta en la interfase indicara resultado positivo.
Con la Solucin de Benedit
En un tubo de ensayo se toman 0.5 ml. De la solucin de Benedict, luego se aade 1 ml
de la solucin problema y e calienta a ebullicin durante dos min. Luego se deja enfriar.
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PRACTICA N 6
DETERMINACION DE PROTEINAS
OBJETIVOS
- Introducir en la determinacin de la concentracin de protenas en plasma sanguneo.
- Entender y practicar los principios de la espectrofotometria.
- Aprender a manejar pipetas automticas
FUNDAMENTO
La sangre est formada por una solucin acuosa que contiene molculas de tamao
variable y diversos tipos de elementos celulares. Los elementos formes de la sangre se
encuentran en suspensin en una solucin acuosa denominada plasma. Aunque el
plasma es el medio natural de las clulas sanguneas, la mayora de las determinaciones
qumicas se hacen en suero. Las protenas del plasma pueden clasificarse en dos
grupos: las que son sintetizadas por el hgado (albmina) y las inmunoglobulinas
(producidas por las clulas plasmticas de la mdula sea). El plasma humano tiene una
concentracin en protenas de 60-80 g/L (frecuentemente se expresa en g/dL; 6-8 g/dl).
Casi la mitad de esta protena plasmtica es albmina, cuyo rango de concentracin es
35-45 g/L. Es una protena de 62.000 D que acta como protena de reserva, adems de
importante transportador (cidos grasos, bilirrubina y frmacos) y regulador osmtico.
Es producida por el hgado. Su concentracin aumenta en casos de deshidratacin y
disminuye en casos de ascitis/edema, y dao heptico severo.
La determinacin de la concentracin de protenas en sangre puede ser llevada a cabo
por diferentes mtodos. En esta prctica vamos a utilizar dos de los mtodos que se
utilizan con mas frecuencia: Biuret y Bradford. Los dos mtodos tienen en comn que la
disolucin de protena se mezcla con algn reactivo que determina que aparezca o se
intensifique un color (azul) que se cuantifica midiendo la absorbancia a una determinada
longitud de onda frente a un blanco de reactivo. El color generado es poco estable y
depende de las condiciones de reaccin, por lo que hay que realizar una curva patrn
con soluciones de una protena de concentracin conocida (albmina bovina).
La base terica de la aplicacin de la espectrofotometria para medir la concentracin de
una sustancia en solucin y las instrucciones para el uso del Espectrofotmetro
Materiales
-Soluciones de suero sanguneo A y B de concentracin desconocida.
-Soluciones de protena patrn (albmina de suero bovina) de concentraciones conocidas
-Reactivo de Bradford
-Reactivo de Biuret
-Pipetas
-Tubos
-Agitadores
-Rotulador
-Espectrofotmetros (Colormetros)
Determinacin por el mtodo de Biuret
La concentracin de protenas se medir utilizando el mtodo del Biuret, que se basa en
la formacin de un compuesto coloreado o cromforo, de color azul-prpura, debido a la
20
21
PRACTICA N7
DETERMINACIN DE COLESTEROL
OBJETIVO
Reconocer la estructura del colesterol, determina experimentalmente en suero los valores
de colesterol total, HDL-Colesterol y triglicridos, para lo que se utilizarn kits
comerciales, valora la importancia del conocimiento de la determinacin del colesterol
FUNDAMENTO
El colesterol es un esteroide de alto peso molecular que contiene una estructura
Ciclopentanofenantreno. Aunque se le considera un lpido, no sirve, como fuente de
energa para el metabolismo, el organismo no puede degradar el anillo de colesterol.
Las Lipoprotenas LDL transportan de 65 al 75 % del colesterol plasmtico. La
hipercolesterolemia esta casi siempre asociada con la elevacin del colesterol LDL (tipo
IIa). Es muy raro que la elevacin este asociada con incremento en el colesterol HDL. Las
elevaciones del colesterol LDL pueden ser el resultado de alteraciones monognicas,
alteraciones polignicas o secundario a otras
enfermedades. Ejemplos:
hiprcolesterolemia familiar, defecto familiar de Apo B100, hipercolesterolemia polignica,
cncer de cabeza de pncreas, diabetes, hipotiroidismo, sndrome nefrtico, etc.
El colesterol de la dieta se absorbe parcialmente y tambin se sintetiza en el hgado y
otros tejidos. El colesterol se excreta a la bilis como tal o tras su transformacin en sales
biliares primarias y secundarias.
Las concentraciones elevadas de colesterol LDL se asocian con un riesgo
progresivamente creciente de ateroesclerosis y enfermedad de las arterias coronarias.
Las concentraciones sricas de colesterol disminuyen (hipocolesterolemia) en:
desnutricin,
esteatorrea idioptica, hepatitis, hipertiroidismo, infecciones agudas,
anemia, cncer, malabsorcin y anorexia nerviosa.
El diagnstico clnico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un nico
ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de laboratorio.
Para las pruebas de perfil lipdico el paciente debe estar en ayuno total excepto agua,
durante un lapso de 12 a 24 horas antes de la prueba. No debe haber realizado ejercicio
vigoroso y bajo la dieta corriente el da anterior de la prueba.
FUNDAMENTO DEL MTODO (COLESTEROL OXIDASA/PEROXIDASA)
Tanto el colesterol libre como el esterificado presentes en la muestra originan, segn las
reacciones acopladas descritas a continuacin, un complejo coloreado que se cuantifica
por espectrofotometra.
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COMPOSICIN
A. Reactivo. Pipes 35 mmol/L, colato sdico 0,5 mmol/L, fenol 28 mmol/L, colesterol
esterasa > 0,2 U/mL, colesterol oxidasa > 0,1 U/mL, peroxidasa > 0,8 U/mL,
aminoantipirina 0,5 mmol/L, pH 7,0.
S. Patrn de Colesterol. Colesterol 200 mg/dL (5,18 mmol/L). Patrn primario acuoso.
MUESTRAS
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estndar.
El colesterol en suero o plasma es estable 7 das a 2 - 8 C. Pueden utilizarse como
anticoagulantes la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro.
PROCEDIMIENTO
1. Colocar a temperatura ambiente el reactivo.
2. Pipetear en tubos de ensayo:
3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25 C) o
durante 5 minutos a 37 C.
4. Leer la absorbancia (A) del Patrn y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color
es estable durante al menos 2 horas.
CLCULOS
La concentracin de colesterol en la muestra se calcula a partir de la siguiente frmula
general:
CUESTIONARIO
1.- Qu es el colesterol y cules son sus funciones?
2.- Cul es la importancia clnica de la determinacin de colesterol?
3.- A qu se refiere cuando se habla del colesterol bueno y el colesterol malo? Explica.
4.- Por que es recomendable consumir mejor grasas de origen vegetal a la animal?
Explica:
5.- Qu es la arteriosclerosis? Quin tiene riesgos de padecerla? Por qu?
6.- Qu otros estudios deben realizarse adems del colesterol para determinar el riesgo
de enfermedades cerebro-vasculares y cmo calculamos el ndice aterognico?
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PRACTICA N 8
ACTIVIDAD ENZIMATICA
OBJETIVO
E + P
24
Donde:
= Enzima
= Substrato
= Producto
10.3
Materiales y equipos
Tubos 17x150mm
Pipeta 1mL
Indicador de pH 1-14
Potencimetro
Pipeta 5mL
Estandar de pH 4
Bao mara
Pipeta 10mL
Estandar de pH 7
Pepsina en SSF
Hielo
Bagueta
Estandar de pH 10
Agua destilada
Beacker 500mL
Gradillas
Portacubetas
NaCO3 10%
Espectrofotmetro
HCl 1N
A E
c n 1
t z
i i
v m
d t
a i
d c
pH ptimo
Procedimiento Experimental:
25
BAJO
pH
ALTO
Tubo N
---
1,5
1,5
---
---
HCl 1N (mL)
2,0
0,5
---
---
---
Na2CO3 10%(mL)
---
---
---
0,5
2,0
---
Albmina (mL)
---
Pepsina
---
---
---
---
---
20
1.0
6.0
10
11.0
---
(mL)
pH del tubo
A E
c n 1
t z
i i
v m
Temperatura ptima
d t
a i
d c
26
a
0
Procedimiento Experimental:
1 Preparar dos series de 5 tubos cada una, de acuerdo al esquema siguiente:
Reactivo / Tubo N
CONTROL
H2O dest. (mL)
3,0
3,5
3,5
3,5
3,5
---
HCl 1N (mL)
---
0,5
0,5
0,5
0,5
---
Albmina (mL)
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
---
Pepsina
---
---
---
---
---
11
(mL)
Temperatura C
0 (hielo)
25(Ambiente)
37
100
(ebullicin)
Al finalizar el tiempo, colocar inmediatamente los tubos en agua helada para detener la
reaccin, hasta el momento de su lectura.
Leer al espectrofotmetro
destilada.
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Cuestionario
1.- Explique el mecanismo de accin de la las enzimas
2.- Con los datos de la prctica elabore las grficas de pH vs Actividad y T vs Actividad, y
explique en funcin a la bibliografa recomendada.
3.- A que llamamos especificidad por el sustrato?
4.- Uso del dosaje de enzimas para el diagnstico clnico, de ejemplos
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PRCTICA N 9
DETERMINACIN DE UREA
OBJETIVO
el alumno tendr la capacidad para cuantificar urea en muestras biolgicas humanas
como la orina o la sangre.
INTRODUCIN
Cuando los aminocidos de la dieta exceden los requerimientos para la sntesis proteica
y otra va anablicas, el exceso es catabolizado para producir ATP o es convertido a
substratos para la sntesis de cidos grasos.
Es importante tomar encuentra que slo los esqueletos de carbono de los aminocidos y
no los grupos amino pueden ser usados en el proceso antes mencionado.
La eliminacin del nitrgeno de los aminocidos es una parte importante en el
catabolismo de los aminocidos, es txico para el cerebro en forma de amonio, por lo que
el organismo humano lo debe de eliminar en forma de urea, compuesto no txico soluble
en agua cuya nica funcin en el metabolismo es la excrecin de nitrgeno.
La urea puede determinarse en el hombre en muestras como: la sangre o la orina, por
diferentes mtodos los ms usados son los mtodos enzimticos.
MATERIAL Y REACTIVOS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
TCNICA
Prepare la siguiente serie de tubos:
REACTIVO
TUBO
PROBLEMA
PATRN
BLANCO
UREASA (mL)
0.2
0.2
0.2
UREA (mL)
0.0
0.02
0.0
PROBLEMA (mL)
0.02
0.0
0.0
Mezclar y dejar en reposo por 30 min. a temperatura ambiente
FENOL (mL)
5.0
5.0
5.0
HIPOCLORITO DE SODIO 5.0
5.0
5.0
(mL)
Mezclar y dejar reposar por 30 min. a temperatura ambiente
Medir en el espectrofotmetro a 620 nm
29
DETRMINACIN DE LA CONCENTRACIN
C = D.O. X 6.66/D.O P.
C = concentracin en mmol/L
D.O.= Densidad ptica del problema
D.O.P.= Densidad ptica del patrn
CUESTIONARIO
30
PRACTICA N 10
DETERMINACION DE ACIDO URICO
OBJETIVOS
FUNDAMENTO
Los nucletidos de una clula se estan renovando continuamente. Los
degradan por hidrlisis a nuclesidos, por medio de las
nucleotidos se
Tips amarillo
Pipetas 5 mL
Suero
Gradilla
Tubos 3 x mesa
Espectrofotomtro
Bao Mara
31
10 mL x
Alantona + H2O2
POD
9.11 Procedimiento
BLANCO
STANDARD
MUESTRA
Muestra
(ml)
---
Standard
(ml)
---
Reactivo
(ml)
1,00
---
0, 025
0, 025
1, 00
--1, 00
FACTOR
10 mg/mL
Absorbancia Estndar
32
VALORES DE REFERENCIA:
En Suero: Hombres.................. 3, 4 a 7, 0 mg/dl.
Mujeres......................
2, 4 a 5, 7 mg/dl.
Cuestionario
1.- Cules son los otros factores de riesgo de padecer enfermedades cardiacas y
vasculares, Adems del exceso de colesterol?
2.- Qu tipos de colesterol hay, haga un breve resumen de cada uno?
3.- Cmo afecta a los nios el colesterol, y cul es el nivel de colesterol recomendable
en la infancia?
33
PRCTICA N 11
DETERMINACIN DE UNA PRUEBA DE EMBARAZO EN ORINA
OBJETIVO
El alumno realiza la deteccin de la hormona gonadotropina corinica como un
mecanismo para determinar el estado de embarazo, comprueba experimentalmente a
travs una muestra de orina de la paciente que se sospecha que est embarazada y
valora la importancia de estas pruebas en el diagnstico del embarazo.
FUNDAMENTO
Los aos de funcin reproductiva de la mujer se caracterizan por cambios rtmicos en las
tazas de secrecin de las Hormonas Femeninas y cambios correspondientes en los
rganos sexuales. Las funciones sexuales y reproductivas en la mujer pueden dividirse en
dos fases principales; primera: la Preparacin del Cuerpo para la Concepcin y la
Segunda: el Periodo de Gestacin o Embarazo.
La gonadotropina corinica humana (hCG) es una hormona glicoproteica que se produce
en condiciones normales en la placenta y aparece en el plasma y en la orina durante el
embarazo. La hCG, junto a la hormona folculo estimulante (FSH), la hormona luteinizante
(LH) y la hormona estimulante del tiroides (TSH), est constituida por una cadena alfa,
estructuralmente similar entre ellas, y una cadena beta especfica que determina su
actividad biolgica.2 Esta hormona estimula la produccin de hormonas esteroides por el
cuerpo lteo, lo que propicia el ambiente uterino adecuado para el desarrollo del embrin.
El principal uso de la determinacin de la hCG es el diagnstico precoz del embarazo; sin
embargo, es posible observar niveles elevados en pacientes con carcinomas urogenitales,
embarazos ectpicos y ovricos.
Una funcin principal de la Gonadotropina Corinica Humana (GCH) es administrar los
factores nutricionales y estimular cantidades necesarias de otras hormonas para
mantener en ptimas condiciones el endometrio y la 69 cavidad uterina, lo que en caso
contrario de no haber concepcin o cantidad insuficiente de esta hormona se perdera en
forma de lquido menstrual.
La deteccin precoz del embarazo por las pruebas bioqumicas se fundamenta en la
determinacin de la gonadotropina corinica humana (HCG) en suero o en orina.
Una vez producida la fecundacin y la implantacin del blastocisto en la decidua
endometrial, las clulas trofoblsticas empiezan a sintetizar HCG.2 Las cifras de HCG se
incrementan rpidamente en las primeras semanas del embarazo y a los 35 das de
amenorrea alcanzan cifras de 1800 UI/L.
La HCG est compuesta de 2 subunidades alfa y beta, diferentes entre s; mientras la
subunidad alfa es compartida por las restantes glicoprotenas hipofisarias, la subunidad
beta le confiere sus caractersticas biolgicas e inmunolgicas distintivas.2
La combinacin del empleo de los anticuerpos monoclonales contra la subunidad beta de
la HCG (beta HCG) y los inmunoensayos enzimticos, ha posibilitado el auge de mtodos
semicuantitativos y cualitativos rpidos, sensibles y especficos con valores de
sensibilidad de 50 UI/L que pueden ejecutarse en las propias consultas mdicas y donde
el resultado se ofrece en menos de una hora.
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EMBARAZO
El primer signo de embarazo es la ausencia de una menstruacin esperada. Si los
ciclos son regulares, el retraso de la regla durante 1 semana o ms es la base de
presuncin de embarazo. El mdico diagnosticar embarazo por medio de procedimientos
exploratorios y utilizando diversos sistemas diagnsticos (doppler, test de embarazo, etc.)
La hCG (Hormona del embarazo) estimula el cuerpo lteo del ovario para mantener las
secreciones de estrgenos y progestgenos a fin de garantizar la integridad del
embarazo. Como regla general, los niveles de hCG se duplican al doble cada dos o tres
das. Una mujer embarazada tendr de 10 a 50 mUI/mL de concentracin de hCG en
suero la primera semana siguiente a la concepcin (al final de la tercera semana del
ciclo), alcanzando la mxima concentracin entre el segundo y tercer mes, seguido de un
descenso a partir de la 12 semana.
Mtodos de determinacin de la Gonadotropina Corinica humana (hCG, -hCG,
hormona del embarazo)
La hCG se sintetiza en la placenta y aparece en el suero y en la orina relativamente
pronto despus de la concepcin.La hCG es una glucoprotena compuesta por dos
subunidades polipeptdicas: alfa y beta. La subunidad alfa es esencialmente idntica a la
cadena alfa de otras hormonas hipofisiarias (TSH, LH y FSH). Es la variacin de las
subunidades beta donde reside la especificidad de la actividad biolgica de estas
hormonas.
Con los mtodos cuantitativos de laboratorio pueden detectarse cantidades muy
pequeas de -hCG (sensibilidad entre 0,05 y 0,1 mUI/mL). Dichos mtodos son:
radioinmunoanlisis (RIA), enzimoinmunoensayo (EIA, ELISA), inmunoanlisis de
fluorescencia (FIA). Casi todos ellos usan dos tcnicas: Inhibicin competitiva (RIA, FIA),
y tcnicas sndwich de doble anticuerpo (EIA, FIA). Todos estos ensayos cuantitativos
requieren instrumentacin especial y largos tiempos de anlisis (de 30 minutos a 3 horas)
Tradicionalmente se han utilizado pruebas cualitativas urgentes en orina, de aglutinacin
en portaobjetos, como indicadores para visualizar una reaccin positiva. Estas tcnicas
han cado en desuso tras la aparicin de los tests rpidos en dispositivos
inmunocromatogrficos, proporcionando sensibilidades de 25 mUI/mL en tiempos de
ensayo por debajo de los 3 minutos.
La aparicin de una nueva generacin de mtodos inmunoabsorbentes con partculas de
oro coloidal recubiertos de anticuerpos anti -hCG (DONNATEST Embarazo) permite
mejorar la sensibilidad de deteccin de esta hormona en orina por debajo de 20 mUI/mL
en menos de dos minutos.
Estas pruebas se utilizan como mtodo cualitativo, tanto en laboratorio, en formato de tira
reactiva para suero y orina, o en formato de dispositivo como prueba rpida de uso
personal, y con la sensibilidad suficiente para detectar la hormona desde el primer da de
la falta.
MATERIALES Y REACTIVOS
Gradilla, tubos de 13X100
Centrifuga, Gasas
Tiras reactivas para deteccin de la fraccin beta de la hormona
Muestra reciente de orina
PROCEDIMIENTO
1. Procedimiento opcional: recoger la orina en un vaso limpio. Sumergir la zona
absorbente del dispositivo durante 10 segundos. Esperar que aparezca el resultado a
partir de un minuto.
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