Ensayo FRAP

ENSAYO DE FRAP
(Ferric Reducing Antioxidant Power)
REACTIVOS
Reactivo
TPTZ
Cloruro Frrico
Hexahidratado

Nombre

Marca

No. Cat.

2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine,
minimum 98%
Iron (III) chloride hexahydrate,
minimum 98%

Sigma

T1253-1g

Sigma-Aldrich F2877-100g
Sigma-Aldrich

Sulfato Frrico
Heptahidratado

Iron (III) sulfate heptahydrate,

99+% A.C.S. reagent

cido Clorhdrico

cido Clorhdrico 36.5-38.0%

J.T. Baker

9535-02

cido Actico
Glacial

Acetic Acid Glacial

J.T. Baker

9507-02

Acetato de Sodio

Sodium acetate trhydrate, A.C.

S. reagent
Alcohol metlico

Aldrich

236500500g
9093-03

Metanol
Agua Destilada

215422250g

J.T. Baker

MATERIAL
-

Matraces aforados de 5 mL con tapa

Matraces aforados de 10 mL con tapa

Matraz aforado de 50 mL

Matraz aforado de 250 mL

Viales de 20 mL con tapa

Viales mbar de 4.5 mL con tapa

Micropipetas de 20, 100, 200, 1000 y 5000 L y puntas

1

Ensayo FRAP
-

Pipeta multi-canal y puntas

Placas para lector de Elisa

Termmetro

Papel aluminio

Parafilm

PREPARACIN DE REACTIVOS
Solucin estndar de Sulfato ferroso FeSO4 7H2O
PM de Sulfato ferroso FeSO4 7H2O: 278.01g/mol.
Se pesan 10 mg de FeSO 4 7H2O, y se disuelven con metanol en un matraz
volumtrico de 5ml (Solucin A).
A partir de la solucin A se obtienen las siguientes diluciones (Cuadro 1).
Cuadro1. Preparacin de diluciones de FeSO4 7H2O
No.
Conc
.

[M]

Vol. de Solucin
A (L)

Vol. de Metanol
(L)

72

10

990

360

50

950

540

75

925

895

125

875

1079.
5

150

8 50

1259

175

8 25

1439

200

800

Solucin de cido clorhdrico 40 mM (HCl)

Ensayo FRAP
PM de HCl: 36.45 g/mol
Para preparar 50 mL de esta solucin, se colocan aproximadamente 10 mL de
agua destilada en un matraz volumtrico de 50 mL y se aaden cuidadosamente
170.214 L de HCl, llenando finalmente al volumen del aforo.
Solucin amortiguadora de acetato 300 mM a pH de 3.6
PM de CH3COONa. 3H2O: 136.08 g/mol
PM de CH3COOH: 60.08 g/mol
Para preparar la solucin amortiguadora de acetato se pesan 683.802 mg de
acetato de sodio (CH3COONa) disolviendo con agua destilada en un matraz
aforado de 250 mL. Se agregan 4 mL de cido actico glacial (CH 3COOH) y se
lleva al volumen del aforo. Se valora el pH de la solucin. Si es necesario el pH se
puede ajustar con cido actico glacial.
Solucin de Cloruro Frrico Hexahidratado 20 mM (FeCl3 6H2O)
PM de FeCl3 6H2O: 270.3 g/mol
Para preparar 10 mL de esta solucin se pesan 54.06 mg de FeCl 3 6H2O y se
afora con agua destilada. Para evitar la oxidacin de la solucin se envuelve con
aluminio el recipiente que la contenga.
Solucin de 2, 4, 6, tris (2-priridil)-s-triazina 10 mM (TPTZ)
PM de TPTZ: 312.34 g/mol
Para preparar 5 mL de este reactivo se pesan 15.6 mg de TPTZ y se utiliza como
disolvente la solucin 40 mM de HCl. Para evitar la oxidacin del reactivo se
envuelve con aluminio el recipiente que lo contenga.
NOTA IMPORTANTE: Tanto el cloruro frrico y el TPTZ deben de disolverse
cuando los pozos ya hayan sido llenados con las diluciones de sulfato
ferroso, control, blanco y solucin amortiguadora.
Solucin FRAP
Para preparar la solucin FRAP se mezclan 10 mL de la solucin amortiguadora
de acetato, 1 mL de la solucin de FeCl 3 6H2O (20 mM) y 1 mL del reactivo TPTZ
10 mM.

Ensayo FRAP
NOTA: Los reactivos en solucin empleados para preparar la solucin FRAP
deben de estar previamente calentados en bao seco a 37 C antes de
adicionarse a la solucin amortiguadora. MUY IMPORTANTE.

PROCEDIMIENTO
1. Diseo de la placa

Bco1

Bco1

Bco1

9 10 11 12

F7 F7 F7 F7 + Buffer
Control+
Buffer

B Control Control Control

C

F1

F1

F1

F1 + Buffer

F2

F2

F2

F2 + Buffer

F3

F3

F3

F3 + Buffer

F4

F4

F4

F4 + Buffer

F5

F5

F5

F5 + Buffer

F6

F6

F6

F6 + Buffer

# Pocillos = 96
2. Encender el equipo (SpectraMax 190) para que el lmpara se vaya calentando.
3. Se prende la computadora y se introducen las condiciones en las que se va a
trabajar:

a) Se abre el programa SoftMax Pro v5

b) En la barra del programa localizar la opcin de Control y seleccionarla.

c) Dentro de esta opcin seleccionar Incubator

Ensayo FRAP

d) Determinar la temperatura de 37C.

e) Se abrir un cuadro con el nombre: Basic End Point

f) Seleccionar la opcin Settings haciendo clic sobre el icono
g) En el cuadro SpectraMax 190 settings se muestran tres opciones:
Endpoint: si se quiere hacer una lectura en un solo tiempo (Punto Final)
Kinetic: si se requieren hacer lecturas a travs del tiempo.
Spectrum.
Para esta tcnica se elige la opcin Endpoint y se ingresan los siguientes
parmetros haciendo clic sobre cada opcin:
Wavelengths:
Wavelengths: 1
Lm1 (Longitud de onda): 595 nm
Path Check :
Of
Automix & Blanking:
Before First Read: 5 secs
5

Ensayo FRAP
Pre-Read Plate: off
Autocalibrate:
On
Strips:
Con el mouse se seleccionan las columnas que sern utilizadas, basndose
en el llenado de la placa con el fin de que el equipo slo lea los pocillos en
donde haya muestra y no se gaste energa en leer pozos que no contengan
nada.
Column Wavelength Priority:
Column Priority
Autoread:
Off
Para finalizar dar clic en OK para guardar las condiciones de trabajo.
h) El siguiente paso es asignar a cada pocillo un nombre para identificar que
muestra contiene en especfico. Se selecciona la opcin Template dando clic
sobre el icono
Se abrir el cuadro Exp01: Plate01
Sobre la cuadricula con el mouse se selecciona el (los) pocillo(s) a nombrar, en el
recuadro Groups se elige la opcin Blank del men desplegable; despus se
da un clic en Assign para que se nombren los pocillos seleccionados como
blanco.
Los cuadros correspondientes a cada pocillo seleccionado cambian de color. Para
los pocillos con la muestra control se elige la opcin Control y Assign. Si se
trabaja con estndares, se elige la opcin Standards La opcin Clear nos
permite corregir en caso de error.
Para nombrar el resto de los pocillos se elige la opcin New+del men
desplegable. Se abrir el cuadro Group Settings Del men desplegable
column format se elige la opcin unknows. Se escribe el nombre de nuestro
grupo en la opcin Name y se da clic en OK para que guardar los cambios. Se
repite la operacin para cada grupo nuevo.

Ensayo FRAP
Al terminar de nombrar los pocillos, se elige la opcin OK para guardar los
cambios en las condiciones de trabajo.
4. Llenado de la placa
Se recomienda que la lnea A sea para el Blanco 1, para esto se agregan 200 L
del disolvente en el que estn las muestras.
Empezar a llenar de izquierda a derecha con las distintas concentraciones del
estndar que es el FeSO4 7H2O, con su respectivo Blanco (dilucin + buffer) y las
muestras (agregar solamente 25 L y en el caso del Blanco de la muestra agregar
175 L de la solucin amortiguadora). Cada muestra debe agregarse en la placa
por triplicado. Los pocillos o lneas que se vayan llenando deben ir tapndose
con parafilm, para evitar que se volatilice el disolvente, al trmino del llenado
la placa se debe cubrir con el parafilm y con papel aluminio para protegerlo de la
luz y evitar la degradacin de la sustancias, se guarda de este modo hasta la
adicin de la solucin FRAP.

Bco1
Bco2
Fn
M
BcoMn

Agua destilada
(l)
200

FeSO4
(l)

Muestra (l)

25
25

Buffer
(l)

Sol. FRAP (l)

175
25
25

175
175
175

Bco1 = Blanco.
Bco2 = Solucin Sin FRAP.
F= Solucin de FeSO4 7H2O con FRAP a las diferentes concentraciones.
M= Muestra.
BcoMn = Blanco dela muestra.

* Si las muestras se solubizaron en otro disolvente diferente al metanol, se debe

incluir en los pocillos, por ejemplo agua destilada.
Se coloca la solucin FRAP en el dispensador y con la pipeta multicanal agregar
a cada pocillo que contenga FeSO 4 7H2O y muestra (a excepcin del Blanco2), 175
L de FRAP para completar a 200 L con los 25 L que se agregaron
previamente, al finalizar se cubre con papel aluminio para evitar la reduccin del
radical y su posterior prdida de actividad.
5. Lectura
La placa se coloca en el porta placas del equipo, para esto es importante que las
columnas y filas coincidan con el diseo que se ingreso al programa.

Ensayo FRAP
Cerrar el porta placas pulsando el botn Drawer que se encuentra en el equipo.
En el programa, seleccionar la opcin Read dando clic sobre el cono de color
verde para que el equipo de inicio a las lecturas.
6. Una vez que el equipo haya terminado de leer, aparecer en la pantalla una
tabla con los resultados de las lecturas, y el equipo sacara la placa,
inmediatamente se volver a introducir la placa al equipo para que contine la
reaccin y la operacin se repetir en los tiempo de 0, 4, 10, 30, 60 y 90 minutos.
Los datos de la lectura se pueden guardan como archivo *.pad o bien los datos se
pueden exportar a un bloc de notas; en el men Archivo se elige la opcin
Export, el programa guarda el archivo en la carpeta de Mis documentos solo
es necesario asignarle un nombre, una vez teniendo los datos en el bloc de notas
se pueden copiar a Excel para realizar clculos y/o grficas de cada placa o
muestra.

CALCULOS
El valor de FRAP para los compuestos puros para cada intervalo de tiempo se
calcula de acuerdo a la Ecuacin 1, mientras que para determinar el valor de
FRAP de los extractos se utiliza la curva de calibracin con FeSO 4 7H2O:
Ecuacin 1. Ecuacin para determinar el valor de FRAP
2+

at Fe
at FI

FRAP ( M )=
a t FI

=Es el cambio de absorbancia despus del intervalo de tiempo del

compuesto a evaluar.
2+
a t Fe = Es el cambio de absorbancia al mismo intervalo de tiempo para el
sulfato de fierro a la misma concentracin.
Se llevarn acabo lecturas de cada una de las muestras y de la curva estndar por
triplicado; de los datos colectados se reportar la media y desviacin estndar.
Ejemplo:

Ensayo FRAP
Valores de absorbancia para cada dilucin, control y blanco a cada tiempo de
lectura. El valor de absorbancia final se calcula restando el valor del buffer
(dilucin + buffer) a la absorbancia 1.
MINUT
O0

BLANCO
CONTRO
L
72
360
540
895
1079.5
1259
1439

Abs final
Abs 1
0.00 0.00 0.00
0
0
0
0.04 0.04 0.04
8
6
4
0.04
8
0.16
5
0.48
1
0.71
4
1.00
2
1.27
9
1.47
3

0.04
5
0.18
0
0.32
2
0.52
6
0.95
1
1.39
2
1.70
0

0.04
9
0.22
8
0.36
2
0.73
0
0.97
3
1.14
6
1.55
8

BUFF
ER

= Abs 1 buffer

PROMED
IO

DESV
EST

0.000
0.012
0.068
0.040
0.023
0.028
0.014
0.026
0.034

0.03
6
0.02
1
0.12
5
0.45
8
0.68
6
0.98
9
1.25
3
1.44
0

0.03
4
0.02
3
0.14
0
0.29
9
0.49
8
0.93
7
1.36
6
1.66
7

0.03
2
0.02
0
0.18
8
0.33
9
0.70
2
0.95
9
1.12
0
1.52
4

0.034

0.002

-0.021

0.002

0.151

0.033

0.365

0.083

0.629

0.113

0.962

0.026

1.246

0.123

1.544

0.115

MIN 4

BLANC
O
CONTR
OL
72
360
540
895
1079.5

Abs 1
0.00 0.00 0.00
2
1
0
0.04 0.04 0.04
8
6
4
0.05
0
0.17
8
0.48
8
0.73
5
1.02
2

0.04
8
0.30
6
0.33
8
0.54
5
0.99
6

0.05
1
0.24
0
0.36
7
0.74
6
0.99
3

BUFF
ER

PROMED
IO

Abs final

DES
EST

0.000
0.011
0.071
0.035
0.023
0.029
0.014

0.03
7
0.02
1
0.14
3
0.46
5
0.70
6
1.00
8

0.03
6
0.02
3
0.27
1
0.31
5
0.51
7
0.98
2

0.03
4
0.02
0
0.20
5
0.34
4
0.71
8
0.97
9

0.036

0.002

-0.021

0.001

0.206

0.064

0.374

0.080

0.647

0.113

0.990

0.016

Ensayo FRAP

1259
1439

1.32
1
1.48
9

1.42
6
1.71
9

1.16
7
1.57
0

0.00
4
0.04
9

Abs 1
0.00 0.00
1
1
0.04 0.04
7
4

0.05
2
0.18
4
0.48
8
0.73
5
1.02
1
1.31
6
1.48
4

0.05
0
0.36
7
0.34
2
0.54
9
1.00
2
1.42
2
1.71
5

0.00
3
0.05
1

Abs 1
0.00 0.00
1
1
0.04 0.04
8
6

0.06
5
0.19
2

0.05
5
0.34
8

0.025
0.035

1.29
6
1.45
4

1.40
1
1.68
4

1.14
3
1.53
4

1.280

0.130

1.557

0.117

MIN 10

BLANC
O
CONTR
OL
72
360
540
895
1079.5
1259
1439

0.05
2
0.24
4
0.36
8
0.74
6
0.99
1
1.16
6
1.56
2

BUFF
ER

PROMED
IO

Abs final

DES
ES

0.000
0.010
0.071
0.037
0.024
0.029
0.014
0.024
0.036

0.03
9
0.01
9
0.14
7
0.46
4
0.70
6
1.00
7
1.29
2
1.44
9

0.03
7
0.02
1
0.33
0
0.31
8
0.51
9
0.98
9
1.39
8
1.67
9

0.03
4
0.01
9
0.20
7
0.34
3
0.71
7
0.97
7
1.14
2
1.52
7

0.037

0.00
3

1.551

0.00
1
0.09
3
0.07
8
0.11
1
0.01
5
0.12
9
0.11
7

PROMED
IO

DES
ES

-0.020
0.228
0.375
0.647
0.991
1.277

MIN 30

BLANC
O
CONTR
OL
72
360

0.05
6
0.25
0

BUFF
ER

Abs final

0.000
0.010
0.072
0.045

0.04
1
0.00
7
0.14
7

0.03
8
0.01
7
0.30
3

0.03
6
0.01
6
0.20
5

0.038
-0.013
0.219

0.00
3
0.00
5
0.07
9

10

Ensayo FRAP

540
895
1079.5
1259
1439

0.48
6
0.73
6
1.02
0
1.30
4
1.47
0

0.34
6
0.55
6
1.00
5
1.40
9
1.69
7

0.36
7
0.74
3
0.99
1
1.16
0
1.54
7

0.025
0.029
0.014
0.024
0.040

0.46
1
0.70
6
1.00
6
1.28
0
1.43
1

0.32
1
0.52
6
0.99
1
1.38
5
1.65
7

0.34
2
0.71
4
0.97
7
1.13
6
1.50
7

0.375
0.649
0.991
1.267
1.532

0.07
6
0.10
6
0.01
5
0.12
5
0.11
5

MIN 60
BUFF
ER

Abs 1
BLANC
O
CONTR
OL
72
360
540
895
1079.5
1259
1439

0.00
2
0.05
2

0.00
0
0.05
0

0.00
1
0.04
7

0.06
0
0.19
6
0.48
0
0.73
2
1.01
6
1.29
0
1.45
5

0.05
9
0.34
8
0.34
7
0.56
4
1.00
5
1.39
3
1.67
1

0.06
0
0.25
1
0.36
4
0.73
9
0.97
4
1.15
1
1.53
0

PROMED
IO

Abs final

0.001
0.011
0.073
0.049
0.025
0.030
0.014
0.025
0.041

DES
EST

0.000
0.04
2
0.01
3
0.14
7
0.45
4
0.70
2
1.00
1
1.26
5
1.41
5

0.04
0
0.01
4
0.29
8
0.32
2
0.53
4
0.99
1
1.36
7
1.63
0

0.03
6
0.01
3
0.20
2
0.33
9
0.70
9
0.96
0
1.12
6
1.49
0

0.039

0.003

-0.013

0.001

0.216

0.077

0.372

0.072

0.648

0.099

0.984

0.022

1.253

0.121

1.512

0.110

PROMED
IO

DESV
ES

0.000
0.040

0.003

MIN 90
BUFF
ER

Abs 1
BLANC
O
CONTR

0.00
1
0.05

0.00
1
0.05

0.00
2
0.04

0.001
0.010

Abs final

0.04

0.04

0.03

11

Ensayo FRAP
OL
72
360
540
895
1079.5
1259
1439

0.06
2
0.19
6
0.47
4
0.72
8
1.01
4
1.27
5
1.44
4

0.06
2
0.31
0
0.34
6
0.56
6
0.99
9
1.37
9
1.65
6

0.06
1
0.24
9
0.36
1
0.73
6
0.96
2
1.14
2
1.51
8

0.073
0.051
0.025
0.030
0.015
0.025
0.041

3
0.01
1
0.14
5
0.44
9
0.69
8
1.00
0
1.25
1
1.40
4

0
0.01
1
0.25
9
0.32
1
0.53
6
0.98
4
1.35
5
1.61
6

7
0.01
2
0.19
8
0.33
6
0.70
6
0.94
7
1.11
8
1.47
7

-0.011

0.001

0.201

0.057

0.369

0.070

0.647

0.096

0.977

0.027

1.241

0.119

1.499

0.108

Tomando el valor promedio de cada dilucin a cada tiempo de lectura:

uM

CONTR
OL
72
360
540
895
1079.5
1259
1439

10

30

60

90

0.034
-0.021
0.151
0.365
0.629
0.962
1.246
1.544

0.036
-0.021
0.206
0.374
0.647
0.990
1.280
1.557

0.037
-0.020
0.228
0.375
0.647
0.991
1.277
1.551

0.0381
-0.0134
0.2186
0.3750
0.6488
0.9914
1.2670
1.5317

0.0393
-0.0134
0.2156
0.3719
0.6481
0.9841
1.2525
1.5116

0.0401
-0.0111
0.2006
0.3686
0.6469
0.9770
1.2408
1.4990

Graficando lo anterior (absorbancia vs tiempo):

12

Ensayo FRAP
1.8
1.6
1.4

CONTROL

1.2

72

1.0
Absorbancia

360

0.8

540

0.6

895

0.4

1079.5

0.2

1259

0.0
-0.2 0

20

40

60

80

100

1439

t (min)

Como se observa en la grfica la reaccin se vuelve estable con el tiempo, por lo

tanto, si quisiramos calcular los valores equivalentes de sulfato de hierro, a un
tiempo determinado, por ejemplo minuto 30, tomamos los datos de absorbancia y
concentracin para graficar y obtener la ecuacin de la recta:
FeSO4
uM
72
360
540
895
1079.5
1259
1439

MIN 30
Absorbanc
ias
-0.0134
0.2186
0.3750
0.6488
0.9914
1.2670
1.5317

13

Ensayo FRAP
1.8
1.6
1.4
1.2

f(x) = 0x - 0.19
R = 0.97

1.0
Absorbancia

0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
-0.2 0

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

uM FeSO4

control 25 metanol 175 de frap

0 4 10 30 60 90

14