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Angel de Jess Heredia Pardio

SECUENCIACION DE LA
11 DE FEBRERO DEL 2016

ENZIMA QUIMOTRIPSINA.

Descripcin breve
La quimotripsina se encuentra clasificada como una serina proteinasa, Dixon y Webb en 1979
reportan la existencia de las formas A, B Y C. Esta enzima es una endopeptidasa que hidroliza
enlaces peptdicos en el extremo carboxilo de aminocidos aromticos, i.e. Phe Tyr o Trp Se
diferencia de la tripsina porque sta hidroliza preferentemente los enlaces carboxilo junto
aminocidos bsicos como Lys y Arg.

La -quimotripsina consta de 241 residuos aminoacdicos con un peso molecular


aproximado de 24,8 KDa; las tres cadenas peptdicas unidas por 5 enlaces disulfuro 13, 131
y 97 residuos respectivamente y se denominan A, B y C.

Caractersticas ms importantes de la quimotripsina.


Zimogenos
Propiedades
Peso molecular
Punto isoelctrico
Formas activadas
Estabilidad (pH)
Activadores
pH ptimo

A
25000
9.1
, , , , .
3 10
Ca2+
7.5

B
26000
5.2

4 10.5
Ca2+
7.5

Secuencia de la enzima
CGVPAIQPVLSGLSRIVNGEEAVPGSWPWQVSLQDKTGFHFCGGSLINENWVVTAAHCGV
TTSDVVVAGEFDQGSSSEKIQKLKIAKVFKNSKYNSLTINNDITLLKLSTAASFSQTVSA
VCLPSASDDFAAGTTCVTTGWGLTRYTNANTPDRLQQASLPLLSNTNCKKYWGTKIKDAM
ICAGASGVSSCMGDSGGPLVCKKNGAWTLVGIVSWGSSTCSTSTPGVYARVTALVNWVQQ
TLAAN

1. La quimotripsina tiene ms de una cadena polipeptdica, por lo cual se har una


separacin de las mismas con -mercaptoetanol el cual es un agente reductor que se
utiliza para romper los enlaces disulfuro y asegurarse de que la protena est
completamente desnaturalizada, para as tener cadenas individuales, para prevenir
recombinacin agregaremos un agente alquilante como iodoacetato, luego estas
cadenas se purificaron mediante precipitacin con sulfato de amonio, cromatografa

de exclusin molecular en gel

donde la alcuota se pas a una columna de

Sephadex G-75 equilibrada con bicarbonato de amonio 0.02 M a pH de 7.8, se


colectaron las fracciones y se determin la absorbancia a 280 nm, y cromatografa
de lquidos de alta resolucin en una columna de FPLC, en donde las fracciones
con actividad tipo quimotripsina se sometieron por separado a cromatografa a
travs de una columna de filtracin FPLC Superose 12 utilizando un sistema de
cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC). La protena fue eluda en
buffer Tris-HCl 0.02 M pH 8, a una velocidad de flujo de 0.4 ml/min,
monitorendose la absorbencia a 220 nm. El pico con actividad fue congelado y
liofilizado. Las fracciones fueron sometidas a electroforesis para evaluar su pureza
y posterior caracterizacin.
Cadena 1

CGVPAIQPVLSGL

Cadena 2

IVNGEEAVPGSWPWQVSLQDKTGFHFCGGSLINENWVVTAAHCGVTTSDVVVAGEFDQGS
SSEKIQKLKIAKVFKNSKYNSLTINNDITLLKLSTAASFSQTVSAVCLPSASDDFAAGTT
CVTTGWGLTRY

Cadena 3

ANTPDRLQQASLPLLSNTNCKKYWGTKIKDAMICAGASGVSSCMGDSGGPLVCKKNGAWT
LVGIVSWGSSTCSTSTPGVYARVTALVNWVQQTLAAN

2. Se reducirn los enlaces sulfhdrilos tratando que sean homogneos, as mismo se


utilizara una proteasa una tripsina que corta Lys el cual es muy especfico.
3. Posteriormente se hace una hidrolisis completa, para determinar la composicin de
los aminocidos, se pone a calentar con una solucin acida HCl 6 N, la cual se
destruye completamente el triptfano, parte de la serina y la treonina, la
temperatura que se pone es de entre 100 y 120 C durante unas 10 horas, se
recomienda hacerlo en un tubo hermticamente cerrado al vaco. La composicin
de los aminocidos hidrolizados se determina mediante cromatografa de
intercambio inico mtodo por el cual se permite la separacin de molculas
basada en sus propiedades de carga elctrica.
4. Separadas las cadenas, se determina la secuencia de aminocidos de cada una. Para
ello se utiliza la tcnica de degradacin de Edman, la idea general de la
secuenciacin de pptidos por esta tcnica es romper un aminocido a la vez desde
un extremo de la cadena peptdica. El aminocido terminal se separa e identifica, y
se repiten las reacciones de ruptura en el pptido de cadena acortada hasta que se
conoce por completo la secuencia del pptido.

Luego se hace un anlisis del C-terminal con Carboxipeptidasa A el cual son


exopeptidasas que clivan el terminal carboxilo. Ambas son activadas por tripsina,
son metaloproteasas pues requieren zinc para la catlisis a diferencia de las
endopeptidasa que son serinoproteasas. La Carboxipeptidasa A clivan residuos
bsicos, lisina arginina. Cada vez que la tripsina corta una protena, se queda un
pedazo de protena que tiene o lisina o arginina en el terminal carboxilo. Las

Carboxipeptidasas puede remover ese pedazo, esto en efecto da aminocidos libres


de lisina o arginina que pueden ser absorbidos.
5. Luego se corta las cadenas con la peptidasa antes mencionada, la cadena 1 se qued
normal ya que no presenta lisinas para que mi proteasa la cortara, posteriormente
en la cadena 2 se parti en 9 pedazos, mientras que en la cadena 3 se parti en 5
pedazos, a los fragmentos de la cadena 2 se purificaron en cromatografa de
particin en la cual los pedazos ms grandes se separan en base a tamao; las ms
grandes es aadida a la columna la cual pasan ms libremente y aparecen en las
primeras fracciones mientras que las otras partes se pasan a las otras columnas,
luego se pasara a una electroforesis para saber si se realiz una buena separacin,
se repetir el mismo procedimiento para la siguiente cadena.

6. Posteriormente se hace un anlisis de los productos separados mediante


cromatografa en columna, luego la mezcla se pasa por electroforesis para su
posterior identificacin.
Tabla 2. Separacin y caracterizacin de los pptidos
Cadena 1

CGVPAIQPVLSGL

Sin cortes
Cadena 2
VPGSWPWQVSLQDK

TGFHFCGGSLINENWVVTAAHCGVT

IVNGEEAVPGSWPWQVSLQDK

TSDVVVAGEFDQGSSSEK
IQK

TGFHFCGGSLINENWVVTAAH
CGVTTSDVVVAGEFDQGSSSE
KIQKLKIAKVFKNSKYNSLTIN

LK

NDITLLKLSTAASFSQTVSAVC
LPSASDDFAAGTTCVTTGWGL
TRY

IAK

VFK

NSK

YNSLTINNDITLLK
LSTAASFSQTVSAVCLPSASDDFAA
GTTCVTTGWGLTRY

Cadena 3
ANTPDRLQQASLPLLSNTNCK

KYWGT

KI

DAMICAGASGVSSCMGDSGGPLVCK

KNGAWTLVGIVSWGSSTCSTSTPGV
YARVTALVNWVQQTLAAN

7. Referencias
1.

Alan Fersht. (1980). Estructura y mecanismos de las enzimas. Barcelona - Bogot - Buenos aires -

2.

Caracas - Mxico - Rio de Janeiro: Editorial Reverte, S. A.


Robert W. McGilvery. (1977). Conceptos Bioquimicos. Barcelona - Bogot - Buenos aires - Caracas

3.

- Mxico - Rio de Janeiro: Editorial Reverte, S. A.


Paginas citadas
National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville

4.

Pike, Bethesda MD, 20894 USA. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/


Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB), Department of Chemistry, Rutgers
University, 610 Taylor Road, Piscataway, NJ 08854-8087, USA,National Institute of Standards and
Technology, Route 270, Quince Orchard Road, Gaithersburg, MD 20899, USA, San Diego
Supercomputer Center, University of California, San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, CA
92093-0505, USA, Department of Pharmacology, University of California, San Diego, 9500 Gilman
Drive, La Jolla, CA 92093-0500, USA and The Burnham Institute, 10901 North Torrey Pines Road,
La Jolla, CA 92037, USA, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do