Ao de la Diversificacin Productiva y del

Fortalecimiento de la Educacin
UNIVERSIDAD CIENTIFICA DEL SUR
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA

INFORME SOBRE LA EXTRACCIN,

CUANTIFICACIN Y LECTURA DEL ADN
Profesora:
Francesca Falconi Agapito
Integrantes:
Guillen Aquino, Nicol Oriana
Guerra Cabrera, Milagritos del Pilar

20
15

INTRODUCCIN
El ADN que constituye el material genetico de los seres
vivos y que ha sido punto de investigacin desde hace ya
tiempo, ahora es posible ser observada y anlizada atraves de
distintos procesos.
En este presente informe explicaremos los procesos
realizados en el laboratorio que sirvieron para poder
observar las bandas finales del ADN (muestra). Para poder
hacer esto posible se debe llevar a cabo tres procedimientos
fundamentales, que son:
Extraccin de ADN (muestra).
Proceso de PCR.
Electroforesis.
La extraccin de ADN es una metodologia mediante la
cual podemos obtener material genetico que nos permite la
manipulacin del producto obtenido. Es un metodo por el
cual podemos estudiar mutaciones que esten involucradas
con diferentes potologias humanas, mapeos y secuenciacin
de genes con fines terapeuticos.
El proceso de PCR (reaccion en cadena de la polimerasa)
es una tecnica utilizada para obtener un gran numero de
copias de un fragmento de ADN en una amplificacin in vitro,
ademas de ser una amplificacin selectiva la cual se basa en
una capacidad de la enzima ADN polimerasa para fabricar
una cadena ADN complementaria a la existente.
La electroforesis es una tecnica utilizada para observar la
concentracin e integridad del ADN, proteinas y otras
biomoleculas. Ya que permite las separacin de las proteinas
y acidos nucleicos a traves de una matriz tamponada de pH
8.
Estos procedimientos hacen posible una amplificacin del
ADN para asi poder detectar o determinar ciertas patologias
como errores geneticos, adems de la determinacin de
paternidad; esto nos permite tener un mejor conocimiento
acerca de la aplicacin de estos metodos en el campo de la
medicina y asi poder ponerlos en practica en el momento
adecuado.

1.MARCO TEORICO
La extraccin de DNA a partir de muestras de distinta
naturaleza, constituye la etapa previa de todo anlisis
gentico. En general; los mtodos de extraccin de DNA
tienen una serie de pasos bsicos, que se cumplen
independientemente del origen de la muestra. Estos son,
a saber: disrupcin celular (ruptura de la bicapa lipdica
de las membranas celulares por tratamiento con
detergentes, agentes quelantes que secuestran cationes
estabilizantes de la membrana, etc.), eliminacin de las
protenas (que constituyen los principales contaminantes
del extracto), concentracin del DNA (por precipitacin
con alcoholes), lavado (para eliminar restos de reactivos y
solventes que puedan inhibir la Taq polimerasa) y
resuspensin.
El PCR (Reaccin en la cadena de la polimerasa) es una
tcnica "in vitro" que imita la habilidad natural de la
clula de duplicar el ADN.
Tcnica usada para crear un gran nmero de copias de un
segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalizacin,
apareamiento con cebadores y extensin por una ADN
polimerasa termoresistente.
Es una tcnica que permite duplicar un nmero ilimitado
de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo,
pueden generarse millones de molculas idnticas, a
partir de una molcula de ADN. Esto se puede conseguir
en unas horas. La reaccin es muy sencilla, necesita
cantidades de ADN muy pequeas y slo se precisa un
tubo de ensayo, algunos reactivos, una fuente de calor y
unas pequeas cadena de nucletidos que actan como
cebadores.
La electroforesis es una tcnica de laboratorio utilizada
para separar molculas cargadas colocadas en un campo
elctrico. Las molculas cargadas positivamente se
desplazarn hacia el polo negativo y las cargadas
negativamente hacia el polo positivo. Uno de los factores
que afecta la separacin de las molculas en una
electroforesis es su carga. Para el caso del DNA, los
grupos fosfato le dan la carga a la molcula. Los grupos

fosfato son grupos cidos con pK bajos, esto significa que

a pH neutro (7.0 7.5) sus grupos hidroxilo pierden los
protones (H+) y quedan cargados negativamente. Por lo
anterior, los cidos nucleicos (DNA y RNA) son molculas
cargadas negativamente a pH neutro, en un sistema
electrofortico se desplazarn hacia el polo positivo, es
decir, separacin de molculas por diferencia en su
movilidad electrofortica. Para separar molculas de DNA
de diferente tamao se incluye en el sistema la utilizacin
de geles, tanto de agarosa como poliacrilamida
(acrilamida ms bis-acrilamida).

2.OBJETIVOS
1. Extraccin ADN a partir de muestras biolgicas.
2. Realizacin de una comparacin entre dos tcnicas de
aislamiento de DNA.
3. Conocimiento los fundamentos en lo que se basa la
tcnica de PCR.
4. Conocemos la importancia del uso de la tcnica de
PCR para el diagnstico de enfermedades en los seres
humanos.
5. Amplificamos una secuencias especifica del ADN
genmico humano utilizando la tcnica de PCR.
6. Describimos las funciones de las enzimas de
restriccin.
7. Conocimos cmo las enzimas de restriccin cortan el
ADN.
8. Observacin el ADN cortado con diferentes enzimas
de restriccin como EcoRI.
9. Familiarizacin con la tcnica de electroforesis en gel.
10.
Comprensin de los conceptos que estn
involucrados en la separacin de cidos nucleicos en
una corrida electrofortica.
11.
Visualizacin la muestra de ADN aislada de la
prctica anterior.

3.MATERIALES
MATERIALES DEL LABORATORIO PARA LA
EXTRACCIN DE ADN
Kit de extraccin de ADN
Micropipetas de 20 100, 100 -1000 l.
Puntas de 10 -100 l y de 100 -1 000 l

 Tubos ependorf de 1,5 mL

Microcentrfuga16000 rpm
Vortex
MATERIALES DEL LABORATORIO PARA LA
CUANTIFICACIN DEL ADN
Qubit Kit (cuantificacin de ADN)
Micropipetas de 20 100, 100 -1000 l.
Puntas de 10 -100 l y de 100 -1000 l
Tubos de PCR (250 l)
Vortex
MATERIALES DEL LABORATORIO PARA EL PCR
Micropipetas de 20 100, 100 -1000 l.
Puntas de 10 -100 l y de 100 -1 000 l
Tubos ependorf de 1,5 mL

Microcentrfuga16000 rpm
Tubos ependorf
Termociclador
Agua estril
Muestras de ADN
Mix de PCR (taq polimerasa, dNTPs, primer,
Mg, agua)
Primers Alfa tubiluna y Beta actina.
MATERIALES DEL LABORATORIO PARA LA
ELECTROFORESIS
Muestra de ADN obtenida de la prctica
anterior.
Marcador de peso molecular.
Cmara de electroforesis y accesorios
(peines, soporte, tabla niveladora, etc).
Fuente de poder.
Micropipetas para volmenes de 0,5 - 20 l.
Guantes.
Gradilla para tubos de 1,5 mL.
Puntas para volmenes de 0,5 - 20 l.

 Agarosa al 2 %.
Buffer Tris borato EDTA 1X (TBE) pH 88.3.
Buffer carga para ADN.
Colorante Sybr green
Transiluminador de luz UV.

4. PROCEDIMIENTO

Extraccin de ADN usando kit de extraccin Purelinkgenomic (Invitrogen)

Extraccin de ADN de sangre Total.
1. En un tubo ependorff, adicionamos una muestra de 20 l
de sangre fresca.
2. Transferimos 20 l de clulas o sangre a un tubo que
contiene 20 l proteinasa K.
3. Aadimos 20 l de RNasa a la muestra.
Luego
sometimos en el vrtex por 15 segundos e incubamos a
temperatura ambiente durante 2 min.
4. Despus aadimos 100 l de Buffer lisis y
homogenizamos utilizando vrtex por 15 segundos.
5. Incubamos a 55 C durante 10 min.
6. Aadimos 100 l de etanol 96-100%. Mezclando en el
vrtex por 15 segundos.
7. Por ultimo incubamos la lisis por 5 min a temperatura
ambiente.
Proceso de purificacin:
1. Colocamos la lisis (260 l) en la columna de extraccin.
2. Centrifugamos la columna a 8500 rpm por 1 min,
descartando el filtrado por la columna y colocando la
columna en un nuevo tubo de lavado.
3. Lavamos la columna con 200ul de buffer de lavado, luego
centrifugamos a 8500 rpm por 1 min y eliminando el
filtrado.
4. Colocamos la columna en un nuevo tubo de lavado,
adicionando 200ul de buffer de lavado y centrifugando la
columna a velocidad mxima por 3 min para filtrar
cualquier residuo del buffer de lavado.
5. Colocamos la columna en un nuevo tubo de recoleccin
(1,5ml).
6. Aadimos 100 l de Buffer de elucin a la columna.

7. Incubamos a temperatura ambiente durante 1 min.

Centrifugando la columna a velocidad mxima durante 1
min a temperatura ambiente.
8. El tubo contiene ADN genmico purificado.
9. Almacenamos el ADN purificado a -80C para otras
aplicaciones.
Cuantificacin de cidos nucleicos (Qubit)
1. En un tubo ependorf de PCR colocamos 1 l de la
muestra en 199 l de buffer.
2. Calibramos el Qubit segn se indique el manual.
3. Medimos todas las muestras y anotamos los resultados,
para comparar los resultados.
PCR
1. En un tubo de PCR colocamos 25 l de solucin de
reaccin final (mix de PCR):

2. Centrifugamos brevemente para mezclar bien los

componentes.
3. Colocamos los ependorf con la solucin de mix de PCR en
el termociclador, el cual ya debe tener programado las
condiciones de amplificacin.
4. Finalizado el proceso de amplificacin, retiramos los
ependorf del termociclador y guardamos las muestras a 4C
si el amplificado se llegara a utilizar en un lapso de poco
tiempo. Si no fuese el caso mantener a 20C.
Electroforesis
1. Preparamos 50 ml de agarosa al 2% y adicionamos 20 l
de colorante Sybr green, dejando polimerizar por 10 min
aproximadamente. Sumergiendo el sistema que

2.

3.
4.

5.

6.

7.
8.

contenia los geles polimerizados en su tanque (cmara

electrofortica) con el buffer TBE 1X para ADN. Al
momento de sumergir los geles en el tanque,
aseguramos que los pocillos del gel estn totalmente
saturados de buffer.
Sobre un pedazo de lmina extensible de parafilm,
preparamos una mezcla de 5 l ADN con 1l de buffer
carga repartida en alcuotas de acuerdo al nmero de
muestras que se colocaron en los pocillos (considerar el
uso de un marcador de peso molecular estndar de
ADN).
Con el uso de puntas de 20 l procedimos a cargar
cuidadosamente la muestra en los pocillos del gel de
agarosa evitando la contaminacin del pocillo contiguo.
Finalizando con la colocacin de las muestras ADN en
los pocillos, cubrimos el tanque con la tapa y
conectamos los cables de los electrodos en la fuente de
poder. Encendiendo la fuente de poder y proceder a
seleccionar
el
voltaje
adecuado
(puede
estar
comprendido entre 75 a 120 voltios).
Luego de seleccionar las condiciones de voltaje, iniciar
el proceso de la electroforesis. Durante el proceso se
evidenciarn dos frentes de corrida de diferente color y
distancia de migracin. Ambos colores, azul oscuro y
azul claro corresponden a los colorantes azul de
bromofenol y xilenecianol, que conforman el buffer de la
muestra. El xilenecianol en geles de agarosa al 2 %
migra de manera similar a un fragmento de ADN de 160
pares de base (pb), mientras que el azul de bromofenol
a esta misma concentracin de agarosa es equivalente
a un fragmento de 45 pb.
Transcurrido el tiempo de corrida de la electroforesis,
procedimos al desmontaje del equipo empezando con la
desconexin de los electrodos de la fuente de poder,
removiendo el sistema que contiene el gel de agarosa.
Removimos el gel del soporte, para realizar este proceso
se requiere tener mucho cuidado, pues el gel es muy
frgil y puede romperse con facilidad.
Desplazamos el gel hacia el transiluminador para el
revelado, encender el equipo y verificar que este a una
longitud de onda de 420 nm.

9.

Dejamos hasta que empiecen a aparecer las bandas y

registrar el resultado final.

5.

ANLISIS
RESULTADOS

DISCUSIN

DE

LOS

En la extraccin del ADN, utilizamos la proteinasa K

para romper las protenas, al igual que el RNasa que
en este caso rompi el RNA, ya que lo que utilizamos
fue el ADN. Luego se utiliz el buffer lisis para la
estabilizacin de las protenas, ya que funciona como
un detergente no ionico, lo cual no maltrato al ADN.
Utilizamos el etanol para estabilizacin del ADN,
porque se pliega a s mismo y evita que se solubilice.
En el proceso de purificacin utilizaremos la micro
centrifugadora para poder obtener tan solo el ADN
purficado. Luego en la cuantificacin usamos el Quibit
para pesar la masa del ADN.
En el proceso de PCR, utilizamos el mix de PCR que
contenia:
Taq: es el ADN polimerasa, el cual tiene la
caracterstica de ser termoestable; la taq acta en el
paso de la replicacin ya que constituye cada cadena
simple de ADN marcada por un iniciador en una
cadena doble de ADN.
Primers: secuencias de oligonucletidos que
flanquean y delimitan la secuencia blanco que se
desea amplificar y son complementarios a sta.
Encargadas de continuar las cadenas ya que se utilizan
dos primers diferentes (Forward y Reaward).
dTNPs: bases nitrogenadas con los que la Taq
polimerasa construye las nuevas cadenas de ADN. Son
factores
importantes
que
contribuyen
a
la
especificidad de la reaccin, por ello es importante que
su concentracin sea la adecuada ya que de lo
contrario pueden afectar la funcin de la Taq
polimerasa.
Tampon: es la solucin amortiguadora que se usa en
la reaccin y generalmente est compuesta de TrisHCL (pH = 8) cuya concentracin final de trabajo debe
ser 1X.

Mg++: El magnesio es un cofactor enzimtico que

influye en la especificidad de la reaccin, por eso se
debe tener una concentracin adecuada para que no
afecte el rendimiento de la Taq polimerasa.
Luego, se centrifuga para la mezcla de los
componentes, para luego ponerlos en el termociclador
el cual logra las tres etapas del PCR. Para finalizar se
guarda a una termperatura baja para conservar la
masa.
Electroforesis, el sybr Green se asocia a la molcula
de ADN interactuando con la hendidura menor del
ADN. Esto ocasiona la tincin de ADN para el anlisis
por electroforesis de productos de PCR, o como
fluorocromo utilizado como medio de visualizacin.
TBE X1 : Reacciona como un amortiguador
AEDT: cido etilendiamino

tetraactico. En sus
formas desprotonadas (2 y 4), es un conocido agente
quelante de cationes divalentes, en especial Ca 2+ y
Mg2+. Dado que el Mg2+ es un cofactor requerido por la
mayora de nucleasas, su secuestro por el EDTA evita
la degradacin del DNA durante la preparacin y la
electroforesis.

1
8

2
9

3
10

1= Marker
(marcador)
Grupo 1
3= Grupo 2
4= Grupo 3
5= Grupo 4
6=
7=
8= Marcador
9=
10=

2=

EXTRACCION

ADN
La
Resultado

Tubo 1

6.58ng/ml

Tubo 2

13.3ng/ml

Tubo 3

10.8ng/ml

Tubo 4

6.84ng/ ml

electroforesis en gel de agarosa ha demostrado ser una

manera eficiente y eficaz de separar los cidos nucleicos.
En general, cuanto mayor sea la concentracin de agarosa,
menor es el tamao de los poros. Tradicionales geles de
agarosa son ms eficaces en la separacin de los
fragmentos de ADN entre 100 pb y 25 kb. De este modo
grandes fragmentos de ADN de tamao estn separados
por la velocidad a la que ellos mismos reorientar con los
cambios en la direccin de la corriente. Los fragmentos de
ADN ms pequeas que 100 pb se separ ms eficazmente
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. El uso de
tubos capilares permite la aplicacin de altas tensiones, lo
que permite la separacin de fragmentos de ADN (y la
determinacin de la secuencia de ADN) de forma rpida.

DEL

Tintes de carga utilizados en electroforesis en gel sirven

para tres propsitos principales. Primero se aade a la
densidad de la muestra, Permitiendo que se hunda en el
gel. En segundo lugar, los tintes proporcionar color y
simplificar el proceso de carga. Finalmente, los colorantes
se mueven a velocidades estndar a travs del gel, lo que
permite la estimacin de la distancia que los fragmentos de
ADN han migrado.
Los tamaos exactos de los fragmentos de ADN separados
pueden determinarse trazando el registro del peso
molecular de las distintas bandas de un estndar de ADN
contra la distancia recorrida por cada banda. El estndar de
ADN contiene una mezcla de fragmentos de ADN de
tamaos predeterminados que pueden ser comparados
contra las muestras de ADN desconocidos. Es importante
sealar que las diferentes formas de ADN se mueven a
travs del gel a diferentes velocidades. ADN plsmido
superenrollado, debido a su conformacin compacta, se
mueve a travs de la ms rpida en gel, seguido por un
fragmento de ADN lineal del mismo tamao, con la forma
circular abierta viajar el ms lento.

Pero puede existir factores que alteren los

resultados de la electroforesis, asi como la carencia
de las bandas en la agarosa, que puede darse por
diferentes causas tales como:
La cantidad o la concentracin de DNA en la muestra
cargada al gel fuesen insuficientes.
La degradacin del DNA.
Que el DNA se halla salido por el extremo del gel
durante la electroforesis.

6.CONCLUSIONES
La extraccin del ADN es una etapa muy
importante ya que en esta vamos a buscar
extraer el ADN puro para luego dar secuencia a
las otras etapas.

 La tcnica del PCR es de gran utilidad en

distintos campos como de la biologa
molecular, biotecnologa entre otros, adems
brinda un resultado mucho rpido y seguro.
Desde la adopcin de geles de agarosa para la
separacin de ADN, se tiene demostrado ser una de
las tcnicas ms tiles y verstiles en la investigacin
ciencias biolgicas.

Estos simples procesos son de gran ayuda para

la investigacin de ciertos patgenos que
pueden ser heredados, ayuda para las
investigacin de los medico forenses entre
otras reas, a nosotros como futuros mdicos,
para la determinacin de enfermedades
genticas.
7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Laboratorios. [Consultado el: 01 de noviembre de 2015]
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1-3.
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Colonial B. Medicina .Colombia .Remuss.Consultado el:
[01 de noviembre de 2015].Disponible en:
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