Prcticas de Biologa Molecular Semestre 2014-II

PRACTICA N8
CROMATOGRAFIA DE FILTRACION
El procedimiento fsico-qumico que permite la separacin de macromolculas a travs de un
tamiz molecular se denomina Cromatografa de filtracin. Para ello es necesario considerar la
forma de la molcula que se est purificando, la cual en la mayora de las protenas es una esfera
estadstica. Esto significa que se pueden separar protenas relacionando su forma tridimensional
con su peso molecular. La malla cromatogrfica o tamiz molecular tiene poros a travs de los que
pueden pasar aquellas protenas que tengan el tamao apropiado, otras no podrn ingresar y su
elucin ser ms rpida que las que ingresaron a la malla. El uso de solventes acuosos que
ejercen presin sobre los componentes que se estn filtrando determinar que la salida de ellas
ocurra en el siguiente orden:
En primer lugar las protenas ms grandes, luego las de tamao intermedio y finalmente las de
pequeo tamao o tambin llamadas de bajo peso molecular.
Un requisito indispensable para el empleo de esta tcnica es contar con geles de dextrano
comercialmente preparados, los cuales son insolubles pero hidratables y que colocados en una
columna de vidrio dan lugar a esta separacin al aplicarse mezclas de dos o ms protenas.

OBJETIVOS:
1. Conocer el procedimiento para preparar una columna de filtracin.
2. Separar dos componentes utilizando el sistema.

MATERIALES:
-

Columna de vidrio ( 20 x 1,1 cm ).

Sephadex G-100
Veneno de B. atrox (20 mg/ml)
Solucin salina (NaCl 0,15M ; pH 7,2)
30 tubos de ensayo 13 x 100 mm
Gradilla
Pipeta de vidrio 1 ml
Papel milimetrado
Regla milimetrada
Tapones de jebe, mangueras finas y agujas descartables No. 19 y 20.
Plumn para escribir sobre vidrio.
Calculadora

PROCEDIMIENTO:

1. Colocar en la columna de vidrio el gel de Sephadex G-100, previamente hidratado y

equilibrado con el eluente.
2. Una vez empacada la columna, colocar 0,7 de la mezcla problema (0,4 ml de hemoglobina
y 0,3 ml de p-nitroanilina) e iniciar la coleccin de las fracciones en los tubos en
volmenes de 1 ml.
3. Observar la coloracin de la mezcla inicial y su separacin durante la corrida
cromatogrfica.
4. Cada vez que se tenga 1 ml en el tubo cambiarlo por otro, tomando el tiempo en que se
obtuvo ese volumen. El contenido de cada tubo ser denominado fraccin.
5. Luego de colectadas las 30 fracciones se observar en cuales aparecen los colores tpicos
de los componentes de la mezcla.
6. Hacer los clculos cromatogrficos para cada componente separado.
7. Graficar en papel milimetrado No. Fraccin vs coloracin muestra

PROBLEMAS:
1. Por una columna de filtracin capaz de atrapar protenas de hasta 80 000 Daltons. Se pasa

una mezcla de cinco protenas: A (100 000 Daltons), B ( 50 000 Daltons), C (120 000
Daltons), D ( 10 000 Daltons) y E (35 000 Daltons). Sabiendo que las dimensiones de la
columna son 30 x 1 cm). Determine:
a) Cul es el volumen mximo de muestra que se puede aplicar?
b) Determine el nmero de picos que se obtendr y la composicin de cada uno?
2. Una mezcla de dos protenas de 120 y 40 kDa, se pasan por una columna de filtracin,
que atrapa protenas de hasta 100 000 Daltons. En otro experimento la misma protena se
pasa por otra columna de filtracin, que atrapa protenas de hasta 50 000 Daltons. Analice
y explique En cul de las columnas la separacin tendr mayor resolucin?
3. Una mezcla de cuatro protenas: A (80 000), B (200 000 Daltons), C (220 000 Daltons) y D
(40 000 Daltons), se pasan por una columna de Sephadex G-75 (este gel atrapa protenas
de hasta 75 000 Daltons). Sabiendo que la columna tiene un volumen interno de 60 ml.
Determine:
a) El nmero de picos y la composicin de cada uno
b) El volumen de elucin del primer pico.
4. Tres protenas de 40, 80 y 120 kDa se pasan por una columna de filtracin, capaz de
atrapar protenas de hasta 200 kDa. Sabiendo que el Vt= 120 ml. Determine:
a) El nmero de picos y composicin de cada uno
b) El Ve del primer pico.