Tratamiento de Aguas Residuales

Bioadsorcin de metales
pesados de aguas cidas
de minas (I)
Sobre residuos de levaduras cerveceras
M. Garca Roig, F. I. Ramrez Paredes
y T. Manzano Muoz
Dpto. de Qumica Fsica. Facultad de Ciencias Qumicas.
Universidad de Salamanca
1. Introduccin

Se ha caracterizado la
composicin qumica y los
estados fisicoqumico y ecolgico
de las aguas cidas de dos minas
a cielo abierto de la cuenca del
ro Duero. Asimismo, se han
establecido las condiciones para
la obtencin y manipulacin
adecuadas de diferentes residuos
biolgicos, abundantes y baratos,
que se muestren tiles para la
descontaminacin de metales
pesados de dichas aguas cidas.
Se ha ensayado, a escala de
laboratorio (<100 l), una
tecnologa innovadora para la
depuracin de estas aguas cidas
contaminadas con metales
pesados, basada en las
caractersticas fisicoqumicas de
adsorcin, intercambio inico y
complejacin de iones metlicos
(bioadsorcin) que poseen
biopolmeros, tales como la
queratina, la quitina y otros
constituyentes mayoritarios de
distintos tipos de residuos
biolgicos industriales, como son
las levaduras cerveceras
exhaustas, objeto de detalle en el
presente artculo, y otros como
pelos de cerdo, plumas de ave y
caparazones de cangrejos de ro
que sern objeto de un artculo
posterior.

Ingeniera Qumica
www.alcion.es

La contaminacin por aguas de

drenaje cidas que contienen metales pesados es un problema comn
en muchas zonas metalognicas y
particularmente importante en
explotaciones mineras de carbn o
de metales [1]. En las minas a cielo
abierto tiene lugar un proceso natural aerobio de biolixiviacin debido
a la existencia en el terreno de determinados microorganismos y de
agua (de escorrentas que circulan a
travs de cortas, filones pirticos y
escombreras). Las reacciones redox
de tipo bioqumico que constituyen
este proceso de biolixiviacin [2-5]
provocan la formacin de cido sulfrico a partir de los sulfuros metlicos presentes en los residuos minerales [2], con la consecuente disminucin del pH del agua y la solubilizacin de los metales pesados que
pueden llegar a difundirse en forma
de contaminacin metalogentica a
masas de agua prximas ms extensas (ros, embalses).
Si bien las minas son fenmenos locales y sus mayores impactos sobre los ecosistemas terrestres
y acuticos son fundamentalmente
de carcter local, no siempre es as
y la dispersin de los metales
pesados puede llegar a ser regional
e incluso ms global. Las minas
generan grandes cantidades de
rocas y escombreras que deben
depositarse sobre la tierra o en los
ecosistemas acuticos. Los resultados principales en trminos de
contaminacin por metales pesados son reas de tierras contaminadas baldas, aguas cidas ricas
en metales surgidas a partir de
residuos y escombreras deposita-

das sobre el terreno y la consecuente contaminacin de tierras,

lagos, ros y reas costeras. En
este sentido, y como triste ejemplo, en Espaa, la dispersin de la
contaminacin por metales pesados y sus nocivos efectos a lo
largo de la cuenca del ro Guadiamar y del coto de Doana tuvo su
causa en la rotura del embalse de
las aguas cidas de la mina de
Aznalcllar (Sevilla).
Un primer objetivo de este trabajo ha sido la identificacin y
evaluacin de problemas de contaminacin metalognica en aguas
superficiales de diferentes zonas
mineras de las provincias de Salamanca y Zamora, donde existen
menas de W, U, Sn, Bi, etc., que en
la actualidad han dejado de explotarse y que mantienen cortas a
cielo abierto desde hace bastantes
aos, con volmenes ms o menos
importantes de agua retenida, y
escombreras, en algunos casos, de
notable magnitud.
Dada la creciente percepcin de
los riesgos que conlleva la contaminacin ambiental por metales pesados, en los casos evaluados positivamente (drenajes cidos de las
minas Merladet y F en la provincia
de Salamanca), nuestro segundo
objetivo sera investigar la capacidad de biorremediacin de dichas
aguas cidas de mina mediante procesos de bioadsorcin por biopolmeros abundantes y baratos.
1.1. Bioadsorcin de
metales

Existen en la naturaleza biomasas muertas e inactivas con capaci-

abril 03

155

INGENIERIA QUIMICA

Tabla I. Grupos ionizables en polmeros biolgicos susceptibles de

participar en la unin de metales
Grupo
Carboxilo
Carboxilo
Carboxilo
Carboxilo
Carboxilo
Carboxilo
Sulfato
Acido sulfnico
Fosfato
Fosfato
Fosfato
Hidroxilo
Hidroxilo

Sulfhidrilo
Amino
Amino
Amino
Amino
Amino
Amino
Lactam-NH
Lactam-NH
Lactam-NH
Lactam-NH
Imidazol- NH

Imidazol
Guanidino-NH2
Imino

Localizacin

pKa

Protena c-terminal
Beta aspartato
Gamma glutamato
Acido urnico
Acido silico
Lactato (Acido murmico)
Carbohidrato como ster.
Tirosina
Acido cisteico
Serina como ster
Azcar o poliol mono ster

3,5-4
4-5
4-5
3-4,4
2,6
3,8(3,9)
Sin datos
(probablemente <-0,5)
1,3
6,8
Pk1 0,94-2,10
Pk2 6,11-6,75
Probablemente similar al
cido nucleico
12,3-13,0
>13

Acido teicoico y otro

polisacrido dister
Tirosina fenlica
Serina, treonina-alcohol,
sacarido-alcohol
(p.ej. Ribosil 2 en ARN)
Cistena
HexosaminaManNH2,GalNH,GlcNH2
Protena N- terminal
Lysina
Histidina (pirimidina)
Adenosina (purina)
Guanosina (purina)
Uridina (piramidina)
Timidina (pirimidina)
Adenosina (purina)
Guanosina (purina)
Guanosina (purina)
Una base de cido
nucleico -NH, o un
imidazol incluido en la
unin con la ribosa
Histidina
Arginina
Pptido

dad para acumular metales por procesos de bioadsorcin, ya que

poseen biopolmeros con grupos
funcionales con afinidad para unir
metales presentes en las aguas.
Dada la complejidad de la mayor
parte de los biopolmeros, en la
unin entre los iones metlicos y los
biopolmeros pueden intervenir
simultneamente diferentes tipos de
procesos fisicoqumicos: intercambio inico, formacin de complejos
de coordinacin, adsorcin fsica,
procesos de microprecipitacin,
reacciones redox. En cuanto concierne al intercambio de cationes
metlicos en disolucin acuosa, los
principales grupos ionizables de

156

10
7,3/7,7/7,85
7,5-8
10
4,11
3,45
1,6
9,17
9,8
3,6
9,2
2,3

6-7
12
13

unin catinica en los biopolmeros

son carboxilo, fosfato y sulfato
orgnicos. As, a modo de ejemplo,
el grupo carboxilo est distribuido
ampliamente en los biopolmeros y
se encuentra casi siempre como
constituyente de las cadenas laterales de las protenas, as como en los
cidos urnico, neuramnico, murmico y monosacridos sustituidos
relacionados de los polisacridos. El
intercambio de aniones metlicos
puede tener lugar por medio de una
amplia variedad de compuestos
orgnicos basados en nitrgeno. En
las protenas, los grupos amino, imidazol y guanidina son sitios comunes de carga positiva. Todos estos

grupos estn sujetos a posibles cambios post- traduccin por metilacin

in vivo y esto afectar a todas sus
caractersticas de carga. Existirn
centros de carga positiva en los cidos nucleicos en los grupos amino
de los anillos protonados de la
purina o de la pirimidina o en el
nitrgeno heterocclico tambin
protonado.
Los polisacridos considerados
como grupo son macromolculas
cidas o neutras con escasos grupos
funcionales bsicos, apareciendo
como aminoazcares no acetilados.
La quitina es un ejemplo notable en
la que una proporcin de los residuos de glucosamina estn no acetilados, lo que facilita la formacin de
quitosano deacetilado, con una alta
proporcin de centros de carga positiva protonable. Algunas de las
constantes de ionizacin representativas para algunos de estos grupos se
pueden observar en la Tabla I.
La formacin de complejos entre
grupos funcionales orgnicos de
biopolmeros adsorbentes y tomos
metlicos implica la presencia en
los restos orgnicos de uno o varios
tomos que tengan un par de electrones solitarios para donar. Entre
ellos, los ms probables sern tomos neutros trivalentes de nitrgeno y tomos de oxgeno y de azufre neutros y divalentes que existen
en una amplia diversidad de grupos
amino, imino y nitrgenos heterocclicos de las protenas y los cidos
nucleicos, en los grupos carbonilo y
en los oxgenos hidroxilados distribuidos en protenas, cidos nucleicos, polisacridos, polifenoles y
poliheterociclos y, finalmente, en el
azufre del grupo tiol y del grupo tioter de los aminocidos cistena y
metionina, respectivamente.
1.2. Biopolmeros de
residuos industriales para la
bioadsorcin de metales

Los biopolmeros naturales han

existido siempre; estas macromolculas producidas por el metabolismo de seres vivos datan de ms de
3.000 millones de aos.
El uso de estos polmeros para el
intercambio inico no es en absoluto

INGENIERIA QUIMICA

nuevo. Baste decir que aparece ya

una cita en el Exodo (15:23-25), en
la que se comenta cmo Moiss, tras
ser aconsejado por Jehov, arroj un
tronco de rbol seco a las aguas saladas del ro Marah convirtindolas en
aguas dulces. Durante mucho
tiempo a lo largo de la historia se us
la arena y la turba como material de
intercambio inico, pero no fue
hasta el ao 1912 cuando se pens
que esta capacidad para remover
iones se deba a los grupos cidos.

como catinico, dextranos y otros

polisacridos marinos se han
comercializado con una gran variedad de grupos de intercambio.

El estudio de los polmeros sintticos es muy reciente; tan slo

abarca el siglo XX. Aunque el
poliestireno se sintetiz en 1839, el
polietilnglicol en 1860 y el polimetilmetacrilato en 1880, la percepcin
generalizada de las macromolculas
no se dio hasta los aos 20 [3].

Existen varios estudios acerca de

la capacidad de adsorcin de los
alginatos o de otros componentes de
las algas [7]. De hecho, los alginatos
funcionan como una mezcla de resinas de intercambio inico, producindose en ellos procesos de intercambio aninico-catinico y de
adsorcin. En muchos casos, la
unin a ciertos metales es funcin
directa del pH, la presencia de ligandos competidores o de iones [8].
Aderhold y col. [9] estudiaron la
capacidad de eliminacin de metales como el cobre, plomo, nquel,
zinc y cadmio por algas fefitas
como Ecklonia mxima, Lessonia
flavicans y Durvillea potatorum.

De hecho, el primer material de

intercambio inico sinttico no se
produce hasta el ao 1903 por
Harm y Rumpler [4], pero el uso
de fragmentos de discos de gramfono rotos como intercambiadores
inicos, por Adams y Holmes [5],
no se produce hasta el ao 1935,
arrancando as la sntesis de intercambiadores sintticos propiamente dichos. Aunque la mayora
de los biopolmeros presentan propiedades de intercambio inico, lo
cierto es que no se han utilizado
mucho con este fin hasta que salieron al mercado los materiales
semisintticos para el intercambio
inico. Los biopolmeros son en la
actualidad muy usados en las separaciones bioqumicas, por ejemplo
para el fraccionamiento de protenas, polisacridos y cidos nucleicos. Y la mayora, por no decir
todos, de estos materiales de intercambio inico son polisacridos.
En 1931 Kullgren [6] fue posiblemente el primero en aplicar
para fines analticos las propiedades como intercambiador inico
de la celulosa modificada al comprobar que la celulosa tratada con
sulfito era capaz de eliminar los
iones de cobre que existieran en el
agua y que adems estos iones de
cobre podan recuperarse despus
mediante un tratamiento cido.
As, desde los aos 50, celulosas tanto de intercambio aninico

158

Mucho ms recientemente ha
comenzado a existir cierto inters
por la quitina y su derivado el quitosano como agentes de unin
inica [7] aplicables para gran
variedad de usos en la industria.
Alginatos

En estos experimentos, se constata la necesidad de encontrar una

relacin entre los porcentajes de
adsorcin para aguas sintticas (con
un solo metal) y aguas residuales
fuertemente contaminadas con
varios metales y, por tanto, susceptibles de sufrir fenmenos de competencia. Se han establecido unos
valores de pH en torno a 4 para la
adsorcin de la mayora de los iones
catinicos. Sin embargo, tambin se
ha visto que, para la eliminacin de
ciertos metales como el Au III, Ag I
y el Hg II, el pH es muy poco influyente [10].
Carvalho y col. [11] demuestran
que en algas los alginatos no son los
absolutos responsables de los procesos de adsorcin, tras haber estudiado comparativamente la capacidad de adsorcin de Cu, Cd y Zn por
clulas de Ascophyllum nodosum.
Celulosa y derivados
Shukla y Sakhardande [12] llevaron a cabo estudios sobre la
adsorcin de diferentes cationes

metlicos (Fe2+, Fe3+, Pb2+, Hg2+)

sobre materiales celulsicos tales
como fibras de algodn, pulpa de
bamb blanqueada, fibras de yute
y serrn, comprobndose niveles
de bioadsorcin de hasta el 96% en
algunos casos.
Otros materiales celulsicos
abundantes, baratos y de origen
agrcola, pueden eliminar cantidades considerables de iones metlicos de las disoluciones acuosas. En
este sentido, Eromosele y Otitolaye [13] utilizaron las cscaras de
las semillas de la planta silvestre
Butyrospermun Parkii, disponibles
en grandes cantidades como subproducto que se desechaba, comprobando su capacidad para bioadsorber iones hierro, cinc y plomo
de disoluciones acuosas. Asimismo, las pieles de las almendras,
subproducto de las industrias de
repelado de almendras, debido a su
elevado contenido en celulosa,
podran encontrar aplicacin en la
eliminacin de metales txicos de
aguas residuales industriales.
La celulosa es insoluble en la
mayora de los disolventes, pero
puede disolverse si se bloquean los
grupos hidroxilos como aductos de
sulfuro de carbono, el anlogo con
azufre del CO2. El grupo funcional
restante se denomina xantato, y
stos tambin han sido estudiados
como productos fcilmente obtenibles a partir de residuos industriales como el serrn, pulpa de maz,
paja y cartuchos de filtros de celulosa. En este sentido, Holland [14]
observ que la capacidad de eliminacin de metales variaba en funcin del nmero de grupos hidroxilo bloqueados, y que adems
existan complicaciones como el
fuerte olor producido por la descomposicin de los xantatos, la
gran cantidad de agua de lavado
que era necesario utilizar, etc. Concluy que exista una imposibilidad prctica de desarrollar estos
procesos a gran escala.
Pectinas
Las pectinas son heteropolisacridos que se encuentran como sustancias cementadoras en las paredes
celulares y en las capas intercelulares de todas las plantas terrestres,

INGENIERIA QUIMICA

entre ellas la remolacha azucarera.

Qumicamente estn formadas por
polmeros del cido galacturnico,
parcial o totalmente esterificado con
metanol. El polmero totalmente
desmetilado se denomina cido pctico y sus sales pectatos.
La pulpa de la remolacha azucarera es un residuo abundante y
barato de las industrias azucareras y
es capaz, gracias a su contenido en
pectinas y mediante procesos de
intercambio inico, adsorcin y
quelacin, de atrapar metales pesados de las aguas (Cu2+ eficacia
similar que para el Pb2+, ambos ms
eficaces que para el Cd2+ que es
similar al Zn2+, Ni2+ y al Ca2+)
[15]. Asimismo, la pectina extrada
de dicha pulpa, despus de procesos
de acilacin por simple hidrlisis
alcalina, acumula Cd2+ tan eficazmente como el alginato, eluyndose
con cloruro clcico 0,3 M [16].
Levaduras
Los residuos de levaduras como
subproductos de las industrias de
fermentacin (cerveza, antibiticos, etc.) presentan una afinidad
notable por los iones metlicos en
disolucin (Zn, Cd, Ni, Pb, Cr,
Ag.), afinidad que es funcin del
pH, y se pueden utilizar, por tanto,
en procesos de bioadsorcin para
la descontaminacin de aguas con
metales [17].
La utilizacin de biomasa fngica para los estudios de biorremediacin se basa en la capacidad de
las paredes de estos microorganismos (cuyos componentes ms significativos son los polisacridos
quitina y (1, 3) -D-glucano)
para bioadsorbedor los metales
pesados independientemente de los
procesos internos que estn sucediendo en la clula, es decir, que se
puede partir de biomasa muerta sin
alterar las propiedades y beneficiarse as de su mayor facilidad de
uso. Los procesos comunes son de
intercambio inico y la capacidad
de adsorcin puede ser manipulada
por una serie de mecanismos fsicos y qumicos que tienen lugar a
nivel de la superficie celular. Esta
biomasa puede ser utilizada en biorreactores de lecho empaquetado o
de flujo continuo [18].

160

Estudios llevados a cabo por

Guibal y col. [19] mediante espectroscopia IR han demostrado la
unin del catin uranilo a los grupos amino del quitosano de la
pared celular de varias biomasas
tpicas de algunas fermentaciones
industriales, como son Aspergillus
niger, Penicillium chrysogenum y
Mucor miehei. Esta unin del uranilo a los sitios amino les confiere
una estructura similar a la de los
grupos amida, por lo que la unin
del metal provoca cambios en las
intensidades relativas de las bandas amina o amida.
La complejacin del uranilo por
los ligandos amino estn gobernados por el pH. Asimismo, Tsezos y
Volesky [20] ya citaron algunas de
las propiedades de unin del uranio a Rhizopus arrhizus, sealando
que los procesos de adsorcin a las
paredes de quitina de dicho hongo
por parte del uranilo ocurren de
forma muy rpida, mientras que la
precipitacin de hidrxido de uranilo dentro de la estructura de la
pared celular se da en ms baja
proporcin. Asimismo sealaron
que se daban procesos de interferencia con otros iones como hierro
y zinc.
En el ao 1995, Simmons y col.
[21] realizaron estudios referentes a
las capacidades de unir metales de la
levadura de cerveza (Saccharomyces
cerevisiae), que ser uno de nuestros
materiales de estudio, y de Candida
albicans, obtenidas como residuos
industriales. En dicho estudio, ya se
encontraron notables diferencias
entre diferentes cepas de Saccharomyces (con diferentes estructuras
en su pared celular) y entre sta y
Candida en la eliminacin de metales (cobre, plata) de las aguas.
As, la adsorcin de Cu II est
fuertemente influida por el pH
[22]. Mediante el uso de electrodos
selectivos de iones, se observ la
liberacin de gran cantidad de
agentes complejantes de cobre
(posiblemente protenas y carbohidratos). En contraste con esto,
estos agentes no presentaron actividad complejante con la plata.
Incidiendo ms en Saccharomyces, Brady y col. [23] estudiaron

sus propiedades ms particularmente llegando a la conclusin de

que se trataba de un buen agente
bioadsorbente a pH entre 5-9. Simmons y col. [24] han estudiado la
respuesta de Saccharomyces frente
a la adsorcin de plata en funcin
de la edad de la biomasa. Llegaron
a la conclusin de que aquellas
cepas ms viejas presentaban valores ms bajos de eliminacin de
metales que las ms jvenes, y esto
debido fundamentalmente a un
descenso en el nmero de complejos de plata en el interior de la
clula. De esta manera, queda
claro que en estos procesos interviene no slo la pared externa del
hongo sino tambin su interior,
presentando agentes que aumentan
la eficacia del proceso de eliminacin. De ah tambin que se haya
observado una mayor eliminacin
usando biomasa formada por clulas completas que aquella formada
slo por pared celular.
2. Materiales y
mtodos
Materiales
Los reactivos cido sulfrico,
cido clorhdrico 35% (Panreac, Barcelona, Espaa), hidrxido sdico,
nitrato de uranilo hexahidratado
(UO2(NO3)2.6H2O) (Merck, Darmstadt, Alemania), arsenazo III, plomo
en polvo (Fluka Chemie Gmbh,
Buchs, Suiza), Tritn X100 (Sigma
Chem. Co.), Hypol 2002 (Grace Service Chemicals Gmbh, Heilderberg,
Alemania), agua de calidad ultrapura
Milli-Q (Millipore) se obtuvieron de
las mencionadas fuentes.
Varias muestras hmedas de
Saccharomyces cerevisiae fueron
donadas por el grupo Cruz Campo
S.A. (Sevilla). Estas levaduras
exhaustas se recogieron de los fermentadores industriales de la
empresa y se conservaron en
cmara frigorfica a 4C.
Aguas de minas
Las tomas de muestra de las
aguas de corta de las minas se llevaron a cabo en la primavera de 1999
transportndose y almacenndose a

Tratamiento de Aguas
Residuales
temperatura ambiente en bidones de
PVC previamente lavados con cido
clorhdrico 2N. Estas muestras de
agua procedan de las cortas de las
siguientes minas:
1) Mina Feli o Alabancos en el distrito minero de Barruecopardo-La Fregeneda (La Fregeneda, Salamanca),
con los minerales casiterita (Sn02), wolframita [(Fe,Mn)W04], arsenopirita
(FeAsS), pirita (FeS2), lepidolita
[K2Li3A14Si7021(OH,F)3].
2) Mina Merladet en el distrito
minero de Barruecopardo-La Fregeneda (Barruecopardo, Salamanca)
con los minerales scheelita (CaW04),
wolframita, arsenopirita y pirita.
3) Mina Terrubias en el distrito
minero de Morille Martinamor
(San Pedro de Rozados, Salamanca), con los minerales scheelita, wolframita y casiterita.
4) Mina Alegra en el distrito
minero de Morille Martinamor
(Morille, Salamanca), con los
minerales scheelita, wolframita,
casiterita.
5) Mina Dorinda en el distrito
minero del Granito de Ricobayo
(Villalcampo, Zamora), con el
mineral casiterita.
6) Mina Fe de ENUSA en el
distrito minero de Ciudad Rodrigo
(Saelices el chico, Salamanca), con
los minerales pechblenda [Complejo], pirita y marcasita (S2Fe).
Instrumentacin
Los instrumentos y equipos utilizados en este trabajo han sido: agitadores magnticos BUNSEN MC-8,
pHmetro CRISON micro 2001,
equipo de ultrasonidos Granzn
2200, centrfugas Centrolit "Selecta
P" y Centromix, pipetas automticas
Biohit Proline, filtros Millipore,
Millex-Gs Sterile 0,22 mm, picadora
Moulinex, balanzas Mettler Toledo
AB204 y Precisa 600C, horno de
secado WTB Binder, reactores de
vidrio y metacrilato de tanque y
columna, bombas peristlticas GILSON Miniplus 2 e Ismatec, conductmetro, salinmetro, turbidmetro y
termmetro (sonda multiparamtrica
WTW Profilab), equipo de ecotoxicidad GEM Biochemical Inc. Bacterial
Systems "BG-1", espectrofotmetro
UV-Visible Hitachi 150-20, equipo
de anlisis cuantitativo de metales y
otros elementos qumicos por ICP

Plasma (Servicio Central de Anlisis

de la Universidad de Salamanca),
espectrofotmetro de absorcin atmica (amablemente cedido por el
Dpto. de Qumica Analtica, Nutricin y Bromatologa de la Universidad de Salamanca).
Preparacin de la biomasa de
Saccharomyces cerevisiae
En los experimentos de bioadsorcin, esta biomasa se utiliz: a)
En forma libre, sin ninguna modificacin, es decir suspendindola
directamente en las aguas contaminadas con metales y despus separndolas por centrifugacin. b)
Inmovilizada fsicamente en el
polmero sinttico espuma reticulada de poliuretano.
Inmovilizacin de las levaduras
La inmovilizacin de las clulas
de Saccharomyces cerevisiae se llev
a cabo por atrapamiento fsico de las
mismas en espuma reticulada de
poliuretano, quedando el microorganismo fsicamente incluido dentro de
la matriz del polmero fuertemente
entrecruzado. Esta matriz se sintetiza
a partir de un poliisocianato hidrfilo
(Hypol 2002) suministrado por Grace
Service Chemicals Gmbh (Heidelberg, Alemania).
El procedimiento experimental
de inmovilizacin de clulas consisti en:
1) Disolver 1,00 g de levadura
liofilizada en 40,0 cm3 de disolucin de NaCl (8,5 g/1), determinando su contenido en protena
(mg protena/cm3) mediante el
mtodo de Lowry.
2) Mezclar lentamente, sin dejar
de agitar, los 40,0 cm3 de Saccharomyces con 20,0 g del prepolmero Hypol 2002.
3) Dejar reposar durante 10 min.
4) Cortar la espuma reticulada
de poliuretano con clulas atrapadas en pequeas lminas o cubos,
conservndose en la disolucin de
NaCl (8,5 g/1) a 4C.
Sntesis de la espuma reticulada de poliuretano
La sntesis de la espuma reticulada de poliuretano se llev a cabo

en las mismas condiciones y

siguiendo el mismo procedimiento experimental antes visto,
con la excepcin de que en este
caso la mezcla se hacia con 40,0
cm3 de NaCl (8,5 g/1) ms 20,0 g
de Hypol 2002. Esta matriz plstica, vaca del microorganismo,
servir de control en todos los
experimentos a fin de evaluar la
posible adsorcin de los metales
sobre la matriz polimrica de
poliuretano.
Anlisis fisicoqumico, qumico y radiolgico de las aguas
Los parmetros fisicoqumicos
que se determinaron (unos in situ y
otros en el laboratorio) en las
aguas de mina fueron la temperatura, el pH, la conductividad especfica, el oxgeno disuelto, la turbidez, la demanda qumica (DQO) y
demanda bioqumica de oxgeno
(DBO) siguiendo los mtodos
habituales (Standard Methods)
para el anlisis de aguas y aguas
residuales [3].
El anlisis qumico cualitativo
de las aguas se llev a cabo obteniendo de las muestras su residuo
seco por calentamiento en estufa a
98 C y efectuando, asimismo, una
precipitacin qumica selectiva,
variando progresivamente el pH.
Sobre los residuos secos y los precipitados obtenidos se proceda a
un anlisis qumico por Barrido
Energtico de Dispersin de Rayos
X (EDAX).
El anlisis qumico cuantitativo
de las muestras de aguas se llev a
cabo por Espectroscopia de Emisin de Inductividad Acoplada de
Plasma (ICP plasma) en el Servicio Central de Anlisis de la Universidad de Salamanca.
Con el fin de confirmar la posible radiactividad de algunas muestras de agua, por el Laboratorio de
Radiactividad Medioambiental de
la Universidad de Salamanca se
determinaron (con rplicas) las
radiactividades y de muestras
de aguas cidas de la corta 1 de la
mina Fe de ENUSA para extraccin de uranio. Se siguieron mtodos estndar [3], mejorados por
Morn y col. [25-27].

abril 03

161

INGENIERIA QUIMICA

Segn el test de bioluminiscencia

de Photobacterium phosphoreum
(test de Ames), se considera que una
muestra lquida es txica cuando se
produce una inhibicin de la luminiscencia de dichas bacterias superior a
un 20% (umbral de toxicidad) en el
anlisis llevado a cabo a 15C y en
15 min. La cuantificacin de la toxicidad de las muestras se realiza de
acuerdo al EC50 (concentracin
efectiva mxima: valor de dilucin
de la muestra para la cual se produce
una inhibicin del 50% de la luminiscencia) y segn la norma
ANFORT T-90-320.
Anlisis qumico del catin
UO22+
Se utiliz un sistema de inyeccin
en flujo (FIA) de dos canales con un
punto de confluencia. El portador era
una corriente de 3,6 M HCl, mientras
que por el canal del reactivo circulaba una corriente de 2.0.10-4 M
Arsenazo en 3,6 M HCl y en presencia de Tritn X-100 al 1%. El caudal
de las corrientes de portador y reactivo era de 2.0 cm3/min.
El anlisis del catin uranilo en las
aguas se realiza mediante un mtodo
rpido y sensible [28], que evita una
manipulacin para conseguir la
reduccin de U(VI) a U(IV) al insertar una minicolumna reductora de
plomo dentro del sistema FIA [29].
Las disoluciones patrn y las
muestras se introducan en el sistema
FIA mediante una vlvula de inyeccin (100 l) para pasar, a continuacin, esta disolucin de uranio (VI) a
travs de la columna reductora de
plomo insertada en el canal de
entrada de muestra (CR, 2 mm de dimetro interno y 5,5 cm de longitud),
producindose la reduccin a uranio
(IV), evitando as el contacto con el
oxgeno del aire. Posteriormente, el
bolo de muestra conflua con la
corriente de reactivo y en su paso por
el reactor helicoidal (1 m) se formaba
el complejo U(IV) - Arsenazo III
cuya absorbancia se registraba a la
longitud de onda de 665 nm. La
medida de la altura de los picos obtenidos para cada una de las disoluciones inyectadas est directamente rela-

162

Cu residual/mg/l

Anlisis ecotoxicolgico de las

aguas

Tiempo/min
Figura 1. Cintica de bioadsorcin del Cu de la disolucin acuosa cida en contacto con Saccharomyces sp. a distintas concentraciones iniciales del metal

cionada con la cantidad de muestra

inyectada y con la concentracin de
uranio en la misma.
Procedimiento experimental
para las cinticas y las isotermas
de bioadsorcin
Los experimentos cinticos de
bioadsorcin se llevaron a cabo a
20C mediante incubacin con la biomasa (25 g) en reactor de tanque agitado (120 r.p.m.) de 5 disoluciones
acuosas de 10 l de volumen cada una
y de concentraciones diferentes en un
nico metal (entre 114 y 0,6 mg/1).
La toma de muestras de agua (alcuotas de 10 cm3) se efectu a tiempos
prefijados entre 0 y 24 h, separando la
levadura por centrifugacin y estabilizando cada disolucin del metal
sobrenadante aadiendo otros 10 cm3
de 0,01 M H2SO4. Los experimentos
de equilibrio (isotermas de bioadsorcin) se efectuaron en lotes en presencia de una concentracin constante de biomasa. El equilibrio se
consider alcanzado a 20C en un
periodo de una hora de incubacin,
tras el cual se extraa una muestra de
la disolucin acuosa en la que medir
la concentracin del metal.
El anlisis de los metales en estas
disoluciones cidas sobrenadantes
se realizaba mediante espectrofotometra de absorcin atmica a la
llama, a excepcin hecha del Al que
se analizaba por espectrofotometra

UV-Visible, siguiendo el mtodo de

la eriocromocianina-R y realizndolo en continuo mediante anlisis
por inyeccin en flujo (FIA).
Ajuste estadstico de los datos
El ajuste de los datos cinticos y
de equilibrio de bioadsorcin a
diferentes ecuaciones y modelos se
ha llevado a cabo con el paquete de
software cientfico SIMFIT, cuyo
autor es el Prof. W.G. Bardsley de
la Universidad de Manchester
(Reino Unido).
3. Resultados y
discusin
3.1. Caracterizacin
fisicoqumica,
ecotoxicolgica y qumica
de las aguas de mina

Dado que el objetivo inicial del

estudio era identificar y caracterizar
aguas cidas de minas en la cuenca
del ro Duero y ms concretamente
en las provincias de Salamanca y
Zamora, tras la toma de muestra de
agua de cada una de las seis minas, se
comprob que las aguas de las cortas
de las minas Merladet y F eran las
nicas aguas cidas y ecotxicas con
las que contar para nuestros estudios
posteriores de biorremediacin de las
mismas (Tabla II). Con el propsito

INGENIERIA QUIMICA

de conocer la composicin qumica

de tales aguas cidas, se efectuaron
anlisis qumicos cuantitativos por
espectroscopia de emisin de inductividad acoplada de plasma (ICP),
con los resultados que se recogen en
la Tabla III.

Tabla II. Parmetros fisicoqumicos de las diferentes aguas de minas evaluadas

Aguas
de mina

T
C

pH

Merladet
F
Feli
Terrubias
Alegria
Dorinda

12,9
9,0
20,6
11,6
11,8
11,2

3.16
3.10
6.8
6.45
6.45
6.9

O2
Conductividad
soluble
mg/l
mS/cm
12,2
100

0.91
6.4

12,5

349

8,8

60,2

Turbidez
Acidez
Ecotox
u.nefelom. mgCaC03/l equitox/m3

0,91
15

96,0
100

Radioactividad
Bq/1

14.6
69.2
(-)
(-)
(-)
(-)

11,3

0
978 11
0
0
0
0

Como principales conclusiones

de este primer estudio cabe comentar que se demuestra una estrecha
correlacin entre el pH cido y la
concentracin de metales en las
aguas. As, las aguas de corta de pH
cidos (mina Merladet y F) son las

DQO y DBO5 fueron nulos para todas las aguas, es decir, no contaminacin orgnica.

Tabla III. Anlisis cuantitativo de los elementos qumicos componentes de las aguas de corta de las minas F y Merladet
(concentraciones expresadas en ppm)
AGUA

F
1501,8
Merladet 176,80

Mg

Ca

Na

Li

Si

Mn

Al

Fe

Zn

Cu

Ni

781,7
38,56

267,9
119,0

34,89
25,24

6,36
3,97

0,63
0,19

12,13
28,58

114,1
3,1

89,43
8,76

6,26
2,39

7,12
3,6

0,54
0,50

4,68
0,50

Concentracin de catin uranilo en las aguas de la mina F: 40 mg/l.

Tabla IV. Porcentajes mximos de metal bioadsorbido de disoluciones acuosas cidas de un nico metal en incubacin en discontinuo (batch) con Saccharomyces sp. y
a diferentes concentraciones iniciales del metal.
Cu

Mn

Ni

Zn

Al

Co
mg/l

Co
mg/l

Co
mg/l

Co
mg/l

Co
mg/l

84
17
7
2
0,8

53
45
47
70
42

111
19
5
2
0,6

43
61
48
62
61

114
15
6
1,5
0,6

40
44
48
43
36

107
24
6
2
0,8

76
71
66
64
58

84
17
7
1,3
0,7

100*
100*
30
100*
26

*Muestras contaminadas con Cladosporium sp.

Tabla V. Porcentajes mximos de metal bioadsorbido de las aguas cidas de la

mina Merladet (Barruecopardo, Salamanca) por Saccharomyces cerevisiae en suspensin libre
Cu

Mn

Zn

Co

Co

Co

94
55
30
7
1,8
0,9
0,5

12
5
16
39
47
77
>80

110
67
33
11
5
4
3

2,4
38
37
3,5
0,2
2,7
3,2

87
61
36
9
2,6
1,0
0,5

42
15,8
44
9
11
16
40

118
70
45
12
5,4
4
3,6

12
7
0
0
0
0

Co: concentraciones expresadas en p.p.m.

164

Ni

Co

que presentan mayores niveles de

metales y de sulfatos en disolucin
(datos no mostrados), siendo, adems, las nicas aguas de las minas
analizadas que dan positivo el test
de ecotoxicidad de Ames.
Los principales metales existentes en estas aguas son aluminio,
manganeso, hierro, nquel, cinc y
cobre, estando el agua cida de la
mina F significativamente ms
contaminada (2870 mg/l de carga
qumica inorgnica) que el agua de
la mina Merladet (411 mg/l carga
qumica) y poseyendo aqulla,
adems, una caracterstica diferenciadora, que es la presencia de
catin uranilo UO22+ (40 mg/1).
Adems, se puede observar que
las aguas examinadas muestran un
cierto grado de mineralizacin
(conductividad especfica ms bien
baja), escasa turbidez y elevado
grado de oxigenacin.
3.2. Bioadsorcin de
metales de aguas cidas
sintticas

Considerando la abundancia y el
bajo coste del residuo de levaduras
cerveceras, se eligi esta biomasa de

INGENIERIA QUIMICA

Saccharomyces cerevisiae como primer candidato con el que estudiar la

biorremediacin de estas aguas cidas de minas. Dado que Al, Cu, Mn,
Ni y Zn eran los metales mayoritarios, el primer experimento consisti
en estudiar la selectividad, la cintica
y el equilibrio de bioadsorcin de
cada uno de estos cinco metales
disueltos en agua destilada de pH
cido (3.3-4.5) por las levaduras
exhaustas de cerveza.
Los resultados de este estudio se
recogen en las figuras 1 (para el caso
del Cu a modo de ejemplo) y 2 y en
la Tabla IV y de ellos se pueden
deducir las siguientes conclusiones:

Se propone que en el proceso de

bioadsorcin participan mayoritariamente interacciones fisicoqumicas especficas (de tipo intercambio
inico, coordinacin, complejacin
de metales), si bien interacciones
ms fsicas y lbiles y menos espe-

166

Figura 2. Isotermas de bioadsorcin de los metales de la disolucin acuosa cida por la accin de Saccharomyces sp. en suspensin libre

cficas (efecto hidrofbico, polares,

van der Waals) entre el catin metlico y los distintos grupos funcionales sobre la superficie del microorganismo pueden tener un menor
grado de participacin.
4) Durante los experimentos de
bioadsorcin de los metales disueltos por las levaduras, el pH de las
aguas aumentaba de manera espontnea desde sus valores iniciales (pH
3.3-4.5) hasta alcanzar valores en
torno a 5.5-6.0 (datos no mostrados). Es decir, el proceso de bioadsorcin del metal sobre las levaduras neutralizaba parcialmente dichas
disoluciones acuosas cidas.

De la curva de valoracin (pH

frente a NaOH aadido) de la biomasa disuelta en agua (datos no
mostrados), se ha deducido la existencia en ella de al menos cuatro
grupos qumicos cido-base, con
pK aparentes 3,7, 4,5, 6,8 y 9,5.
Conviene citar como de especial inters el hecho de que al realizar el experimento de bioadsorcin del aluminio sobre las levaduras, los sobrenadantes de algunas
muestras alcuotas separadas del
biorreactor y una vez filtradas y
aciduladas con 0,01 M H2SO4 se
contaminaron con un microorganismo, que posteriormente se iden-

Cu elim/ mmol/g

1) En cuanto a la selectividad de
la biomasa por los distintos metales y su capacidad de bioadsorcin
(Tabla IV), se comprueba que los
mayores porcentajes de eliminacin corresponden al Zn (76%)
seguido de Cu (70%), Mn (62%),
Ni (48%) y Al (30%).
2) Las cinticas de eliminacin
de cada metal disuelto en el agua
sinttica por bioadsorcin sobre
Saccharomyces sp. son de primer
orden respecto de la concentracin
del metal ([Metal]disolucin = Ae-kt +
C), alcanzndose el equilibrio en
los primeros 15-20 minutos, lo que
apunta a un proceso rpido de
adsorcin superficial del metal
sobre la biomasa.
Para el caso de la bioadsorcin
del Cu, k = 0,139 min-1, es decir
que el 50% de bioadsorcin del
metal sobre la levadura se consigue a los 5 min de proceso (t1/2).
3) Las isotermas de bioadsorcin de
los metales sobre la biomasa (Fig. 2)
parecen ajustarse al comportamiento de
Langmuir [Metaladsorbido/masa adsorb e n t e = K b [ M e t a l ] equilibrio/
(1+K[Metal]equilibrio)]. Las constantes de
afinidad para la unin metal-bioadsorbente son: K=7,29 (Zn), 3,65 (Cu), 3,31
(Mn) y 3,20 (Ni) dm3/mmol, y las constantes de capacidad de unin: b = 0,076
(Zn), 0,069 (Cu), 0,060 (Mn) y 0,059
(Ni) mmol/g.

Cu residual/ mM
Figura 3. Isoterma de adsorcin tipo Langmuir del Cu del agua cida de la mina Merladet por Saccharomyces cerevisiae en suspensin libre

Tratamiento de Aguas
Residuales

Tabla VI. Evolucin de la ecotoxicidad de las aguas cidas por incubacin con la
matriz soporte vaca y cargada de clulas de Saccharomyces cerevisiae.

Muestra

Poliuretano ( levadura)

EC 50%
Equitox/m3

200 cm3 agua cida

200 cm3 agua cida
200 cm3 lixiviado
200 cm3 lixiviado

11,5 g (- Saccharomyces)
13,7 g (+ Saccharomyces)
11,3 g (- Saccharomyces)
13,6 g (+ Saccharomyces)

14,63
8,20
-

tific como el hongo filamentoso

Cladosporium sp. En consecuencia, los correspondientes resultados de eliminacin de Al por Saccharomyces cerevisiae fueron artefactos pero sorprendentes, ya que
Cladosporium sp. elimin porcentajes del orden del 70% del Al presente en las aguas. Este hallazgo
novedoso (no descrito en bibliografa) podra servir de base para
futuros estudios de biorremediacin de aguas cidas con metales
pesados por la accin de este
microorganismo que, por otra
parte, creci espontnea y notablemente en aguas de pH 2.0-3.5.
3.3. Bioadsorcin de
metales de aguas cidas de
mina

Conocida la selectividad, cintica

y capacidad de bioadsorcin de cada
metal disuelto en agua cida sinttica
por la accin de Saccharomyces
cerevisiae, en el siguiente estudio se
pretenda comprobar dichos parmetros para los procesos de bioadsorcin de los metales que contaminan
las aguas cidas reales de la mina
Merladet (Barruecopardo, Salamanca) por la accin de las levaduras
cerveceras. Los experimentos son
anlogos a los realizados en el estudio anterior manteniendo las mismas
condiciones y el mismo tipo de anlisis de las muestras.
Dada la baja contaminacin metalognica de las aguas cidas de la
corta principal de la mina Merladet
(3,6 mg./l Zn, 3,1 mg/1 Mn, 0,5 mg/1
Cu, 0,5 mg/1 Ni segn Tabla III), las
muestras de agua fueron dopadas
cada una por separado con cada metal
a estudiar su bioadsorcin hasta conseguir siete concentraciones diferen-

tes entre 118 y 0,5 mg/1. Aunque el

anlisis y seguimiento se hace de un
solo metal cada vez, en el agua de
corta estn presentes los otros metales, adems de otras especies qumicas que pueden interferir o competir
con el propio proceso de bioadsorcin por levadura (Tabla III).
Los resultados de este estudio se
recogen en la figura 3 (para el caso
del Cu a modo ilustrativo) y en la
Tabla V, y de ellos se pueden deducir las siguientes conclusiones:
1) En cuanto a la selectividad y
capacidad de bioadsorcin de los
distintos metales por la biomasa,
se comprueba que los mayores
porcentajes de eliminacin corresponden al Cu (80% eliminacin, es
decir 0,19 mgCu/g bioadsorbente)
seguido de Ni (25 %, 0,24 mgNi/g
bioadsorbente) y Mn (3%, 0,026
mgMn/g bioadsorbente).
2) La cintica de bioadsorcin de
los metales disueltos en el agua
cida de mina por Saccharomyces
sp. es rpida, siendo de primer orden
respecto de la concentracin del
metal ([Metal]disolucin = Ae-kt + C) y
alcanzndose el equilibrio en los
primeros 10-15 minutos (datos no
mostrados), lo que apunta a un proceso rpido de adsorcin superficial
del metal sobre la biomasa.
3) Las isotermas de bioadsorcin
del Cu (Fig. 3) y los dems metales
(datos no mostrados) sobre la biomasa parecen ajustarse al comportamiento de Langmuir [Metaladsorbido/masa adsorbente=Kb[Metal]equilibrio/(1+ K[Metal]equilibrio)]. La constante de afinidad para la unin Cubioadsorbente es K = 2,46 dm3/mmol
y la constante de capacidad de unin
b = 0,1 mmol/g.
Al igual que con aguas cidas sin-

tticas, se propone que en el proceso

de bioadsorcin participan mayoritariamente interacciones fisicoqumicas especficas (de tipo intercambio
inico, coordinacin, complejacin
de metales), si bien interacciones
ms fsicas y lbiles y menos especficas (efecto hidrofbico, polares,
van der Waals) entre el catin metlico y los distintos grupos funcionales sobre la superficie del microorganismo puedan tener un menor grado
de participacin.
4) Durante los experimentos de
incubacin de las aguas cidas de
corta con las levaduras, el pH de
las aguas aumenta de manera
espontnea desde sus valores iniciales (pH 3.3) hasta alcanzar
valores en torno a 4.0-4.6 (datos
no mostrados). Es decir, el proceso de bioadsorcin del metal
sobre las levaduras neutraliza parcialmente dichas aguas cidas de
mina.
5) Comparando los procesos de
bioadsorcin de metales por Saccharomyces sp en aguas sintticas
y en aguas de la mina Merladet
(aunque dopadas) se observan
valores muy similares en cuanto a
la eliminacin de los metales Cu y
Ni, siendo, sin embargo, sensiblemente menor la eficacia del proceso con aguas reales para el caso
del Mn y nula para los dems
metales. Se postula una interferencia antagonista sobre la bioadsorcin de un metal por la presencia simultnea de otros metales.
3.4. Eliminacin de la
ecotoxicidad del agua de
mina por levaduras
inmovilizadas

Los experimentos se llevaron a

cabo en reactor discontinuo de tanque agitado a 120 r.p.m. y a temperatura de 20C con el agua cida de
la mina Merladet (Barruecopardo,
Salamanca) (0,06 mg/1 Al, 0,06
mg/1 Ni, 0,56 mg/1 Cu, 1,91 mg/1
Zn, 2,91 mg/1 Mn) y con un lixiviado de lodo de la mina (0,04
mg/1 Cu, 0,20 mg/1 Zn, 0,19 mg/1
Mn), tratados segn el mtodo oficial B.O.E. 10/ 11/89 de anlisis de
ecotoxicidad. Los resultados del
estudio de la evolucin de la ecotoxicidad del agua y del lixiviado

abril 03

167

INGENIERIA QUIMICA

de la mina de Barruecopardo tras

su incubacin con el soporte de
poliuretano sin y con clulas de
Saccharomyces se recogen en la
Tabla VI. Como consecuencia de
este estudio se pudo extraer la
conclusin de que dicha agua
cida ecotxica por el hecho de
incubarla con levaduras cerveceras atrapadas en espuma de poliuretano dejaba de serlo.
4. Conclusiones
1. Tras evaluar la composicin
qumica y los estados fisicoqumico y ecolgico de las aguas
superficiales de las cortas de una
serie de minas a cielo abierto de las
provincias de Salamanca y
Zamora, se ha podido concluir que
nicamente son aguas cidas contaminadas con metales pesados
txicos las aguas de las minas F
(Saelices el Chico, Salamanca)
(con U, Al, Cu, Mn, etc.) y Merladet (Barruecopardo, Salamanca)
(con Al, Mn, Zn, Cu).
2. Tras investigar la cintica y
el equilibrio de eliminacin de
metales de las aguas cidas de la
mina Merladet mediante procesos
de bioadsorcin sobre residuos
industriales de levaduras de cerveza (Saccharomyces cerevisiae),
se puede proponer, en principio, a
estos residuos, abundantes y
baratos, como agentes activos eficaces para la biorremediacin de
este tipo de aguas contaminadas
con metales. Adems, estos biorresiduos se han demostrado eficaces a la hora de rebajar o anular
los niveles de ecotoxicidad y
radioactividad de estas aguas cidas de mina.
5. Bibliografa
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Agradecimientos
A Iberdrola Instituto Tecnolgico y al Centro
de Investigacin y Desarrollo Tecnolgico del
Agua (CIDTA) de la Universidad de Salamanca
por la concesin de una beca. Al Director y personal del CIDTA por su eficaz colaboracin, asesoramiento y cesin temporal de sus equipos e
instalaciones para el desarrollo de algunas de las
tareas del programa de trabajo. Al Departamento
de Qumica Analtica, Nutricin y Bromatologa
de la Universidad de Salamanca por la cesin de
sus espectrofotmetros de Absorcin Atmica. A
las empresas donantes de las aguas cidas y de los
residuos biolgicos utilizados en este proyecto:
Empresa Nacional del Uranio S.A. (ENUSA)
(Saelices el Chico, Salamanca), Merladet S.A.
(Barruecopardo, Salamanca), Grupo Cruz Campo
S.A. (Sevilla), por su excelente colaboracin. Al
Prof. William G. Bardsley por la cesin gratuita
de la ltima versin del paquete SIMFIT.