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Cuantificacin de protenas
Procedimiento de estudio de protenas
Seleccin de fuente
Fraccionamiento de clulas
Centrifugacin
Cromatografa
Cromatografa en capa fina
Cromatografa en columna
Cromatografa de intercambio inico
Cromatografa de exclusin molecular o filtracin en gel
Cromatografa de afinidad
Electroforesis
Electroforesis en acetato de celulosa
Electroforesis en geles de acrilamida (SDS-PAGE)
2) Purificacin
Cromatografa
Electroforesis
3) Determinacin de su
actividad
3) Determinacin de la
estructura primaria
3) Determinacin de sus
niveles de expresin
Seleccin de la fuente
Tejido
Disgregacin del tejido: (Colagenasa, quelantes del Ca++....... )
Separacin de las clulas
Cultivos celulares
Cultivos primarios
Lneas celulares
Mecnicos
Lisis osmtica
Homogenizacin
Detergentes
Sonicacin
Disolventes orgnicos
(acetona, etanol, TCA)
Congelacin
Homogenado
1000g x 10 min
c. enteras, ncleos
y citoesqueleto
20.000g x 20 min
mitocondrias,
lisosomas
y peroxisomas
80.000g x 1h
microsomas y
pequeas vesculas
150.000g x 3h
ribosomas, virus y
grandes macromolculas
Aumento de la velocidad de
centrifugacin
Se basa en la diferente:
Solubilidad
CROMATOGRAFA
Tamao
Carga elctrica
Densidad
Afinidad por otras molculas
ELECTROFORESIS
Cromatografa
Cromatografa
CROMATOGRAFA EN COLUMNA
Las diferentes protenas se retrasan segn sus interacciones con la matriz, de
acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamao o unin a grupos qumicos
Muestra
aplicada
El solvente se aplica
contnuamente a la
boca de la columna
Matriz
slida
Molculas fraccionadas
eludas y recogidas
Tapn
poroso
Tubo de
ensayo
tiempo
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
Cromatografa
TRES CLASES DE CROMATOGRAFA EN COLUMNA
A) Intercambio inico:
B) Filtracin en gel:
en base a la carga
Flujo de solvente
C) de Afinidad:
en base a interaccin
en base al tamao
Flujo de solvente
Flujo de solvente
Partcula
cargada
positivamente
Molcula
cargada
negativamente
unida
Molcula
cargada
positivamente
libre
Partculas
porosas
Molcula
pequea
retrasada
Molcula grande
no retrasada
Partcula con
sustrato unido
covalentemente
Molcula de
enzima unida
Otras protenas
pasan de largo
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
Protenas
cargadas
positivamente se unen
a la matriz cargada
negativamente
Protenas
cargadas
negativamente pasan
sin unirse
Matriz de polmeros
de carbohidratos
Molculas pequeas
entran
entre
los
espacios
acuosos
dentro de la matriz
Molculas grandes no
entran dentro de los
espacios de la matriz
Cromatografa de afinidad
Las protenas se separan en funcin de la especificidad de unin a un ligando
Adicin de glucosa
(G)
Molculas se liberan
tras la adicin de
glucosa
Enzima - Sustrato
Antgeno - Anticuerpo
Hormona - Receptor
Electroforesis
45-55% total
5-8%
Globulinas: a1
a2
8-13%
11-17%
15-25 %
Formacin de un gel de
poliacrilamida
Determinacin de las
masas moleculares