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Prof. Eleonora
Fermentao Alcolica
1. Importncia
A fermentao alcolica importante no s na fabricao de bebidas como vinho, cerveja,
cachaa, etc., mas tambm para fabricao do lcool industrial. O etanol tornou-se, com a crise do
petrleo da dcada de 70, uma opo como combustvel. Alm disso, possvel antever sua
utilizao para formao de etileno e butadieno, matrias primas para a indstria de plsticos.
Compreende-se, ento, o enorme interesse que desperta a melhoria do processo, dos agentes de
fermentao utilizados e das condies de retificao do lcool obtido.
2. Matria Prima
As matrias primas utilizadas na indstria de fermentao alcolica so originadas direta ou
indiretamente da agricultura, ou seja, de recursos renovveis. A escolha da matria prima e outros
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aditivos para o mosto (meio de cultura que se destina operao industrial de transformao de uma
substncia em excreta til) ponto de fundamental importncia para a indstria da fermentao. A
matria prima deve conter substrato utilizvel pelo microrganismo, ser de fcil obteno e
estocagem. As matrias primas para a produo de lcool podem ser:
Sacarneas: possuem como substrato acares solveis (mono e dissacardeos), por exemplo:
Melao - (resduo da cristalizao do acar) principal substrato: sacarose
Caldo de cana - principal substrato: sacarose. O caldo de cana utilizado devido
importncia econmica do etanol.
Suco de frutas - substratos: sacarose, glicose e frutose.
As matrias primas sacarneas podem ser diretamente consumidas pelo agente de fermentao
(geralmente leveduras do gnero Saccharomyces); as leveduras so capazes de assimilar tanto
glicose como frutose e outros monossacardeos; a sacarose assimilada sofrendo uma prvia
hidrlise pela enzima invertase, existente nesses microrganismos.
Amilceas: substrato fermentvel o amido. Altos teores de amido so encontrados em razes
(batata e mandioca) e gros (trigo, milho, cevada e centeio).
As leveduras utilizadas no processo de fabricao do lcool no possuem enzimas capazes de
hidrolisar o amido. Uma das perspectivas, ainda em fase de pesquisa, a introduo de genes que
codificam essas enzimas no genoma de leveduras (objeto de estudo da engenharia gentica).
O tratamento prvio que sofrem as matrias primas amilceas denominado de sacarificao do
amido e consiste na transformao do amido em matria prima fermentvel. A sacarificao do
amido pode ser feita de varias formas:
Por via qumica: consiste na hidrlise em presena de H2SO4 5% sob presso de 2 atm, por
duas horas. H converso do amido em glicose, mas apresenta como inconveniente o alto
custo e a corroso que promove nos equipamentos; alm disso, exige neutralizao para que
possa ser utilizada e o sal resultante leva a um baixo rendimento na fermentao.
Por via enzimtica: utilizam as preparaes amilolticas presentes nos gros (malte) ou
enzimas extradas de fungos e bactrias (amiloglicosidases e amilases, respectivamente).
Celulsicas: substrato a celulose. Assim como para o amido, necessria uma hidrlise prvia
da celulose para que os monossacardeos e/ou oligossacardeos liberados possam ser assimilados
pelo microrganismo. Esta hidrlise pode ser feita:
Por via qumica: atravs de tratamento com H2SO4 a quente sob presso. um tratamento
drstico que envolve a hidrlise cida do material lignocelulsico. Utilizado industrialmente
na Alemanha e na Rssia; no Brasil os primeiros testes em escala piloto foram realizados nas
instalaes da Fundao de Tecnologia Industrial (FTI) em Lorena/SP, na dcada de 1980.
Por via enzimtica: este tratamento requer um pr-tratamento da matria prima para
aumentar a digestibilidade do substrato enzima. Em que pesem os esforos realizados,
ainda no um processo industrial.
importante ressaltar que a diversidade de bebidas alcolicas existentes no mercado
decorre, inicialmente, do tipo da matria prima utilizada (sacarnea ou amilcea) e, posteriormente,
do tratamento a que submetida bebida (destilao, tempo de maturao, etc.).
3. Agentes de Fermentao
S no final do sculo XIX foi identificado o microrganismo responsvel pela transformao do
acar em etanol. Em todos os casos as leveduras do gnero Saccharomyces so as mais utilizadas,
especificamente as da espcie S. carlsbergensis (para cerveja) e S. ellipsoideus (para vinho).
Embora na fabricao, por exemplo, de vinho caseiro se utilize a flora mista presente na prpria
uva, procura-se no nvel industrial usar linhagens puras e selecionadas. Os organismos normalmente
utilizados como agentes de fermentao so anaerbicos facultativos.
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4. Caractersticas do Processo
Temperatura: 25-30 oC Como o processo exotrmico, as dornas (equipamento onde ocorre
a fermentao) exigem sistemas de refrigerao.
pH: 4,5-5,0 Como durante o processo h produo de CO2 com conseqente queda do pH,
so necessrias correes.
Tenso de oxignio Anaerobiose ou baixa aerao.
5. Fundamento Bioqumico
O procedimento de fermentao ocorre em anaerobiose e do ponto de vista bioqumico, a produo
de etanol ocorre unicamente para que haja a re-oxidao do NADH formado na via glicoltica.
Se levedura dado como nutriente um glicdio, por exemplo, a sacarose, primeiro ocorrer
a hidrlise da sacarose glicose e frutose e posteriormente a absoro dos monossacardeos. Se o
glicdio for glicose, como o caso da prtica, ocorre logo a absoro. Os glicdios transportados
entram na via glicoltica.
2 ATP
Glicose 2 cidos pirvico
2 NADH+H+
O NADH+H+ formado re-oxidado:
2 CO2
O
2 H3 C C C
OH
cido pirvico
O
pi ruvat o
d escarboxi l ase
l cool
d esi drog enase
2 H C C OH
2 H3 C C
H
H H
2 NA DH+H+
acetaldedo
H H
2 NAD+
etano l
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2. OBJETIVO
Calcular a eficincia de uma fermentao de glicose por clulas de S. cerevisiae atravs da
medida da produo de etanol e de CO2 e do consumo de glicose.
Verificar o poder de inibio do NaF (inibidor da enolase) no processo fermentativo.
3. PROCEDIMENTO
3.1. Produo de etanol, produo de CO2 e consumo de glicose.
a) Em um erlenmeyer de 250 mL preparar 100 mL de meio YED 10%, contendo 20% (p.u./v) de
clulas (10 mL meio YED + 90 mL de H2O + 20 g de fermento).
Agitar, anotar o tempo e imediatamente retirar uma alquota de 3,0 mL para tubo de centrfuga.
Pesar rapidamente o frasco.
b) Centrifugar a alquota previamente retirada e transferir o sobrenadante para outro tubo.
Centrifugar novamente o sobrenadante, transferir para o tubo de ensaio e conserv-lo em banho
de gelo. Enquanto isto, o mosto inoculado deixado em banho 28C, sendo agitado
vigorosamente a intervalos de 10 minutos.
c) Aps 1 hora de fermentao, agitar bem e pesar o frasco para calcular a quantidade de CO2
desprendido.
d) Centrifugar cerca de 50 mL do meio fermentado e caso o sobrenadante permanea turvo,
centrifugar novamente.
e) Pegar 10 mL do sobrenadante e colocar no compartimento para amostra do destilador, adicionar
em seguida 10 mL de H2O e 0,5 mL de NaOH 0,1 N (o hidrxido de sdio colocado para evitar
a destilao de alcois superiores). Fechar o sistema e recolher os 8 mL iniciais do destilado que
contero todo o etanol presente na amostra. Completar este volume a 10 mL com exatido.
f) Determinar no destilado o teor de etanol pelo mtodo do dicromato.
g) Diluir uma alquota dos sobrenadantes (tempo inicial e tempo final de fermentao) e determinar
a quantidade de glicose consumida pelo mtodo do DNS.
Sugesto para as diluies: tempo inicial: diluio de 10 a 100 vezes
tempo final: sem diluio ou diluio de 10 vezes
h) Calcular o rendimento e a eficincia da fermentao a partir da quantidade de CO2 produzido em
relao quantidade de glicose consumida.
i) Efetuar os mesmos clculos do item anterior (3.1h), a partir da quantidade de etanol produzido.
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2. PROCEDIMENTO
A. Construo da curva padro de glicdios redutores
Sensibilidade do mtodo qumico: 1-20 moles de glicose
1. Seguir o protocolo abaixo utilizando a soluo padro de glicose (10 mol/mL)
Tubo
B
1
2
3
4
5
Sol. Glicose
(mL)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
H2O dest.
(mL)
1
0,8
0,6
0,4
0,2
-
Reagente DNS
(mL)
1
1
1
1
1
1
Absorbncia
(540 nm)
Concentrao
(
)
2. Aps a adio dos reagentes, agitar e aquecer a 100 oC por 5 minutos, resfriar e adicionar 13 mL
de gua destilada.
3. Usando o tubo B como branco de reao, determinar as absorbncias a 540 nm.
4. Lanar em grfico as leituras de absorbncia x concentrao de glicdios e determinar o
coeficiente angular e o fator da reta obtida.
5. Verificar quais os limites de sensibilidade do mtodo para a aparelhagem utilizada.
Tubo
Branco
Tempo inicial
Tempo final
H2O
destilada
(mL)
1
-
Diluio Amostra
da
(mL)
amostra
1
1
Reagente
DNS
(mL)
1
1
1
Absorbncia
(540 nm)
Concentrao
(
)
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1. REAGENTES
Soluo padro de dicromato de potssio: 33,816 g de K2Cr2O7 dissolvidos em gua e
completados a 1 litro
H2SO4 concentrado
H3PO4 a 85%
Indicador: 0,5 g de sal de brio do cido 4-difenilamina-sulfnico dissolvido em 100 mL de H2O.
Utilizar o sobrenadante.
Soluo de sulfato ferroso amoniacal: 135,1 g de FeSO4(NH4)2SO4.6H2O, 20 mL de H2SO4
concentrado so dissolvidos em gua e completados 1 litro.
2. PROCEDIMENTO
a) 10 mL da soluo de dicromato so colocadas em 3 frascos cnicos, adicionando-se, em
seguida, 5 mL de H2SO4 concentrado, resfriando-se em gua de bica corrente.
b) Colocar em cada frasco 5,0; 2,5 e 1,0 mL do destilado, respectivamente, e completar o volume a
5,0 mL com gua, quando for o caso.
Para o destilado do frasco contendo fluoreto de sdio basta fazer a alquota de 5 ml.
c) Agitar e aguardar, em repouso, durante 15 minutos para o etanol ser quantitativamente levado a
cido actico.
d) Aps os 15 minutos, adicionar 165 mL de gua destilada, 18 mL de cido fosfrico e 0,5 mL da
soluo do indicador.
e) Titular com sulfato ferroso amoniacal at a cor da soluo mudar de prpura para verde e anotar
o volume consumido (n).
f) Para o ensaio em branco adicionar 5,0 mL de gua destilada em lugar da amostra e repetir o
procedimento. Anotar o volume consumido (N).
3. REAO
2 Cr2O7 -2 + 12 Fe 2+ + 14 H+ 4 Cr 3+ + 12 Fe 3+ + 14 H2O
2 Cr2O7 -2 + 3 C2H5OH + 16 H+ 4 Cr 3+ + 3 C2H4O2 + 11 H2O
A = 4 (1- n/N)
A = 10 (1- n/N)