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SofiaBustosLorenaNavarreteJocelynOrellana
Este cuestionario debe ser desarrollado por grupos de 3 o 4 estudiantes. Los
grupos se indican en el archivo excel que est en la carpeta de la pgina web del
curso.Eltiempomximodeentregaeselprximo18demarzode2016.
1 Los anticuerpos son molculas ampliamente utilizadas en tcnicas inmunolgicas.
Respondaclaraybrevementelassiguientepreguntas:
a. Quesunanticuerpo?
Los anticuerpos son protenasproducidasenlosvertebradosenrespuestaala
exposicin a estructuras extraas conocidas como antgenos. Los anticuerpos
son increblemente diversos y especficos en su capacidad para reconocer
formas extraas, y son los principales mediadores de la inmunidad humoral
frenteatodotipodemicrobios.(1)
Western blot:
Esta tcnica de inmunotransferencia permite la deteccin y
caracterizacin de protenas mediante el reconocimiento entre antgeno y
anticuerpo.Para ello debe haber una separacin por electroforesis segn su
peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Posteriormente se realiza una
transferencia cuantitativa e irreversible a una membrana de PVDF de las
protenas de una mezcla compleja (lisado total celular). Los antgenos quese
han transferido a lamembranasonreconocidosporanticuerposmonoclonales
o policlonales especficos de ellos.
Finalmente, se detecta la
unin
antgenoanticuerpo por
actividad enzimtica o
fluorescencia
, entre otros
mtodos.(3)
Inmunoprecipitacin:
Es la tcnica mediante la cual un antgenoproteicoes
precipitado de unasolucinusandounanticuerpoque seuneespecficamente
aesaprotena.
Este proceso puede ser usado para aislar y concentrar un protena particular
deunamuestraquecontienemuchosmilesdeprotenasdistintas.
En algn momento del procedimiento, la inmunoprecipitacin requiere de que
elanticuerpoesteacopladoaunsubstratoslido.(4)
ELISA directo:
En esta tcnica se cubren los pocillos con la muestra, inmovilizando los
antgenos que se presumen est dentro de esta, posteriormente se incuban con
anticuerpos marcados capazde generarunproductodetectable,yaseaconuncambiode
coloroalgnotrotipo,losqueevidenciaranlapresenciadeantgenos.
ELISA Sandwich:
En este tipo de elisa se adhiere al pocillo un primer anticuerpo anti
antgeno, luego de lavar el exceso se agrega la muestra, que ser retenida al ser
reconocida por el primer anticuerpo. Luego de un segundo lavado donde se retira el
materialoadheridoalanticuerpo,seagregaunsegundoanticuerpoconunamarca.
Esta variedad de ELISA posee mayor especificidad y sensibilidad que los dems, yaque
el segundo anticuerpo permite amplificar la seal, sin embargo solo permite la deteccin
delantgenoynodelanticuerpo(5).
AplicacionesdelmtodoELISA:
DiagnsticoparaelVIH
Testdeembarazo
Enfermedadesautoinmune
Enfermedadesproducidasporvirusenfrutas
Enfermedadesproducidasporbacteriascomo
Mycobacteriumtuberculosis
CuantificacindeinmunoglobulinasIgG
IgE
IgA
Fluorescente:
variacin del colorimtrico, la enzima convierte el sustrato en un
producto de reaccin que emite fluorescencia cuando es excitado a una
determinada longitud de onda, siendo las unidades relativas de fluorescencia
(fotonesdeluzemitidos)proporcionalesalacantidaddeproductoanalizado
Este mtodo de cuantificacin es ligeramente mssensiblequeelcolorimtrico,ya
que ampla el rango de medida a pesar de ser susceptible a cambios en el pH,
temperatura, concentracin inica, concentracin de detergente, secado, y a la
matrizslida,locualpuedeconduciradistorsindeluz.(7)
Luminiscencia:
Similar a la fluorescencia, una enzima transforma un substrato e
unproductoqueemitefotonesenlugardedarcolorvisible.
hay distintas formas de luminiscencia dependiendo de la forma en que se alcanza
elestadoexcitado.(7)
a. Qu es un
Cluster of differentiation (CD) y paraquseusan?Adems,
Cmo se mide e interpreta la expresin de estos CDs en las clulas del
sistemainmune?
Son molculas marcadoras en la superficie celular, que reconocen ciertos anticuerpos, y
aon utilizadas para la identificacin del tipo de clula, etapa de la diferenciacin celulary
actividad de esta misma. Es un sistema de antgenos de superficie celular de los
leucocitoshumanos, quesecaracterizanmedianteanticuerposmonoclonales,permitiendo
la categorizacin de los leucocitos y otras clulas hematopoyticas (de la sangre).
Tambinseconocencomocmulodedeterminantesodedesignaciones.
Debido a que durante la maduracin y diferenciacin, los linfocitos inmaduros van
recibiendo en su superficie una serie de receptores inmunitarios, se denomina a dichos
compuestos marcadores de
diferenciacin,puesledanalaclulalinfocticacomponentes
fenotpicosnicosdelaetapadediferenciacinenqueestn.(10)
b. Queslacitometradeflujo?
Elprincipioenelquesebasaestatcnica:
Hacer pasar clulas u otras partculas en suspensin alineadas y de una en una por
delante de un haz luminoso. La informacin producida puede agruparse en dos tipos
Este tipo de tincin o marcaje es posible utilizarla, por ejemplo, mediante el uso de
microscopaconfocalodefluorescencia.(12)
Tinciones
Quescadamolcula
Linfocitos
1.CD4
2.CD8
3.CD3
Monocitoso
macrfagos
1.CD68
2.CD16
3.CD13
Es una
molcula que se expresa en la superficie de algunas
clulas T y en las
clulas dendrticas
. Es una glucoprotena
monomrica de59
kDa de peso quecontiene cuatrodominios
(D1,D2,D3,D4)detipo
inmunoglobulinas
.(13)
CD8(Cmulode diferenciacin 8oclusterofdifferentation,en
ingls
), es una molcula que se expresa en la superficie de
algunas
clulas T
, conocidos como citolticas. Es una
glucoprotenadimricade 6570
kDaque cruza la
membranay
participa como coreceptoren la estabilizacin delaadhesin
del receptor de linfocitosTa
molculasdelComplejoMayorde
Histocompatibilidad tipo I (MHC I). Implicada tambin en la
maduracin
tmica de linfocitos T y en la transmisin de
sealesintracelularesdurantelaactivacindelHLAI.(14)
EninmunologasedenominaCD3(delinglsclusterof
differentiation)auntipodeantgenoCDpropiodelsistema
inmunedemamferos.Secaracterizaporposeerunpeso
molecularde:2528:20,:20kDaysunaturaleza
bioqumicaloencuadradentrodelafamiliadelas
inmunoglobulinas.Sufuncinbiolgicaenlaclulaes:
intervenirenlatransduccindeseales,expresindelTCRen
lasuperficiedelaclulayasociacinaesteltimoreceptor.Se
expresaespecficamenteentimocitosyclulasT.(15)(16)
CD68(Cmulodediferenciacin68oclusterofdifferentiation
68,eningls)esunaglicoprotenaexpresadaenlamembrana
plasmticadelosmacrfagos.LafuncindeCD68pareceser
lacaptacindelipoprotenasdebajadensidad.
LamacrosialinaeselequivalentedeCD68enratones.(17)(18)
En
inmunologa se denomina CD16 (del
ingls cluster of
differentiation 16)oFcRIIIauntipodeantgenoCDpropiodel
sistema inmune de
mamferos
. Se caracteriza por poseer un
peso molecular de 5080
kDa y su naturaleza bioqumica lo
encuadra dentro de la familia de las
inmunoglobulinas
. Su
funcinbiolgica enla
clulaes: actuar comocomponente del
receptor de baja afinidad para
Fc
, FcRIII, y mediar en la
fagocitosis y citotoxicidad debida a clulas dependientes de
anticuerpos. Se expresa especficamente en neutrfilos,
clulasNKymacrfagos
.(19)
En
inmunologa se denomina CD13 (del
ingls cluster of
differentiation 13) o aminopeptidasa N a un tipo de
antgeno
CD propio del sistema inmune de mamferos. Se caracteriza
porposeer un
peso molecular de 150170
kDaysunaturaleza
bioqumica lo encuadra dentro de la familia de
enzimas
metaloproteasas. Una de sus
funciones biolgicas conocidas
hastahoyen la clula es:hidrolizar protenas con suactividad
metaloproteasa de zinc. Se
expresa especficamente en
clulasmielomonocticas
.(20)
InformacinExtra
(21)(22)(23)(24)
:
Anticuerpos monoclonales: sustancias homogneas con accin sobre un solo
determinanteantignico(epitopo:epi=sobretopo=lugar),producidosporuncloncelular.
CD1ATimocitos
CD2
ReceptordeErosetas,molculadeadhesincelular,aumentalaafinidaddelainteraccincelular.
CD3
ClulasT
CD4
ClulasTmolculassuperficiales,cooperadoras/inductoras
CD5
ClulasT,subpoblacindeclulasbeta
CD6
ClulasT
CD7
ClulasT,clulasNK(Naturalkillers=destructorasnaturales)
CD8
ClulasT,molculassuperficiales,citotxicas/supresoras
CD9
ClulasTactivadas,clulaspreByplaquetas
CD10
Antgenodeleucemialinfoblsticaagudacomn,granulocitos.
CD11
ClulasTsupresoras,clulasNK,monocitos,granulocitos
CD13
Monocitos,granulocitos
CD14Monocitos,granulocitos:Seexpresaespecficamenteenclulasmielomonocticas.
CD15
Monocitos,granulocitos
CD16
ReceptorFcdeIgGsobreclulasKyneutrfilos
CD19
ClulasB
CD20
ClulasB
CD21
ClulasB,maduras
CD22
ClulasB
CD23
ClulasB
CD24
ClulasB,granulocitos
CD25
ClulasportadorasdereceptorIL2
CD34
Clulasprogenitoras
CD35
ClulasportadorasdecomplementoCR1
CD45
Leucocitos
5.
Los resultados que arroja el citmetro de flujo son grficos de frecuencia
representados como diagramas de puntos (cuando se analizan dos marcadores en
simultneo) o histogramasdefrecuencia(cuandoseanalizalaexpresinde unsolo
marcador). Adems con base en el tamao (forward scatter) y complejidad de la
clula (side scatter) se pueden identificar de una manera gruesa los diferentes
tiposcelularesqueseestnanalizando
.
Diagramadepuntos
Conbaseenestainformacinyenloconsultado,interpretelossiguientesgrficos:
Respuesta:
A:Granulocito
B:Monocito
C:Linfocito
Fundamento:
Debido a que FSC, corresponde al tamao de la clula en este
caso. Aquellos elementos de menor tamao estn hacia la izquierda del eje x
(hacia el punto de coordenadas (0,0)). En cambio, El SSC, corresponde a la
complejidadcelularogranularidad.
En este caso, los linfocitossonclulasdemenor tamaoygranularidadquelos
Monocitos y Granulocitos. Por ende, corresponden a la poblacin celular
marcadas con la letra C. Por otra parte, no hay mucha diferencia de tamao
entre Monocitos y Granulocitos, pero s en cuanto a su granularidad, aquellas
que sean mscomplejasogranularestendrnunvalormayorenel ejey.Porlo
tanto, al comparar respecto a la granularidad entre monocitos y granulocitos,
sonlosgranulocitoslosqueposeenmayorgranularidad.
8 Los genes MHC son altamente polimrficos. Usted hereda un grupo de alelos
tanto delpadrecomodelamadre.Dequformaseexpresan estasglicoprotenas?
(Utilice conceptos como dominancia, recesividad,etc) Quventaja tienequeestos
genesseexpresendeesaforma?
.
10 Un cocultivo es un experimento en el que se ponen en contacto 2 tipos de
clulas distintas: clulas presentadoras de antgenos y linfocitos T, esto con el fin
de evaluar la activacin de estos linfocitos T. Para realizar el experimento usted
cuentaconlossiguientescomponentesmurinos(deratn):
a. Clulas presentadoras: Dendritic cell (H2b), Lung Epithelial cell
(H2b),Macrophage(H2b/d)
b. Linfocitos:CD4Tcell(H2d),CD8Tcell(H2b)
c. Pptidos: A (para MHCI), B (para MHCII). Los pptidos se cargan
inmediatamente en los respectivos MHC y pueden ser reconocidos
porloslinfocitosTencuestin.
Con base en la informacin consultada y considerando el concepto de la
restriccin del MHC Cules son las posibles combinaciones entre clulas
presentadoras de antgenos y linfocitos? Necesariamente tiene que escoger
una clula presentadora, un pptidoy unlinfocito(Estoesunacombinacin).
Nota: Haplotipos: H2b, H2d H2b/d (Posee ambos haplotipos). Adems
indique cmo medira usted que los LT maduraron o no (marcadores CD y
secrecindecitoquinas)
Antecedentesyrespuesta:
La restriccin de MHC tiene relacin con el reconocimiento del pptido antignico
por el linfocito T, nicamente si se encuentra unido a una molcula MHC en la
membranadelaclulapresentadora.
Los linfocitos T CD8+ tienen una restriccin MHC de clase Y, porque solamente
son capaces de reconocer pptidos antignicos que se presenten unidos a
molculas MHC de clase I en la membrana de otra clula. Cualquiera de las 3
clulas antes mencionadas(Dendrtica, epitelial o macrfago) puede actuar como
clula presentadora, ya que todas las clulasnucleadasdelcuerpoposeenMHCI.
Por lo tanto, en este caso la combinacin apropiada entre clula presentadora,
pptido y linfocito es : Clula dendrtica, epitelial o macrfago + CD8+ t +
pptidoA(paraMHCI)
(31)
Por otra parte, los linfocitos T CD4+ tienen una restriccinMHCdeclaseII,porque
slo reconocen pptidos unidos a molculas MHC de clase II en la membrana de
las clulas presentadoras, por lo que una combinacin apropiada para este tipo
sera :
Clula dendrtica, epitelial o macrofago (las 3expresanMHCII)+CD4+
T+pptidoB(paraMHCII).
(32)
11Lacomunicacinentrelasclulasdelsistema inmunesedaatravsdediversas
seales. Entre ellas se destacan dos tipos de molculas: Citoquinas y
Quimioquinas.DefinacadaunadeellasHaciendonfasisensusdiferencias.
Las citoquinas y quimioquinas son molculas que permiten la comunicacin
mediantelainteraccinconreceptoresdesuperficieespecficos.
Las citoquinas son protenas producidas de forma breve y autolimitada por las
clulaslinfoidesydeotrostipos,queregulanyestimulanlarespuestainmunitaria.
El radio de accin de las citoquinas es corto y generalmente tienen funcin
autocrina (sobre la misma clulaquela produce),yuxtacrina(sobrelaclula vecina
mediante la expresin en membrana de la citoquina) o paracrina (sobre la clula
vecina al liberarse de forma soluble), favoreciendo de esta manera la aparicin de
fiebre y refuerzan la respuesta inflamatoria, provocando la activacin de los
macrofagos.
Su accin fundamental consiste en la regulacin del mecanismo de la
inflamacin
,
estas pueden actuar sobre diferentes tipos celulares e inducirdiversasrespuestas.
Estas pueden ser pro inflamatorias, las cuales son producidas principalmente por
38
(3),109116.
4
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