Electroforesis

/3C1
t.
%. XOCHIMII.CO SERVICIOS DE INFIIRMEI

ARCHIVO HISTORIQ
UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA

UNIDAD XOCHIMILCO
DIVISIN DE CIENCIAS BIOLGICAS Y DE LA SALUD
DEPARTAMENTO DE SISTEMAS BIOLGICOS
QUMICO FARMACUTICO BIOLOGO
INFORME DE ACTIVIDADES DEL SERVICIO SOCIAL
"Diseo y validacin de un mtodo analtico para la cuantificacin de
cido valprico en materia prima por electroforesis capilar"
PERTENECE AL PROYECTO GENRICO:
"Evaluacin de productos relacionados con la salud".
Alumno: Agustn Flores Luna
Matrcula: 99345658
Asesores: M. en C. Ma. Luisa Margarita Vzquez Ramrez

M. en C. Edilberto Prez Montoya
LUGAR DE REALIZACIN: Departamento de Biofarmacia en la Escuela Nacional de
Ciencias Biolgicas del Instituto Politcnico Nacional.
FECHA DE INICIO: Febrero, 2003
FECHA DE TRMINO: Octubre, 2003
Febrero, 2005
INDICE
INTRODUCCIN
MARCO TERICO
1. Caractersticas generales del cido valproico
II. Caractersticas generales de la electroforesis capilar
11
III. Validacin de mtodos analticos en electroforesis capilar
29
OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECFICOS
32
DESARROLLO EXPERIMENTAL
33
RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS
37
OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS
47
CONCLUSIONES
47
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
49
RESUMEN
50
ANEXOS
58
INTRODUCCIN
El cido vaiproico (Ay), as como sus sales de sodio y magnesio han sido
reconocidos como uno de los antiepilpticos de primer nivel, de amplio espectro
activos frente a muy diversos tipos de crisis epilpticas (generalizadas convulsivas
y no convulsivas).
El AV es uno de los antiepilpticos ms utilizados en todo el mundo,

principalmente en monoterapia, y a diferencia de otros frmacos est indicado en
todos los tipos de epilepsia como medicamento de primera lnea. (1)
Actualmente el mtodo analtico para la valoracin del AV como materia prima

est reportado en la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (2) y en la
farmacopea Europea por medio de una titulacin con hidrxido de tetrabutil
amonio e hidrxido de sodio respectivamente, las cuales son metodologas de baja
especificidad y sensibilidad, as como baja precisin. En la farmacopea de los
Estados Unidos de Amrica (USP) se utiliza una metodologa analtica
desarrollada por cromatografa de gases, en la cual se emplean temperaturas
elevadas, presiones de gas elevada y en donde se utilizan disolventes orgnicos
para la preparacin de la muestra, a diferencia de la metodologa por electroforesis
capilar, en la que se trabaja a temperatura ambiente, con agua como disolvente y
en ocasiones bajas concentraciones de disolventes orgnicos, y sales inorgnicas;
obteniendo electroferogramas de alta sensibilidad y eficiencia a tiempos de
migracin relativamente cortos y con bajos riesgos a la seguridad del analista.
Como en cualquier mtodo analtico, es necesario tener bajo control las variables
crticas, para obtener un mtodo confiable, lo cual slo se demuestra con la
validacin del mismo (4).
3
MARCO TERICO
1.- CARACTERSTICAS GENERALES DEL CIDO VALPRICO
1.0 Descripcin
El AV es un lquido ligeramente viscoso e incoloro y tiene un olor
caracterstico (5).
1.1 Nombres qumicos

El AV es conocido como cido 2-propilpentanico, cido n-diropiI actico,
cido 2-propil valrico y DPA
1.2 Peso molecular, frmula desarrollada y condensada.

P.M.: 144.21 g/mo!
H3C
COOH
H
H3C
C8H1602
2.0 Propiedades fisicoqumicas
2.1 Constante de disociacin

En experimentos realizados (5), se demostr que el valor de pKa del
AV es de 4.6.
2.2 Solubilidad
Los siguientes valores de solubilidad han sido determinados para AV

a temperatura ambiente:

N-Heptano
>10% y/y
Cloroformo
>10% y/y
Acetato de etilo
>10% y/y
Metanol
>10% y/y
Etanol 100%
>10%v/v
Acetona
>10% y/y
Dietil ter
>10%v/v
Benceno
>10% y/y
NaOH aq. 1 N
>10% y/y
HcI aq. 0.1 N
1.15 mg/mL
Agua
1.27 mg/mL
Fil
2.3 Espectro UI! e IR
El Espectro UY que se muestra a continuacin es a partir de una solucin de

AV al 0.1% en metano!. El barrido se realiz de 400 a 205 nm y se encontr la
longitud de onda mxima a los 213 nm (E = 86). El experimento se llev a cabo en
im espectrofotmetro Beckman Acta V.
ESPECTRO UVNIS CIDO VALPROICO

04
u.
1..
1(
di.
al
Di
01
a
210
100
WVENQnI(n4
El espectro infrarrojo fue medido usando el mtodo capilar.
ESPECTRO INFRARROJO CIDO VALPROICO
4000
3500
1*
J5:

I:
IDO: 7w
2.4 ndice de refraccin
El AV tiene un ndice de refraccin de ND245: 1.425
2.5 Gravedad especfica
La gravedad especfica del AV a 25 oc tiene un valor de 0.904 g/mL
3.0 Estabilidad
El AV es un compuesto muy estable. No se ha observado degradacin por la
accin del calor, la luz, soluciones alcalinas y cidas fuertes. (5)
4.0 Usos
Es un cido graso, con un perfil nico de accin anticonvulsivante tanto

desde el punto de vista experimental como clnico. En dosis no txicas es eficaz
contra convulsiones tnicas inducidas por electroshock o por estricnina, as como
contra convulsiones de umbral mnimo inducidas por petilenetetrazol, bicuculina o
picrotoxina. La eficacia clnica confirma este amplio espectro de actividad
anticonvulsivante. Es uno de los frmacos de eleccin en el manejo de las
convulsiones con ausencias simples. De manera similar, responden bien las
convulsiones con ausencias atpicas y las epilepsias mioclnicas y como no ha
habido una droga completamente satisfactoria para estos tipos de epilepsia de la
infancia, sta constituye un importante avance. Tambin es eficaz en convulsiones
tnico-clnicas generalizadas. En algunos pacientes refractarios, ha sido utilizada
eficazmente para tratar las convulsiones parciales con sintomatologa compleja
(temporales o psicomotoras) o convulsiones mioclnicas y acinticas. A semejanza
de la carbamazepina, el valproato ha sido empleado con algn xito en el manejo
de trastornos bipolares y en el tratamiento de la agresin o la violencia. (6)
5.0 Farmacocintica y metabolismo del frmaco
El AV es un frmaco que se une a las protenas plasmticas, el volumen de

distribucin oscila entre 0.1 a 0.5 L/kg (media 0.2 L/kg) y la vida media vara
desde 6 hasta 17 h en los adultos y de 4 a 14 h en nios. El nivel plasmtico
teraputico oscila entre 50 y 100sg/mL, los niveles superiores a lOOj.tg/mL son
potencialmente txicos. En sangre y en orina humanas, se han identificado ms de
diez metabolitos. Slo del 0.5 al 20% se elimina sin cambios por la orina. De los
diferentes metabolitos, slo el cido 2-propil-2 pentanico (2-en-VPA) se acumula
en el cerebro. El matabolito 2-en-VPA es aproximadamente 1.3 veces ms potente

que la droga original, y puede contribuir significativamente al efecto
anticonvulsivante del vaiproato administrado crnicamente. (7)
El mecanismo preciso de su accin anticonvulsivante es an desconocido. Se ha

postulado que inhibe la GABA transminasa y, de ese modo, aumenta la
concentracin del GABA cerebral. Sin embargo, otros cidos grasos de cadena
lineal saturados (propinico, butrico y pentanico), que carecen de propiedades
anticonvulsivantes, son inhibidores ms potentes de la GABA transaminasa que el
AV. Tambin se ha comunicado una fuerte correlacin entre la potencia
anticonvulsivante del valproato y de otros cidos grasos de cadena ramificada y la
capacidad de reducir la concentracin de aspartato cerebral. (7)
El AV puede disminuir la unin a protenas sricas o bloquear el metabolismo

heptico del fenobarbital. La administracin del frmaco a pacientes en el estado
de equilibrio mientras estn medicados con fenobarbital (o primidorna, que se
metaboliza a fenobarbital) puede aumentar los niveles sricos de fenobarbital del
35 al 200% y causar somnolencia excesiva. Evidencias actuales indican que esto se
debe a una inmediata disminucin en la velocidad de eliminacin del fenobarbital.
Esta droga interacta impredeciblemente con la fenitona, se la ha asociado no slo
con niveles sricos disminuidos de fenitona y aumento de las frecuencias de las
convulsiones, sino tambin con niveles aumenados de fenitona libre y toxicidad
por fenitomna. Se ha hallado que el valproato aumenta significativamente la
depuracin del felbamato y, por lo tanto, reduce su concentracin plasmtica. A la
inversa, el fenobarbital, la primidona, la fenitona y otros agentes pueden inducir
enzimas que metabolizan este frmaco, y reducen su vida media. (7)
Por el contrario, el felbamato aumenta la concentracin plsmtica del valproato,
cuando se administran simultneamente.
9
Se han comunicado ms de 40 casos de insuficiencia heptica fatal en pacientes que

recibieron este tratamiento. El riesgo de insuficiencia heptica es extremadamente
menor en pacientes con monoterapia (ca 1/37.000) que en los que reciben
politerapia (1/6500). Por otra parte, la incidencia es mucho mayor en nios
menores de 2 aos y en politerapia (monoterapia 1.42/10.000 ; politerapia, ca
1/500).
Los efectos colaterales ms frecuente en pacientes que reciben monoterapia

(valproato) son aumento de peso (11%), sedacin (10%), nuseas (6%), cefalea (3%),
temblor (3%) , cada del cabello (1%) y mareos (1%). Otros efectos adversos poco
frecuentes son erupciones cutneas, enuresis, insomnio, ansiedad, fatiga y
parestesias. Se han comunicado efectos teratognicos en animales. Sin embargo, su
uso para mujeres con epilepsia durante el primer trimestre (3 meses) del embarazo
comunicado por el Centro para Control de las Enfermedades (Centers for Diseases
Control, USPHS) parece estar asociado con un mayor riesgo (1.2%) de espina bfida
en sus hijos.
Aunque la mayora de las mujeres con epilepsia que toman esta medicacin tienen
hijos no afectados, se recomienda realizar las pruebas prenatales para evaluar los
defectos de la mdula espinal. (7)
6.0 Dosis
Adulto y peditrico, inicialmente, 15 mg/kg/da; aumentar a intervalos de 1
semana de 5 a 10 mg/kg/da; dosis mxima diaria 30 mg/kg (algunos pacientes
pueden necesitar hasta 60 mg/kg/da). Si la dosis diaria excede los 250 mg debe
administrarse fraccionada. (6)
1101
7.0 FORMA FARMACUTICA

Cpsulas: 250 mg; jarabe: 250 mg en 5 mL.
II.- CARACTERSTICAS GENERALES DE LA ELECTROFORTESIS

CAPILAR (EC)
1.0 Definicin de electroforesis

La electroforesis ha sido definida como el movimiento o desplazamiento
diferencial de especies cargadas (iones), sustancias neutras o migracin pasiva, por
atraccin o repulsin en un campo elctrico. (3)
Las tcnicas que ms se han desarrollado estn en la actualidad aplicadas al campo

de las protenas y productos de la biologa molecular, como son los geles de
agarosa y proliacrilamida en placas o pelculas de distinto espesor verticales u
horizontales (figl).
Gel hozoxilal
Gel verdcal
Fig 1. Electroforesis en placa
1.1 Caractersticas de la EC
El empleo de capilares para la separacin de sustancias neutras o iones
cargados elctricamente, apareci en 1967 en un experimento desarrollado por
Hjerten empleando capilares milimtricos, los que eran cortados a travs de su
seccin longitudinal para evitar los efectos de la conveccin. Virtanen y Mikkers en
11
1.
1979
desarrollaron las separaciones empleando electroforesis en capilares de 200
jim de dimetro interno en vidrio y tefln respectivamente.

En 1980, Jorgenson y Lukacs empleando tcnicas avanzadas en la obtencin de
capilares de slica fundida utilizan dimetros de
75
pm y Jorgenson clarifica
tericamente las relaciones entre los parmetros operacionales y las cualidades de

la separacin reveland el elevado potencial analtico de esta tcnica.
Los capilares de 75 a 100 cm de largo y con dimetros internos de
50-70-100
tm y
de 300 a 400 im de dimetro externo son los que permiten una capacidad elevada
de resolucin. (3)
N>200.000 platos /m.
La fuerza electroosmtica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie

interna de capilar da como resultado una corriente plana del frente de liquido que
contrasta con el frente parablico de la cromatografa liquida de alta resolucin
(HPLC) (fig. 2).
-ti
Frenteplanar -
Frente pwabkco - HPIC
rio. a comparacin entre Ec y HF'LC
La EC separa iones de acuerdo a la movilidad del electrolito en lugar de una

interaccin con la fase estacionaria, por lo que se detectan primero los cationes
pequeos mono y divalentes, posteriormente los cationes de mayor peso
12
molecular y molculas neutras y por ltimo los aniones mayor y menor peso
molecular.(8)
La ventaja de esta tcnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se

cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una
ventana a travs de ella que permite el paso de la luz U y de tal manera que la
deteccin es en lnea.
Con esta tcnica descrita es posible separar cationes, aniones, protenas,

macromolculas y sustancias no cargadas en forma simultnea. (3)
2.0 Aplicaciones
El explosivo avance de la electroforesis capilar se ha extendido al rea
biomdica, en el campo de las protenas, ADN, anlisis de lquidos de perfusin,
monitoreo de frmacos, marcadores genticos tumorales y neurobioqumicos,
frmacos xenobiticos, de abuso, y pericias forenses.
En el rea biofarmacutica, para el control de calidad de productos farmacuticos

y biotecnolgicos, quimioterpicos y de estructura quiral.
En el rea de alimentos, se le aplica el fraccionamiento y cuantificacin de
aminocidos, hidratos de carbono, cidos orgnicos, aditivos y contaminantes.
En el rea de control ambiental, permite la identificacin de contaminantes y sus
metablitos, pesticidas, metales pesados e hidrocarburos.
13
Como todo desarrollo de un rea analtica nueva, la incorporacin de tcnicas

acopladas como la espectroscopa de masa, fluorescencia inducida por lser y otras
variantes permiten augurar un promisorio futuro. (3)
3.0 Desarrollos tecnolgicos que contribuyeron ala EC

Seis desarrollos tecnolgicos han concurrido para el desarrollo comercial de la
instrumentacin, que constituye en la actualidad la EC.
1. Los capilares de slica fundido revolucionaron la cromatografa de gases (CC) y

han producido la cmara de separacin de la EC.
2. La disponibilidad de fuentes de poder de alto voltaje (20 a 30 kV), altamente
estabiIizads y automatizadas para el mantenimiento estable de la tensin y
corriente.
3. Los detectores desarrollados para HFLC, de absorbancia de alta sensibilidad
pudieron ser aplicados con modificaciones pticas al tubo capilar.
4. Los desarrollos obtenidos por la electroforesis en geles de tamizado
molecular como la poliacrilamida, agarosa y otros, en la separacin de
protenas.
5. El desarrollo de lo anfolitos, obtenidos por copulacin de cido acrlico y las
polietilen poliaminas que han permitido generar ambientes de pH continuos y
estables, donde se logra separar protenas de puntos isoelctricos (pI) muy
prximos.
6. El anlisis computacional aplicado a la resolucin de productos obtenidos por
separacin por HPLC o EC que pueden ser estudiados, espectralmente a travs
del software para tal fin.
4.0 Ventajas
14
Las separaciones se realizan empleando mecanismos tradicionales, en un

mbito capilar, que adems ofrece ms facilidad y velocidad que el HPLC.
Mientras elimina los problemas de los disolventes del HPLC, la toxicidad de los
mismos y su costo, pues emplea soluciones acuosas en su gran mayora con muy
baja concentracin inica, incorpora los principios de la automatizacin a travs de
un hardware creado especialmente con un software altamente optimizado.
Las separaciones se obtienen en pocos minutos, en lnea con la corrida,

obtenindose simultneamente resultados cuantitativos. En oposicin a los
procedimientos tradicionales que utilizan horas o das.
La EC ofrece mayores ventajas para la separacin de iones que la cromatografa

inica (IC), ya que la separacin es ms rpida y con mayor resolucin, adems la
columna requerida para la separacin por IC es ms cara en comparacin con el
capilar de silica fundida. (10)
5.0 Fundamento
La separacin por electroforesis esta basada en la diferencia de velocidad de
solutos en un campo elctrico. La velocidad de un ion esta dada por
VteE
Donde:
Y: Velocidad jnica
le: movilidad electrofortica
E: Campo elctrico
1k
Existe una relacin entre el voltaje aplicado y la longitud del capilar en volts /cm,
la movilidad de un ion es una constante, la que puede ser determinada por el
coeficiente friccional a travs de un medio elegido
Fuerza Elctrica (F[)
Ftierza fricional
La fuerza elctrica est representada en la siguiente ecuacin
FE = qE
Y para un ln esfrico la fuerza friccional esta determinada por la ecuacin
FF-6lcflrv
Donde:
q:Carga jnica
ip Viscosidad de la solucin
r:Radio inico
y: Velocidad del in
En el estado estacionario, las fuerzas son iguales y opuestas:
qE = 6 It 11 r y
qE = 6 it ri r y , E
k= qW6iti
= q 6 it t r
Con lo expuesto queda en evidencia que especies altamente cargadas tienen
movilidades elevadas.
16
La movilidad electrofortica se le encuentra usualmente en las tablas de constantes

fsicas.(3)
6.0 Principio fisicoqumico

Las molculas son separadas por las fuerzas del campo elctrico aplicado y
las muestras separadas en un capilar son monitoreadas por el detector (fig 3).
-'
H k.
-
t 2..
1+)
itYl
FIG.3 Representacin del fennienode polarizacin del
capilar, desplazamiento jnico y deteccin
Los picos del electroferograma son similares a los de HPLC, y se generan como
consecuencia de la concentracin de los analitos y de su velocidad de migracin
(fig 3 bis).
Eloctrotorear
12 ECWB -3 1.2 DIMM
Las muestras son introducidas en el capilar de dos modos, migracin hidrosttica y

por electromigracin. (8)
17
Durante la inyeccin electrofortica (electromigracin), el capilar est sumergido

en la muestra y se aplica el alto voltaje.
Los iones de la muestra migran dentro del capilar en relacin a sus movilidades
electroforticas.
Si la fuerza inica de la solucin muestra es ms baja que el buffer electrofortico,

los cambios en el campo elctrico de la interfase muestra-buffer producen un efecto
de enfoque o stacking, en el cual los iones del analito aparecen concentradas
alrededor de la zona de la interfase. Este proceso de delineamiento de la zona,
puede producir incrementos en la deteccin de la sensibilidad y poder de
resolucin (fig 4).
uv

++ + +
t;t -t+.
Mtenol
uy
11
+

+ + +
Oesgnns del
FIG.4. ENFOQUE DE LA MUESTRA EN LA MIGRACIN ELECTROFORTICA
ita
El efecto de enfoque puede producir cambios sustanciales en la inyeccin

electrofortica (fig5).
C.p4ts Is *
\
IL
Dncttz LJV
Funtt e poder
MtOVMI$
FIG.5 Condiciones experimentales.
7.0 Flujo electrosmtico (FEO)

El FEO es el componente efector ms importante en la EC, surge con la
consecuencia de aplicar un campo elctrico que genera una doble capa elctrica
entre la solucin y la pared del capilar.
En condiciones acuosas, la fase slida posee un exceso de cargas negativas, como
resultado de los procesos fsicoqumicos, la ionizacin de la superficie (que es un
equilibrio cido-base) y por otra parte la adsorcin de especies jnicas sobre la
superficie del capilar. (10)
Estos procesos ocurren en el capilar al paso de la corriente elctrica y la FEO se
encuentra altamente controlada por los numerosos grupos silanoles (SiOH) que
tambin pueden existir como Si-O -
El
til E
mili
Ej
ji
11
ti L
E'
El
*
Los cationes en la mayora de los casos mantienen el balance de cargas; ese
potencial se llama potencial zeta. Cuando se aplica el voltaje a travs del capilar,
los cationes que forman la doble capa elctrica migran hacia el polo positivo(fig. 6).
Figura 6. flujo de cargas hacia el ctodo.
Por consiguiente, la doble capa elctrica llene un balance que est a su vez en
equilibrio con la pared que corresponde al potencial zeta.
La magnitud de la FEO puede ser expresada en trminos de la movilidad y

velocidad por la frmula siguiente:
VFE0 = ( c ! fl) E
RFEO = (E / 1)
Donde:
Vo Velocidad
po: Movilidad del flujo electroosmtico
e: Constante dielcfrica
: Potencial Z
8.0 Equipo de EC
El equipo est constituido por una fuente de poder de alto voltaje (20 a 30
kV) y de O a 200 jiA, y un capilar de slica de 25 a 75 i.xm de dimetro interno y de
100 a 200 j.xm de dimetro externo, el que puede estar refrigerado por aire o
lquido.
Los electrodos de platino se encuentran ubicados en el recipiente que contiene el

buffer, que adems de servir para su contacto recibe los extremos del capilar.
Es posible controlar la temperatura del carrusel que almacena las muestras y los
buffer.
Los capilares de slica dejan pasar la luz UV/ Visible a distintas longitudes de onda,
generando por arreglos de diodos, los espectros para la identificacin de los
compuestos separados. (fig. 7).
-51
lomocalizcmn
]
Oetcto,
de dEodo
FP
Carrousffl de 'nue1ri
t3uNer
Factro*o
F1G7 Esquema de un aparato deEc
Los aparatos desarrollados por la industria instrumental recin aparecieron en

1988, y el primer simposio internacional del ao siguiente, permiti mostrar los
avances extraordinarios de este logro analtico.
Los aparatos comerciales de FC comprenden dos compartimientos electroforticos
unidos por un compartimento que contiene un capilar, a una fuente de alta tensin
de 20 a 30 kV, el que es sometido a la luz UV con detector unido con un
registrador, que grafica las diferencias de absorbancia; a un sistema de
21
administracin de datos. Las terminales de salida permiten, por su conexin, el

registro de voltaje, tiempo de corrida, y registro de temperatura del capilar, a
travs de un software que est incluido en una computadora (fig 8).
Figura S. Carrousel para muestras en una EC
9.0 Tipo de inyecciones

La inyeccin electrocintica, consiste en introducir el material empleando
una combinacin de la bomba electroendosmtica y la movilidad electrofortica.
La inyeccin por desplazamiento puede ser realizada por aplicacin de la muestra
con gas inerte a presin (por ej. nitrgeno) o por vaco en el extremo del capilar.
Inyeccin por diferencia de altura. Idntico efecto puede obtenerse por cambio en
las alturas relativas de la muestra o de los viales de salida del buffer (inyeccin por
gravedad).
La inyeccin electrofortica, produce un desplazamiento inico, debida a un

campo elctrico donde migran los iones
22
El efecto de enfoque, puede producir cambios sustanciales en la inyeccin

electrofortica. (FIG. 9)
Presin ,____ _iidrodii1
1
Ruifo,
Muestra
Sitonado
Muestra
Buris
EPutrocinica
8:ffevI
1
FIG. 9 Diagrama de los tres mtodos de introduccin de

muestra
10.0 Volmenes empleados

El empleo de microvolmenes y la rapidez de la EC en comparacin al
HPLC, consume microlitros de muestra y volmenes del orden de los nanolitros
para la soluciones electrolticas, lo que la hace una tcnica altamente verstil y
econmica.
TABLA 1
Volmenes inyectados para varios capilares
AP
50prn
75 g
lOOgm
50 ml,ar
1.0 nL
5.2 nL
16.4 nL
75 mbar
1.5 nL
7.8 nL
24.6 nL
100 mbar
2.0 nL
10.4 nL
32.8 nL
23
11.0 Tipos de capilares

La eletroforesis se efecta en capilares de slica fundida, de 25- 75 jim de
dimetro interno; los capilares son recubiertos externamente con una pelcula de
poliamhias, para protegerlos de los daos mecnicos y provistos de una ventana
de deteccin. (3)
12.0 Voltaje
Las fuentes estabilizadas de corriente continua generan 10 a 30 kV y
elevados campos elctricos (100 a 500 V/cm.) al capilar, pueden variar de 25 a 75
jim. de dimetro interno, pudiendo llegar a 300 pm. de dimetro externo. Las
longitudes pueden ser de 1 m,, pero normalmente no exceden los 75 cm. (FIG. 10).
-e
LS
it
'1
..LLJ
25 um u 75 tm de
'g,nMro nterno y
300 Otr,
de diatn*c eateu'o
FJG 10 Esquema de un capilar
En algunos aparatos, el capilar se encuentra dentro de un soporte de plstico en el

cual se ha prealineado el capilar con una lente de micro enfoque, para obtener una
deteccin ms sensible y estable. Los soportes de plstico que contienen el capilar
son hermticos y en su interior se hacen circular lquidos refrigerantes.
Es imprescindible mantener la temperatura La elevada resistencia elctrica del
capilar limita la corriente y el calentamiento interno. Se logran campos elctricos
muy elevados (100 a 500 V/cm.) con mnima generacin de calor. El empleo de
campos elctricos muy elevados permite reducir drsticamente el tiempo de
24
realizacin de la corrida, y la elevada relacin del rea al volumen disipa en forma

eficaz el calor que se pueda producir.( 3)
13.0 Polaridad
La FC puede ser desarrollada empleando polaridad normal o invertida. El
valor del pH permite definir el sentido de la migracin a pH bajos, muchas
protenas y pptido son catinicos y migran hacia el ctodo en el extremo del
capilar. Inversamente, a pH elevados muchas bimolculas tienen una carga neta
negativa y migran hacia el nodo.
El conocimiento del pK para distintos componentes de las muestras (pptidos y

aminocidos) como tambin el pi para las protenas, permite seleccionar los buffer
apropiados para determinar el sentido de la migracin para que los compuestos se
orienten hacia el detector; normalmente se emplean campos elctricos de 200 a 400
y/cm.
Para muchas aplicaciones, el empleo de capilares de longitud elevada (hasta 1 m.)

permite y requiere voltajes mayores de 20 kV para encontrar el campo elctrico
adecuado.
14.0 Deteccin
Una amplia variedad de detectores han sido desarrollados para la EC
(incluyendo fluorescencia, electroqumica y conductividad) pero los detectores ms
usados comercialmente son los que emplean el UY/visible.
Los detectores son similares a los de I-[PLC, usando fuentes de deuterio con filtros
o deteccin con longitudes de onda seleccionadas.
SERVICIOS BE 1NFORMAc1A
%IItH1MIC
ARCHIVO UISTORIGQ
25
Las fuentes de luz generalmente provienen de un haz de luz entre un fotodiodo de

referencia y un micro enfocado ptico en el estuche capilar.
El barrido es a travs de un detector que ilumina el capilar con luz blanca luego
dispersada y analizada a travs de un policromador por arreglo de fotodiodos
(detector PDA para ptica reversa).
Alternativamente, el sistema ptico convencional puede ser empleado por una

banda espectral aislada por un monocromador colocado entre la fuente de luz y el
capilar.
El barrido puede ser controlado rpidamente por un sistema computarizado que

controla el movimiento del monocromador en el rango espectral en el tiempo de
milisegundos.
Este sistema de deteccin produce menos ruido de fondo, y mucha ms

sensibilidad que el detector con arreglo de diodos PDA.
15.0 Reactivos en EC
Una amplia variedad de buffer y aditivos puede ser usada para las
separaciones; la mayora de ellos son buffer no txicos, de fosfato, borato y TRIS.
No emplea sustancias orgnicas, inflamables o txicas como acetonitrilo, hexano,
metanol y tetrahidro furano, como en HPLC. Se requieren volmenes muy
pequeos de soluciones de electrolitos que no presentan los principios de toxicidad
encontrados en I-JPLC.
16.0 Seleccin de buffer

26
y.
Esta es una de las etapas bsicas en la separacin por EC. La sensibilidad de
la FEO a un determinado pH requiere buffer que mantengan el pH constante.
Los sistemas buffer efectivos tienen un rango de aproximadamente dos unidades

de pH alrededor del valor del pKa. Los buffer polibsicos como los de fosfato, y
citrato tienen ms de un pKa para usar, y pueden ser utilizados en un rango de pH
ms amplio.
El buffer que se emplea en EC debe reunir una serie de propiedades:
1) Buena capacidad amortiguadora en el rango encontrado
2) Baja absorbancia en la longitud de onda empleada en la deteccin.
3) Baja movilidad (para lo cual se necesita baja concentracin inica)
Las separaciones de protenas y pptidos son regidas por las alteraciones del pH
que estn ntimamente ligadas al pl. Los cambios de pH afectan tambin al
comportamiento del FEO, pues a pH prximos a 3 la superficie interna del capilar
se encuentra cargada negativamente por los grupos silanol.
27
9--
El empleo de uniones covalentes en la superficie del capilar puede reducir

dramticamente el FEO, sobre todo en la separacin de las protenas (FIC.11).
lo
pH FEO
-
anodt:
FEO
Ctoda
FEOHG.11 Electroendoosmosis
Particular cobertura en la superficie interna del capilar, en condiciones de pH

alcalino o neutro, permiten muy buenas separaciones.
El FEO puede ser afectada ajustando la concentracin y la fuerza inica del buffer;
elevadas concentraciones del buffer son tiles para la limitacin de las
interacciones inicas, por disminucin de las alteraciones inicas contra la pared,
pero el calentamiento de los capilares limita el uso de las concentraciones elevadas
de los buffer.
La concentracin de los buffer debe oscilar entre 10 a 50 mM, aunque es posible

emplear concentraciones entre 100 a 500 mM.
Las modificaciones del FEO pueden ser controladas alterando la cubierta dinmica,
agregando aditivos al buffer, o con cubiertas covalentes.
28
III. VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS EN FC

1.0 Caractersticas generales
El uso de un mtodo analtico, se justifica slo despus de haber descubierto que es

vlido (6).
El objetivo de validar un mtodo analtico es demostrar que ste es apropiado para

cuantificar lo que pretende. (4).
2.0 Especificidad/ Selectividad

Es la habilidad de un mtodo analtico para obtener una respuesta debida
nicamente a la sustancia de inters y no a otros componentes de la muestra. (9)
3.0 Precisin (repetibilidad)

La precisin de un mtodo analtico es el grado de concordancia entre
resultados analticos individuales cuando el procedimiento se aplica repetidamente
a diferentes muestreos de una muestra homognea del producto. Usualmente se
expresa en trminos de Desviacin Estndar o del Coeficiente de Variacin. (9)
La precisin es una medida del grado de reproducibilidad y/o repetibilidad del
mtodo analtico bajo las condiciones normales de operacin.
Se determina por el anlisis sextuplicado de una misma solucin estndar

correspondiente al 100% establecido en la linearidad del sistema.
79
4.0 Linearidad
La linearidad de un sistema o mtodo analtico es su habilidad para

asegurar que los resultados analticos, los cuales pueden ser obtenidos
directamente o por medio de una transformacin matemtica bien definida, son
proporcionales a la concentracin de la sustancia dentro de un intervalo
determinado. (9)
Se determina, construyendo una curva de calibracin (concentracin vs respuesta

media) utilizando cuando menos 5 diluciones preparadas a partir de una misma
solucin patrn y haciendo anlisis cuando menos por duplicado para cada
dilucin
4.1 Unearidad del sistema
En la linearidad del sistema se demuestra la relacin lineal que existe entre

la concentracin de analto adicionada y la respuesta del instrumento.
5.0 Exactitud
La exactitud de un mtodo analtico es la concordancia entre un valor
obtenido experimentalmente y el valor de referencia. Se expresa como el por ciento
de recobro obtenido del anlisis de muestras a las que se les ha adicionado
cantidades conocidas de la sustancia. (9)
Se determina de, cuando menos, 6 muestras de manera independiente con la
cantidad necesaria de la sustancia de inters para obtener la concentracin del
30
100%, utilizando el mtodo propuesto o bien, realizar la prueba a tres niveles de

concentracin por triplicado. Haciendo el anlisis en las mismas condiciones de
operacin y por el mismo analista.
6.0 Otros parmetros a evaluar
Estabilidad de la muestra. Es la propiedad de una muestra preparada para su

cuantificacin, de conservar su integridad fisicoqumica y la concentracin de la
sustancia de inters, despus de almacenarse durante un tiempo determinado bajo
condiciones especficas.
Estabilidad del buffer. Es la propiedad de una sustancia amortiguadora de

conservar sus caractersticas fisicoqumicas para llevar a cabo la separacin de la
muestra bajo condiciones precisas y exactas.
31
OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECFICOS
Objetivo General
Disear y validar un mtodo analtico para la cuantificacin de cido

valprico como materia prima por Electroforesis Capilar.
Objetivos especficos:
Establecer las condiciones necesarias para la preparacin de la muestra, como

disolventes utilizados, concentracin final, pH, temperatura, tiempo de
agitacin, y sonicacin.
Determinar las condiciones adecuadas para la conservacin de la muestra y el
sistema buffer empleado.
Establecer las condiciones operacionales para el anlisis en el equipo de CE,
como tipo y dimetro interno del capilar, longitud total y efectiva del mismo,
polaridad, temperatura, voltaje, corriente, volumen de inyeccin, tipo de
separacin, entre otros
Establecer los parmetros de adecuabilidad del sistema como rea bajo la
curva, simetra del pico, resolucin y eficiencia.
Desarrollar un sistema buffer adecuado para la cuantificacin del cido
valprico de forma directa tomando en cuenta las propiedades cido-bsicas de
la molcula y las condiciones operacionales del equipo para establecer el pH y
concentracin (fuerza inica) del mismo.
Evaluar la especificidad/selectividad del mtodo demostrando que el mtodo
es capaz de cuantificar slo el analto de inters.
Evaluar la precisin del sistema (repetibilidad) con una desviacin estndar
relativa no mayor a 2%.
32
Evaluar la exactitud con un por ciento de recobro de 98 a 102%
y una
desviacin estndar relativa no mayor a 2%.

Evaluar la linearidad del sistema demostrando un coeficiente de
determinacin mayor a 0.98.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Para el desarrollo y validacin del mtodo analtico se emple un equipo de
Electroforesis capilar marca Beckman coulter modelo MDQ P/ACE equipado con
una fuente de poder para generar los electroferogramas; un capilar negativo de
siica de 75 ism de diametro interno y una longitud efectiva de 50 cm, para la
deteccin se emple un detector de arreglo de diodos con un filtro ptico a 200 nm
y para la identificacin un barrido de 190 a 400 nm. La inyeccin de la muestra fue
de forma hidrodinmica. Se emplearon viales de borosilicato estndar de 2 mL
para contener la muestra y el buffer de separacin.
Adems se emplearon reactivos y disolventes con las siguientes caractersticas:

Estndar de referencia y muestra:
Nombre
cido Valprico ST
cido Valprico MTA
Identificacin
5LR109863
J100326
Valoracin (%)
99.98
99.54
Reactivos:
Nombre
Agua grado HPLC
Fosfato monobsico
sodio
Hidrxido de sodio
Metanol
cido brico
Marca
Burdick
ACS/HPLC
de J.T. BAKER
J.T. BAKER
Burdick
ACS/ HPLC
JT. BAKER
&Jackson
&Jackson
33
Diseo del mtodo analtico
En base a las caractersticas fisicoqumicas del analito, se realizaron las

siguientes pruebas:
PREPARACIN DE LA MUESTRA
Se pesaron 20 mg de AV en un matraz Volumtrico de 100 mL aforando con
las siguientes mezclas de disolventes:
Agua 100%, agua-metanol 95:05, 90:10, 85:15 y 80:20; con agitacin
constante.
Nota: Se adicion en primera instancia el metanol y despus, lentamente el agua con agitacin
constante.
SELECCIN DEL BUFFER DE SEPARACIN
Para garantizar que la molcula se encuentre ionizada, se trabajo a un pH

arriba de 4.6 (valor de pKa del A y), por lo que se realizaron experimentos con
buffer de fosfatos a pH 7.2 y de boratos a pH 8.3.
El buffer de separacin de fosfatos a pH 7.2 fue preparado a partir de
Fosfato monobsico de sodio monohidratado y ajustado el pH con hidrxido de
sodio 1 N y el buffer de boratos de pH 8.3 a partir de cido brito ajustado el pH
de igual forma con hidrxido de sodio 1 N.
Se inyectaron por duplicado utilizando cada buffer a polaridad normal e
invertida muestras de AV a una concentracin de la muestra de 1 mg/mL y 75 mM
la concentracin del buffer, a 20 kV con inyeccin hidrodinmica a 5 psi de
presin, con una temperatura de capilar ambiente en corridas de 20 minutos.
34
Todas las muestras y buffer de separacin se sonicaron por 5 minutos y se filtraron

a travs de un filtro Millipore de 0.22 jim antes de su uso. El buffer se prepar cada
da de experimentacin.
AJUSTE DEL MTODO
De acuerdo al buffer de separacin seleccionado, se ajustaron los siguientes

parmetros:
Voltaje de separacin
Temperatura del capilar
o Concentracin de la muestra
Secuencia de lavado (acondicionado del capilar)
Concentracin del buffer
Se establecieron las condiciones de adecuabilidad del sistema para el

mtodo (platos tericos, asimetra, rea y resolucin, adems del coeficiente de
variacin para cada uno de estos parmetros), con lo que se demostr que el
equipo, reactivos utilizados y condiciones de trabajo no afectaron en los resultados.
Validacin del mtodo
Para realizar la validacin se evalu:
1.0 Especificidad/Selectividad:
Se inyect por duplicado:
Una solucin de estndar de AV a 200 jig/mL
Una muestra de materia prima de AV a 200 jig/mL
Una solucin blanco
Solucin Buffer
35
2.0
Linearidad del sistema

Se realiz por triplicado una solucin stock, de la cual se obtuvieron las
siguientes concentraciones en la curva de calibracin:

raaa5
vaiproico (kg/mL)
100
150
200
250
300
Previamente verificados los parmetros de adecuabilidad del sistema de
electroforesis capilar, se realizaron dos inyecciones de cada nivel de concentracin.
3.0 Exactitud del mtodo
Se prepar de manera independiente 6 muestras de cido valproico al 100% de

concentracin (200 ig/mL) de materia prima de a cuerdo a la preparacin de la
muestra, indicada en la metodologa.
Una vez verificado el cumplimiento de los parmetros de adecuabilidad del

sistema se realizaron dos inyecciones de cada muestra.
4.0 Precisin (repetibilidad)
Se analizaron de manera independiente, pero de la misma solucin patrn 6
muestras al 100% de la concentracin de prueba (200 j.tg/mL), utilizando
soluciones estndar.
36
Una vez verificado el cumplimiento de los parmetros de adecuabilidad, se

inyectaron por duplicado las muestras en el equipo de electroforesis capilar.
5.0 Estabilidad del buffer de separacin.
Se inyect una misma muestra de AV varias veces, hasta que el buffer perdiera
la capacidad de mantener el voltaje y corriente de separacin apropiados para
la separacin.
RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS

DESARROLLO DEL MTODO
1.0
Preparacin de la muestra
Se observ rpida disolucin de la muestra en la mezcla 95:5 agua-metanol, con un

tiempo de agitacin no mayor a 5 minutos.
2.0
Sistema Buffer de separacin
Experimento
Buffer de boratos pH 8.3 con polaridad
nornal
Buffer de boratos pH 8.3 con polaridad
invertida
Buffer de fosfatos pH 7.2 con polaridad
normal
Resultado
No se observ respuesta
No se observ respuesta
Se observ respuesta del analito, lo que

fue corroborado por medio de analisis
espectral.
Buffer de fosfatos pH 7.2 con polaridad No se observ respuesta
invertida
37
3.0 AJUSTE DEL MTODO

Se disminuy la concentracin de la muestra, para proporcionar mayor simetra
al pico, al aumentar la temperatura del capilar y disminuir la concentracin del
buffer de separacin, se logr disminuir el tiempo de migracin de la molcula y
de acuerdo a los resultados obtenidos, se estableci la secuencia apropiada de
acondicionamiento del capilar previo a la inyeccin de la muestra, obteniendo las
siguietes caractersticas del mtodo analtico:
Preparacin de la muestra: Pesar 20 mg de AV en un matraz volumtrico de 100
mL, adicionar 5 mL de metano! grado HPLC y lentamente aforar con agua.
Preparacin del buffer de separacin (fosfatos 5OmM): Pesar 1.2 g de fosfato
monobsico de sodio y agregar 160 mL de agua a un matraz agitar hasta completa
disolucin, ajustar el pH con hidrxido de sodio 0.1 N a 7.2 y aforar a 200mL.
Condiciones de separacin: Previo a la inyeccin de la muestra se acondiciona el
capilar con el buffer de separacin por 2 minutos a 20 psi de presin, se inyecta por 10
segundos a 1 psi de presin la muestra de AV y posteriormente se inyecta durante 5
segundos a 0.5 psi de presin buffer de separacin (para asegurar la eficiencia de
separacin); Para la separacin se aplica un voltaje de 26 kV con una temperatura de
capilar de 30 o c en un capilar de 50 cm de longitud efectiva, con un dimetro interno de 75
jim. Las muestras son conservadas en el carrousel a 20 c con un tiempo de corrida de 8
minutos y un tiempo de migracin del AV de 5.5 minutos. La deteccin se realiza mediante
un detector fotomtrico UV sencillo a 200 nm.
Adecuabilidad del sistema. Despus del ajuste del mtodo, se observ que el mtodo
es consistente siempre y cuando se demuestre que el sistema cumple con los parmetro
establecidos para la adecuabilidad del sistema
rea bajo a curva
Platos tericos
Resolucin
Asimetra
>50,000
> 6,000
>1
de 0.5 a 1.5
%cV c 2%
38
VALIDACIN DEL MTODO ANALTICO

1.0 ESPECIFICIDAD/SELECTIVIDAD
1.1 Adecuabilidad del Sistema.
Parmetro de
Especificacin
Resultado
Adecuabihdad
%PSD
cido _vaiproico
Inyeccin 1 Inyeccin 2 Inyeccin 3
Asimetra
05-1.5
0.564
0.564
0.566
Eficiencia (N)
Mayor a 6000
6996
7029
6837
Resolucin
Mayor a 1
14.115
14.087
14.517
rea bajo la
Mayor a 50.000
69863
68698
70295
curva
0.2
1.5
1.7
1.2
1.2 Prueba Analtica.

Figura No.
Muestra
Coicentracin. F
-final AY
(iig/mL)
-
/rede pico
Observacin
El
E2
Estndar AV
203.2
588452
58849.8
Muestra de AV
215.1
62352.1
62368.7
E3
Blanco de
Disolventes
E4
Disolventes:
Buffer de
separacin
-------
El espectro UV obtenido
al tiempo de migracin
del AV es igual al
reportado
bibliogrficamente.
El espectro Uy obtenido
es igual al del estndar.
No se observa
interferencia del blanco
en el electroferograma
ni en el espectro.
No se observa
interferencia del fuifer
en el electroferograma
m en el espectro.
39
Figura El. Estndar de AV a 200 RgImL.
D:\32KaraIData\AcidovaIproico\ESPECIFICIDAD STa-Repl
lo-
lo
o1I<
4
-lo -
.--
min.
Figura E2. Muestra de AV a 200 jsglmL.
D:\32KaraflDatacjdovaIproj\Es pEcIF ,cloAo MTAa-Rep2
10
.0 --------:
1:
-..
,.,.U-..-min.
-,--
7
lo
____;--;;
Ainn
200
260
nm
40
Figura S. Blanco de disolventes

O:32Karat\Data\AcjdovaIproico\Es p EcIFlcIDAD BLANCOa-Rep2
--
-10
Figura E4. Buffer de separacin
D:32Karat\Data\AcidovaIprojcoESPEcIFlciDAD BUFFa-Repl
loo
-lo
41
-. -lv
2.0 LINEARIDAD DEL SISTEMA

2.1 Adecuabilidad del sistema
Fci
!ttS
FJ
iI3/ecdiill }Idn 21 IPfohtdilirsj

!W7cid6a1jiik&P !
Asimetra
0.56119
0.0.55907
0.56013
0.268
10.54.5
Eficiencia (N)
6999
6967
6983
0.323
Mayor a 6000
Mayor a 1
17.48246
14.70641
16.09443
12.197
Resolucin
69217
69452
0.478
Area bajo la
Mayor a 50.000
69686
curva
2.2 Prueba Analtica

Peso Muestra 1: 258 mg
Peso terico: 250 mg
Preparacn de los niveles de concentracin:

Stock (250 mg/SO mL) x 6mL1I00mL

Stock (250 mg/SO mL) x SmUlOOmL
Stock (250 mg/SO mL) x 4mL1100mL=
Stock (250 mg/SO mL) x 3mUI00mL=
Stock (250 mg/SO mL) x 2mUI00mL
Muestra
.1
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
ncentrad iJ
FnaIdeAV
Z(/L)
103.2
98.8
100.8
154.8
148.2
151.2
206.4
197.6
201.6
258.0
247.0
252.0
309.6
296.4
302.4
150%
125%
100%
75%
50%
fl
-_
88657
87662
85016
66400
73442
70100
58417
56333
56284
41176
41787
41807
29155
27535
27829
ftme dio
88781
87425
83903
67770
73100
70651
58795
56077
56917
40975
41024
40707
29000
27306
28194
88719.0
87543.5
84459.5
67085.0
73271.0
70375.5
58606.0
56205.0
56600.5
41075.5
41405.5
41257.0
29077.5
27420.5
28011.5
42
Linearidad del Sistema
1.
90.
70000.0
=
o
cc
+S2
50000.0
-t-Stcd3
cc
-n
cc
+Promecio
Regresn lineal
40000.0
30000.0
20000.0
icoco.a
0.0
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
1601A
Nivel de Concentracin
43
3.0 EXACTITUD
3.2 Prueba analtica
44
4.0 Precisin (Repetibilidad)

PaTmetro d
Especificacin
:Adecuabihdad
Parmetro de
Especificacin
Adecuabilidad
cido valprico
Inyeccin 1
Asimetra
0.5-1.5
0.56036
Eficiencia (N)
Mayor a 6000
8656
Resolucin
Mayor a 1
15.80802
Area bajo la
Mayor a 50.000
55420
curva
Resultado
v:
Resultado
%RSD
Inyeccin 2: Inyeccin 3
0.56866
0.56574
8067
8209
18.79032
18.57679
54383
54796
0.746
3.702
9.386
0.952
4.2 Prueba analtica
Area bajo la curva de AV

Peso AV Cantidad Final
Muestra
(mg) de AV (j.tg/mL)
1
2
3
4
5
6
Estndar
de
referencia
20.7
20.7
20.7
20.7
20.7
20.7
207
207
207
207
207
207
Rep 1
54194
53439
54143
54174
52739
52399
Rep 2
54190
52434
52788
52215
53359
52426
Promedio:
Desv St- 1 1
Promedio
54192.0
52936.5
53465.5
53194.5
53049.0
52412.5
53208.3
801.56
1.51
45
5.0 Estabilidad de buffer

PfffiffbTd1 E5dfkdff
Rii1tido
FAai
tSAcid vaIFicfl
V _I3 ecci 31
__IIytEff II _lciff
h
Asimetra
0.5-1.5
0.56853 0.57332
0.56490
Eficiencia (N)
Mayor a 6000
8523
8495
8721
Resolucin
Mayor a 1
18.80345
18.69675
18.99162
rea bajo la
Mayor a 50.000
51778
52825
51197
curva
Lsfr'Si
0.742
1.433
0.793
1.589
7.2 Prueba analtica.

Muestra: 204 gg/mL
Un par de viales de buffer son estables para 23 corridas.
AE?N..
REP1
REP2
REP3
REP 4
REP5
REP6
REP7
REP8
REP9
REPlO
REP11
REP12
REP13
REP14
REP1S
REP16
REP17
REP18
REP19
REP20
REP21
REP22
REP23
REP24
tt'nt"'fl Media
*aas_Desvst
rtana.%Cv
104.67
103.48
103.29
103.50
103.48
101.75
105.52
102.87
104.92
103.78
104.23
104.62
105.49
104.18
104.92
103.97
104.37
104.39
104.21
103.86
105.12
105.38
105.96
Sin seal
104 26WW
0.97 SI
093tL_-
46
OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS
Se logr disear un mtodo analtico especifico para la cuantificacin del

cido valproico como materia prima por electroforesis capilar, mediante
deteccin fotomtrica directa a 200 mu, con polaridad normal y tiempo de
corrida de 8 minutos, con un tiempo de migracin del cido valproico de 5.8
minutos.
Se establecieron los parmetros de adecuabilidad del sistema para el

mtodo analtico.
Se estableci el nmero de inyecciones apropiadas para un mismo par de

viales de buffer de separacin.
Se demostr, mediante la validacin, que es un mtodo especifico, exacto,

preciso (repetible) y lineal.
CONCLUSIONES
a. Diseo del Mtodo

El mtodo desarrollado est diseado para cuantificar cido vaiproico
como materia prima por electroforesis capilar.
Es un mtodo sencillo, utiliza una mezcla agua-metano 95:5 como disolvente del
cido valproico, la temperatura de trabajo es de 30 C durante la separacin, se
emplea un buffer de fosfatos 50mM a pH de 7.2, con tiempos de corrida de 8
minutos y utilizando un detector UV sencillo a una longitud de onda de 200 nm,
obteniendo picos simtricos, con alta resolucin y eficiencia.
47
r. nr
b. Validacin del Mtodo
El
mtodo analtico diseado y validado para la cuantificacin de cido
valproico como materia prima por electroforesis capilar es especfico, ya que el

anlisis espectral el estndar al tiempo de migracin del AV (5.8 mm) es similar
al reportado bibliogrficamente para este frmaco, as como no se observa
interfer4encia del blanco de disolventes, ni del buffer de separacin empleados;
es exacto, ya que se demostr un por ciento de recobro del 99.75%, con una
desviacin estndar relativa de 1.10 0/o; es preciso, ya que se obtuvo una
desviacin estndar relativa de 1.51%; y linear, ya que se obtuvo un coeficiente
de determinacin (r2) de 0.9993.
El
buffer es capaz de mantener la corriente y el voltaje, hasta en 23 inyecciones
un mismo par de viales.
PRUEBA
ESPECIFICIDAD
PRECISIN DEL SISTEMA

EXACTITUD DEL MTODO
RESULTADO
El anlisis espectral del AV demuestra que
el mtodo es especfico para este frmaco.
No interfieren ni disolventes de preparacin,
ni el buffer de separacin
%CV = 1.51%
Recobro: 99.75%
%C.V.= 1.10%
LINEARIDAD DEL SISTEMA
ROBUSTEZ. ESTABILIDAD DEL
BUFFER
r2=0.9993
El buffer de separacin es estable hasta 23
inyecciones del mismo par de viales.
48
1. Rabasseda, X. 1994. Drugs of today. Departamento de informacin y

Documentacin mdica Prous Xcience, Barcelona. sup!. 7.
2. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. 2000. 7' cd Secretara de
Salud.
3. ICH Steering Comittee 1996. Guidance for Industry. Q213 Va!idation of
Analytical Procedures: Methodology.
4. !CH Steering Comittee 1995. Guidance for Industry. Q2A Text on
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5. Florey, K. 1982. Analytical Profiles of drug substances v.8. Ed. Academic
Press Inc. USA.

6. Gennaro A. R. 1999. Remington Farmacia. 19 ed. Ed.mdica Panamericana.
Buenos Aires, Arg.
7. Ci!Iman G. A. & Ggriffith, J . 1981. Las Bases Farmacolgicas de la
Teraputica. 6 ed. Ed Mdica Panamericana. Mxico.
8. Castagnino, J . Migue!. 2000. Electroforesis Capilar. Bioqumica. 25. 1-98.
9. Jones, W. R. y Jandik, P. 1991.Controlled changes of selectivity in 11w separation
of iones by capillary electrophoresis. Journal of Chromatography, 546.445-458.
10.Heiger, D. 2003. Determina tion of Small Ions by Capillary Zone Electro phoresis
with Indirect Photometric Detection. Agilent Technologies..
11.Jones, W. R. y Jandik, P. 1991.Controlled changes of selectivity in t/w separation
of iones by capillary electrophoresis. Journal of Chrornatography, 546. 445-458.
12.United States Pharmacopeia. XXVII. 2004. CC [1225]. Validation of
Coinpendial Methods. p.2622-2625.
49
VoBo DEL CONTENIDO ACADEMICO
2 /JX
M. en C. Ma. Luisa Margarita
Vzquez Ramrez
e
M.en C. Edilberto Prez
Montoya
UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA

UNIDAD XOCHIMILCO
DIVISIN DE CIENCIAS BIOLGICAS Y DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE SISTEMAS BIOLGICOS
QUMICO FARMACUTICO BIOLOGO
INFORME DE ACTIVIDADES DEL SERVICIO SOCIAL
"Diseo y validacin de un mtodo analtico para la cuantificacin de
cido valprico en materia prima por electroforesis capilar"
PERTENECE AL PROYECTO GENRICO
"Evaluacin de productos relacionados con la salud".
Alumno: Agustn Flores Luna
Matrcula: 99345658
Direccin: Diamante # 35 Col. Estrella, Mxico D.F.

Telfono: 57-59-60-38.
Asesores:
M. en C. Ma. Luisa Margarita Vzquez Ramrez

M. en C. Edilberto Prez Montoya
LUGAR DE REALIZACIN: Departamento de Biofarmacia en la Escuela Nacional de

Ciencias Biolgicas del Instituto Politcnico Nacional
FECHA DE INICIO: Febrero, 2003
FECHA DE TERMINACIN: Octubre, 2003
Febrero, 2005
Introduccin
El cido valprico (AV) y sus sales de magnesio y sodio son frmacos
antieplipticos de primer nivel (Rabasseda, 1994).
El anlisis de la pureza de este frmaco, en las distintas farmacopeas est

reportado por medio de titulacin y cromatografa de gases (CG).
EL AV es una molcula muy pequea, con una doble ligadura en el grupo

carboxilo, con un Xmax 213 nm, lo que dificulta su deteccin de manera directa
por cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC), ya que emplea
disolventes orgnicos que interfieren con la lectura a esa longitud de onda tan baja.
Con el avance tecnolgico, una alternativa al uso de la cromatografa en separacin

y cuantificacin de macromomolculas y micromolculas es la Electroforesis
capilar (EC), la cual ofrece grandes ventajas con respecto a la cromatografa, ya que
para el manejo de las muestras no se requiere del empleo de grandes temperaturas,
uso de disolventes txicos y de alto costo, gases, tiempos de anlisis prolongados,
muestra mayor selectividad y eficiencia en la separacin, etc.; puesto que en su
gran mayora, se emplean soluciones acuosas con muy baja concentracin inica.
La EC es una tcnica moderna, en la que la separacin se realiza por cargas y peso

molecular del analto en una matriz sencilla o compleja, dentro de un capilar de
silice fundido, al aplicar cierto voltaje que propicie la migracin de las molculas
dependiendo de su tamao y carga (positiva o negativa). Las molculas migran del
nodo al ctodo en fase normal. Las molculas que se detectan primero son los
cationes pequeos, luego los cationes grandes, posteriormente las molculas
neutras (sin carga) y al ltimo los aniones grandes y pequeos.
51
El flujo electroosmtico (FEO) es un fenmeno fisicoqumico, que permite explicar

la capacidad de esta tcnica para separar compuestos de cualquier tipo, incluso
molculas neutras y est directamente relacionado con la estructura interna del
capilar.
Para la separacin se usan buffer, por lo general inicos, a concentraciones bajas y
la inyeccin de la muestra puede ser por presin, vaco o electrocintica.
Los componentes esenciales de un equipo de EC son una fuente de poder, capilar,
electrodos y el detector, controlados a travs de una computadora. Se acondiciona
el capilar con el buffer de separacin, despus toma la muestra y posteriormente
inicia la separacin al introducir los electrodos dentro del buffer de separacin y al
aplicar voltaje, la seal es recibida por el detector y comienza a monitorear la
corrida, observndose as los electroferogramas.
Los parmetros crticos de la separacin en EC son: el pH, que permite modificar la

fuerza del FEO y de esta manera inducir la movilidad de las molculas neutras.
Permite tambin la ionizacin de las molculas con caractersticas cido-bsicas; y
la fuerza inica (concentracin del buffer) que es el contenido de iones dentro del
buffer de separacin. Su control permite modificar la corriente generada durante la
separacin.
OBJETIVO GENERAL
Disear y validar un mtodo analtico para la cuantificacin de cido
valprico como materia prima por Electroforesis Capilar.
52
OBJETIVOS ESPECFICOS:
Establecer las condiciones necesarias para la preparacin de la muestra, como

disolventes utilizados, concentracin final pH, temperatura, tiempo de
agitacin, y sonicacin.
Determinar las condiciones adecuadas para la conservacin de la muestra y el
sistema buffer empleado.
Establecer las condiciones operacionales para el anlisis en el equipo de CE,
como tipo y dimetro interno del capilar, longitud total y efectiva del mismo,
polaridad, temperatura, voltaje, corriente, volumen de inyeccin, tipo de
separacin, entre otros
Establecer los parmetros de adecuabilidad del sistema como tiempo de
migracin, simetra del pico, resolucin.
Desarrollar un sistema buffer adecuado para la cuantificacin del cido
vaiproico de forma directa tomando en cuenta las propiedades cido-bsicas de
la molcula y las condiciones operacionales del equipo para establecer el pH y
concentracin (fuerza inica) del mismo.
Evaluar la especificidad/selectividad del mtodo demostrando que el mtodo
es capaz de cuantificar slo el analto de inters.
Evaluar la precisin del sistema (repetibilidad) con una desviacin estndar
relativa no mayor a 2%.
Evaluar la exactitud del mtodo con un por ciento de recobro de 98 a 102% y
una desviacin estndar relativa no mayor a 2%.
Evaluar la linearidad del sistema demostrando un coeficiente de
determinacin mayor a 0.98.
5i
METODOLOGA
Para el desarrollo y validacin del mtodo analtico se emple un equipo de

Electroforesis capilar marca Beckman coulter modelo MDQ P/ACE equipado con
una fuente de poder para generar los electroferogramas; un capilar negativo de
silica de 75 p.m de dimetro interno y una longitud efectiva de 50 cm de largo, para
la deteccin se emple un detector de arreglo de diodos con un filtro ptico a 200
nm y para la identificacin un barrido de 190 a 400 nm. La inyeccin de la muestra
fue de forma hidrodinmica. Se emplearon viales de borosilicato estndar de 2 mL
para contener la muestra y el buffer de separacin.
Todas las soluciones fueron preparadas usando agua grado HPLC marca Burdik &
Jackson, se sonicaron por 5 minutos y se filtraron a travs de un filtro Millipore de
0.22 jim antes de su uso. El buffer se prepar cada da de experimentacin.
Con el fin de ionizar la molcula de AV se realizaron experimentos con buffer de

separacin de boratos y fosfatos a pH de S. y 7.2 respectivamente, con polaridad
normal e invertida, onservando fijas variables como: Voltaje de separacin: 20 kV,
Temperatura de capilar: ambiente, Concentracin del buffer: 75 mM,
Concentracin de la muestra: lmg/mL y tiempo de corrida: 20 minutos.
Del resultado de estos experimentos se seleccion el buffer ms apropiado y se
realizaron los ajustes necesarios a las condiciones operacionales del mtodo y del
equipo, para obtener las condiciones optimas del mtodo y establecer los
parmetros de adecuabilidad del sitema.
El mtodo analtico se valid bajo los parmetros de exactitud, precisin,

linearidad, robustez y especificidad.
54
RESULTADOS
Preparacin de la muestra: Pesar 20 mg de AV en un matraz volumtrico de 100

mL, adicionar 5 mL de metano? grado H.PLC y lentamente aforar on agua.
Preparacin del buffer de separacin (fosfatos 50mM): Pesar 1.2 g de fosfato
monobsico de sodio y agregar 160 mL de agua a un matraz agitar hasta completa
disolucin, ajustar el pH con hidrxido de sodio 0.1 N a 7.2 y aforar a 200mL.
Condiciones de separacin: Previo a la inyeccin de la muestra se acondiciona el
capilar con el buffer de separacin por 2 minutos a 20 psi de presin, se inyecta por 10
segundos a 1 psi de presin la muestra de AV y posteriormente se inyecta durante 5
segundos a 0.5 psi de presin buffer de separacin (para asegurar la eficiencia de
separacin); Para la separacin se aplica un voltaje de 26 kV con una temperatura de
capilar de 30 C en un capilar de 50 cm de longitud efectiva, con un dimetro interno de 75
j.tm. Las muestras son conservadas en el carrousel a 20 C con un tiempo de corrida de 8
minutos y un tiempo de migracin del AV de 5.5 minutos. La deteccin se realiza mediante
un detector fotomtrico 11V sencillo a 200 nm.
Adecuabilidad del sistema. Despus del ajuste del mtodo, se observ que ste es
consistente siempre y cuando se demuestre que el sistema cumple con los parmetro
establecidos para la adecuabilidad del sistema
rea bajo acurva
Platos tericos
Resolucin
Asimetra
>50,000
> 6,000
>1
de 0.5 a 1.5
%CV c 2%
VALIDACIN DEL MTODO.

PRUEBA
ESPECIFICIDAD
PRECISIN DEL SISTEM

EXACTITUD
ROBUSTEZ ESTABILIDAD DEL
BUFFER
RESULTADO
El anlisis espectral del AV demuestra que
el mtodo es especfico para este frmaco.
No interfieren ni disolventes de preparacin,
ni el buffer de separacin
%CV = 1.51%
Recobro: 99.75%
%C.V.= 1.10%
r20.9993
El buffer de separacin es estable hasta 23
inyecciones del mismo par de viales.
55
CONCLUSIONES
a. Diseo del Mtodo
El mtodo desarrollado est diseado para cuantificar cido valproico como

materia prima por electroforesis capilar.
Es un mtodo sencillo, utiliza una mezcla agua-metanol 95:5 como disolvente del
cido valproico, la temperatura de trabajo es de 30 C durante la separacin, se
emplea un buffer de fosfatos 50mM a pH de 7.2, con tiempos de corrida de 8
minutos y utilizando un detector U y sencillo a una longitud de onda de 200 nm,
obteniendo picos simtricos, con alta resolucin y eficiencia.
b. Validacin del Mtodo
El mtodo analtico diseado y validado para la cuantificacin de cido

valproico como materia prima por electroforesis capilar es especfico, exacto,
preciso y linear.
'Iii
1. Rabasseda, X. 1994. Drugs of today. Departamento de informacin y
Documentacin mdica Prous Xcience, Barcelona. supi. 7.
2. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. 2000. 7' ed Secretara de
Salud.
3. ICI-I Steering Comittee 1996. Guidance for Industry. Q2B Validation of
Analytical Procedures: Methodology.
4. ICH Steering Comittee 1995. Guidance for Industry. Q2A Text on
Validation of analytical procedures.
5. Florey, K. 1982. Analytical Profiles of drug substances v.8. Ed. Academic
6.
7.
8.
9.
Press Inc. USA.

Gennaro A. R. 1999. Remington Farmacia. 19 ed. Ed.mdica Panamericana.
Buenos Aires, Arg.
Giliman G. A. & Ggriffith, J . 1981. Las Bases Farmacolgicas de la
Teraputica. 6 ed. Ed Mdica Panamericana. Mxico.
Castagnino, J . Miguel. 2000. Electroforesis Capilar. Bioqumica. 25. 1-98.
Gerard C. H. A Lft Cycle to the Validation of Pharmaceutical Product
Developnient, part 1: The Inicial Method Validation Process. Pharmaceutical

Technology. 1994.118-130.
10.United States Pharmacopeia. XXVII. 2004. GC [1225]. Validation of
Conipendial Ivlethods. p.2622-2625.
11. Heiger, D. 2003 Determination of Small Ions by Capillary Zone Electrophoresis
with Indirect Photometric Detection. Agilent Technologies.
12.Jones, W. R. y Jandik, P. 1991.Controlled changes of selectivity in 11w separation
of iones by capillary electrophoresis. Journal of Chromatography, 546. 445-458.
57
VoBo DEL CONTENIDO ACADMICO
M. en C. Ma. Luisa Margarita

Vzquez Ramrez
fi
M.eif. Edilberto Prez

Montoya
ANEXOS
58
r.
REPORTE DE SERVICIO SOCIAL
DESARROLLO DEL METODO
iO
Mk,utot
12
14
16
16
20
30-
30
20
-20
10
-10
1.
10
Mfi,uIts
12
14
10
10
w2u
91
91
PI
ti
Ot
01
oz
oz
91
91
PI
ti
acinuin
01
o
ao
000001
o
100000
P00000
t000Uo
P00000
000J131N 130 0110nIv53a

1VIJOS OIDIMI35 aa 310d3I
a1-
OlflUWd
Ot
91
91
P1
ti
01
0I
oz
oe
91
91
01
tI
Ql
00000
9000.0
01000
00013V4 130 01101JV530

1VIDOS OIDIMI3S 30 3180d3
fil
fil
PI
tI
01
0-
01-
01
oel
Po
SaInLIM
01
Pl
01
00i3IAJ i;a O11OiVS3G

1VIDOS 0IDIMI3S 30 3JOd3
co1nhjiI'
CE
o'
91
Vi
Pl
ti
01
o'
1
DE

CE
OGIflIJM
CE
Rl
91
Pi
tI
01
00013IN iaa 0110v53a

1VOOS OIDIMI3S 3a 3flIOd3I
fr

VALORACIONI ACIDO VALPROICO
VALIDACION DEL METODO ANALITICO
ESPECIFICIDAD
Estabilidad del Buffer Mta: ESPECIFICIDAD BCO 1124105 5:21:06 PM
00
Minutes
D:32KaratData'iAcidovalproico\ESPECIFICtDAD BLANCOa-Repl
lo0
-lo
lo --

VALORACION ACIDO VALPROICO
VALIDACION DEL MET000 ANALITICO
ESPECIFICIDAD
Estabilidad del Buffer Mta: ESPECIFICIDAD BUFF 1124105 4:55:34 PM
4
E
Minutes
D:\32Karat\Data\Acidovalproico\ESPECIFICIDAD BUFFa-Repl
lo
o
-lo

ESPECIFICIDAD
Estabilidad del Buffer Mta: ESPECIFICIDAD STD 1124105 5:59:45 PM
7.5
5.0
2.5
D
0.0
-2.5
-5.0
0
4
Minules
D:\32Karat\Data\AcidovaIproicoESPECIFICIDAD STDa-Rep2
lo
o
-10

ESPECIFICIDAD
Estabilidad del Buffer Mta: ESPECIFICIDAD MTA 1124105 6:12:46 PM
7-5
5.0
D
E
2.5
E
0.0
-2.5
4
Inutes
D:\32KaratData'iAcidovaIproico\ESPEClFlCIDAD MTAa-Repl
10
-10

VALORACION DE ACIDO VALPROICO
System is
Suitable
UV 200m
Sample ID
st!
PREC 1510
NI
sU!
PRECISIO
Ni
sU!
PRECISIO
NI
sU!
Compound
Parameter
Min
Max
acido
vaiproico
asyrnm
0.5
1.5
tpusp
arca
resusp
6000
50000
1
Parameter
asymm
Average
0.56492
Compound
acido
vaiproico
%RSD
Low
0.56036
High
0.56866
%RSD
0.746
Status
0.56036
Passed
0.56866
Passed
0.56574
Passed
tpusp
8656
83111
8067
8656
3.702
Passed
PRECISIO
NI
std
PRECISIO
Ni
std
PRECIS1
Ni
sU!
PRECISIO
NI
sU!
PRECISIO
8209
Passed
8067
Passed
area
55420
54866
54383
55420
0.952
Pasaed
54383
Passed
54796
Passed
NI
std
PRECISIO
NI

std
PREC LS LO
NI
std
PRECISIO
NI
std
PRECISIO
NI
resusp
15.80802
17.72504
15.80802
18.79032
9.386
Passed
18.79032
Passed
18.57679
Passed
VALIDACION DEL METODO

PRECISION DEL SISTEMA
PRECISION1
PRECISION1
PRECISION2
PRECISION2
PRECISION3
PRECSION3
PRECISION4
PRECISION4
PRECISION5
PRECISION5
PRECISION6
PRECISION6
54194.00
54190.00
53439.00
0.56
0.57
0.57
52434.00
54143.00
52788.00
54174.00
52215.00
52739.00
0.57
0.57
0.57
0.56
0.56
0.57
0.57
0.57
53359.00
52399.00
52426.00
Mm:
Max:
Mean:
SM 0ev:
%RSD:
52215.00
54194.00
53208.33
801.56
1,51
01122105 02:13:29 PM
15.47
15.39
18.57
19.04
15.11
15.42
15.37
18.76
15.91
0.56
19.31
18.80
18.91
0.56
0.57
0.57
0.00
0.79
15.11
19.31
17.17
1.82
10.59
8271.26
5.64
Ama
Area
Ama
Area
8128.92
8209.16
8679.78
8010.50
8747.92
7998.17
Area
Area
Ama
Area
Ama
8334.76
8662.20
8906.97
8522.23
8640.47
5.62
5.60
5.59
5.54
5.55
5.60
5.60
5.58
5.57
5.55
5.54
7998.17
8906.97
8426.03
306.54
Error!
5.54
5.64
5.58
0.03
Error!
Ama
Area
Ama
sgsetwq
94.22
94.21
92.90
91.16
94.13
91.77
94.18
9178
91.69
92.76
91.10
91.14
90.78
94.22
92.50
1.39
1.51
111 -1

Precision del sistema
Muestra PRECISIONI 1121/05 7:25:28 PM
Minutes
13V - 200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.642
rea
54194
ESTD
Theoretical
concentration plates (USP)
94.216
8271
Totais
54194
94.216
Resolution
(USP)
15.46990
Asymmetiy
0.56295

Muestra PRECISION2 1/21105 7:51:41 PM
0.010
0.005
0.000
-0.005
0
Minutos
UV-200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.600
Arta
53439
ESTD
Theoretical
concentration piales (USP)
92.903
8209
Totais
53439
92.903
Resolution
(USP)
18.57256
Asynuaetiy
0.57282

Muestra PRECISION3 1121105 8:18:40 PM
0-ole
0.005
0.000
-0.005
0
13V - 200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.542
rea
54143
4
Mhutos
ESTD
Theoretical
concentration plates (OSP)
94.127
8010
Totais
54143
94.127
Resolution
(USP)
15.10731
Asymmetiy
037179

Muestra PRECISION4 1121/05 8:45:37 PM
o
4
15V - 200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.604
rea
54174
4
Mtes
ESTD
Theoretical
94.181
7998
Resolution
(USP)
15.36697
Asymmetiy
0.56477

Mjrwtas
Uy - 200mn
Results
Naine
acido
vaiproico
Migration
Time
5.575
Arca
52739
ESTD
Theoretical
concentration plates (U P)
8662
91.686
Resotution
(USP)
15.91363
Asymmetiy
0.57454

Mtrujtos
Uy - 200nzn
Results
Name
acido
valpmico
Migraiion
Time
5.546
rea
52399
ESTO
Theoretical
91.095
8522
Resolution
(USP)
1839611
Asymmetry
0.57464

System is
Suitable
Uy 200nm
Sample ID
aId
exactitud]
su!
exactitud 1
sU!
exactitud 1
std
exactitud!
su!
exactitud 1
std
exactitud!
std
ex actitud 3
sU!
exactitud 1
std
exactitud 1
sU!
exactitud!
sU!
exactitud]
std
exactitud!
Compound
Paranieter
Min
Max
acido
vaiproico
asymm
0.5
1.5
tpusp
arca
resusp
6000
50000
Parameter
asymni
Average
0.56651
Coinpound
acido
vaiproico
%RSD
Low
0.56581
Higb
0.56720
%RSD
0.122
Status
0.56650
Passed
0.56720
Passed
0.56581
Pasaed
tpusp
8014
7638
7424
8014
4.280
Passed
7424
Passed
7476
Passed
arca
64171
65598
64171
66388
1.888
Passed
66236
Passed
66388
Passed
resusp
18.56323
18.20837
17.97694
18.56323
1.714
Passed
17.97694
Passed
18.08493
Passed
VALIDACION DEL MET000

EXACTITUD
74283.00
EXACTITUD1
EXACTITIJD1
EXACTITUD2
EXACTITUD2
74001.00
78627.00
78705,00
74689.00
EXACTITIJD3
EXACTITUO3
74817.00
EXACTITUD4
EXACTITUD4
EXACTITUD5
EXACTITIJD5
EXACTITUD6
EXACTITUO6
0.55
0.56
0.56
0.56
0.56
0.56
0.56
76996.00
76748.00
77545.00
77375.00
70857.00
71153.00
0.56
0.56
0.56
0.56
0.56
Miii:
70857.00
Max:
18705.00
Mean:
75483.00
Std0ev: 2643.10
%RSD:
3.50
0.55
0.56
0.56
0.00
0.31
0122105 02:33:22 PM
-.
46.33
14.02
Area
Arca
5900.27
610101
5.88
5.87
98.83'
98,46
15.92
16.07
Area
5577.54
5.89
99.29
Area
Area
5693.18
6163.42
5.88
5.87
Area
Arca
Area
Area
Area
Area
Area
6318.95
5887.24
5.86
5.88
99.39
98.25
98.41
5799.36
5609.46
5938.23
6571.57
6337.02
5.88
5.90
6.08
13.71
14.06
13.63
16.09
15.87
13.44
17.05
16.69
13.44
17.05
15.24
1.35
8.83
sgsetwq
5577.54
6571.57
5991.44
311.87
Error!
5.88
5.86
5.86
6.08
5.89
0.06
Error!
100.90
100.57
100.48
100.26
100.84
101.27
98.25
101.27
99.75
1.09
1.10

EXACTITUD
Muestra std exactitudl 10123104 12:26:05 PM
o
c
Uy - 200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
6.096
4
Minutes
Arca
ESTD
Theoretical
66388 13.900 CAL
7476
Totais
66388 1 113.900CAL
Resolution
(USP)
18.08493
Asymmetiy
0.56581

EXACTITUD
Muestra EXACTITUD1 1015104 6:03:24 PM
10
MMutes
UV-200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migralion
Time
5.879
Arta
74283
ES11)
Theoretical
concentration pintes (USP)
98.835
5900
Totais
74283
Resotution
(USP)
16.33166
Asymmetry
0.55493

EXACTITUD
Muestra EXACTITUD2 10/5/04 7:21:53 PM
10
Minutes
UY - 200nm
Results
Nanie
acido
vaipro leo
Migration
Time
5.879
Arca
78705
ESTD
Theoreticai
coneentration piales (US?)
99.387
5693
Resolution
(USP)
16.06922
Asymmetry
0.55825

EXACTITUD
0.010
< 0.005
0.000
&
10
MZnutes
UV-200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.867
Arca
74689
ESTD
Theoretical
98.246
6163
Totais
74689
98.246
Resolution
(liS?)
13.70728
Asymmetiy
0.55692

EXACTITUD
0.010
< 0.005
0.000
lO
Mtnules
UV-200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migrafion
Time
rea
5.875
76748
Theoretical
ESTI)
100.573
5799
Resolution
((ISP)
16.09486
Asymmetiy
0.55720

EXACTITUD
o
o
o
6
0.010
o
o
o
0.010
o -
Or
1)
fo
fO
< 0.005
0.005 <
['I']
0.000
lO
Minutos
Uy - 200nm
Results
Name
acido
valproieo
Migration
Time
6.083
Arca
77375
ESTD
Theoretical
100.260
5938
Resolution
(USP)
13.43806
Asymmetiy
0.55991

EXACTITUD
10
Mirmies
0V - 200nm
Results
Name
acido
valproico
Migration
Time
5.862
rea
71153
ESTD
Theoretical
concentration plates (US?)
101.266
6337
Totais
71153
101.266
Resolution
(OSP)
16.69054
Asymznetiy
0.55929

VALIDACION DEL METODO ANALITICON
ROBUSTEZ. ESTABILIDAD DEL BUFFER
System is
Suitable
UV -
200nm
Compound Parameter Min

acido
vatproico
Sample ID
Compound
acido
vaiproico
asymm
0.5
tpusp
arca
resusp
6000
50000
1
Parameter
asy'nm
Average
0.56892
Max
%RSI)
1.5
Low
0.56490
HIgJI
0.57332
%RSD
0.742
Status
Passed
Passed
Passed
std robustez
std robustez
std robustez
0.56853
0.57332
0.56490
tpusp
8523
8495
8721
8580
std robustez
std robustez
std robustez
arca
51778
52825
51197
51933
stil robustez
std robustez
std robustez
resusp
18.80345
18.69675
18.99162
18.83061
std robustez
st! robustez
std robustez
8495
8721
1.433
Passed
Passed
Passed
51197
52825
1.589
Passed
Passed
18.69675
18.99162
0.793
Passed
Passed
Passed

Robustez. Estabilidad del buffer
estabilidad bufi
estabilidad buff
estabilidad buff
estabilidad buff
estabilidad buff
estabilidad buff
estabilidad buff
estabilidad buff
estabilidad buff
estabilidad buff
estabilidad buff
estabilidad buff
estabilidad buff
estabilidad buff
estabilidad butf
estabilidad buff
estabilidad buff 2 REP.,.
estabilidad buff 2 REP...
53874.00
53262.00
53162.00
53274.00
53262.00
52373.00
54310.00
52948.00
54003.00
53417.00
53648.00
53850.00
54298.00
53623.00
54005.00
53512.00
5371100
53732.00
53639.00
53456.00
54104.00
54241 .00
54536.00
Mm: 52373.00
Max: 54536.00
Mean: 53662.91
Std 0ev: 498.19
%RSD: Errori
01124105 05:38:23 PM
0.57 0.57
0.57
0.58
0.57
0.57
0.56
0.57
0.57
0.58
0.57
0.57
0.57
0.57
0.57
0.57
0.57
0.58
0.57
0.57
0.57
0.57
0.57
19.30
15.86
15.72
19.63
19.39
16.08
19.44
15.79
15.86
19.11
15.60
15.52
19.05
19.12
18.99
15.62
15.54
19.46
19.21
19.17
19.03
15.45
19.30
0.56
0.58
0.57
0.00
Enori
15.45
19.63
17.71
1.81
Error!
Ama
Area
Arca
Area
Aiea
Ama
Ama
Area
Area
Ama
Ama
Aiea
Area
Area
Ama
Ama
Area
Area
Ama
Area
Area
Aiea
Area
sgsetwq
9092.06
8813.55
9134.70
9399.81
9188.73
9413,49
9265.85
9280.65
9235.73
9052.56
8814.84
9177.62
9014.97
9122.14
9014.20
9064.29
9085.03
9516.66
9258.58
9238.63
9105.46
9048.33
9428.16
5.50
5.50
5.49
5.47
5.48
5.48
5.47
5.45
5.42
5.40
5.42
5.40
5.40
5.40
5.40
5.39
5.40
5.40
5.40
5.40
5.40
5.38
5.39
104.67
103.48
103.29
103.50
103.48
101.75
105.52
102.87
104.92
103.78
104.23
104.62
105.49
104.18
104.92
103.97
104.37
104.39
104,21
103.86
10512
105.38
105,96
8813.55
9516.66
9163.74
178.25
Error!
5.38
5.50
5.43
0.04
Error!
101.75
105.96
104.26
0.97
0.93

ROBUSTEZ
MTA:estabilidad buff 1/22/05 11:57:37 AM
0.010
0.005
0.000
Minutes
VV - 200nm
Results
Name
acido
vaipro leo
Migralion
Time
5.496
rea
53262
ESTD
Theoretieal
coneentration plates (USP)
8814
103.481
Totais
53262
103.481
Resolution
(USI')
15.85667
Asymmeuy
0.57402

ROBUSTEZ
MTA:estabilidad buff 1/22/05 1:01:36 PM
0.010
0.005
3
4
0,
Minutes
Uy - 200nm
Rtsults
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.467
Arca
54310
ESTD
Theorecal
105.518
9266
Resolution
(USP)
19.44262
Asymmetry
0.56348

ROBUSTEZ
MTA:estabilidad buff 1/22105 12:23:12 PM
0.010
0.005
D
0.000
Minutes
UV-200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.475
Arca
53274
Totais
53274
Theoretical
ESTD
9400
103.505
103.505
Resolution
(USP)
19.62664
Asymmetry
0.57854

ROBUSTEZ
MTA:estabilidad bufE 1122/05 11:44:39 AM
Uy - 200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
rea
5.496
53874
4
Mu1es
ESTD
Theoretical
concentration piales (USP)
104.670
9092
Resolution
(USP)
19.30179
Asymmetiy
0.57110

VALIDACION DEL METODO ANALITI.CO
ROBUSTEZ
MTA:std robustez 1121105 10:08:32 PM
Minutos
Uy - 200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.554
Arca
ESTD
Theoretical
51778 100.900 CAL
8523
Totais
51778 100.900 CAL
Resolution
(USP)
18.80345
Asymmey
0.56853

ROBUSTEZ
MTA:estabilidad buff 2 REP 17 A... 1122/05 4:59:55 PM
- ..---
iL
0.005
oo
o
6
o
co
Ro
oq
ej'O
a,
e,0
o
'o
co
- co
3
-0.005
oO
0
o
o
.3
o
o
.3
o
co
a,
e,
e,
ci
U) r'-
-' -'-H
u,
o rcDej
tca,
-0.010
0
VV - 200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
4.354
rea
77678

4
Minutes
Theoretical
ESTD
0
150.919
Totais
77678
150.919
Resolution
(USP)
10.58762
Asymmet'y
0.00000

ROBUSTEZ
Minutos
13V - 200nm
Results
Name
acido
valproico
Migration
Time
5.388
rea
54536
ESTD
concentration
105.957
Theoretical
plates (IJSP)
9428
Resolution
(US?)
19.29959
Asymmetry
0.56704

ROBUSTEZ
MTA:estabilidad buff 2 REP 17 A... 1122105 4:34:18 PM
o
0.010
S o
0.010
y.1
o
o
9
o
04
0.000
Ii
tu
Mh,utes
UV - 200nm
Results
Name
acido
valproico
Migration
Time
5.383
Area
54241
ESTD
Theoretical
105.384
9048
Totais
54241 1
105.384
Resolution
(USP)
15.45022
Asymmetry
0.56685

ROBUSTEZ
MTA:estabjljdad buff 2 REP 17 A... 1/22/054:21:30 PM
o_ola-]
r-$
0.010
o
o
111l
0.005
D
0.000
-0.005

O
Minutes
UV - 200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
rea
5.400
54104
ESTI)
Theoretical
105.117
9105
Totais
54104 1
105.117
Resolution
(USP)
19.03297
Asymmetry
0.56730

ROBUSTEZ
Minules
UY - 200nm
Results
Name
acido
va lproic o
Migration
Time
5400
rea
53456
ESTI)
Theoretical
concentntion plates (USP)
103.858
9239
Resolution
(USP)
19.17164
Asymmetiy
0.56746

ROBUSTEZ
0.010
rl
0.005
0.005
N
o-o)
co,
co
co,
u)
o
o
o
a
0.000
o
o
o
m
-0,005
0
Minutos
UV-200nm
Results
Name
acido
va Ip ro ic o
Migration
Time
5.396
rea
53639
ESTD
Theoretical
104.214
9259
Totais
53639
104.214
Resolution
(USP)
19.20716
Asymmetry
0.57340

ROBUSTEZ
0.010
0.005
D
0.000
-0.005
0
Mfriutes
UY - 200nm
Resu lis
Name
acido
va iproic o
Migiation
Time
5.400
rea
53732
ESTD
Theoretieat
104.395
9517
Resolution
(USP)
19.45798
Asymmelry
0.57700

ROBUSTEZ
MTA:estabilidad buff 2 REP 17 A... 1122105 3:30:18 PM
0.010
0.005
D
0.000
-0.005
0
LJV-200nm
Results
Name
acido
valproico
Migration
Time
5.404
Arca
53718
4
Miriules
ESTD
Theoretical
104.367
9085
Totais
53718
104.367
Resolution
(US?)
15.53605
Asymmetry
0.57090

ROBUSTEZ
MTA:estabflidad buff 1/22105 2:56:56 PM
0.010
0.005
o
0.000
-0.005
0
Minutes
Uy - 200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.388
Arta
53512
ESTD
Theoretical
103.967
9064
Resolution
(IJSP)
15.62163
Asymmetry
0.56943

ROBUSTEZ
MTA:estabilidad buff 1/22/05 2:31:15 PM
0.010
0.005
J
0.000
-0.005
0
Minutes
UV-200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migntion
Time
5.400
rea
53623
ESTD
Theoretical
104i83
9122
Totais
53623 1
104.183
Resolution
(USP)
19.12409
Asymmetiy
0.57281

ROBUSTEZ
MTA:estabilidad buff 1122105 2:44:06 PM
0-ola
0.010
0.005
0.005
0,000
o
-o
ID
-0.005
0
Minutes
Uy - 200nm
Re su Its
Name
acido
va Ip ro e o
Migration
Time
5.396
Arca
54005
ESTD
Theoretical
coneentration piafes (USP)
104.925
9014
Totais
54005
104.925
Resolution
(USP)
18.98863
Asyminetry
0.57214

ROBUSTEZ
MTA:estabilidaci buff 1/22/05 2:05:37 PM
0-ola
0.005
o
0.000
-0.005
0
VV - 200nm
Results
Name
acido
va Ip ro ico
Migration
Time
5.400
rea
53850
4
Minutes
ESTD
Theoretical
104.624
9178
Totals
53850
104.624
Resolution
(USP)
15.51562
symmetry
0.56776

ROBUSTEZ
MTA:estabilidad buff 1/22105 2:18:25 PM
0.010
0.005
3
4
3
4
0.000
-0.005
0
UV-200nm
Resuits
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.400
Arca
54298
4
Minutes
ESTD
conceritration
105.494
Theoretical
plates (USP)
9015
Totais
54298
105.494 - -
Resolution
(USP)
19.04805
Asymmetry
0.56621
-- - ---u


ROBUSTEZ
MTA:estabjjjdad buff 1/22/05 1:40:00 PM
-0.010
Id
ci
0
0.005-
r0.005
e.l
------------ -
.
-
---.
0.000--
O).
o
-
o
o
O
-0.0051
0
IJV - 200nm
Results
Name
acido
va Ip roic o
- -0.005
1
Migmtion
Time
5.404
Area
53417
4
Mutos
ESTD
Theoretical
103.783
9053
Totais
53417 1
103,783
Resolution
(USP)
1910968
Asymmetry
0.57627

VALIDACION DEL METODO ANALITICON
System is
Suitable
1W -
200nm
Compotmd Panmeter Min

acido
vaiproico
Sample ID
STO LIN
SISTI
STO UN
SISTI
STO LIN
SIST1
STO LiN
SISTI
STO UN
SISTI
STO LIN
SISTI
STO LEN
SISTI
STO UN
SISTI
Compound
acido
valproico
asymm
0.5
tpusp
area
rcsusp
6000
50000
1
Parameter
asymm
Average
0.56013
Max
%RSD
1.5
Low
0.55907
111gb
0.56119
%RSD
0.268
Status
0.56119
Passed
0.55907
Passed
tpusp
6999
6983
6967
6999
0.323
Passed
Passed
6967
arca
69686
69452
69217
69686
0.478
Passed
Passed
69217
resusp
17.48246
14.70641
16.09443
14.70641
17.48246
12.197
Passed
Passed

UY- 200nm
Sample ID
LINEARIDAO150
LINEARIDAD150
LINEARIDAD125ni
acido val... acidovaL. acido vaL, icido vaL.

Asyxnmetiy Resolutiofl Quantitati...
Ama
89450.00
0.56
13.43
Ama
0.56
13.22
88756.00
Ama
15,64
Ama
66662.00
0.56
LINEARIDAO125m
LINEARIOAO100m
LINEARIOAOIOm
73319.00
58417.00
58831.00
0.56
0.57
0.57
15.09
18.33
17.99
Ama
Ama
Aiea
LINEARIOAD75rn
LINEARIDAD75ni
41978.00
42378.00
0.58
0.59
16.57
16.93
Aiea
Ama
LINEARIDAD50rn
LINEARIOAD5Om
LINEARIDAD150-2m
LINEARIDAD150-2rn
UNEARIDAD125-2m
LINEARIOAO125-2m
LINEARIOAD100-2m
LINEARIDAD100-2m
LINEARIDAD75-2m
LINEARIDAO75-2n,
LINEARIDAD50-2m
LINEARIOAD50-2m
LINEARIDAD150-3m
LINEARIDAD150-3m
LINEARIDAD125-3m
LINEARIDADI25-3m
LINEARIDADI00-3m
LINEARIOAD100-3m
LINEARIDAD75-3m
LINEARIDAD75-3m
LINEARIDAO50-3m
LINEARIDADSO-3m
29194.00
28933.00
88762.00
87511.00
73573.00
73312.00
56323.00
56021.00
42731.00
41316.00
27745.00
27306.00
84865.00
84118.00
69910.00
70634.00
56371.00
57061.00
41807.00
40707.00
27802.00
28194.00
0.60
0.60
0.56
0.56
0.57
0.57
0.58
0.57
24.85
24.28
15.64
15.48
16.73
16.64
18,81
18.72
Ama
Aiea
Aiea
Aiea
Ama
Arca
Ama
Aiea
0.56
0.58
0.61
0.59
156
0.56
0.00
0.56
0.57
0.57
0.59
0.58
0.61
0.59
21.80
21.35
19.37
25.14
Aiea
Ama
Ama
Arca
Aiea
Aiea
Ama
Arca
Aiea
Aiea
Aiea
Aiea
Aiea
Arca
27306.00
89450.00
57132.90
21285.27
37.26
0.00
0.61
0.56
0.11
19.08
1.41
25.61
17.70
5.56
31.42
Mm:
Max:
Mean:
8W Dcv:
%RSD:
01122105 03:00:27 PM
2.91
15.77
1.41
16.98
18.78
14.98
2149
21.63
25,41
25.61
sgsetwq
acido val... acidova... acido...

theoretic... Migration... ESTD...
5487.66
5.94
151.38
5496.18
5.84
150.21
8256.76
112.82
6.59
124.08
7818.63
6.34
8108.03
5.69
98,86
7870.18
5.65
99.56
71.04
10893.26
5.60
10984.30
5.61
15520.17
14966.90
5781.54
5714.78
6756.46
6726.86
8715.33
8645.83
11859.36
1151215
17128.00
16217.57
6079.86
6008.19
7131.11
7120,51
8848.62
8582.99
11879.63
11968.86
16982.19
17189.71
5.55
5.52
5.71
5.66
5.60
5.63
5.56
5.55
5.47
5.69
5.61
5.55
5.53
5.49
5.46
5.40
5.42
134
535
73.04
49.05
48.27
147.04
145.75
121.13
122.39
97.67
98.87
72.44
70.53
4817
48.85
5487.66
17189.71
9875.05
3842.13
38.91
5.34
6.59
5.63
0.26
En'or!
48.17
156.91
98.89
36.89
37,31
5.52
5.50
5.44
71.72
4941
48.97
156.91
154.70
130.06
129.60
99.57
99.03
75,54

Muestra STD LIN SIST1 10123104 2:08:38 PM
0.010-
Q
o
.-
--
_--t-----0.010
cs
0.005-
o
(6
--------o..
'o
0.000- -
-0.005
'-
-0.000
nl
>
o
o
o
-0.005-
(0
4
Mh,ules
Migration
Time
rea
5.725
69217
ESTD
concentration
121.300 CAL
--0.005
6
UV - 200nm
Results
Name
acido
va Ipro leo
Totais
69217 1 121.300 CAL
Tbcoretical
plates (USP)
6967
Resolution
(USP)
14.70641
Asymmetry
0.55907

Muestra LINEARIDAD150 10116104 3:10:23 PM
--- . .-4-
9
0.005
o
to
a
a
-
0.000
,-
-0.000
o,
o
(3
a
-
o
O
o
11V - 200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Mgraoa
Time
5.942
4
Mitt
Asea
ESTD
concentation
151.384
89450
Theorcticai
plates (USP)
5488
-0.005
Resolution
(IJSP)
13.43302
Asymmetry
0.55666

VALIDACION DEL MET000 ANALTICO
LNEARIDAD DEL SISTEMA
Muestra LINEARIDAD125m 10/18104 9:22:02 AM
--------
0.010
---- -
o
6
(O
$
O
e.'
0.005
c
J.
....
(.4
co
co
----' rs
co
'o
o
b.
0.000-
u'-,
2a
>
o
o
o
co
Mm
EV - 200nm
Results
Name
acido
va LP ro ic o
Migration
Time
6.588
rea
66662
ESTD
Theoretic.al
112.818
8257
Totais
66662 1
112.818
Resohation
(USP)
15.64388
Asymmetry
0.56234

Muestra LINEARIDADIOOm 10116104 4:09:26 PM
0.010
o
o
9
o-o
8
o
e)
0005
cO
In
o
D
--
('1
o
O
- ---
It)
a'
e')
o
'o
o
o
0.000
o,
o,
u)
o.
0
>
o
o
o
o
0
UY - 200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Totais
Migration
Time
5.650
rea
58831
58831 1
4
Mhmtas
fleoretical
ESTE)
conccntration plates (USP)
99.565
7870
99.565
Resolution
(USP)
17.99142
Asymmetry
0.56749

Muestra LINEARIDAD75m 10116104 4:22:16 PM
0.010
0.010
-
0.005
3
------o
000
0.000
i
o,
o
y
-0.005
0
200nm
Results
Name
Uy -
acido
vaiproico
Migraon
Time
5,604
Arca
41978
ESTD
Theoretical
concajiration platas (1.JSP)
71.043
10893
Resotution
(USP)
16.56858
Asymmetiy
0.58173

Muestra UNEARIDAD50m 10116104 5:00:42 PM
-k
o
o
2
o
0005
0.005
(1
-i
-
---...
a,
0.000
o,o,
o,
8d
o
o.
o>
IP
o
o
o
-0.0051

o
UY - 200nm
Re su lts
Name
acido
va iproic o
0.000
el
oo
-0.005
1
Migration
Time
5.521
Arca
28933
ESTD
fleoretical
concentration platas (USP)
48.966
14967
Totais
28933 1
48.966
Resolution
(USP)
24.28319
Asymmetry
0.60193

Muestra LINEARIDADI50-2m 10116104 5:35:28 PM
0.010
0.010
o
o
o
o
-g
0.005
o
-.0
0.005
--o
r
og-
0)
cc
3d
c'iI
-
0.000
o
*IN
--
o
03
0.000
a)
o
o
e._
a
w
o
D
o
a
0.005
UV - 200nni
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.713
ATIC3
88762
ESTE)
Theoreticai
concaitntion plata (USP)
156.910
5782
Totais
88762
-0.005
156.910
Resolution
(USP)
15.63988
Asymmetzy
0.55985

Muestra LINEARIDAD125-2m 10116104 6:13:56 PM
0.010
0.010
o
o
ci
o
o
s
('1
o
o
'o
0.005
o
oo
s
1)
1.
0.005
a3
t4
.e.l
Pl
o.h
6It,
0.000
o
o
O:
0.000
tu
>
o
o
u
tu
-0.005
-0.005
Uy - 200nm
Results
Name
acido
vaLproico
Migration
Time
rea
5.596
73312
4
Mfrwte,
ESTI)
Theoretical
129.598
6727
Totas
73312 1
129.598
Resolution
(OSP)
16.64165
Asymmetiy
0.56817

Muestra LINEARIDADI00-2m 10/16104 6:26:45 PM
0.010-
..---
- -
4----
-aOjO
.6
-n
o
o
o
ci
0.005-
-0.005
................_..-_
'o
Y..-
-0_000
1
>
O
L3
o
03
-0.005-
-0.005
0
MflI
UV-200nm
Res uits
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.563
Arca
56323
ESTD
Theorcticai
conceiilmtion piales (USP)
99.565
8715
Resolution
(USP)
18.81104
Asymmetry
0.57737

.---
-------
01
Ql
-H
0.005-
C
0.000-(
--e.
0.000
1
0
1JV - 200am
Results
Name
acido
vaLproieo
Migration
Time
5.517
rea
42731
4
Mi
ESTI)
Theorctical
concentration platcs (USP)
75.538
11859
Totais
42731 1
75.538
Resolution
(USP)
21.79659
Asyrnmey
0.56377

VALORACIQN ACIDO VALPROICO
r0 ,
80
8o
01
r
O.00S
o,
00
cj o,[
Ib
o.2
m>
o
-0M05
0
Mkfls
Uy - 200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.688
Arca
84865
ESTE)
TheoTeticiI
concentntion plates (USI')
147.044
6080
Resolution
(USP)
2.91383
Asymmetry
0.56169

-
------.j-
-.:1
6
'o
o
e
0.00500
-0.0050
.
(0
0.0025-
..
...
co
.c.J
N
-0.0075
o
-0.0025
:-0
0.0000-!
T00
i5
-00025
UV - 200nm
Results
Name
acido
valproico
Migration
Time
tea
5.442
27745
4
Mhms
ESTD
Theoretica!
conceniration plates (USP)
49.046
17128
Tota Ls
27745 1
49.046
Resolution
(USP)
19.36567
Asymmetry
0.60765
REPORTE DE SERVICIO SOCIA(..

o.oio-j
0
0
-.
--- /
-----.'------
J--------'-.,-------.-.\-.-t--1
t-aoio
0
Id,
a'--CI
la
0.005
--,w-
0.005
----------------------01
0.000-
auno
Li
y
>
o
-0.005
o
0
1-0.005
6
MSjs
11V - 200nm
Re su Its
Name
acido
valpmico
Migration
Time
5.546
rea
69910
ESTD
concentration
121.132
Theoreticai
plates (USP)
7131
Resolution
(USP)
1.41140
Asymrnetry
0.00000

0.010
-0.010
o
o
---
$0
0.005 -:
0N5
'e.
Fi
DM00,
co
ti)
0.000
0o
a
Y
4005
UY . 200nm
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.487
Area
56371
Totais
56371 1
--0.005
4
MSPs
ESTD
Thcoretical
concaitration platcs (USP)
97.673
8849
Resolution
(USP)
18.78485
Asymmetry
0.57041

VALIDACION DEL MET000 ANLITICO
0.010
6
LO
0)
cs
0.005
0.005
rl:
0.000
2
>
o
2
-0.005
.0005
0
Mk
UY - 200nrn
Results
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.400
Arca
41807
ESTD
Thcorctical
conitralion plates (USP)
71438
11880
Resolufion
(USP)
21.48757
Asymmetiy
0.58833

o4
Uy - 200nm
Res ults
Name
acido
vaiproico
Migration
Time
5.354
rea
28194
ESTD
Ttworetical
conceatration piales (USP)
48.851
17190
Totais
28194:
48.851
Resotution
(USP)
25.60972
Asymmetry
0.59311

Electroforesis

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/3C1

%. XOCHIMII.CO SERVICIOS DE INFIIRMEI

UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA

Asesores: M. en C. Ma. Luisa Margarita Vzquez Ramrez

1. Caractersticas generales del cido valproico

II. Caractersticas generales de la electroforesis capilar

III. Validacin de mtodos analticos en electroforesis capilar

OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECFICOS

RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS

El AV es uno de los antiepilpticos ms utilizados en todo el mundo,

Actualmente el mtodo analtico para la valoracin del AV como materia prima

1.- CARACTERSTICAS GENERALES DEL CIDO VALPRICO

1.1 Nombres qumicos

1.2 Peso molecular, frmula desarrollada y condensada.

2.0 Propiedades fisicoqumicas

2.1 Constante de disociacin

Los siguientes valores de solubilidad han sido determinados para AV

HcI aq. 0.1 N

2.3 Espectro UI! e IR

El Espectro UY que se muestra a continuacin es a partir de una solucin de

ESPECTRO UVNIS CIDO VALPROICO

El espectro infrarrojo fue medido usando el mtodo capilar.

ESPECTRO INFRARROJO CIDO VALPROICO

2.4 ndice de refraccin

El AV tiene un ndice de refraccin de ND245: 1.425

2.5 Gravedad especfica

La gravedad especfica del AV a 25 oc tiene un valor de 0.904 g/mL

Es un cido graso, con un perfil nico de accin anticonvulsivante tanto

5.0 Farmacocintica y metabolismo del frmaco

El AV es un frmaco que se une a las protenas plasmticas, el volumen de

en el cerebro. El matabolito 2-en-VPA es aproximadamente 1.3 veces ms potente

El mecanismo preciso de su accin anticonvulsivante es an desconocido. Se ha

El AV puede disminuir la unin a protenas sricas o bloquear el metabolismo

Se han comunicado ms de 40 casos de insuficiencia heptica fatal en pacientes que

Los efectos colaterales ms frecuente en pacientes que reciben monoterapia

7.0 FORMA FARMACUTICA

II.- CARACTERSTICAS GENERALES DE LA ELECTROFORTESIS

1.0 Definicin de electroforesis

Las tcnicas que ms se han desarrollado estn en la actualidad aplicadas al campo

Fig 1. Electroforesis en placa

desarrollaron las separaciones empleando electroforesis en capilares de 200

jim de dimetro interno en vidrio y tefln respectivamente.

tericamente las relaciones entre los parmetros operacionales y las cualidades de

Los capilares de 75 a 100 cm de largo y con dimetros internos de

La fuerza electroosmtica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie

Frente pwabkco - HPIC

rio. a comparacin entre Ec y HF'LC

La EC separa iones de acuerdo a la movilidad del electrolito en lugar de una

La ventaja de esta tcnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se

Con esta tcnica descrita es posible separar cationes, aniones, protenas,

En el rea biofarmacutica, para el control de calidad de productos farmacuticos

Como todo desarrollo de un rea analtica nueva, la incorporacin de tcnicas

3.0 Desarrollos tecnolgicos que contribuyeron ala EC

1. Los capilares de slica fundido revolucionaron la cromatografa de gases (CC) y

Las separaciones se realizan empleando mecanismos tradicionales, en un

Las separaciones se obtienen en pocos minutos, en lnea con la corrida,

La EC ofrece mayores ventajas para la separacin de iones que la cromatografa

La fuerza elctrica est representada en la siguiente ecuacin

La movilidad electrofortica se le encuentra usualmente en las tablas de constantes

6.0 Principio fisicoqumico

12 ECWB -3 1.2 DIMM

Las muestras son introducidas en el capilar de dos modos, migracin hidrosttica y

Durante la inyeccin electrofortica (electromigracin), el capilar est sumergido