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CULTIVO DE CLULAS MADRE MESENQUIMALES A PARTIR DE
SANGRE DE CORDN UMBILICAL Y MDULA SEA
JENNY ANDREA ARVALO ROMERO

DIANA MARCELA PEZ GUERRERO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar por el ttulo de
Bacterilogo
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGA
BOGOT D. C.
2007
NOTA DE ADVERTENCIA
Artculo 23 de la Resolucin N13 de Julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Slo velar porque no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catlica y porque las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia
A Dios por permitirnos llegar a esta

etapa de nuestra vida.
A nuestros padres y hermanos por
ser nuestro apoyo incondicional.
Y a todas aquellas personas que
siempre estuvieron presentes,
brindndonos su apoyo y
colaboracin.
Jenny y Diana
AGRADECIMIENTOS
Principalmente a la Doctora Viviana Rodrguez por su dedicacin y esmero
para ensearnos, guindonos siempre a lo largo de este proyecto;
entregndonos siempre lo mejor, para hacer de este trabajo la realidad que
es hoy.
A Vicerrectora Acadmica por brindar la financiacin para realizar este
proyecto.
A los servicios de Ginecoobstetricia del Hospital Pedro Len lvarez E.S.E
(La Mesa. Cund)
por colaborarnos en el inicio de nuestro estudio y al
Hospital Occidente de Kennedy E.S.E, especialmente a la Doctora Amparo

Ramrez quien nos brind su apoyo durante el transcurso de la investigacin.
Al servicio de Ortopedia y Traumatologa del Hospital Universitario San
Ignacio por contribuir con la segunda parte de este estudio y un
agradecimiento especial al Doctor Efran Leal.
A las madres que voluntariamente contribuyeron y a aquellos pacientes
sometidos a procedimientos de artoplastia de cadera y osteosntesis, por su
colaboracin para llevar a cabo esta investigacin.
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIN ........................................................................................ 9
2.1 Clulas madre: Generalidades................................................................ 11
2.2 Clulas Madre Mesenquimales (CMM)................................................... 12
2.2.1 Generalidades...................................................................................... 12
2.2.2 Ontogenia de las Clulas Madre Mesenquimales.................................14
2.2.3 Localizacin de las Clulas Madre Mesenquimales............................. 18
2.2.4 Microambiente: Citoquinas involucradas y mobilizacin de CMM........ 19
2.2.5 Microambiente y diferenciacin hacia adipocitos, osteoblastos y
condrocitos ................................................................................................... 24
2.2.6 Caracterizacin fenotpica de las CMM.................................................29
2.2.6.1 Estructura y funcin de CD90 ........................................................... 29
2.2.6.2 Estructura y funcin de CD105 ......................................................... 30
2.2.6.4 Estructura y funcin de STRO-1 ....................................................... 34
2.2.6.6 Estructura y funcin de CD166 ......................................................... 36
2.2.7 Cultivo de CMM ................................................................................... 37
2.2.7.1 Antecedentes en el cultivo de CMM.................................................. 37
2.2.7.2 Condiciones de cultivo y factores de crecimiento para la
diferenciacin de CMM. ................................................................................ 38
2.2.7.3 Obtencin y cultivo de CMM derivadas de mdula sea, sangre de
cordn umbilical y tejido adiposo ...................................................................42
2.2.8 Aplicaciones clnicas de CMM ............................................................. 45
2.2.9 Relacin entre CMM y CMH ................................................................ 51
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN ............................53
4. OBJETIVOS...............................................................................................55
4.1 Objetivo General ......................................................................................55
4.2 Objetivos Especficos...............................................................................55
ii
5. MATERIALES Y MTODOS......................................................................56
5.1 Tipo de estudio ........................................................................................56
5.2 Poblacin .................................................................................................56
5.3 Muestra de estudio ..................................................................................56
5.4.1 Plan tcnico de trabajo .........................................................................57
5.5 Variables de estudio ................................................................................58
5.6 Seleccin de donantes.............................................................................59
5.7 Recoleccin de SCU y MO ......................................................................60
5.8 Aislamiento de clulas madre mesenquimales derivadas de sangre de
cordn umbilical y medula sea.....................................................................64
5.9 Establecimiento del cultivo primario de clulas madre mesenquimales...65
5.10 Mantenimiento del cultivo primario y tripsinizacin. ...............................65
5.11 Evaluacin de la expresin de CD34, CD45, CD90 y CD105 en las
CMM obtenidas de SCU y MO por citometra de flujo. ..................................66
6. RESULTADOS...........................................................................................67
6.1 Aislamiento de clulas madre mesenquimales de sangre de cordn
umbilical y medula sea.................................................................................67
6.2 Establecimiento de la tasa de generacin celular ....................................69
6.3 Determinacin de caractersticas morfolgicas........................................71
6.3.1 Sangre de cordon umbilical...................................................................71
6.4 Evaluacin de la expresin de los marcadores CD34, CD45, CD90 Y
CD105 en celulas madre mesenquimales de sangre de cordn umbilical y
mdula sea ..................................................................................................77
6.5 Anlisis Estadstico.......86
7. DISCUSIN ...............................................................................................87
8. CONCLUSIONES....91
9. RECOMENDACIONES ..............................................................................92
10. BIBLIOGRAFA ........................................................................................93
iii
NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Diagrama esquemtico de lineajes de diferenciacin de las Clulas

Madre Mesenquimales...................................................................................12
Figura 2. Diagrama esquemtico de la jerarqua de proliferacin de CMM. ..14
Figura 3. Dibujo esquemtico de un embrin de ratn en el da 11 de
gestacin .......................................................................................................15
Figura 4. Frecuencia de progenitores osteognicos, adipognicos y
condrognicos en las regiones AGM, AoM y UGRs. .....................................16
Figura 5. Representacin del Nicho de las Clulas Madre Mesenquimales ..21
Figura 6. Modelos de diferenciacin de las CMM. .........................................25
Figura 7. Modelo esquemtico de la diferenciacin de las CMM. ..................26
Figura 8. Estructura del antgeno CD90.........................................................30
Figura 9. Estructura del antgeno CD73........................................................33
Figura 10. Estructura del antgeno CD44.......................................................36
Figura 11. Anlisis histolgico e histoqumica de Osteocitos.........................40
Figura 12. Anlisis histolgico e histoqumica de Condrocitos......................41
Figura 13. Anlisis histolgico e histoqumica de Adipocitos .........................41
Figura 14. Diferenciacin de las CMM ...........................................................46
Figura 15. Ilustracin esquemtica de los efectos de CMM en el Sistema
Inmune...........................................................................................................50
Figura 16. Localizacin anatmica en la obtencin de aspirados de mdula
sea. ..............................................................................................................62
Figura 17. Tasa de generacin celular para SCU. .........................................69
Figura 18. Tasa de generacin celular para MO............................................70
Figura 19. Tasa de generacin celular para MO. Muestra MO-002 ..............70
Figura 20. Controles empleados ....................................................................77
Figura 21. Expresin de CD34 en cultivos obtenidos de MO.........................79
Figura 22. Expresin de CD34 en CMM de MO al da 13 (1 pase) ..............80
iv

Figura 27. Expresin de CD105 en cultivos obtenidos de MO.......................83
Figura 28. Expresin de CD105 en CMM de MO al da 13 (1 pase). ...........83
Figura 29. Promedio de expresin de antgenos en CMM ...85
Figura 30. Promedio de expresin de antgenos en CMM (1er pase) 85
NDICE DE TABLAS
Tabla 1. Distribucin de CMM en diferentes rganos/tejidos y sus estados de
ontogenia .......................................................................................................17
Tabla 2. Caracterizacin fenotpica de CMM humanas. ................................23
Tabla 3. Marcadores Celulares que definen inmunofenotipo de CMM ..........29
Tabla 4. Comparacin de las caractersticas observadas en cultivo de CMM
obtenidas de MO, SCU y TA..........................................................................43
Tabla 5. Marcadores celulares y moleculares de clulas derivadas a partir de
CMM. .............................................................................................................44
Tabla 6. Anticuerpos Monoclonales empleados.............................................59
Tabla 7. Caractersticas de las muestras de sangre de cordn umbilical
recolectadas .................................................................................................67
Tabla 8. Caractersticas de las muestras de medula sea recolectadas .......68
vi
NDICE DE FOTOGRAFAS
Fotografa 1. Registro fotogrfico en recoleccin de Sangre de Cordn

Umbilical. .......................................................................................................61
Fotografa 2. Registro fotogrfico en recoleccin de Mdula sea. ..............63
Fotografa 3. Registro Microscopia Invertida. CMM obtenidas de SCU. Da 6
de cultivo........................................................................................................72
Fotografa 4. Registro Tincin con Wright. CMM obtenidas de SCU. Da 6 de
cultivo.............................................................................................................73
vii
NDICE DE ABREVIATURAS
CM:
Clulas Madre
CMA:
Clulas Madre Adultas
CMH:
Clulas Madre Hematopoyticas
CMM:
Clulas Madre Mesenquimales
MO:
Mdula sea
CMN:
Clulas Mononucleares
IL-6:
Interleucina 6
UFC:
Unidad Formadora de Colonia
AGM:
Regin Aorta Gnada Mesonefro
TA:
Tejido Adiposo
SCU:
Sangre de Cordn Umbilical
UGRs:
Regin de Surcos Urogenitales
AoM:
Regin aorta-dorsal que rodea al Mesnquimo
mTGF-:
Miembros
de
la
familia
del
Factor
de
Crecimiento
Transformante Beta
PMHs:
Protenas morfogenticas de hueso
TGF:
Factor de Crecimiento Transformante
TGF- :
Factor de Crecimiento Transformante Beta
UFC-F:
Unidad Formadora de Colonia de Fibroblastos
PBS:
Buffer Salino Fosfatado
SFB:
Suero Fetal Bovino
EICH:
Enfermedad del Injerto contra el Hospedero
CMM-MO:
Clulas Madre Mesenquimales derivadas de Medula sea
CMM-SCU: Clulas Madre Mesenquimales derivadas de SCU

TGC:
Tasa de generacin celular
IMF:
ndice medio de Fluorescencia
PDGF:
Factor de crecimiento derivado de plaquetas
EGF:
Factor de crecimiento epidermal

viii
1. INTRODUCCIN
En las ltimas dcadas el significado de las clulas madre (CM) ha cobrado

gran importancia como una posible solucin a enfermedades crnicas
convirtindose en una esperanza para aquellos pacientes que conviven con
ellas.
Dentro de las CM, se encuentran las clulas madre mesenquimales (CMM)
que se caracterizan por ser clulas adherentes con morfologa fibroblastoide,
capaces de diferenciarse a osteoblastos, adipocitos y condrocitos. Estas
clulas se pueden obtener de distintas fuentes, siendo las ms comunes
mdula sea y sangre de cordn umbilical.
La mdula sea (MO) es la principal fuente de obtencin de CMM, ya que all
se encuentran en mayor proporcin; aproximadamente una por cada 34.000
clulas mononucleares, contando con un xito de aislamiento en cultivo del
100% en un tiempo aproximado de 10 a 15 das.
La sangre de cordn umbilical (SCU) se propuso como una fuente
alternativa, ya que la recoleccin de la muestra implicaba procesos menos
invasivos a la MO y con menor riesgo de contaminacin, aunque
desafortunadamente no cuenta con un alto induce de obtencin y
proliferacin de estas clulas.
La literatura concerniente a la biologa y potencial de diferenciacin de las
CMM se ha incrementado en los ltimos 10 aos, sin embargo algunos datos
son an contradictorios. Las CMM se han convertido en una herramienta
promisoria en terapia celular debido a sus caractersticas particulares que
9
imitan parcialmente a las clulas madre embrionarias, pero con algunas

ventajas como la facilidad en su obtencin, expansin in vitro e implicaciones
ticas.
Existen muchas aplicaciones clnicas para el uso de las CMM, entre ellas las
ms importantes son el tratamiento en enfermedades degenerativas o
inflamatorias
que
comprometen
hueso,
cartlago,
tendn
tejidos
musculares.
Finalmente, con este trabajo se espera no solo estandarizar el aislamiento y
cultivo de CMM, sino fortalecer la lnea de investigacin Biologa de Clulas
Madre del grupo de Inmunologa y Biologa Celular del Departamento de
Microbiologa de la Pontificia Universidad Javeriana.
10
2. MARCO TERICO Y REVISIN DE LITERATURA
2.1 Clulas madre: Generalidades
Las clulas madre (CM) son un tema de actualidad por sus caractersticas de
autorenovacin, plasticidad y regeneracin tisular (1). Las clulas madre
adultas (CMA), son clulas progenitoras no diferenciadas que pueden
renovarse constantemente y dar origen a clulas especializadas; stas
clulas se encuentran en rganos de individuos adultos para reparar
eventualmente el tejido en caso de sufrir algn dao (2). Entre las CMA mas
estudiadas se encuentran las Clulas Madre Hematopoyticas (CMH) y las
Clulas Madre Mesenquimales (CMM).
Las CMH han sido objeto de una extensa investigacin ya que son
responsables de la regeneracin y mantenimiento de las clulas sanguneas
que se ubican en sangre perifrica, mdula sea, hgado y timo (3). En la
medula sea (MO) se encuentra otro tipo de CM llamadas clulas madre
mesenquimales, las cuales proveen el soporte fsico y factores de
diferenciacin para las CMH (4).
En la ltima dcada se han realizado numerosos estudios de caracterizacin
de CMM que las han definido como clulas adherentes pluripotentes de
morfologa fibroblastoide no hematopoyticas, capaces de diferenciarse en
diversos tejidos como osteoblastos, adipocitos, condrocitos, neuronas,
cardiomiocitos y hepatocitos. (4, 5)
11
2.2 Clulas Madre Mesenquimales (CMM)

2.2.1 Generalidades
Las CMM son CMA con un gran potencial de diferenciacin hacia distintos
tejidos mesenquimales. Estas clulas fueron descritas por Alexander
Friedenstein en MO siendo caracterizadas como clulas adherentes de
morfologa fibroblastoide que existen en una relacin de una clula por cada
34.000 clulas mononucleares (CMN) en MO, capaces de diferenciarse
fcilmente
in vitro
en diferentes tejidos de origen conectivo como
osteoblastos, condrocitos y adipocitos. (6). (Figura 1).

Figura 1. Diagrama esquemtico de lineajes de diferenciacin de las Clulas
Madre Mesenquimales.
Adaptado de: Marshak D, Gardener R, Gottlieb D. 2001. Stem Cell Biology. Cold
Spring Harbor Laboratory Press. New York. Pg. 350.
12
Las CMM juegan un papel biolgico importante por ser parte activa del
estroma de MO, brindando de esta manera el soporte necesario para regular
la hematopoyesis a travs de seales que inducen la diferenciacin y
proliferacin de las CMH y su progenie por medio de interacciones directas
clula-clula y la secrecin de factores de crecimiento (7). Las CMM tienen
un esquema jerrquico de maduracin, el cual ha sido descrito en dos
compartimientos medulares: Un compartimiento no comprometido y un
compartimiento comprometido que contiene progenitores CMM agrupadas en
Unidades Formadoras de Colonias (UFC), que vara de acuerdo a la
especializacin tisular inducida por seales emitidas en el microambiente,
an desconocidas y no caracterizadas (8). Como se muestra en la figura 2,
el compartimiento no comprometido esta compuesto por las CMM primarias
las cuales tienen una alta capacidad de autorenovacin dando origen a
cuatro progenitores comprometidos que agrupan varios grupos celulares, que
dependiendo del microambiente brindado lograrn diferenciarse en lineajes
celulares especficos, que madurarn a distintos tipos de clulas como
condrocitos, tenocitos, osteocitos, adipocitos, clulas de msculo liso, clulas
cardiacas, astrocitos y neuronas; las cuales tienen un potencial de
autorenovacin limitado.
13
Figura 2. Diagrama esquemtico de la jerarqua de proliferacin de CMM.
Adaptado de: Roufosse C, Direkse N, Otto W, Wright N. Circulating mesenchymal

stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 2004; 36:585-97.
2.2.2 Ontogenia de las Clulas Madre Mesenquimales

Hasta la fecha es poco lo que se conoce acerca de la ontogenia de las CMM,
siendo un tema pobremente definido y caracterizado incluso en la vida fetal
temprana;
desconociendo
los
tejidos
embrionarios
donde
residen
inicialmente y si estn localizadas en asociacin en los lugares donde se

encuentran los progenitores hematopoyticos embrionarios (9, 10). Algunos
investigadores han tratado de dilucidar este tema realizando ensayos
experimentales en animales, donde han identificado CMM a partir del da 11
de formacin en embriones de ratn (Figura 3A); mostrando que estas
14
clulas se localizan especficamente en la regin aorta-gnada-mesonefro

(AGM) (Figura 3B), donde tambin aparecen las primeras CMH, lo que
podra mostrar que tanto CMM como CMH podran tener un desarrollo
paralelo y coordinado (11).
Figura 3. Dibujo esquemtico de un embrin de ratn en el da 11 de
gestacin. A. Embrin de ratn en el da 11 de formacin. B. Regin Aorta-gnadamesonefro.
Adaptado de: Mendes S, Robin C and Dzierzak E. Mesenchymal progenitor cells

localize within hematopoietic sites throughout ontogeny. Development. 2005;
132:1127-36.
En dichos estudios tambin se ha encontrado que diferentes regiones del

embrin proveen el microambiente necesario para que los progenitores
mesenquimales se puedan diferenciar en adipocitos, condrocitos y
osteoblastos. Estos estudios en modelos animales han mostrado una alta
frecuencia de progenitores adipognicos en la regin de surcos urogenitales
(UGRs) comparada con las regiones AGM y Aorta Dorsal que rodea el
Mesnquima (AoM) (Figura 4B), lo que muestra que este sitio provee un
microambiente particular y favorable para que se de all la adipognesis; de
la misma forma se encontraron depsitos de progenitores osteognicos en
15
esta regin, en la regin AGM y en la regin AoM, pero la cantidad de

progenitores osteognicos fue similar en las regiones UGRs y AGM (Figura
4A). Contrario a este ltimo, los progenitores condrognicos estn presentes
en alta frecuencia en la regin AoM y en mayor cantidad en las regiones
UGRs y AGM (Figura 4C). (11)
Figura
4.
Frecuencia
de
progenitores
osteognicos,
adipognicos
condrognicos en las regiones AGM, AoM y UGRs.
DIFERENCIACION OSTEOGENICA
DIFERENCIACION
ADIPOGENICA
DIFERENCIACION ADIPOGENICA
DIFERENCIACION
CONDROGENICA
DIFERENCIACION CONDROGENICA
PROGENITORES/ 104 CELULAS
DIFERENCIACION OSTEOGENICA
AGM: Regin aorta-gnada-mesonefro, AoM: Aorta dorsal que rodea el mesenquima, UGRs: Regin del surco urogenital
Tomado de: Mendes S, Robin C and Dzierzak E. 2005. Mesenchymal progenitor

cells localize within hematopoietic sites throughout ontogeny. Development.
132:1127-1136.
Otras investigaciones muestran que las CMM derivan del mesodermo, por lo
que se les ha designado con la palabra Mesenquimal que hace referencia
al tejido conectivo flcido que se desarrolla en el embrin, que da lugar a
gran parte de las clulas del tejido conectivo del adulto (8). Otros autores
sugieren que las CMM pueden originarse a partir del hemangioblasto en MO,
aunque esta teora an no ha sido probada. (12) Las CMM se han
16
encontrado en varios tejidos en diversas especies y en diferentes estados de

desarrollo (fetal y/o postnatal) como se presenta en la tabla 1.
Tabla 1. Distribucin de CMM en diferentes rganos/tejidos y sus estados de
ontogenia
Tejido u rgano
Estado de
Especie
Ao
Referencia
desarrollo
Tejido Adiposo
Postnatal
Humano
2002
Zuk et al.
Tejido Adiposo
Postnatal
Ratn
2002
Safford et al.
Pncreas
Fetal
Humano
2002
Safford et al.
Mdula sea
Fetal
Humano
2001
Campagnoli et al.
Hgado
Fetal
Humano
2001
Campagnoli et al.
Sangre
Fetal
Humano
2001
Campagnoli et al.
Tendn
Postnatal
Ratn
2003
Salingcarnboribon
et al.
Membrana
Posnatal
Ratn
2003
De Bari et al.
Fetal
Humano
2003
Int Ander et al.
Postnatal
Humano
2000,
Zvaifler et. al,
2003
Kuwana et al.
2000
Alfonso et al.
Sinovial
Lquido
Amnitico
Sangre
Perifrica
Sangre Cordn
Fetal
Umbilical
Postnatal
Humano
Adaptado de: N. Beyer Nardi and L. da Silva Meirelles. Mesenchymal stem cells:
isolation, in Vitro expansion and characterization. Handb Exp Pharmacol. 2006; 174:
249-82.
17
2.2.3 Localizacin de las Clulas Madre Mesenquimales

El nicho en el cual se localizan las CMM an no se ha investigado en
profundidad, ya que no se tiene un conocimiento completo de la totalidad de
rganos y tejidos en los que se pueden encontrar estas clulas adems de la
MO. En la MO estas clulas se localizan en el estroma donde residen con
clulas endoteliales, adipocitos, macrfagos, clulas reticulares, fibroblastos,
osteoprogenitores y CMH; brindando interacciones celulares esenciales para
la existencia y funcionamiento de la hematopoyesis (13).
Hasta la fecha, estudios realizados han demostrado la existencia de CMM en
otros tejidos como tejido adiposo (TA), pncreas, hgado, sangre perifrica,
lquido amnitico, sangre de cordn umbilical (SCU), hueso trabecular,
msculo esqueltico y gelatina de Wharton. (13, 14) (Tabla 1).
Para lograr el aislamiento y cultivo de CMM los tejidos u rganos ms
empleados son MO, SCU y TA en donde cada uno de ellos ofrece ventajas y
desventajas que se adaptan a las exigencias que se requieran por parte del
investigador. La MO es la mejor fuente de obtencin de CMM multipotentes,
existen algunos aspectos que dificultan la investigacin, incluyendo la
limitada tasa de crecimiento, la capacidad de diferenciacin de acuerdo a la
edad del donante y el riesgo en la toma de muestra. (15-17)
Otra fuente como sangre de cordn umbilical requiere optimizar puntos
crticos para lograr un cultivo exitoso como: i) Tiempo de procesamiento
inferior a 16 horas a la toma de muestra y ii) Volumen de SCU igual o
superior a 30 ml. (17-21)
18
Respecto al aislamiento y cultivo de CMM a partir de tejido adiposo, estudios

han revelado que las clulas obtenidas de esta fuente tienen la misma
morfologa, fenotipo y capacidad de diferenciacin in vitro que las CMM
obtenidas de MO, pero su principal diferencia se encuentra en la capacidad
proliferativa de las CMM obtenidas de TA, ya que cuentan con un perfil de
expresin gentica mas alto que las CMM obtenidas de MO, postulndolas
como una importante alternativa para el aislamiento y cultivo de CMM;
incluyendo la alta accesibilidad para la obtencin de muestras en
procedimientos como liposuccin o abdominoplastia (19).
2.2.4 Microambiente: Citoquinas involucradas y movilizacin de CMM

En la medicina regenerativa, las CMM tienen un gran impacto, razn por la
cual son utilizadas para expandirlas en cultivos y estudiar su capacidad de
diferenciacin. De esta manera, es de gran importancia entender el tipo de
interacciones que establecen las CMM dentro de su microambiente nicho
cuya funcin es brindar todas las condiciones necesarias para establecer y
mantener sus propiedades biolgicas (23).
La habilidad de las CM de alojarse dentro de sus nichos es un fenmeno
evolutivamente conservado en el reino eucaritico, el cual se encuentra
regulado por seales celulares intrnsecas como factores controladores de
divisin asimtrica, factores que modulan la expresin gnica de los estados
de compromiso o no compromiso en linajes celulares y los relojes biolgicos
que controlan el nmero de ciclos de divisin celular; involucrando el
mantenimiento de fenmenos de autorenovacin y maduracin celular (23,
24). Uno de los microambientes ms importantes en los que residen las CMM
es el estoma medular, en el cual conviven con clulas hematopoyticas y
clulas endoteliales, aunque se cree que cada una mantiene su nicho en
19
compartimentos separados, necesitando cooperacin entre todas ya que son

sistemas dependientes. Las CMM al pertenecer a las clulas del estroma, se
encuentran reguladas por seales de interaccin clula-clula principalmente
para modular sus estados metablicos, mitticos y de desarrollo en general.
(Figura 4).
Estudios realizados revelan que la Interleucina-6 (IL-6), es una de las
interleucinas ms importante secretada por las CMM ya que es responsable
del desarrollo, regeneracin y diferenciacin de las CMH, llevando a cabo
tambin funciones de remodelacin tisular por medio de acciones ejercidas
sobre clulas del tejido conectivo, proteasas e inhibidores de proteasas por
medio de la unin a receptores especficos compuestos de un sitio de unin y
una seal de traduccin (24) (Figura 5).
20
Figura 5. Representacin del Nicho de las Clulas Madre Mesenquimales
Adaptado de: Yin T, Li L. 2006. The stem cell niches in bone. J Clin Invest.; 116:1195-201.
21
En investigaciones realizadas in vitro, se ha logrado mostrar el incremento en

la sntesis de IL-6 por parte de las CMM al adicionar IL-1, que es una
molcula conocida por sus procesos de mediacin en invasin microbiana,
inflamacin, reacciones inmunolgicas y dao en tejidos. Tanto la IL-6 como
la IL-1 tienen un papel importante en la regulacin de la respuesta inmune y
procesos de homestasis, lo que sugiere que las CMM pueden actuar en
procesos inmunolgicos localmente y fuera de la MO cuando algn tejido se
encuentra expuesto frente a algn tipo de dao o infeccin, apoyando la
teora de migracin de CMM (24).
En la MO, las CMM pueden autorenovarse para dar lugar a clulas que
pueden diferenciarse en lineajes de tejido conectivo, incluyendo tanto
diferenciacin osteognica como a tejidos derivados de estroma, compuesto
por tres tipos de clulas: i))adipocitos, ii)clulas osteognicas y iii) clulas
reticulares in vivo, caracterstica que otorga a las CMM la posibilidad de
incluirlas como herramienta teraputica. (24, 25)
Aunque estudios recientes revelan la presencia de CMM en la mayora de
tejidos humanos, se han investigado mecanismos en los cuales se ha
comprobado la movilizacin de CMM desde MO hacia distintos rganos en
los cuales puede llegar a formar un microambiente particular, expandirse y
posteriormente diferenciarse. Se cree que a travs de mecanismos como
interacciones clula-clula o clula-matriz, las CMM son liberadas del nicho
en el que residen en MO, facilitando as su ingreso al flujo sanguneo, medio
por el cual llegarn a su destino y crean un nuevo nicho. (26) Al realizar el
aislamiento y cultivo de CMM humanas de diferentes tejidos, se han logrado
identificar y caracterizar molculas que les confieren adhesin, marcadores
especficos y de matriz celular, factores de crecimiento e integrinas (24), que
se encuentran descritas en la tabla 2.
22
Tabla 2. Caracterizacin fenotpica de CMM humanas.
Adaptado de: Deans RJ, Moseley AB. 2000. Mesenchymal Stem Cells: Biology and
potential clinical uses. Exp Hematol; 28:875-84.
23
2.2.5 Microambiente y diferenciacin hacia adipocitos, osteoblastos y

condrocitos
La naturaleza y las propiedades de un microambiente para las clulas madre

hematopoyticas, neuronales y epiteliales han sido mostradas por varios
estudios (27, 28); sin embargo, no existen datos especficos sobre las
caractersticas y las propiedades del microambiente para los progenitores
mesenquimales en mdula sea o tejido conectivo. (29).
El mantenimiento del compartimiento de una clula madre depende de
reguladores de la clula modulados por seales externas que comprenden la
regulacin gnica que modula los distintos estadios de diferenciacin de las
CMM; a su vez, dichas seales para logran controlar el destino celular,
involucran una compleja interrelacin de seales cortas y prolongadas entre
los progenitores y las clulas vecinas. (30)
En estudios realizados, se ha comprobado la existencia de colonias de CMM
derivadas de un nico precursor que tienen distintos potenciales de
diferenciacin (15) (Figura 6B); dicho potencial se ha clasificado de acuerdo
a su capacidad para dividirse y dar origen a cada una de las clulas
derivadas del tejido conectivo (adipocitos, osteoblastos, condrocitos y clulas
de otros tejidos conectivos) , en tetra, tri, bi y uni lineaje; donde solo una
tercera parte de clones de CMM derivados de mdula sea son pluripotentes,
es decir se pueden dividir y dar origen a: osteocitos, condrocitos y adipocitos.
(31) En estudios realizados solo un 30% de clones de clulas no
inmortalizadas exhibieron un potencial tri-lineaje (osteo/condro/adipo) de
diferenciacin, en tanto que las dems mostraron un potencial de bi
(osteo/condro) o uni (osteo) lineage. (32)
24
Figura 6. Modelos de diferenciacin de las CMM.
Tomado de: Baksh D, Song L and Tuan R. S. 2004. Adult mesenchymal stem cells:
characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J. Cell. Mol.
Med. 3: 301-316.
Basados en la informacin gentica y genmica de las CMM, se ha diseado

un modelo de regulacin para la diferenciacin de estas clulas madre
adultas, que incorpora dos compartimientos continuos y distintos. En el
primer
compartimiento,
las
CMM
experimentan
una
modificacin
transcripcional, lo que genera clulas precursoras sin cambios aparentes en

el fenotipo y en su capacidad de autorenovacin como lo muestra figura 7A.
Cuando existe una estimulacin, las CMM multipotentes no comprometidas
sufren una divisin asimtrica, generando dos clulas hijas, una que es una
replica exacta de la clula que le dio origen y mantiene su potencial de
multilineaje, y la otra clula hija que comienza a ser una clula precursora,
con un programa de desarrollo mas restringido. En este modelo, la clula
precursora contina con la divisin asimtrica, generando ms precursores
celulares tripotentes y bipotentes como lo muestra la figura 7B (13).
25
Figura 7. Modelo esquemtico de la diferenciacin de las CMM.
Tomado de: Baksh D, Song L and Tuan R. S. 2004. Adult mesenchymal stem cells:
characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J. Cell. Mol.
Med. 3: 301-316.
Dichos
precursores
son
morfolgicamente
similares
las
CMM
multipotentes, pero difieren en su repertorio de trascripcin gnica, y por

tanto, residen en el mismo compartimiento de las CMM multipotentes. La
salida de las clulas del compartimiento de clula madre al compartimiento
de presentacin ocurre cuando la clula precursora continua dividindose
simtricamente para generar un progenitor celular unipotente con la
adquisicin de propiedades especficas de un linaje definido, para dar origen
a clulas maduras comprometidas con fenotipos evaluables; no obstante,
hasta la fecha, no esta claramente entendido el mecanismo que controla el
trnsito de clula madre no comprometida a comprometida para generar
progenitores celulares de un linaje especfico, y dar origen a clulas
somticas (13).
26
El compromiso y la diferenciacin de las CMM hacia tipos celulares maduros

es un proceso temporalmente controlado y estricto, que involucra actividades
de varios factores de trascripcin, citoquinas, factores de crecimiento, y
molculas de la matriz extracelular. Gracias a la tecnologa de microensayos
de DNA, se ha logrado identificar los genes como: period homolog 1 (PER1),
nebulette (NEBL), neuronal cell adhesin molecule (NRCAM), FK506 binding
protein 5 (FKBP5), interleukin 1 type II receptor (IL1R2), zinc finger protein
145 (ZNF145), tissue inhibitor of metalloproteinase 4 (TIMP4), y serum
amyloid A2. La funcin de estos genes cubre un amplio rango de procesos
celulares, incluido la adhesin celular, la organizacin del citoesqueleto de
actina, as como tambin la respuesta inflamatoria implicando la inicializacin
y el comprometimiento de las clulas madre adultas en un complejo proceso
que requiere de la coordinacin de mltiples molculas y de vas de
sealizacin. (13)
Mediante estrategias de diferenciacin in vitro, se ha observado que las CMM
diferenciadas en osteoblastos, adipocitos y condrocitos pueden cambiar sus
fenotipos hacia otros lineajes mesenquimales en respuesta a estmulos
especficos extracelulares adicionados en el medio de cultivo (33).
Por ejemplo, la osteognesis de las CMM tanto in vivo como in vitro, es una
cascada organizada de secuencia de eventos, que involucran mltiples
pasos y la expresin de varios factores de regulacin. Durante la
osteognesis, las CMM multipotentes entran en periodo de divisin
asimtrica y generan precursores osteoblsticos, quienes progresan hasta
formar
pre-osteoblastos,
osteoblastos
funcionales
eventualmente
osteocitos. El progreso de un estado de diferenciacin al siguiente esta

acompaado
por
la
activacin
de
factores
de
trascripcin,
como:
Cbfa1/Runx2, Msx2, Dlx5, Osx, y la expresin de marcadores de genes

relativos al hueso como osteopontina, colgeno tipo I, fosfatasa alcalina,
27
sialoprotena de hueso y osteocalcina. La ruptura de la expresin de alguno

de estos genes resulta en el retraso de la progresin celular hacia el fenotipo
de osteoblasto y la subsiguiente falla para formar osteoblastos funcionales,
de la misma manera se ha encontrado que miembros de la familia WNT tiene
gran impacto en la osteognesis de las CMM (13).
Por otra parte, la condrognesis es uno de los procesos prioritarios in vivo
que realizan las CMM dentro del estroma medular. Se sabe que involucra
eventos como el incremento de interacciones celulares tipo uniones gap
interactuando con la N-caderina y N-catenina, que son
molculas
fundamentales para la formacin de cartlago y el desarrollo completo de la

condrognesis a travs de fosforilaciones llevadas a cabo por protenas de
las familia WNT (26).
En estudios realizados de adipognesis in vivo por parte de las CMM, estos
revelan que existen grandes familias de protenas que dirigen o inhiben la
diferenciacin hacia adipocitos. Las protenas encargadas de estimular la
diferenciacin hacia adipocitos son: i) Receptores Activados de Peroxisomas
PPAR3 y ii) Factor de trascripcin CAAT/ que aumenta la unin proteica
CEBP; actuando como factores reguladores positivos de una forma ligando
dependiente a travs de fosforilacin por cascadas MAP quinasa. Por otra
parte, las molculas contrarreguladoras del proceso de adipognesis son los
miembros de la familia del
Factor de Crecimiento Transformante Beta
mTGF- y las protenas morfogenticas de hueso
PMHs. Las mTGF-
proveen las seales necesarias para llevar a cabo la diferenciacin hacia

osteoblastos y condrocitos, inhibiendo la biognesis y adipognesis; mientras
que las PMHs tambin inhiben la adipognesis y la generacin de miocitos,
pero promueve potentemente la diferenciacin hacia osteoblastos (34).
28
2.2.6 Caracterizacin fenotpica de las CMM.

Las CMM cultivadas in vitro han sido analizadas a partir de caractersticas
morfolgicas y protenas expresadas en la superficie celular. Aunque hasta la
fecha no se ha logrado estandarizar un perfil especifico para la
caracterizacin inmunofenotpica de las CMM, los marcadores celulares ms
importantes que definen el fenotipo de las CMM se presenta en la tabla 3.
Tabla 3. Marcadores Celulares que definen inmunofenotipo de CMM
Marcadores
Mesenquimales
Positivos
Referencia
Marcadores
Mesenquimales
Negativos
Referencia
CD90
34 - 36.
CD14
22, 70
CD105 (SH2)
37- 40.
CD31
22, 70
CD73 (SH3 SH4)
41- 46.
CD33
22, 70
STRO-1
47- 49.
CD34
22, 70
CD166
26, 55- 57.
CD45
22, 70
CD44
50-54.
Glicoforina A
22, 70
Las caractersticas de las molculas ms importantes son presentadas a

continuacin con una descripcin detallada.
2.2.6.1 Estructura y funcin de CD90
Conocido tambin como Thy-1, es una protena que hace parte de la
superfamilia de las inmunoglobulinas, cuenta con un peso molecular de 2535 KDa y se encuentra compuesta de 112 aminocidos. CD90 se localiza en
la superficie celular, anclada a la membrana por medio de una molcula de
glicofosfatidilinositol (35) (Figura 8).
29
Figura 8. Estructura del antgeno CD90
Tomado de: Barboni E, Rivero BP, George AJ, Martin SR, Renoup DV, Hounsell EF,
Barber PC, Morris RJ. The glycophosphatidylinositol anchor affects the conformation
of Thy-1 protein. J Cell Sci. 1995; 108:487-97
El principal ligando de CD90 es la molcula CD45, con la cual interacta

mediante asociaciones moleculares, requeridas para la activacin de
linfocitos murinos. La molcula CD90 se expresa entre el 10-40% de las
clulas CD34, mientras que en tejido conectivo y en clulas pertenecientes al
estroma medular se encontr una expresin mayor. (36, 37).
Tambin
conocida
como
endoglina
SH-2,
es
una
glicoprotena
transmembranal con un peso de 180 kDa, que hace parte del Complejo
30
Receptor del Factor de Crecimiento Transformante Beta (TGF) (38). TGF es

una citocina involucrada en la proliferacin y diferenciacin celular que acta
a travs de mecanismos de fosforilacin regulados por TGF-1, quien acta
como molcula contrarreguladora suprimiendo el crecimiento y la migracin
celular (38)
La molcula CD105 interviene en la regulacin de distintos componentes de
matriz extracelulares como fibronectina, colgeno, inhibidor del activador del
plasmingeno -1 (IAP-1). Tambin se cree que CD105 se encuentra
relacionada con procesos de angiognesis y reparacin vascular, aunque no
hay certeza de ello (38, 39)
CD105 se encuentra predominantemente expresado en la mayora de
clulas endoteliales y en clulas progenitoras en el estroma de la MO sin
embargo, existen ciertas clulas no endoteliales que tambin expresan
CD105 como monocitos activados, macrfagos activados, precursores
eritroides, fibroblastos, clulas foliculares dendrticas, melanocitos, clulas
cardiacas, clulas vasculares de msculo liso, clulas mesangiales,
sincitiotrofoblastos y CMM (37). Tambin se ha demostrado que defectos en
la expresin de CD105 o su ausencia, son la causa de Telangectasia
hemorrgica hereditaria tipo 1, que es un sndrome autosmico dominante
caracterizado por una displasia vascular multisistmica que incluye signos y
sntomas
como
epistaxis
recurrente,
telangectasias
mucocutneas,
hemorragia gastrointestinal y malformaciones en arterias y venas de pulmn,

cerebro e hgado (40).
Investigaciones recientes sugieren que la expresin de CD105 en CMM
humanas tienen un gran impacto en la medicina cardiovascular regenerativa
debido su gran plasticidad para generar a partir de progenitores no
diferenciados, clulas especializadas como cardiomiocitos en procedimientos
31
realizados in situ, los cuales expresan protenas de unin gap necesarias

para la interaccin de las clulas del msculo cardiaco y espontneamente
Ca2+ como generador de energa, cuando son inyectadas CMM en el corazn
de murinos (41).
Es tambin conocido como 5 ectonucleotidasa, SH3
o SH4. Esta
glicoprotena cuenta con un peso molecular de 69-72 KDa y 548

aminocidos. La estructura qumica responsable su adhesin a la membrana
celular es una molcula de glicosil-fosfatidilinositol la cual se une a travs de
residuos de serina presentes en el extremo C-Terminal, el cual hace parte de
un complejo oligoglicano (42, 43).
La estructura de CD73 se compone de dos dominios: El dominio N- terminal
y el dominio C-terminal. El dominio N terminal posee entre 250 y 342
aminocidos y es el responsable de la adhesin celular gracias a sus dos
iones metlicos de Zinc que llevan a cabo la accin ltica; el dominio Cterminal contiene de 362 a 361 aminocidos el cual provee el lugar de unin
para la adenosina. Finalmente una larga -hlice que cuenta con 343 a 361
aminocidos conecta los dos dominios para hacer que CD73 sea funcional
(42, 44) (Figura 9).
32
Figura 9. Estructura del antgeno CD73
Iones
Metlicos
de Zinc
Adaptado de: Strter N. 2006. Ecto- 5-nucleotidase: Structure function relationships.

Purinergic Signal; 2:343-50.
Su principal funcin biolgica es hidrolizar nucletidos extracelulares para

permitir el ingreso de nuclesidos como adenosina, inosina y guanosina para
generar ATP y GPT como fuente de energa celular, llevando a cabo la
siguiente reaccin:
5 Ectonucleotidasa
5 ribonucletido + H2O
Ribonucletido + fosfato
CD73 se ha encontrado en clulas de placenta, linfocitos de sangre

perifrica, clulas endoteliales, clulas dendrticas y CMM. (44, 45).
33
Las funciones celulares mediadas por CD73 an no se encuentran

totalmente esclarecidas, sin embargo, se ha comprobado que no solo media
reacciones de hidrlisis, sino que tambin se sabe que es responsable de
activar seales coestimuladoras en linfocitos T. En inmunobiologa CD73 es
empleado como un marcador de maduracin de linfocitos T y B, ya que en
clulas inmaduras se encuentra totalmente ausente (45, 46). El papel que
juega CD73 en las CMM an no se ha definido completamente; sin embargo
se ha encontrado co-expresin con 2 Integrinas, lo que ha planteado a
CD73 como un mediador de adhesin celular (47).
2.2.6.4 Estructura y funcin de STRO-1
En 1991 se identific STRO-1 como un antgeno especfico para la

identificacin de CMM presentes en el estroma medular, convirtindose en
un posible marcador especfico para este tipo de clulas (48). Investigaciones
realizadas demuestran que STRO-1 es un marcador que se expresa en el
desarrollo temprano de las CMM, cuando conservan completamente su
plasticidad y no se han diferenciado a progenitores comprometidos; y su
expresin declina cuando genes asociados a la diferenciacin y expansin
osteognica como el Factor de Unin Core A1 (CBFA1) inician la interaccin
con osteopontina y osteocalcina (48, 49).
En un principio, el uso de STRO-1 fue utilizado en aspirados frescos de MO
con el objetivo de identificar CMM para realizar estudios de esta poblacin,
sin embargo, en tejidos fijados, no se detect (48, 49). Investigaciones
recientes implementan el uso de este marcador debido a que tiene una alta
expresin cuando se realizan cultivos in vitro libres de suero utilizados para
comprender el funcionamiento in vivo del ambiente medular o como soporte
para la expansin y crecimiento de CMH
34
ex vivo, ya que bajo estas
condiciones se logra improvisar con alta reproducibilidad el funcionamiento y

microambiente del estroma medular (50).
Investigaciones actuales se
encuentran enfocadas a establecer la estructura qumica de STRO-1, ya que

an no se encuentra caracterizada, esperando con esto, una mayor
comprensin de las funciones celulares realizadas por esta molcula.
Es una protena transmembranal que cuenta con un peso molecular de 37 kD
y 341 aminocidos. (Figura 10) (51). CD44 es una molcula de adhesin que
acta a travs de interacciones con molculas por las cuales posee alta
afinidad, entre ellas el cido hialurnico, siendo su principal receptor en la
matriz celular para la orientacin polar celular; interactuando adems con
otros ligandos como osteopontina, colgeno, anquirina, fibronectina y
metaloproteinasas para establecer las interacciones clula-clula, adhesin y
migracin celular incluyendo el homing de linfocitos a travs de distintos
mecanismos de
glicosilacin que dependen de caractersticas celulares
como estado de diferenciacin, estado de activacin y transformacin celular.

Se expresa aproximadamente en el 90% de los linfocitos, monocitos,
granulocitos y en menor proporcin en timocitos, fibroblastos y precursores
celulares no hematopoyticos (progenitores mesenquimales) (51-53).
35
Figura 10. Estructura del antgeno CD44.

Motivo Asn 4
Determinante
eptope KM114
Motiv
o As n
Determinante eptope
IRAWB14
Extremo
Amino
Extremo
Carboxil
Terminal
Adaptado de: Kincade P, Zheng Z, Katoh S, Hanson L. 1997. The importance of

cellular environment to function of the CD44 matrix receptor. Curr Opin Cell Biol;
9:635-42.
Investigaciones recientes relacionan a las CMM con la reparacin de clulas

cardiacas a travs de procesos de migracin desde MO hasta corazn por
mecanismos celulares y moleculares que involucran la expresin de CD44 y
su interaccin con cido hialurnico (AH); sin embargo tambin se ha podido
comprobar que CD44 acta como una molcula de adhesin en compaa de
HA al demostrar que median la interaccin con protenas como hialuronan y
fibronectina, sugiriendo que CD44 tiene gran importancia en procesos
biolgicos como adhesin, migracin y proliferacin de CMM (54, 55).

Tambin conocida como molcula de adhesin celular activadora de
leucocitos (ALCAM), es una protena que cuenta con un peso molecular de
100-105 KDa con 556 aminocidos que consisten en 5 dominios similares a
36
inmunoglobulinas, ya que pertenece a la gran familia de las inmunoglobulinas

(56).
Su principal ligando es CD6, con el cual realizan importantes acciones en el
sistema inmune, especialmente en la generacin de memoria en linfocitos B
pudiendo o no estar involucrada en la activacin de linfocitos T y produccin
de citoquinas. CD166 se expresa en distintos tipos de clulas como
neuronas, linfocitos T activados, monocitos activados, epitelio, fibroblastos y
CMH y CMM (57, 58, 59).
Estudios realizados sugieren que CD166 tiene un papel muy importante en la
hematopoyesis involucrando a las CMM, ya que la proliferacin y
diferenciacin de las CMH dependen de una muy cercana asociacin con las
CMM presentes en el estroma medular, las cuales generan una diversidad de
factores reguladores incluyendo citocinas y factores de crecimiento que
mantienen interacciones adhesivas esenciales para la supervivencia y
funcin de las CMH, que media un estado de indiferenciacin de las CMH y
probablemente de las CMM (26).
2.2.7 Cultivo de CMM
2.2.7.1 Antecedentes en el cultivo de CMM
Alexander Friedenstein, Maureen Owen y colaboradores fueron los primeros

en utilizar cultivos in vitro de CMM para ser transplantados en animales de
laboratorio en sistemas abiertos (bajo la cpsula renal, o subcutneamente)
para caracterizar clulas que componan el estroma de la mdula sea.
Debido a la existencia de una pequea matriz extracelular en la mdula,
realizaban una disrupcin mecnica suave para obtener el estroma y las
clulas hematopoyticas en una suspensin celular; cuando estas clulas
37
eran sembradas a una baja densidad, las clulas del estroma de la mdula
sea rpidamente se adheran y podan ser separadas de las clulas
hematopoyticas no adherentes, mediante repetidos lavados. La presencia
de esta capa adherente poda ser observada a los pocos das, como una
capa altamente heterognea. Alrededor del tercer a cuarto da, observaban
dos o cuatro fibroblastos entre los histiocitos y las clulas mononucleares,
quienes se podan diferenciar en clulas que podan formar pequeos
depsitos de hueso o cartlago; a estas clulas les di el nombre de unidades
formadoras de colonias de fibroblastos (UFC-F). (22, 26, 60).
2.2.7.2 Condiciones de cultivo y factores de crecimiento para la

diferenciacin de CMM.
Las CMM representan una pequea fraccin de la poblacin total de clulas

nucleadas presentes en mdula (1 por cada 34.000 CMN) (22); logrando ser
sembradas
enriquecidas
utilizando
tcnicas
de
cultivo
estndar.
Frecuentemente, la muestra de mdula sea completa, es sometida a

fraccionamiento mediante una solucin que provee un gradiente de densidad
como el Hystopaque o Ficoll-Hypaque (21, 61); seguido a esto, las clulas
mononucleares son separadas y sembradas a una densidad que oscila entre
1x106 clulas/cm2 a 4x106 clulas/cm2. (21, 31, 62).
Las clulas generalmente son cultivadas en medios como Dulbecco
modificado de Eagle en presencia de 10% de suero fetal bovino (SFB), 1%
de aminocidos no esenciales, 1% de piruvato de sodio, 0.1% de
penicilina/estreptomicina y 0.5% Ciproxacilina (60 -66), y son incubadas a
37C en atmsfera hmeda que contiene el 5% de CO2. (67). Las clulas no
adherentes son removidas 24-72 horas despus y se les realiza cambio de
38
medio. Despus dos semanas se obtiene un cultivo relativamente

homogneo con morfologa e inmunofenotipo similar a las CMM (22, 60, 61).
Algunos investigadores prefieren la adicin de suplementos como factores
de crecimiento, por ejemplo el factor de crecimiento fibroblastoide -2 (FGF-2)
a los cultivos primarios de CMM; para inducir un incremento en el potencial
osteognico pueden ser utilizados y citocinas como la IL-6 y la interleucina 1 (IL-1 ) y para mantener el desarrollo del cultivo y potenciar la
diferenciacin de las CMM multipotentes (24, 54).
La expansin de las CMM depende del uso que se les quiera dar, por esto se
requiere de varios aspectos a tener en cuenta como: la preseleccin de un
SFB de excelente calidad, si las CMM van a ser utilizadas en aplicaciones
con seres humanos es muy importante identificar y definir un medio de cultivo
libre de suero, para obtener tcnicas de cultivo ms reproducibles e
incrementar la seguridad de los mismos. (60).
Las condiciones ideales de cultivo se realizan con el fin de mantener las
caractersticas de las CMM como: i). Genotipo y funciones similares a las que
exhiben en su nicho original, ii). proliferacin indefinida, y iii) plasticidad
activa para poder diferenciarse en mltiples lineajes. (22).
La utilizacin de CMM para llevar a cabo activacin osteognica requiere de
la presencia de -glicerol-fosfato, cido ascrbico-2-fosfato, dexametasona y
suero fetal bovino. Cuando se cultiva en monocapa en presencia de estos
suplementos las clulas adquieren una morfologa osteoblstica con la
regulacin de la actividad de la fosfatasa alcalina y la deposicin de una
matriz extracelular mineralizada rica en calcio. (31, 32, 33, 60) (Figura 11).
39
Figura 11. Anlisis histolgico e histoqumica de Osteocitos. Identificados

mediante el rojo de alizarin que reconoce la matriz extracelular calcificada.
Tomado de: Song L., Tuan R. S. 2004; Transdifferentiation potential of human

mesenchymal stem cells derived from bone marrow. FASEB J; 18: 980-94.
Sobre la diferenciacin condrognica, esta ocurre cuando las CMM crecen

bajo condiciones que incluyen un medio libre de suero, y la adicin de un
miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta
(TGF-). TGF-1, 2 y 3 tienen la habilidad de inducir esta respuesta pero
TGF-2 y 3 son ms efectivos que 1 para promover la condrognesis.
Cuando estas condiciones estn dadas las clulas rpidamente pierden su
morfologa fibroblstica y se inicia la expresin de un nmero de
componentes de matriz extracelular especfico de cartlago. Esto involucra
una rpida biosntesis de glicosaminoglicano y es acompaado por la
dramtica alteracin en la morfologa celular (31, 32, 33, 60) (Figura 12).
40
Figura 12. Anlisis histolgico e histoqumica de Condrocitos. Detectados por

pellet de alta densidad.
Tomado de: Song L., Tuan R. S. 2004; Transdifferentiation potential of human

mesenchymal stem cells derived from bone marrow. FASEB J. 18: 980-994.
Tambin se ha observado que las CMM cultivadas en monocapa en

presencia de isobutimetilxantina induce la diferenciacin hacia adipocitos con
la produccin de vacuolas largas lipdicas. La diferenciacin adipognica de
las CMM es inducida por el l receptor gamma de peroxisoma-proliferador
activado (PPAR-) as como la sintetasa cida grasa (31, 32, 33, 60) (Figura
13)
Figura 13. Anlisis histolgico e histoqumica de Adipocitos. Vacuolas lipdicas
identificadas con aceite rojo-O.
Tomado de: Song L., Tuan R. S., 2004. Transdifferentiation potential of human
mesenchymal stem cells derived from bone marrow. FASEB J. 18: 980-994
41
2.2.7.3 Obtencin y cultivo de CMM derivadas de mdula sea, sangre

de cordn umbilical y tejido adiposo
Las CMM originalmente han sido aisladas de mdula sea (MO) (26, 32,33),
pero poblaciones similares han sido reportadas en otros tejidos, como sangre
de cordn umbilical (4, 21, 61, 62, 63) y tejido adiposo (65, 66).
Las CMM asiladas de MO son obtenidas a travs de aspirados medulares
realizados por personal entrenado, los cuales son mezclados con
anticoagulantes como Heparina o EDTA para garantizar la estabilidad de la
muestra hasta realizar el procesamiento (26, 32, 33).
Para realizar aislamiento y cultivo de CMM obtenidas de SCU, la recoleccin
de las muestras se realiza en bolsas de recoleccin que contienen CPDA
como anticoagulante en la mayora de trabajos experimentales realizados (4,
21, 61, 62, 63). Las CMM tambin pueden ser aisladas de tejido adiposo
humano obtenido a travs de procedimientos como abdominoplastias y
lipoesculturas. (15, 19).
Luego de la obtencin de la muestra ya sea MO, SCU o TA, por medio de
gradientes de densidad como Ficoll - Hypaque se separan las clulas
mononucleares y estas son puestas en medios de cultivos que tengan alto
contenido proteico para garantizar la supervivencia celular de las CMM,
siendo los mas empleados: i) Medio Dulbecco modificado de Eagle (DMEM),
ii) Medio Dulbecco modificado de Eagle bajo en glucosa con L-glutamina
(DMEM/LG/L-G), iii) Medio Dulbecco modificado de Iscove con L-glutamina y
iv) y Medio alfa MEM (-MEM); con suplementos como SFB, gentamicina,
aminocidos no esenciales, piruvato de sodio entre otros (21, 31, 61, 62).
42
Las ventajas y desventajas que ofrecen cada una de las principales fuentes
de obtencin de CMM, se presentan en la tabla 4 se presentan los
principales aspectos relacionados con aislamiento y diferenciacin; y en la
tabla 5 se muestran los principales marcadores celulares y moleculares que
expresan las clulas diferenciadas a partir de CMM.
Tabla 4. Comparacin de las caractersticas observadas en cultivo de CMM
obtenidas de MO, SCU y TA.
PARMETRO EVALUADO
MO
SCU
TA
100%
30-34%
100%
4-5 das
2-4 semanas
4-5 das
(83 61)
(0.002 0.004)
(557 673)
71.4%
100%
78.8%
100%
0%
94%
100%
100%
100%
CD44
97.5 5.1
99.7 0.5
99.8 0.2
CD73
90.0 20.0
99.3 1.3
99.6 0.5
CD90
99.1 2.5
97.8 7.1
99.6 0.2
CD105
88.1 7.4
72.4 20.0
90.4 5.9
HLA I
95.2 6.0
94.3 6.8
98.8 2.8
xito de aislamiento
Formacin de monocapa adherente
UFC-F obtenidas en la monocapa
adherente
Capacidad
de
diferenciacin
osteognica
Capacidad
de
diferenciacin
adipognica
Capacidad
de
diferenciacin
condrognica
Expresin antgenos (%)
Adaptada de: Kern et al. Comparative Analisis of Mesenchymal Stem Cells from
Bone Marrow, Umbilical Cord Blood, or Adipose Tissue. Stem Cells; 2006:24:1294301; Wagner et al. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from
human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. Exp Hematol. 2005;
33:1402-16.
43
Tabla 5. Marcadores celulares y moleculares de clulas derivadas a partir de

CMM.
MARCADORES DE IDENTIFICACION DE FENOTIPO TERMINAL
DIFERENCIACIN HACIA
MOLECULAR
Adipocitos
PPAR2
C/EBP
aP2
Adipsina
Leptina
Lipoprotein lipasa
Condrocitos
Cbfa-1
Colgeno tipo II y IX
Agrecano
Osteoblastos
Acumulacin en el citoplasma de gotas

lipdicas.
Matriz enriquecida con en proteoglucanos

y colgeno tipo II y IX.
Cbfa-1
Fosfatasa alcalina Hueso/hgado /rin
Sialoprotena de hueso
Osteopontina
Osteocalcina
Colgeno tipo I
Tenocitos
Colgeno tipo II
Proteoglucanos
Clulas
de
msculo
esqueltico
Clulas
de
msculo
liso
Clulas
de
msculo
cardiaco
Astrocitos
Oligoendrocitos
Neuronas
Formacin de una matriz mineralizada.
Tendn implantado con

biomecnicas mejoradas.
Soporte del estroma

hematopoyetico
CELULAR
propiedades
Mantenimiento y soporte hematopoyetico

para la diferenciacin de clulas que
expresan CD34+.
Soporte para la osteoclastogenesis.
Soporte
para
megacariopoyesis
y
trombocitopoyesis.
------
MyoD
Myf 5 y 6
MEF-2
Miogenina
MRF4
Miosina
Clulas multinucleadas contrctiles.
ASMA
Metavinculina
Calponina
h-Caldesmonina
Actina de msculo tarda
------
GATA 4 y 6
Troponina cardiaca I y C
Actina-sarcomerica
Desprendedor de miosina lento
ANP
------
Filamento intermedio de protena acidita

fibrilar glial
Galactocerebrosidasa
Neurofilamentos
Tubulina BIII
Sinaptofisina
Integracin dentro del cerebro neonatal.

------
------
Adaptada de: Mingell J, Erices A, Conget P. Mesenchymal Stem Cells. Exp Biol
Med. 2001; 226:507-20
44
2.2.8 Aplicaciones clnicas de CMM

En las ltimas dcadas, las CMM han sido objeto de estudio biolgico por la
plasticidad demostrada in vitro al lograr diferenciarse en mltiples tejidos
celulares y sus funciones inmunoreguladoras las convierten en candidatas a
brindar soluciones clnicas importantes.
Con base en la diferenciacin que
poseen las CMM in Vitro, muchos experimentos de ingeniera de tejidos han sido
llevados a cabo con animales
en los cuales estas clulas son capaces de
reparar o regenerar tejidos deteriorados o mutados como hueso, cartlago, tejido

heptico o miocrdico; tambin son capaces de interferir con el crecimiento
celular en neoplasias y modular reacciones inmunes en colagenopatas y
esclerosis mltiple. Sin embargo, las patologas son complejas, lo que requiere
la invencin de propiedades estructurales y mecnicas similares a las que se
encuentran en cada uno de los tejidos humanos, reto que est siendo estudiado
e investigado para brindar en un futuro cercano mecanismos que sean
empleados para mejorar la calidad de vida de la poblacin (70) (Figura 14).
45
Figura 14. Diferenciacin de las CMM
Modoficado
de:
Stem
Cell
Information.
Stem
Cell
Basics.
http://stemcells.nih.gov/info/basics/basics4.asp. [En lnea] (Consulta Noviembre 19

de 2006).
46
Las principales aplicaciones estn en la reparacin de hueso, donde se han
realizado experimentos in vivo en ratones NOD/SCID y en caninos con

defectos crneo-faciales y defectos de huesos largos administrando
directamente CMM con matrices como hidroxiapatito/fosfato triclcico
(HA/TPC) para la formacin de hueso obteniendo resultados satisfactorios,
sobre todo cuando se realiza administracin de CMM in situ (9). Tambin las
CMM han sido administradas en ratones con osteognesis imperfecta, que
es un desorden gentico hereditario ocasionado por defectos en la cantidad o
estructura del colgeno tipo I, que hace parte fundamental del la matriz sea;
deteriorando posteriormente la formacin de hueso y cartlago funcional. Este
tipo de prctica se realiz en nios sin tener efecto en el momento, pero
transcurridos 3 meses, se increment el nmero de osteoblastos, la
formacin de nueva lmina sea y el contenido mineral presente en el cuerpo
disminuyendo la frecuencia de fracturas. Se cree que el efecto de las CMM
fue adems fibras de colgeno y proveer factores de crecimiento de la familia
BMP. Para garantizar la formacin de hueso, se hace necesario el uso de
materiales naturales o sintticos como transportadores de CMM por ejemplo
cermicas o titanio que son materiales inertes y osteoconductivos. (9, 67, 71)
El rol de las CMM en la reparacin de cartlago fue descrito en 1994 a travs
de la inyeccin local de condrocitos para corregir defectos de cartlago
humano. Desde ese momento se han realizado protocolos estratgicos en
ingeniera de tejido para lograr diferenciacin in situ de CMM en cartlago (67,
69). La induccin de diferenciacin de CMM a condrocitos se ha realizado en
matrices tridimensionales que han sido estudiadas in vivo en presencia de
citocinas y protena morfogentica recombinante de hueso humano (rhBMP);
al realizar este procedimiento
que combina las clulas regenerativas,
matrices biolgicas activas y factores de crecimiento que inducen a la

formacin de condrocitos, se ha logrado un mayor xito en el tratamiento de
defecto de cartlago (67).
47
Tal vez el logro ms significativo es la regeneracin de discos vertebrales en

ratas que no los tenan. Se realiz inyeccin local con CMM marcadas con
fluorocromos, usando como transportador hialuronan al 15%. A los 28 das
de haber realizado la inyeccin celular, se observaron el nmero de clulas
introducidas con un 100% de viabilidad, indicando que la proliferacin y
viabilidad de las CMM dentro de la rata fue exitosa (67, 70).
Las CMM tienen tambin juegan un papel importante en la reparacin de
tendn en donde se han empleado modelos humanos y animales para
evaluar la eficiencia de las CMM en reparacin de tendn a travs de una
inyeccin local, usando como transportador usualmente colgeno tipo I en
distintas concentraciones autlogas de CMM (1, 4 y 8 x106 clulas/ml);
teniendo un 30% de efectividad en la reparacin ya que generalmente el
tendn se caracteriza por ser un tejido que modula gran fuerza y estrs (67).
En estudios realizados en conejos defectuosos, tambin se emple colgeno
junto a las CMM en una concentracin de 4x106 clulas/ml en el tendn de
Aquiles; revelando los anlisis histolgicos y bioqumicos una mejora de las
propiedades biomecnicas y en la estructura y funcionalidad del tejido. A las
12 semanas de realizada la ciruga, se observ una reparacin de tejido del
34-37%. Estos datos sugieren que deben implementarse factores adicionales
a los establecidos para mejorar el porcentaje de regeneracin tisular (67).
Uno de los campos en los que las CMM han sido objeto de profunda
investigacin actual es en la reparacin de miocardio. En la realizacin de
investigaciones se han usado modelos humanos y murinos, en los cuales se
realiza un implante de CMM en el miocardio y al diferenciarse en
cardiomiocitos, estimula procesos como angiognesis, disminuye de
apoptosis e incrementa la produccin de colgeno, lo cual contribuye a la
48
atenuacin o reversin de los efectos causados por el infarto, remodelando a

su vez el ventrculo izquierdo (9, 67).
Tambin se han descrito procesos de generacin de vasculatura cardiaca a
partir de inyectar CMM diferenciadas a cardiomiocitos in vitro en miocardio
ventricular, detectndose los cardiomiocitos alrededor de los vasos
sanguneos que rodeaban el sitio de inyeccin (22, 67, 68).
Defectos congnitos en el msculo esqueltico como distrofia muscular y

otras miopatas, pueden ser tericamente restaurados con un transplante de
CMM que mejoran la estructura y funcin del msculo. CMM obtenidas de la
membrana sinovial han mostrado in vivo un potencial miognico en el modelo
murino mdx que expresa distrofia muscular de Duchenne, contribuyendo las
CMM a la expresin normal de la distrofina (9, 72).
Las CMM han mostrado en trabajos de investigacin su potencial

inmunomodulatorio en la supresin de la activacin de linfocitos T tanto in
vivo como in vitro. In vivo puede ser una manera para mantener la
homestasis
e inhibir la activacin inmune en distintos compartimientos,
como MO y la interfase entre la madre y el feto. Las CMM modulan la funcin

inmune de la mayora de poblaciones celulares involucradas en el
reconocimiento
eliminacin
de
aloantgenos,
incluyendo
clulas
presentadoras de antgenos, linfocitos T y clulas Natural Killer (Figura 15)

(67, 71, 72).
49
Figura 15. Ilustracin esquemtica de los efectos de CMM en el Sistema

Inmune.
Adaptado de: Rasmusson I. 2006. Immune modulation by mesenchymal stem cells.

Exp Cell Res; 312:2169-79.
Aunque el mecanismo molecular que media este tipo de reaccin an no se

encuentra totalmente comprendido, esta caracterstica puede ser usada en
usos teraputicos como i) transplante de CMM con transportadores
biolgicos sintticos como fosfato triclcico en enfermedades degenerativas
50
e inflamatorias que involucran hueso, cartlago, tendn y tejidos musculares

que conduzcan a las clulas hasta el tejido lesionado; ii) transplante de CMH
junto con CMM para la prevencin de la enfermedad injerto versus husped
que generalmente se genera en este procedimiento y iii) tratamientos contra
el cncer, ya que las CMM poseen propiedades para la secrecin de
molculas como IFN-, que posee propiedades antiproliferativas sobre lneas
celulares de melanomas (72).
2.2.9 Relacin entre CMM y CMH
La hematopoyesis eficiente depende de un completo microambiente que
provee seales apropiadas para la produccin de factores solubles e
interacciones de contacto celular (5).
Las CMM, inicialmente identificadas en la MO humana, han sido descritas en
los tejidos fetales hematopoyticos en donde al parecer acompaan el
desarrollo y migracin de las CMH. La primera evidencia de la importancia de
las CMM en el desarrollo de las CMH la realiz Friedenstein hacia los aos
70; mas adelante, en modelos murinos que eran sometidos a irradiacin, se
inici la realizacin de inyeccin de CMM con CMH del donante, ocasionando
una aceleracin en la recuperacin de la actividad hematopoytica (73).
Con el fin de entender el microambiente que se lleva a cabo en la MO, se
han realizado co-cultivos entre CMM y CMH, para esclarecer que tipo de
seales enva el estroma medular a las CMH y como se regulan mecanismos
de quiescencia y diferenciacin de CMH. Estudios realizados, demuestran
que cuando se realizan co-cultivos entre CMH y CMM, estas ultimas brindan
seales para la proliferacin celular y diferenciacin celular; mientras que los
cultivos de CMH realizados sin CMM con factores celulares que proveen las
CMM, tienen una tasa de proliferacin normal, pero muchas de las CMH
51
pierden su plasticidad y por ende, su capacidad de diferenciacin.

Investigaciones han revelado que en co-cultivos realizados entre CMM y
CMH, las CMM pueden mantener la hematopoyesis por periodos cercanos a
6 meses (73-75).
Una de las mayores complicaciones en el transplante de CMH es la
Enfermedad del Injerto contra el Husped (EICH), donde las clulas
inmunocompetentes reconocen el transplante realizado como extrao y lo
atacan hasta destruirlo (76). Esta patologa se genera porque al realizar un
transplante de CMH van incluidas una mezcla de clulas, incluyendo
linfocitos T maduros. Para realizar un transplante de CMH, el receptor posee
per se profundos daos a causa de una enfermedad de base, y al realizar el
transplante, las clulas del receptor se activan para iniciar la secrecin de
citoquinas pro-inflamatorias como FNT- e IL-1 que desencadenarn la
reaccin entre los Linfocitos T maduros y las clulas presentadoras de
antgeno y llevarn finalmente a EICH. Al realizar cotransplantes de CMM
con CMH, hay menor probabilidad de desatar EICH, ya que redisminuyen los
niveles sricos de IFN- (71, 76).
Gracias a sus propiedades biolgicas como la capacidad de regeneracin y
mantenimiento celular e inhibicin de la respuesta inmune al realizar
transplantes, las CMM representan una gran herramienta con la que la
medicina contar en el futuro para dar una solucin definitiva a aquellas
enfermedades que hasta el momento no cuentan con un tratamiento viable.
Hasta la fecha, se siguen realizando investigaciones
in vitro que se
asemejan cada vez ms al microambiente en el que residen in vivo con el fin

de caracterizar completamente la biologa de las CMM para poder realizar
prximamente regeneracin y reparacin tisular en humanos no solo como
proyectos de investigacin, sino como una herramienta teraputica
clnicamente instaurada; aunque en las dos ltimas dcadas los avances
52
cientficos han aportado conocimientos claves de CMM, al lograr realizar

exitosamente este tipo de procedimientos en animales.
En el momento en el que se logre realizar la identificacin de los roles
biolgicos que llevan a cabo las CMM y los mecanismos responsables de
cada una de estas acciones, la medicina regenerativa ya no pensar en
tratamientos
temporales
para
enfermedades
degenerativas,
sino
en
soluciones definitivas con transplantes de CM.
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN

El desarrollo de investigaciones orientadas al estudio y caracterizacin de la
biologa de las clulas madre mesenquimales en Colombia an no cuenta
con una larga trayectoria. Actualmente existen 3 lneas de investigacin
inscritas
en
Colciencias
(http://www.colciencias.gov.co/),
las
cuales
corresponden a: i) Clulas Stem perteneciente al grupo Biotecnologa en

salud de la Universidad Militar Nueva Granada, ii) Medicina Regenerativa a
travs de Clulas Madre de la Universidad de Antioquia y iii) Biologa de las
Clulas Madre perteneciente al grupo Inmunobiologa y Biologa Celular de
la Pontificia Universidad Javeriana. El desarrollo de dichas lneas de
investigacin se realiz hace menos de 10 aos razn por la cual no existen
an publicaciones cientficas colombianas en revistas de alto impacto
internacional sobre este tema, demostrando que este campo de la ciencia en
nuestro pas es aun insipiente.
Debido a la razn anteriormente nombrada, con la realizacin de este
trabajo, se pretende realizar un estudio en la obtencin, condiciones de
cultivo e inmunofenotipificacin de CMM provenientes de sangre de cordn
umbilical y medula sea, con el fin de establecer las condiciones ptimas,
para que en un futuro, con base en los resultados obtenidos, se puedan
53
realizar trabajos de investigacin orientados a la caracterizacin biolgica de

CMM en Colombia que permitan realizar aportes de nuevos conocimientos
acerca las mismas, a travs del entendimiento del funcionamiento del
microambiente medular ex vivo, ya que se ha comprobado que las CMM
brindan soporte fsico y seales apropiadas para la produccin de factores e
interacciones celulares en las CMH, logrando guiar mecanismos de
quiescencia o diferenciacin celular.
Las CMM son una alternativa teraputica en la regeneracin tisular y
mediante este trabajo se espera establecer un sistema de cultivo para el uso
de CMM para desarrollar estudios experimentales que puedan contribuir en
la implementacin de protocolos clnicos que lleven a cabo su utilizacin en
reparacin de hueso en nuestro pas que lleven a cabo su utilizacin para
realizar aplicaciones en campos como reparacin de hueso en sndromes
que involucren malformaciones, regeneracin de tejido dental en pacientes
con enfermedades degenerativas y regeneracin de cardiomicitos en
pacientes con problemas cardiacos entre otras aplicaciones. A pesar que
existen an muchos interrogantes que no estn resueltos, es inminente el
uso de las CMM junto con otras disciplinas como la terapia gnica y la
bioingeniera, que en un futuro se convertirn en valiosas armas con las que
contar la medicina regenerativa, por esta razn, es de gran importancia
incentivar trabajos de investigacin orientados a esta materia en Colombia.
Finalmente, con este trabajo se espera no solo estandarizar el aislamiento y
cultivo de CMM, sino fortalecer la lnea de investigacin Biologa de Clulas
Madre del grupo de Inmunobiologa y Biologa Celular del Departamento de
Microbiologa de la Pontificia Universidad Javeriana.
54
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Aislar y cultivar clulas madre mesenquimales derivadas de sangre de

cordn umbilical y medula sea.
4.2 Objetivos Especficos
4.2.1 Aislar clulas madre mesenquimales a partir de sangre de cordn

umbilical y medula sea de donantes voluntarios normales (segn
criterios de inclusin).
4.2.2 Establecer la Tasa de Generacin Celular (TGC) de las CMM en el
sistema de cultivo establecido.
4.2.3 Determinar las caractersticas morfolgicas de las CMM obtenidas en
cultivo a partir de microscopia invertida y tincin con Wright.
4.2.4 Evaluar la expresin de las protenas CD34, CD45, CD90 y CD105 en
las CMM obtenidas de SCU y MO por medio de citometra de flujo.
.
55
5. MATERIALES Y MTODOS
5.1 Tipo de estudio: Descriptivo transversal

5.2 Poblacin
Clulas mononucleares, obtenidas a partir de sangre de cordn umbilical de
donantes voluntarias sanas y aspirados de medula sea de pacientes
sometidos a reemplazo de cadera y otros procedimientos ortopdicos.
5.3 Muestra de estudio
Clulas mononucleares, obtenidas a partir de sangre de cordn umbilical de
donantes voluntarias sanas que asisten al servicio de ginecobstetricia del
Hospital Occidente de Kennedy y aspirados de mdula sea de pacientes
sometidos a reemplazo de cadera en el servicio de Ortopedia del Hospital
Universitario de San Ignacio y Hospital Occidente de Kennedy.
5.4 Mtodos
56
5.4.1 Plan tcnico de trabajo
Seleccin de
donantes y
recoleccin de SCU
Ficoll-Hypaque
Amershan
Biosciences
Seleccin de donantes
y recoleccin de
aspirados de MO
Separacin de CMN de
SCU y MO
Recuento celular en
cmara de Neubauer
Viabilidad celular
superior a 90%
Cultivo celular con una densidad

celular inicial de 1x106 cel/ cm2
para las muestras de SCU y MO.
Medicin de
Variables
Tasa de generacin
celular
Morfologa Celular
57
Expresin de
Marcadores celulares
5.5 Variables de estudio

Las variables incluidas en este estudio son aquellas que logran medirse ya
sean de forma cualitativa o forma cuantitativa, comprendiendo i) Tasa de
Generacin celular, ii) Caractersticas morfolgicas e iii) ndice Medio de
Fluorescencia.
5.5.1 Tasa de generacin celular (TGC):

Se realiza a travs del conteo
de CMM en cmara de Neubauer,
determinando el nmero de clulas obtenidas en un intervalo de tiempo por

medio de la siguiente frmula (77):
TGC=
Logn2
Donde:
( Xf / Xi)
Tiempo (h)
Logn: 0.6931 (Constante)

Xf:
Nmero de clulas recogidas
Xi:
Nmero de Clulas sembradas
5.5.2 Caractersticas morfolgicas

Por medio de la tcnica citolgica Cytospin, realizada en el equipo Cytospin 3
(Shandon) centrifugndose la muestra por 5 minutos a 500 rpm, se realiz el
anlisis de las caractersticas morfolgicas celulares de CMM a travs de
microscopa en lminas coloreadas con tincin de Wright.
58
5.5.3 Expresin de marcadores celulares por Citometra de Flujo

La determinacin de los marcadores celulares de CMM se realiz a travs de
anticuerpos monoclonales de la siguiente manera (Tabla 6.):
Tabla 6. Anticuerpos Monoclonales empleados
CASA
ANTICUERPO
FLUOROCROMO
ISOTIPO
CLON
COMERCIAL
Mouse IgG1 CD34
FITC
FITC
BIRMA
DAKOCYTOMATION
K3
Mouse IgG1 CD45
PERCP
PERCP
T29/33
DAKOCYTOMATION
5E10
DAKOCYTOMATION
SN6
EBIOSCIENCE
Mouse IgG1 CD90
PE
PE
Mouse IgG1 -
CD105
APC
APC
5.6 Seleccin de donantes

Las muestras de sangre de cordn umbilical se obtuvieron a partir de
donantes voluntarias sanas que se encontraban en trabajo de parto (segn
indicaciones gineco-obsttricas) cumpliendo con los siguientes criterios de
inclusin:
Participacin voluntaria, con aceptacin y firma de un consentimiento

informado. (Anexo 1).
Mujeres entre 18 y 35 aos de edad y mujeres menores de edad que

contaran con la autorizacin de una persona mayor de edad.
59
Estado de gravidez a termino (38-40 semanas).
Ausencia de eclampsia, embarazos ectpicos, abortos o embarazos

de alto riesgo segn la valoracin del ginecobstetra.
Ausencia de diabetes gestacional.
Ausencia de resultados positivos para TORCH (Toxoplasma, Sfilis,

Rubola, Citomegalovirus, Herpes) y enfermedades infecciosas (HIV,
Hepatitis B y C).
Ausencia de enfermedades congnitas en embarazos previos.
Las muestras de medula sea se obtuvieron a partir de pacientes que fueron

sometidos a reemplazo total o parcial de cadera y que cumplieran con los
siguientes criterios de inclusin:
Participacin voluntaria, con aceptacin y firma del consentimiento

informado (Anexo 2).
Pacientes sanos sometidos a procesos quirrgicos ortopdicos.
Ausencia de resultados positivos para enfermedades infecciosas (HIV,

Hepatitis B y C).
5.7 Recoleccin de SCU y MO

Las muestras de sangre de cordn umbilical se obtuvieron en bolsas de
recoleccin con anticoagulante CPDA (Baxter); previo a la recoleccin de la
60
muestra se realizaba un pre-tratamiento mediante el cual se eliminaba el

exceso de anticoagulante y se mantena la manguera de la bolsa cerrada con
una pinza Kelly, seguido a esto, se pinzaba el cordn umbilical (Fotografa
1a) y el especialista cortaba el cordn en dos secciones (Fotografa 1b); la
primera que es la que lleva el neonato unido y la segunda, que es la que
permanece unida a la placenta de la madre, a la cual se le realizaba una
desinfeccin adecuada con una solucin yodada; seguido a esto, se proceda
a recolectar la muestra (Fotografa 1c); a medida que la sangre drenaba, la
bolsa era mezclada con movimientos circulares. Una vez terminada la
recoleccin se sellaba la bolsa y se retiraba la aguja al respectivo guardin
(Fotografa 1d). El volumen promedio recolectado de SCU fue de 70 a 100
mL. Las muestras fueron recogidas gracias al apoyo del personal y servicio
de ginecobstetricia del Hospital Occidente de Kennedy.
Fotografa 1. Registro fotogrfico en recoleccin de Sangre de Cordn
Umbilical. A, Cordn umbilical Pinzado. B, Cordn Umbilical Cortado. C
Recoleccin de la muestra. D, Finalizacin del proceso de recoleccin de SCU.
61
Los aspirados de mdula sea se recolectaron en pacientes con artroplastia

de cadera, realizando un abordaje posterolateral para llevar a cabo un
procedimiento cbitolateral. Las muestras fueron obtenidas de Cresta Iliaca,
rimado acetabular y fmur (Figura 16)
Figura 16. Localizacin anatmica en la obtencin de aspirados de mdula
sea.
A travs de una capsulotoma de cadera y posterior luxacin de la misma; se

procede a la exposicin de la cavidad acetabular mediante la implementacin
de una sierra, resecndo el componente del tejido blando y la superficie
condral, para obtener la muestra medular de esta cavidad.
62
La recoleccin de la muestra medular del canal femoral, se realizaba a travs

de una ostectoma del cuello femoral y la posterior exposicin del canal,
mediante el uso de guas y fresas o reamer para la obtencin de la muestra
(Fotografa 2). Una vez recolectada la muestra, sta era transferida a tubos
falcon de 50 ml pretratados con EDTA, mezclando homogneamente la
muestra con el anticoagulante, obteniendo un volumen de recoleccin
promedio de 10 a 25 mL. Las muestras fueron recogidas gracias al apoyo
del personal y servicio de ortopedia del Hospital de San Ignacio y Hospital
Occidente de Kennedy
Fotografa 2. Registro fotogrfico en recoleccin de Mdula sea. A. Apertura
del canal femoral. B, C, D. Luxacin de la cadera. E. Rimado de acetbulo con
reamer o fresa. F. Continuacin del procedimiento quirrgico.
63
5.8 Aislamiento de clulas madre mesenquimales derivadas de sangre

de cordn umbilical y medula sea.
Tanto las CMM de SCU y MO son tomadas a travs de un consentimiento

escrito autorizado por el paciente en el cual, se hace referencia acerca del
procedimiento, utilidad, beneficio y finalidad de la muestra a recolectar. (78).
La recoleccin de SCU se realiz en un sistema de bolsas mltiple que
contiene CPDA, con un volumen promedio de 80 a 100 ml; mientras que la
recoleccin de aspirados de MO se hace a travs de aspirados medulares
con un volumen aproximado de 10 a 30 ml que son obtenidos de cresta
iliaca, fmur o rimado de acetbulo de donantes sanos de diferentes edades,
el cual es mezclado con EDTA.
La SCU obtenida era medida y diluida con PBS 1X -EDTA 2mM en relacin
1: 4 y 1:2 para MO, seguido a esto se proceda a separar las clulas
mononucleares mediante gradiente de densidad utilizando Ficoll-Hypaque
Amershan Biosciences en una relacin 1:3 tanto para SCU como para MO,
centrifugando a temperatura ambiente a 800g por 30 minutos para SCU y a
450g por 30 minutos para MO. Finalizada la centrifugacin las capas de
clulas mononucleares eran separadas y mezcladas con PBS1X, para ser
lavadas y centrifugadas; este procedimiento se realizo 3 veces a 1800rpm
por 5 minutos. En el ltimo lavado las clulas era resuspendidas en 1mL de
PBS 1X, a partir del cual se realizaban los clculos de viabilidad y recuento
celular. Las muestras deban ser procesadas antes de transcurrir 24 horas
despus de su recoleccin, ya que la eficiencia en la obtencin de CMM se
ve afectada negativamente.
64
5.9
Establecimiento
del
cultivo
primario
de
clulas
madre
mesenquimales.
De acuerdo a la viabilidad (mayor a 90%) y al recuento celular, se proceda a

establecer el cultivo celular primario con una densidad celular de 1x106
clulas/cm2, estas clulas se suspendan en un volumen final de medio de
cultivo IMDM de 1ml (Medio Iscove modificado de Dulbecco) suplementado
con 10% de suero fetal bovino, 1% de aminocidos no esenciales y de
piruvato de sodio, 0.5% de ciproxacilina y 0.1% de penicilina/estreptomicina.
La
formacin de la capa de clulas adherentes era evaluada transcurridas 72
horas para MO o 6 das para SCU, momento en el cual la capa de clulas no

adherentes era retirada.
5.10 Mantenimiento del cultivo primario y tripsinizacin.

El cultivo primario era mantenido hasta observar una confluencia celular del
70%, con cambio de medio de cultivo cada 3 das. Una vez observada la
confluencia se proceda a realizar el desprendimiento de las clulas
adherentes de morfologa fibroblastoide a
travs del proceso llamado
tripsinizacin con Tripsina (0.25%) EDTA (1mM).

Para poder llevar a cabo una tripsinizacin exitosa, era necesario retirar el
medio de cultivo de las placas y lavar las clulas que quedaban adheridas a
la placa con 1 ml aproximadamente de PBS 1X, seguido a esto se agregaba
la solucin Tripsina/EDTA por 5 minutos a 37C. Transcurridos los 5 minutos,
se inactiva la solucin Tripsina/EDTA con una solucin de medio de cultivo
con SFB al 20% en igual volumen al de la solucin Tripsina/EDTA con el fin
de preservar la integridad celular. La mezcla de las soluciones se lleva a
65
centrifugar 5 minutos a 1800 rpm a temperatura ambiente y el pellet celular

obtenido es lavado 2 veces con PBS1X.
De las clulas obtenidas luego de realizar la tripsinizacin, una parte de ellas
se coloreaban con tincin de Wright para observar morfologa celular, otra
parte se destinaba para realizar citometra de flujo y aproximadamente 10000
clulas eran destinadas a realizar pase celular de la muestra, con el fin de
obtener un cultivo mas puro.
5.11 Evaluacin de la expresin de CD34, CD45, CD90 y CD105 en las

CMM obtenidas de SCU y MO por citometra de flujo.
Al observar una confluencia celular cercana al 70%, se utilizaban 20.000

clulas que eran destinadas a ser analizadas para determinar la expresin de
las protenas CD34, CD45, CD90 y CD105, realizando el marcaje celular
agregando 5 l de Anti - CD45 y Anti - CD105 y 10 l de Anti CD34 y Anti
CD90 sobre el pellet de clulas directamente en los tubos de citometra.
Se realizaba una incubacin de 30 minutos en oscuridad a 4C. Transcurrida
la incubacin, se proceda a lavar con buffer PBS1X 5% albmina srica
bovina (ASB); llevando a centrifugar a 1800 rpm por 5 minutos. Al finalizar los
lavados, se descartaba el sobrenadante y este se resuspenda en 500 l de
buffer de citometra o buffer de fijacin con una concentracin de
paraformaldehido al 1%. Finalmente, la determinacin de la expresin de las
protenas se realiz mediante la lectura de las muestras en el citmetro de
flujo Facs Calibur BD con el software Cell Quest Pro.
66
6. RESULTADOS
6.1 Aislamiento de clulas madre mesenquimales de sangre de cordn
umbilical y medula sea
A continuacin se presentan las principales caractersticas de las muestras
obtenidas a partir de las dos fuentes utilizadas para el aislamiento de CMM;
sangre de cordn umbilical y medula sea.
Tabla 7. Caractersticas de las muestras de sangre de cordn umbilical
recolectadas (n=10)
SANGRE DE CORDON UMBILICAL

Muestra
Volumen
Tiempo de
Semanas de
recolectado
procesamiento
gestacin
SCU 001
80 mL
14 horas
42 semanas
SCU 002
70 mL
14 horas
40 semanas
SCU 003
80 mL
13 horas
38 semanas
SCU 004
80 mL
13 horas
39 semanas
SCU 005
100 mL
12 horas
40 semanas
SCU 006
120 mL
14 horas
38 semanas
SCU 007
100 mL
13 horas
40 semanas
SCU 008
80 mL
13 horas
38 semanas
SCU 009
80 mL
12 horas
36 semanas
SCU 010
80 mL
12 horas
40 semanas
67
Tabla 8. Caractersticas de las muestras de medula sea recolectadas (n=13)
MEDULA OSEA
Muestra
MO 001
Volumen
Edad
Procedimiento
Tiempo de
recolectado
donante
quirrgico
procesamiento
5 mL
69 aos
Reemplazo de
6 horas
cadera
MO 002
61 mL
59 aos
Reemplazo de
7 horas
cadera
MO 003
20 mL
65 aos
Reemplazo de
6 horas
cadera
MO 004
21 mL
23 aos
Osteosntesis
7 horas
fmur
MO 005
5 mL
79 aos
Reemplazo de
9 horas
cadera
MO 006
10 mL
72 aos
Reemplazo de
9 horas
cadera
MO 007
20 mL
8 aos
Osteosntesis
9 horas
fmur
MO 008
20 mL
12 aos
Osteosntesis
9 horas
fmur
MO 009
20 mL
15 aos
Osteosntesis
9 horas
fmur
MO 010
27 mL
74 aos
Reemplazo de
7 horas
cadera
MO 011
20 mL
68 aos
Reemplazo de
5 horas
cadera
MO 012
20 mL
9 aos
Osteosntesis
14 horas
fmur
MO 013
72 mL
42 aos
Reemplazo de
cadera
68
6 horas
Para el estudio, se procesaron 10 muestras de sangre de cordn umbilical y

13 muestras de medula sea, a partir de las cuales se obtuvo una eficiencia
en la obtencin de clulas con caractersticas fibroblastoides del 30% para
sangre de cordn umbilical y 80% para medula sea.
6.2 Establecimiento de la tasa de generacin celular
La tasa de generacin celular se define como el tiempo (horas/minutos)

necesario para que una poblacin celular se duplique.
Las muestras de sangre de cordn umbilical (n=3) presentaron una tasa de
generacin celular que variaba entre 20 minutos y 50 minutos como se
observa en la figura 17.
Figura 17. Tasa de generacin celular para SCU.
TASA DE GENERACION CELULAR PARA SCU

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
SCU-002
SCU-005
SCU-007
M U EST R A S
Las muestras de medula sea (10) mostraban una tasa de generacin celular
que oscilaba entre 16 minutos y 39 minutos como se observa en la figura 18.
69
Figura 18. Tasa de generacin celular para MO
TASA DE GENERACION CELULAR PARA MO

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
M O001A
M O001B
M O005A
M O006B
M O007B
M O008B
M O009B
M O010B
M O011B
M O013B
M O013C
M U EST R A S
Una de las muestras de medula sea (MO-002) fue separada y cultivada

segn el lugar de obtencin de la muestra; en mdula de cresta iliaca, rimado
de acetbulo y medula de fmur, observando una variacin importante en la
TGC entre los lugares de extraccin, esto se puede observar en la figura 19
donde es evidente las diferentes tasas de generacin obtenidas para cada
una de las muestras.
Figura 19. Tasa de generacin celular para MO. Muestra MO-002

TASA DE GENERACION CELULAR PARA MO-002
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
MO-002A
Mdula Cresta Iliaca
MO-002B
Mdula Acetbulo
M U EST R A
70
MO-002C
Mdula Fmur
6.3 Determinacin de caractersticas morfolgicas

La evaluacin morfolgica de las CMM se realizo mediante dos mtodos;
microscopia invertida y tincin con Wright. En microscopia invertida se utilizo
una cmara fotogrfica digital marca OLYMPUS D-540 CAMEDIA y un
microscopio invertido marca OLYMPUS CK2.
6.3.1 Sangre de cordn umbilical

Para las muestras obtenidas a partir de SCU el registro fotogrfico se
realizaba los das 6 y 20 de cultivo, donde el da 6 corresponda al da en que
se les retiraba las clulas no adherentes y el da 20 cuando se obtena una
monocapa de clulas adherentes.
En el da 6 de cultivo, se al realizarse la evaluacin morfolgica mediante
microscopia invertida, en las muestras de sangre de cordn umbilical (n=3)
se observaban clulas con caractersticas fibroblastoides, que emitan
prolongaciones como se puede observar en la fotografa 3-A, B, C y E, as
como tambin en la fotografa 3-D
se observa que en
algunas clulas
exista la presencia de vacuolas en las prolongaciones.

En el registro realizado a partir de clulas fijadas mediante la tcnica de
Cytospin y posterior tincin con Wright, en las fotografas 4A y 4C se
aprecian clulas de gran tamao que tienen un ncleo redondo excntrico,
con un citoplasma ligeramente basfilo y desprovisto de granulaciones,
inclusiones o vacuolas.
71
Fotografa 3. Registro Microscopia Invertida. CMM obtenidas de SCU.
F
Fotografa 3. Muestras SCU Da
6 A. CMM-SCU. 10X. Da 20 B.
CMM-SCU. 20X. C. CMM-SCU.
40X D. CMM-SCU. 40X E. CMMSCU. 40X. Control fibroblastos
Dia 6 F. Fibroblastos. 10X G.
Fibroblastos. 10X H. Fibroblastos.
20X.
72
Fotografa 4. Registro Tincin con Wright. CMM obtenidas de SCU.
Fotografa 4. Muestras CMMSCU. Da 20 100X. A-E.
73
6.3.2 Mdula sea

Para las muestras derivadas de MO el registro fotogrfico se realizo el da
3 de cultivo, momento en el que se retiraba las clulas no adherentes y el
da 10 de cultivo cuando se observaba una monocapa de clulas
adherentes.
En el registro realizado el da 3 mediante microscopio invertido, se
observaron clulas alargadas con prolongaciones que cumplen con las
caractersticas fibroblastoides descritas en la literatura. En la fotografa 5
A se puede observar que las clulas emiten dos prolongaciones contrario
a lo que se puede ver en las fotografas 5 B-D donde las clulas
solamente emiten una prolongacin por cada extremo, adems de ser
clulas un poco ms gruesas y cortas.
La evaluacin morfolgica a partir de tincin con Wright, presenta clulas
de gran tamao, que cuentan con un ncleo redondo excntrico y en
algunas fotografas se alcanzan a apreciar nucleolos; respecto al
citoplasma, este se observa basfilo y desprovisto de granulaciones o
inclusiones, comparado con las CMM obtenidas a partir de SCU, algunas
CMM de MO presentan vacuolas (Fotografa 6. A, C y D).
74
Fotografa 5. Registro Microscopia Invertida. CMM obtenidas de MO.
Fotografa. 5. Muestras MO. Da 3 A. CMM-MO.10X. B. CMM-MO. 10X. Da 10 C. CMM-MO. 10X. D. CMM-MO. 10X. E. CMMMO. 20X. F. CMM-MO. 40X. Control fibroblastos Da 3 G. Fibroblastos. 10X. H. Fibroblastos. 20X.
75
Fotografa 6. Registro Tincin Wright. CMM obtenidas de MO.
Fotografa 6. Muestras CMM-MO. Da 10. 100X. A E. Muestras CMM-MO. Da 13. 100X F

fibroblastos. Da 10. 100X. I L.
76
H. Control
6.4 Evaluacin de la expresin de los marcadores CD34, CD45, CD90 Y

CD105 en clulas madre mesenquimales de sangre de cordn umbilical
y mdula sea
Los controles utilizados para evaluar la expresin de los marcadores CD34,
CD45, CD90 y CD105 en las CMM, fueron: Sangre Perifrica para 34-/45+/90/105+, sangre de cordn umbilical para 34+/45+/90low/105- y Fibroblastos para
34-/45-/90+/105+ (Figura20).
Figura 20. Controles empleados. A. Sangre Perifrica. B Sangre Cordn Umbilical.

C. Fibroblastos.
M1
100
101
102
103
104
77
No se logr realizar citometra de flujo para las muestras de sangre de

cordn umbilical, al analizar estas muestras en el clitmetro y realizar un dot
plot de SSC/FSC se observaba una alta dispersin celular y era imposible
definir una poblacin celular homognea.
La evaluacin de los marcadores seleccionados para las clulas madre
mesenquimales de MO, fue realizada a partir del clculo del ndice Medio de
Fluorescencia (77), calculado as:
Media geomtrica de la muestra

IMF=
Media geomtrica del control negativo
La expresin del antgeno CD34 fue heterognea; de 13 muestras

procesadas 7 expresaron CD34+ y 6 fueron negativas para CD34. Este
criterio fue establecido al hallar el IMF del control de fibroblastos, cuyo valor
fue 1.95, a partir del cual se tomaron como expresin del antgeno aquellas
muestras que estuvieran por encima de este valor y negativas las que se
encontraran por debajo del mismo. El IMF obtenido para el control de
fibroblastos en cada uno de los marcadores realizados (CD34, CD45, CD90 y
CD105), fue utilizado de la misma manera para analizar los datos obtenidos y
as determinar las muestras que tienen una expresin positiva y/o negativa
respecto a los marcadores en mencin.
En la figura 21 Se pueden observar los distintos ndices medios de
fluorescencia de cada muestra analizada para el antgeno CD34.
78
Figura 21. Expresin de CD34 de CMM en cultivos obtenidos de MO
M 013C
M 013B
M 012
M 011
M 010
M 009B
M 008B
M 007B
M 006B
M 005A
M 002C
M 002B
M 002A
M 001B
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
M 001A
IM F
EXPRESIN CD34 EN CULTIVOS OBTENIDOS DE MO
MUESTRAS
Comparando la expresin del IMF de CD34 de las muestras al da 10

respecto al da 13, momento en el cual se realiz el primer pase, se observa
una disminucin la expresin de CD34, por consiguiente ninguna de las
muestras tuvo un IMF superior al punto de corte establecido, como lo
muestra la figura 22.
79
Figura 22. Expresin de CD34 en CMM de MO al da 13 (1 pase)
IMF
EXPRESIN CD34 EN CM M DE M O - 1 PASE
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
M002A
M002C
M006
M007
M008
M009
MUESTRAS
De la misma forma como se determin el antgeno CD34, se expreso el

antgeno CD45; de 13 muestras procesadas, 7 expresaron CD45+ (>1,78) y 6
CD45 negativas (<1,78), valor que pudo ser demostrado por el ndice medio
de fluorescencia del control de fibroblastos negativos para este antgeno,
como lo muestra la figura 23.
Figura 23. Expresin de CD45 de CMM en cultivos obtenidos de MO

60
50
30
20
MUESTRAS
80
M013C
M013B
M012
M011
M010
M009B
M008B
M007B
M006B-1
M005A
M002C
M002B
M002A
M001B
10
M001A
IMF
40
La expresin de CD45 para las CMM del primer pase, mostraron un descenso
significativo en la expresin de CD45, lo cual conllev a que el IMF fuera negativo
para todas las muestras, como lo muestra la figura 24.
EXPRESIN CD45EN CMM DE MO - 1 PASE
60
50
IMF
40
30
20
10
0
M002A
M002C
M006
M007
M008
M009
MUESTRAS
La expresin del antgeno CD90 para la mayora de las muestras analizadas

comparado con el IMF de los fibroblastos control para CD90 (3.98) fue positivo,
como se puede observar en la figura 25 donde pocas muestras tienen un IMF
inferior a 3.98 para la expresin de CD90.
Figura 25. Expresin de CD90 en CMM en cultivos obtenidos de MO.
EXPRESIN CD90 EN CULTIVOS OBTENIDOS DE M O
20
10
M UESTRAS
81
M013C
M013B
M012
M011
M010
M009B
M008B
M007B
M006B
M005A
M002C
M002B
M002A
M001B
0
M001A
IMF
15
Al realizar el primer pase de las muestras para CD90, se esperaba que la

mayora de las muestras aumentara o continuara con la expresin del
marcador; sin embargo el comportamiento de las clulas fue opuesto,
evidencindose una marcada disminucin en la expresin del marcador,
siendo el IMF positivo solo en una muestra de la poblacin total como se
observa en la figura 26.
EXPRESIN CD90 EN CMM DE MO - 1 PASE
20
IMF
15
10
0
M002A
M002C
M006
M007
M008
M009
MUESTRAS
Para la expresin el antgeno CD105, se observ que la expresin del

marcador fue positivo para la mayora de las muestras en el da 10 de cultivo,
comparado con el IMF obtenido para los fibroblastos control, que fue 3.80,
evidencindose en la figura 27.
82
Figura 27. Expresin de CD105 en cultivos obtenidos de MO.

160
140
120
IMF
100
80
60
40
20
M013C
M013B
M012
M011
M010
M009B
M008B
M007B
M006B
M005A
M002C
M002B
M002A
M001B
M001A
MUESTRAS
En
el
primer
pase
de
CMM,
la
expresin
de
CD105
fue
alta,
correlacionndose con el IMF, que fue positivo para el 100% de las

muestras. Este comportamiento era esperado ya que este marcador junto
con otros como STRO-1, han sido caracterizados como parte del fenotipo de
las CMM para permitir su identificacin. Lo anteriormente descrito puede
observarse en la grfica 28.
Figura 28. Expresin de CD105 en CMM de MO al da 13 (1 pase).
12
10
IMF
8
6
4
2
0
M002A
M002C
M006
M007
MUESTRAS
83
M008
M009
Los promedios de expresin de los antgenos evaluados (IMF) se

representan en las figuras 29 y 30.
Figura 29. Promedios de expresin de antgenos en CMM de MO
PROMEDIO DE EXPRESION DE ANTIGENOS DURANTE CULTIVO PRIMARIO DE CMM
60
40,64
50
IMF
40
30
15,98
20
10
7,65
2,16
0
CD34
CD45
CD90
CD105
ANTIGENOS
Figura 30. Promedio de expresin de antgenos en CMM de MO (1er pase)
PROMEDIO DE EXPRESION DE ANTIGENOS DURANTE 1er PASE DE CMM

15
10
IMF
6,11
2,65
0,99
0,77
0
CD34
CD45
CD90
ANTIGENOS
84
CD105
6.5 Anlisis estadstico

Para el anlisis de la expresin de los antgenos evaluados por citometra de
flujo, se aplico la prueba de Shapiro-Wilk para probar la normalidad de los
datos (ndice Medio de Fluorescencia o MIF) mostrando una distribucin no
paramtrica (CD34 p=0.0164, CD45 p=0.0022, CD90 p=0.0957, CD105
p=0.0025), por lo cual se utilizo una prueba de Kruskal-Wallis que mostr
una diferencia estadsticamente significativa durante los primeros das de
cultivo (p=0.0040) y durante el primer pase de las clulas (p=0.0001). El
anlisis se realizo en Statistix 7.0.
Las hiptesis planteadas fueron:
Ho: Durante el cultivo de las clulas madre mesenquimales se espera
que el ndice medio de fluorescencia de los antgenos CD34, CD45,
CD90 y CD105 sea igual durante el cultivo.
Ha: Durante el cultivo de las clulas madre mesenquimales se espera
que el ndice medio de fluorescencia de la expresin de los antgenos
CD34, CD45, CD90 y CD105 sea diferente durante el cultivo.
85
7. DISCUSIN
El estudio de las clulas madre mesenquimales inicio a mediados de los

aos 60s y se expandi durante la dcada de los 70s, con los trabajos
realizados por Friedenstein, et al. (22, 26, 60),
donde describieron por
primera vez una poblacin de clulas adherentes de medula sea que

formaban parte del estroma medular, con caractersticas fibroblastoides a las
que les dieron
el nombre de unidades formadoras de colonias de
fibroblastos (UFC-F), capaces de diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y

condrocitos. (6)
En la ltima dcada varios grupos de investigacin se dieron a la tarea de
caracterizar y describir aquellas clulas
con morfologa fibroblastoide
descrita aos atrs por Friedenstein, encontrando tres fuentes principales

para obtener estas clulas; mdula sea, sangre de cordn umbilical y tejido
adiposo (16, 19, 61, 65). Este hallazgo produjo nuevas investigaciones
comparativas que identificaron a la medula sea como la mejor fuente de
aislamiento y obtencin de CMM. (15, 18)
En
nuestro
estudio
pudimos
comprobar
los
hallazgos
descritos
anteriormente, ya que se logro un aislamiento y obtencin de CMM del 100%

al recurrir a la MO; comparado con SCU donde solo obtuvimos una eficiencia
del 30%. No obstante la MO posee una mayor susceptibilidad a
contaminacin debido a la forma de recoleccin y procesamiento de la
muestra, razn por la cual dos muestras presentaron contaminacin y
tuvieron que ser eliminadas del estudio, sin embargo se lograron observar
clulas con morfologa fibroblastoide lo cual evidencia que el aislamiento y la
obtencin fueron exitosos.
86
Para evaluar la capacidad proliferativa de las CMM in vitro se utiliz la tasa

de generacin celular como un indicador de la capacidad de expansin de
las mismas, aunque el tiempo que tarda cada una de las fuentes analizadas
en duplicar su poblacin inicial es similar, la MO mostr una TGC menor que
las de SCU indicando que tarda menos tiempo en proliferar, lo que reafirma a
la MO como una fuente de obtencin ideal.
No obstante cabe citar que los datos obtenidos para el anlisis de TGC son
datos hipotticos calculados a partir de un referencia de una CMM por cada
34000 clulas mononucleares (22), por lo cual se recurri a la utilizacin de
esta frmula, debido a la baja cantidad de CMM que existen en la MO; es
necesario aclarar que los datos obtenidos son precisos pero no exactos, ya
que parten de una dato calculado no comprobado biolgicamente.
Segn la morfologa descrita por varios investigadores se corrobor la
morfologa fibroblastoide al compararse bajo microscopio invertido, como
puede observarse en las fotografas 3E, H y 5B, D, en donde se puede
apreciar que aunque no son iguales s comparten caractersticas con los
fibroblastos utilizados como control.
Respecto a las diferencias entre la morfologa de las CMM derivadas de SCU
y MO se confirma lo citado en literatura (32, 79), en las fotografas 3A y 3B se
puede observar que generalmente las de SCU crecen en filasy su
morfologa muestra clulas no tan alargadas con proyecciones cortas y en el
centro se aprecia un mayor crecimiento hacia los lados (Fotografa 3C, D, y
E). Las CMM de MO crecen en racimoscomo se observa en las fotografas
5E y 5F, mostrando clulas mas alargadas y delgadas con prolongaciones
extensas comparadas con las de SCU (Fotografa 5A, 5C y 5D).
87
En cuanto a la obtencin de una monocapa el tiempo que tard esta en

aparecer en las muestras de SCU fue mayor que en las de MO, para SCU
tardo 20 das mientras que para MO fue 7 das, esto confirma los datos
obtenidos en la TGC.
La apreciacin morfolgica de las CMM, a partir de tincin con Wright,
muestra algunas diferencias entre las derivadas de SCU y las de MO. Las
clulas obtenidas a partir de SCU presentan un menor tamao comparadas
con las de MO, ambas poseen un ncleo redondo en la mayora de veces
excntrico (Fotografa 4. C y 6. A) y en algunas fotografas de CMM-MO se
alcanzan a apreciar la presencia de nucleolos (Fotografa 6. A-E) y esta
caracterstica se sigue observando al realizar el primer pase (Fotografa 6.F);
respecto al citoplasma, tanto para las de SCU como para las de MO se
observa basfilo y desprovisto de granulaciones o inclusiones (Fotografa 4
A-E y 6. A-D) y en algunas fotografas de CMM-MO presentan vacuolas
(Fotografa 6. A, C y D), lo que podra indicar que estas clulas estn en
apoptosis, sugiriendo un enriquecimiento al medio de cultivo con factores que
estimulen y prolonguen su crecimiento evitando el stress celular.
La fenotipificacin de las CMM por citometra de flujo revel que al da 10 de
cultivo, momento en el cual se realiza la primera tripsinizacin, existe
contaminacin probablemente con progenitores hematopoyticos, ya que en
los resultados observados en las figuras 21, 23, 25 y 27, presentan en su
mayora expresin positiva para CD34, CD45, CD90 y CD105; expresin que
vara al realizar el primer pase de cultivo, en donde disminuye la expresin
de CD34 y CD45, lo que indica que al realizar pases de cultivo se purifica la
poblacin de CMM. No obstante, CD90 no se consolida como un buen
marcador para incluir en la fenotipificacin de CMM, ya que su expresin es
muy ambigua y no determina una poblacin celular especfica, ya que en los
88
aspirados de MO realizados, existe una mezcla celular de todos los

componentes del estroma medular y se requiere un marcador que permita
identificar y delimitar una poblacin especfica, como lo es las CMM. Por otra
parte, CD105 se ratifica como un marcador celular que ayuda a definir el
fenotipo de las CMM, ya que su comportamiento en los cultivos primarios y
en los pases, su expresin fue mantenida (Figuras 27, 28, 29 y 30).
De acuerdo a los resultados obtenidos en la citometra de flujo, sera de gran
importancia para futuras investigaciones implementar el uso del anticuerpo
monoclonal STRO-1, el cual es altamente expresado por las CMM presentes
en el estroma medular y su uso se ha visto incrementado en estudios
recientes; cabe aclarar que su expresin se limita a poblaciones de CMM no
diferenciadas.
Los resultados presentados en nuestro trabajo, demuestran y confirman que
entre SCU y MO, esta ltima es la mejor fuente de obtencin de CMM;
evidenciado a travs de todas las pruebas realizadas para evaluar la
morfologa, tasa de crecimiento celular y la expresin de marcadores, as
como tambin surge la importancia de implementar factores de crecimiento
en el medio de cultivo como factor de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF), factor de crecimiento epidermal (EGF), factor de crecimiento bsico
de fibroblastos , factor de crecimiento transformante beta (TGF- ) y factor de
crecimiento similar a la insulina-1 (26), para mejorar la condiciones de cultivo
de las CMM, y esto se pueda ver reflejado en una mejora en la morfologa,
tasa de generacin celular y expresin de marcadores.
89
8. CONCLUSIONES
1.
El aislamiento de clulas madre mesenquimales es ms eficiente a

partir de mdula sea que de sangre de cordn umbilical.
2.
La muestra de mdula sea para el aislamiento de clulas madre

mesenquimales puede ser extrada de cresta y/o fmur.
3.
La Tasa de Generacin Celular de las clulas madre mesenquimales,

en nuestro sistema de cultivo, fue mayor cuando la fuente de
obtencin era medula sea
4.
No se observaron diferencias morfolgicas significativas entre las

CMM derivadas de SCU y MO en microscopio invertido.
5.
En la tincin con Wright no se observaron diferencias morfolgicas

entre las CMM de SCU y MO pero si se establecieron diferencias con
respecto al control de fibroblastos gingivales.
6.
Durante los primeros das de cultivo se observ contaminacin con

progenitores hematopoyticos (34+/45+/90+).
7.
La expresin de CD90 no constituye un marcador de linaje especfico

para CMM.
90
9. RECOMENDACIONES
1.
Utilizar como fuente de obtencin para CMM mdula sea de cresta

iliaca y/o fmur.
2.
Implementar el uso de Factor de crecimiento de fibroblastos para

optimizar el cultivo de CMM.
3.
Iniciar los cultivos con un sistema de seleccin negativa con CD34 y

CD45, para evitar contaminacin con progenitores hematopoyticos.
4.
Realizar la inmunofenotipificacin de las CMM con la determinacin de

STRO-1 y CD105.
5.
Utilizar una
como
lnea celular control de clulas madre mesenquimales
HB10743/44/45
proporcionados
por
ATCC
(http://www.atcc.org/)
6.
Apoyar la fenotipificacin de las CMM a travs de la implementacin

de microscopa confocal.
91
10. BIBLIOGRAFA
1.
Krbling M, Estrov Z. 2003. Adult Stem Cells for Tissue Repair A New
Therapeutic Concept? N Engl J Med; 349: 570-82.
2.
Stem
Cell
Information.
Stem
Cell
Basics.
http://stemcells.nih.gov/info/basics/basics4.asp. [En lnea] (Consulta

Noviembre 19 de 2006).
3.
Szilvassy S. 2003. The biology of hematopoietic stem cells. Arch Med

Res; 34: 446-60.
4.
Kang X, Zang W, Bao L, Li D, Xu X, Yu X. 2006. Differentiating

characterization of human umbilical cord blood derived mesenchymal
stem cells in vitro. Cell Biol Int; 30:569-75.
5.
Le Blanc K, Ringdn O. 2005. Immunobiology of Human Mesenchymal

Stem Cells and Future Use in Hematopoietic Stem Cell Transplantation.
Biol Blood Marrow Transplant; 11:321-34.
6.
Gregory C, Prockop D, Spees J. 2005. Non-hematopoietic bone marrow

stem cells: Molecular control of expansion and differentiation. Exp Cell
Res; 306:330-35.
92
7.
Stewart K, Monk P, Walsh S, Jefferiss C, Letchford J, Beresford J.

2003. STRO-1, HOP-26 (CD63), CD49a and SB-10 (CD166) as markers
of primitive human marrow stromal cells and their more differentiated
progeny: a comparative investigation in vitro. Cell Tissue Res; 313:28190.
8.
Roufosse C, Direkse N, Otto W, Wright N. 2004. Circulating

mesenchymal stem cells. Int J Biochem Cell Biol; 36:585-97.
9.
Javazon EH, Beggs KJ, Flake AW. 2004. Mesenchymal Stem Cells:
Paradoxes of passaging. Exp Hematol; 32:414-25.
10. Campagnoli C. 2001. Identification of mesenchymal stem/progenitor

cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow. Blood;
98:2395-402.
11. Mendes S., Robin C., Dzierzak E. 2005. Mesenchymal progenitor cells
localize within hematopoietic sites throughout ontogeny. Development;
132:1127-36.
12. Marshak D, Gardener R, Gottlieb D. 2001. Stem Cell Biology. Cold
Spring Harbor Laboratory Press. New York. Pg. 355.
13. Baksh D, Song L, Tuan RS. 2004. Adult mesenchymal stem cells:
characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.
J Cel Mol Med; 8:301-16.
93
14. Wexler S, Donaldson C, Denning P, Rice C, Bradley B, Hows J. 2003.

Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal stem cells
but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol;
121:368-74.
15. Kern S, Eichler H, Stoeve J, Klter H, Bieback K. 2006. Comparative
Analysis of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Umbilical Cord
Blood, or Adipose Tissue. Stem Cells; 24: 1294-301.
16. Lee O, Kuo T, Wei-Ming C, Der-Lee K, Hsieh S, Chen T. 2004. Isolation
of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Blood;
105:1669-675.
17. Lee M, Choi J, Yang M, Moon Y, Park J, Kim H, Kim Y. 2005.
Mesenchymal stem cells from cryopreserved human umbilical cord
blood. Int J Hematol; 81:126-30.
18. Wagner W, Wein F, Seckinger A, Frankhauser M, Wirkner U, Krause U,
Blake J, Schwager, Eckstein V, Ansorge W, Ho A. 2005. Comparative
characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow,
adipose tissue, and umbilical cord blood. Exp Hematol; 33:1402-16.
19. Lee RH, Kim B, Choi I, et al. 2004. Characterization and expression
analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and
adipose tissue. Cell Physiol Biochem; 14:311-24.
20. McNiece I, Harrington J, Turney J, Kellner J, Shpall EJ. 2003. Ex vivo
expansion of cord blood mononuclear cells on mesenchymal stem cells.
Cytotherapy; 6: 311-17.
94
21. Bieback K, Kern S, Klter H, Eichler H. Critical Parameters for the

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Umbilical Cord Blood. 2004.
Stem Cells; 22: 625-34.
22. Beyer N, Da Silva L. 2006. Mesenchymal Stem Cells: Isolation in vitro
Expansion and Characterization. Handb Exp Pharmacol; 174: 249-82.
23. Fuchs E, Tumbar T, Guasch G. 2004. Socializing with the Neighbors:
Stem Cells and Their Niche. Cell; 116: 769-78.
24. Liu CH, Hwang SM. 2006. Cytokine interactions in mesenchymal stem
cells from cord blood. Cytokine; 32:270-9.
25. Deans RJ, Moseley AB. 2000. Mesenchymal Stem Cells: Biology and
potential clinical uses. Exp Hematol; 28:875-84.
26. Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, Robey P. 2001. Bone Marrow
Stromal Cells: Nature, Biology, and Potencial Applications. Stem Cells;
19: 180-92.
27. Slack JMW. 2000. Stem cells in epithelial tissues. Science; 287: 1431-3.
28. Gage FH. 2000. Mammalian neural stem cells. Science; 287: 1433-8.
29. Minguell J, Erices A, Conget P. 2001. Mesenchymal stem cells. Exp Biol
Med; 226:507-20.
30.
Watt FM. 1998.
Epidermal stem cells: Markers, patterning and the
control of stem cell fate. Phil Trans R Soc Lond B Biol Sci; 353:831-7
95
31. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD,
Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR. 1999. Multilineage
potential of adult human mesenchymal stem cells. Science; 284:143-7.
32. Muraglia A, Cancedda R, Quarto R. 2000. Clonal mesenchymal
progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a
hierarchical model. J Cell Sci; 113:1161-6.
33. Song L, Tuan RS. 2004. Transdifferentiation potential of human
mesenchymal stem cells derived from bone marrow. FASEB J; 18: 9802.
34. Bernard AJ, Duke R, Duke P. 2003. Controlling mesenchymal stem cell
differentiation by TGF family members. J Orthop Sci; 8:740-8.
35. Barboni E, Rivero BP, George AJT, Martin SR, Renouf DV, Hounsell
EF, Barber PC, Morris RJ. 1995. The glycophosphatidylinositol anchor
affects the conformation of Thy-1. J Cell Sci; 108:487-97.
36. Craig W, Kay R, Cutler RL, Landsorp PM. 1993. Expression of Thy-1 on
Human Hematopoietic Progenitor Cells. J Exp Med; 177:1331-42.
37. ExPASy.
CD90.
http://www.expasy.org/uniprot/P04216
[En
lnea]
(Consulta Noviembre 2 de 2006).

38. Fonsatti E, Maio M. 2004. Highlights on endoglin (CD105): from basic
findings towards clinical applications in human cancer. J Transl Med;
2:18-24
96
39. Cheifetz S, Bellon T, Cales C, Vera S, Bernabeu C, Massagu J,

Letarte. 1992. Endoglin is a Component of the Transforming Growth
Factor Receptor System in Human Endothelial Cells. J Biol Chem;
267: 19027-030.
40. ExPASy. CD105. http://www.expasy.org/uniprot/P17813 [En lnea]
41. Roura S, Farre J, Soler-Botija C, Llach A, Hove-Madsen L, Cairo JJ,
Godia F, Cinca J, Bayes-Genis A. 2006. Effect of aging on the
pluripotential capacity of human CD105 (+) mesenchymal stem cells.
Eur J Heart Fail; 8:555-63
42. Airas L, Niemel J, Salmi M, Puurunen T, Smith DJ, Jalkanen S. 1997.
Differential
Regulation
and
Function
of
CD73,
Glycosyl-
Phosphatidylinositollinked 70-kD Adhesion Molecule, on Lymphocytes

and Endothelial Cells. J Cell Biol; 136:421-31.
43. PROW. CD73. http://mpr.nci.nih.gov/prow/guide/1470319548_g.htm [En
lnea] (Consulta Octubre 27 de 2006).
44. Strter N. 2006. Ecto- 5-nucleotidase: Structure function relationships.
Purinergic Signal; 2:343-50.
45. Airas L, Hellman J, Salmi M, Bono P, Puurunen T, Smith D, Jalkanen S.
1995. CD73 Is Involved in Lymphocyte Binding to the Endothelium:
Characterization of Lymphocyte-Vascular Adhesion Protein 2 Identifies
It as CD73. J Exp Med; 182:1603-08.
97
46. ExPASy.
CD73.
http://www.expasy.org/uniprot/P21589
[En
lnea]

47. Barry F, Boynton R, Murphy M, Zaia J. 2001. The SH-3 and SH-4
Antibodies Recognize Distinct Epitopes on CD73 from Human
Mesenchymal Stem Cells. Biochem Biophys Res Commun; 289:519-24.
48. Simmons PJ, Torok-Storb B. 1991. Identification of Stromal Cell
Precursors in Human Bone Marrow by a Novel Monoclonal Antibody,
STRO-1. Blood; 78:55-62
49. Gonalves R, Da Silva C, Cabra J, Zanjani E, Almeida-Porada G. 2006.
A Stro-1+ human universal stromal feeder layer to expand/maintain
human bone marrow hematopoietic stem/progenitor cells in a serumfree culture system. Exp Hematol; 34:1353-59.
50. Kortesidis A, Zannettino A, Isenmann S, Shi S, Lapidot T, Gronthos S.
2005. STRO-1 promotes the growth, survival, and development of
human bone marrow stromal cells. Blood; 105:3793-801.
51. PROW.
CD44.
http://mpr.nci.nih.gov/prow/guide/1621804819_g.htm
[En lnea] (Consulta Noviembre 2 de 2006).

52. Kincade P, Zheng Z, Katoh S, Hanson L. 1997. The importance of
cellular environment to function of the CD44 matrix receptor. Curr Opin
Cell Biol; 9:635-42.
53. Lesley J, Hyman R, Kincade PW. 2000. Hyaluronan binding by cell
surface CD44. J Biol Chem; 275:26967-75.
98
54. Pure E, Cuff CA. 2001. A Crucial Role for CD44 in Inflammation. Trends
Mol Med; 7:213-21.
55. Zhu H, Mitsuhashi N, Klein A, Barsky L, Weinberg K, Barr M, Demetriou
A, Wu G. 2006. The Role of the Hyaluronan Receptor CD44 in
Mesenchymal Stem Cell Migration in the Extracellular Matrix. Stem
Cells; 24:928-35.
56. PROW.
CD166. http://mpr.nci.nih.gov/prow/guide/1844846226_g.htm
[En lnea] (Consulta Noviembre 2 de 2006).

57. Skonier JE, Bowen MA, Emswiler J, Aruffo A, Bajorath J. 1996.
Recognition of diverse proteins by members of the immunoglobulin
superfamily: delineation of the receptor binding site in the human CD6
ligand ALCAM. Biochemistry; 35:12287-91.
58. Ohneda O, Ohneda K, Arai F, Lee J, Miyamoto T, Fukushima Y,
Dowbenko D. 2001. ALCAM (CD166): Its Role in Hematopoietic and
Endotelial Development. Blood; 98:2134-42.
59. Alhadlaq A., Mao J. J., 2004. Mesenchymal stem cells: isolation and
therapeutics. Stem Cells Develop; 13:436-48.
60. Barry F. P., Murphy J. M. 2004. Mesenchymal stem cells: clinical
applicantions and biological characterization. Int J Biochem Cell Biol; 36:
568-84.
61. Erices A., Conget P., Minguell J. J. 2000. Mesenchymal progenitor cells
in human umbilical cord blood. Br J Haematol; 109: 235-42.
99
62.
Zeni A., et al., 2000. Establishment of an adherent cell layer from

human umbilical cord blood. Genet Mol Biol; 23:519-22.
63. Yang S-E., et al. 2004. Mesenchymal stem/ progenitors cells developed
in cultures from UC blood. Cytotherapy; 5:476-86.
64. Bianchi G., et al. 2003. Ex vivo enrichment of mesenchymal cell
progenitors by fibroblast growth factor 2. Exp Cell Res; 287:98-105.
65. Zuk P. A., et al. 2001. Multilineage cells from human adipose tissue:
implications for cell-based therapies. Tissue Eng; 7:211-28.
66. Alhadlaq A., Tang M., Mao J.J. 2005. Engineered adipose tissue from
human mesenchymal stem cells maintains predefined shape and
dimension: implications in soft tissue augmentation and reconstruction.
Tissue Eng; 11:556-66
67. Krampera M, Pizzolo G, Aprili G, Franchini M. 2006. Mesenchymal Stem
Cells for bone, cartilage, tendon and skeletal repair. Bone; 39:678-83.
68. Kassem M, Kristiansen M, Abdallah B. 2004. Mesenchymal Stem Cells:
Cell Biology and Potential use in Therapy. Basic Clin Pharmacol Toxicol;
95:209-14.
69. Brittberg M, Lindahl A, Nillson A, Ohlsson C, Isaksson O, Peterson L.
1994.Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous
chondrocyte transplantation. N Engl J Med; 331:88995.
100
70. Crevensten G, Walsh AJ, Ananthakrishnan D, Page P, Wahba GM, Lotz

JC. 2004. Invertebral disc cell theraphy for regeneration: Mesenchymal
stem cell implantation in rat invertebral discs. Ann Biomed Eng; 32:4304.
71. Rasmusson I. 2006. Immune modulation by mesenchymal stem cells.
Exp Cell Res; 312:2169-79.
72. Krampera M, Pasini A, Pizzolo G, Cosmi L, Romagni S, Annunziato.
2006. Regenerative and immunomodulatory potential of mesenchymal
stem cells. Curr Opin Pharmacol; 6:435-41.
73. Dazzi F, Ramasamy R, Glennie S, Jones S, Roberts I. 2006. The role of
mesenchymal stem cells in haemapoiesis. Blood Rev; 20:161-71.
74. Koh SH, Choi HS, Park ES, Kang HJ, Ahn HS, Shin HY. 2005. Coculture of human CD34+ cells with mesenchymal stem cells increases
the survival of CD34+ cells against the 5-aza-deoxycytidine- or
trichostatin A-induced cell death. Biochem Biophys Res Commun;
329:1039-45.
75. Jang YK, Jung DH, Jung MH, Kim DH, Yoo KH, Sung KW, Koo HH, Oh
W, Yang YS, Yang SE. 2006. Mesenchymal stem cells feeder layer from
human umbilical cord blood for ex vivo expanded growth and
proliferation of hematopoietic progenitor cells. Ann Hematol; 85:212-25.
76. Kindler V, Suva D, Soulas C, Chapuis B. 2006. Haematopoietic stem
cells and mesenchymal stem cells as tools for present and future
cellular therapies. Swiss Med Wkly; 136:333-7.
101
7 7 . Maurillo L, Del Poeta G, Venditti A, Bucciana F, Battaglia A, Santinelli S,

Caravita T, Epiceno AM, Del Moro B, Tamburini A, Picardi A, Suppo G,
Catalana G, Bruno A, Amadori S. 2001. Quantitative Analisis of Fas and
Bcl-2 expression in haematopoietic precursors. Haematologica; 86:23743.
78. Gutirrez JM, Prez RB. 2005. Consentimiento informado de Medicina
Interna en el Hospital Universitario San Ignacio. Universitas Mdica;
46:74-9.
7 9 . Chang Y, Tseng C, Hsu L, Hsieh T, Hwang S. 2006. Characterization of
two populations of mesenchymal progenitor cells in umbilical cord blood.
Cell Biol Int; 30:495-99.
102
Pontificia Universidad Javeriana

Facultad de Ciencias
Departamento de Microbiologa
Grupo de Inmunobiologa y Biologa Celular
Laboratorio de Hematologa
Lnea Investigacin:
Biologa de las Clulas Madre
Proyecto:
Cultivo de Clulas Madre Mesenquimales a

partir de Sangre de Cordn Umbilical y
Mdula sea.
Jenny Andrea Arvalo Romero Diana Marcela Paz Guerrero
Carrera de Bacteriologa
Enero 2007
CARACTERISTICAS CLULAS MADRE (CM)

Krbling M. et al. 2003, Horwitz E.2003, Baksh D. et al. 2004. Rodriguez V. 2005, Kern S. et al.
2006. Beyer N. et al. 2006.
1. Autorenovacin
2. Plasticidad
3. Regeneracin
Tisular
Tomado de
www.gcarlson.com/images/new_cell_division.jpg
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

2006. Beyer N. et al. 2006.
1. Autorenovacin
Clula Madre
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

2006. Beyer N. et al. 2006.
2. Plasticidad
Ectodermo
Neuronas
Microambiente
Mesodermo
Clulas Sangu
Sanguneas
Endodermo
Hepatocitos
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

2006. Beyer N. et al. 2006.
3. Regeneracin Tisular
Cerebro
Neuronas
Coraz
Corazn
Msculo Cardiaco
Mdula
sea
Clulas Sangu
Sanguneas
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
CLULAS MADRE MESENQUIMALES (CMM)

Pontificia Universidad Javeriana
Laboratorio de Hematolog
Hematologa
Clulas Madre Mesenquimales 20X
1. Generalidades
2. Ontogenia
3. Distribucin tisular
4. Caracterizacin Fenotpica
5. Aplicaciones clnicas
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

Friedenstein AJ et al. 1966, Barry et al. 2004. Wagner W. et al. 2005. Kern S. et al. 2006. Beyer N.
et al. 2006. Florez Figueroa et al. 2006
1. Generalidades
Adipocitos
Condrocitos
Origen
embrionario:Mesodermo
Morfologia: Clulas
adherentes de tipo
fibroblastoide.
Prevalencia en MO:
Osteoblastos
Osteoblastos
0.001 0.1% / 1:34.000 CMN

Funcin: Soporte en
hematopoyesis,
Inmunomoduladoras y
regeneracin tisular
Tomado de www.nature.com/.../v37/n10/images/1705358f3.jpg
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

Mendes S. et al. 2005. Durand C. et al. 2006.
2. Ontogenia
Residencia embrionaria
desconocida
Identificacin de CMM en
animales: Da 11
Localizacin: Regin AGM
Regin AGM y UGRs:
Regiones de alta frecuencia
para adipognesis,
condrognesis y
osteognesis.
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

Bieback K. et al. 2004, Roufosse C et al. 2004. Wagner W et al. 2005, Kang X et al. 2006, Kern S
et al. 2006.
3. Distribucin tisular
PAR
PARMETRO EVALUADO
xito de aislamiento
Formacin de monocapa adherente
MO
SCU
TA
100%
30-34%
100%
4-5 das
2-4 semanas
4-5 das
(83 61)
(0.002 0.004)
(557 673)
71.4%
100%
78.8%
100%
0%
94%
100%
100%
100%
97.5 5.1
90.0 20.0
99.1 2.5
88.1 7.4
95.2 6.0
99.7 0.5
99.3 1.3
97.8 7.1
72.4 20.0
94.3 6.8
99.8 0.2
99.6 0.5
99.6 0.2
90.4 5.9
98.8 2.8
UFC-F obtenidas en la monocapa adherente

Capacidad de diferenciacin osteognica
Capacidad de diferenciacin adipognica
Capacidad de diferenciacin condrognica
Expresin antgenos (%)

CD44
CD73
CD90
CD105
HLA I
Adaptada de: Wagner W et al. 2005, Kern S et al. 2006.

Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

Simmons PJ et al. 1991, Cheifetz et al. 1992, Craig et al. 1993, Airas et al. 1995, Barboni E et al.1995, Skonier JE
et al. 1996, Kincade et al. 1997, Airas et al. 1997, Lesley et al. 2000, Pure et al. 2001, Ohneda O et al. 2001,
Bianco P et al. 2001, Barry et al. 2001, Bernard AJ et. al 2003, Fonsatti et al. 2004, Alhadlaq A et al. 2004,
Kortesibis A et al. 2005. Gonalvez R et al, 2006, Zhu et al 2006, Strter N. 2006, Roura et al. 2006.
4. Caracterizacin Fenotpica
Marcadores
Mesenquimales
Positivos
Marcadores
Mesenquimales
Negativos
CD90
CD14
CD105 (SH2)
CD31
CD73 (SH3 SH4)
CD33
STRO-1
CD34
CD166
CD45
CD44
Glicoforina A
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
CD73
Airas et al. 1995, Airas et al. 1997, Barry et al. 2001, Strter N. 2006.
Iones de Zinc
Conocido como 5
Ectonucleotidasa
No tiene ligando conocido
Principal sustrato: AMP
Funcin: Converisn AMP en
adenosina
En CMM an no es clara su funcin
Se ha encontrado co-expresin
con 2 Integrinas, lo que ha
planteado a CD73 como un
mediador de adhesin celular.
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
CD90
Craig et al. 1993, Barboni et al. 1995,
Conocido como Thy-1

Hace parte de familia de
Inmunoglobulinas
Principal ligando: CD45
En CMM an no es clara su
funcin.
Se cree que est involucrado con
la inhibicin de la diferenciacin
de las Clulas Madre
Hematopoyticas.
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
CD105
Cheifetz et al. 1992, Fonsatti et al. 2004, Roura et al. 2006.
Conocido como Endoglina SH2

Glicoprotena transmembranal
Componente del receptor TGF-
Molcula asociada: TGF-1
Regula la expresin de componentes
de matriz extracelular.
Se cree que est relacionado con
procesos de angiognesis y reparacin
vascular.
Tambin se ha demostrado que
defectos en la expresin de CD105 o su
ausencia,
son
la
causa
de
Telangectasia hemorrgica hereditaria
tipo 1.
1
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
STRO-1
Simmons PJ et al. 1991 , Kortesibis A et al. 2005. Gonalvez R et al, 2006.
En 1991 fue identificada como

antgeno especfico para la
identificacin de CMM.
Marcador expresado en el
desarrollo temprano en las
CMM
An no se ha caracterizado su
estructura bioqumica.
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
Aplicaciones clnicas de las clulas madre

mesenquimales
CMM
Osteogensis imperfecta
Defecto de huesos largos
Regeneracin de msculo
cardiaco
Regeneracin de tendn
Terapia gnica (Tecnologia
recombinante)
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
PORQU CULTIVAR CLULAS

MADRE MESENQUIMALES DE
SANGRE DE CORDN UMBILICAL
Y MDULA SEA?
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
CELULAS MADRE
Expectativas
generadas sobre
clulas madre en
Colombia
Trabajos
exploratorios
no publicados
CELULAS MADRE
INVESTIGACIN
BSICA
Mecanismos reguladores de la
proliferacin simtrica y
asimtrica
Modelos para el estudio de la
diferenciacin de clulas madre
Interacciones del microambiente
en nichos especializados de
celulas madre
INVESTIGACIN
APLICADA
Co-cultivo de clulas madre
mesenquimales y
hematopoyeticas para su
aplicacin en trasplante de MO
Sistema de proliferacin de CMM
en membranas SEFAR PETEX 071/2 para regeneracin de hueso
FORTALECIMIENTO DE LA LINEA DE INVESTIGACIN BIOLOGIA DE LAS

CELULAS MADRE DEL GRUPOS DE INMUNOBIOLOGIA Y BIOLOGIA CELULAR
OBJETIVO GENERAL
Aislar y cultivar clulas madre
mesenquimales a partir de sangre
de cordn umbilical y mdula sea
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Aislar clulas madre mesenquimales a partir de sangre de cordn
umbilical y mdula sea de donantes voluntarios normales
Establecer la tasa de generacin celular de las clulas madre
mesenquimales en sistema de cultivo establecido
Determinar las caractersticas morfolgicas de las clulas madre
mesenquimales obtenidas en cultivo a partir de microscopa
invertida y tincin con Wright
Evaluar la expresin de las protenas CD34, CD45, CD90 y CD105
en las clulas madre mesenquimales obtenidas de sangre de
cordn umbilical y mdula sea por medio de citometra de flujo.
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
Seleccin donantes voluntarios sangre de

cordn umbilical
CRITERIOS DE INCLUSIN:
Participacin voluntariaconsentimiento informado.
Edad entre 18 y 37 aos.
No embarazos ectpicos*.
No abortos o embarazos de alto

riesgo*.
No diabetes gestacional
No enfermedades infecciosas*.
No enfermedades congnitas en
embarazos previos*.
Hospital Occidente de Kennedy III Nivel E.S.E
*Datos obtenidos a partir de las Historias Clnicas
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
Seleccin donantes voluntarios de mdula sea
Participacin voluntariaconsentimiento informado.
Pacientes sanos sometidos a

procesos quirrgicos
ortopdicos.
Hospital Universitario San Ignacio
Ausencia de resultados positivos

para enfermedades infecciosas
(HIV, Hepatitis B y C).
Hospital Occidente de Kennedy III

Nivel E.S.E.
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
Aislamiento de clulas madre mesenquimales a partir de

sangre de cordn umbilical y mdula sea
Pretratamiento bolsa de recoleccin
Baxter. Desinfeccin y puncin
Pretratamiento tubos Falcon 50 ml con

EDTA
Recoleccin sangre de cordn umbilical
Recoleccin muestra mdula sea
Separacin clulas mononucleares

Ficoll-Hypaque Amershan Biosciences /
Relacin (3:1)
30 minutos / 22C / 800 g
Recuento en cmara de Neubauer
Viabilidad celular superior a 90%
Cultivo celular con una densidad celular

inicial de 1x106 cel/cm2 para SCU y MO
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
Recoleccin Muestras Sangre Cordn Umbilical

A, Cordn umbilical Pinzado. B, Cordn Umbilical Cortado. C Recoleccin de
la muestra. D, Finalizacin del proceso de recoleccin de SCU.
Recoleccin Muestras Mdula sea

A. Apertura del canal femoral. B, C, D. Luxacin de la cadera. E. Rimado de acetbulo con
reamer o fresa. F. Continuacin del procedimiento quirrgico.
Establecimiento de tasa de generacin celular de las clulas

madre mesenquimales en sistema de cultivo establecido
Sistema de cultivo establecido
Suplementos:
SFB:
10%
A.A No Esenciales:
1%
Piruvato de Sodio:
Ciproxacilina:
1%
0.5%
Penicilina/Estretomicina
0.1%
Condiciones Generales:
Temperatura: 37C / 5% CO2
Duracin:
Cultivo Primario
Densidad Celular Inicial
1x106 cel/cm2
SCU: 20 das
MO: 10 das
Primer pase (70% confluencia)

Medio cultivo:
Iscoves Dulbecco Modified Medium
(GIBCO)
SCU: 7 das
MO: 3 das
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
Determinacin de caractersticas morfolgicas de las clulas madre

mesenquimales obtenidas en cultivo a partir de microscopa invertida y tincin
con Wright
Cultivo Primario y Primer Pase
Evaluacin
morfolgica
Microscopio Olympus CK2 Cmara

Fotogrfica Olympus D-540
Microscopa
Invertida
Tripsinizacin
Tripsina-EDTA 5 min a 37C
Desprendimiento Clulas
Cytospin
5 min a 500 rpm
Equipo Cytospin3
(Shandon)
Tincin de Wright
Evaluacin Morfolgica
Wright
Microscopio Olympus
con cmara digital
3 min colorante Wright

5 min buffer de
Giordano
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
Evaluacin de expresin de las protenas CD34, CD45, CD90 y CD105 en las

clulas madre mesenquimales obtenidas de sangre de cordn umbilical y
mdula sea por medio de citometra de flujo.
Tripsinizacin
Desprendimiento Clulas
Clulas Marcadas: 25000 cel/ml
10l CD34
FITC
5l CD45
PERCP
10l CD90
PE
5l CD105
APC
Clulas adquiridas: 10000 cel/ml
Citmetro FACS Calibur BD

Anlisis Software Cell Quest Pro
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
RESULTADOS
Aislamiento de clulas madre mesenquimales a partir de sangre de
cordn umbilical y mdula sea.
Establecimiento de tasa de generacin celular de las clulas madre
mesenquimales obtenidas en cultivo a partir de microscopa invertida
y tincin con Wright
Evaluacin de la expresin de las protenas CD34, CD45, CD90 y
CD105 en las clulas madre mesenquimales obtenidas de sangre de
cordn umbilical y mdula sea por medio de citometra de flujo.
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

cordn umbilical y mdula sea
SANGRE DE CORD
CORDN UMBILICAL
Muestra
SCU 001
Volumen
recolectado
80 mL
30%
Tiempo de
procesamiento
MDULA SEA
100%
Muestra
Volumen
recolectado
Procedimiento
quir
quirrgico
Tiempo de
procesamiento
MO 001
5 mL
Reemplazo de
cadera
6 horas
MO 002
61 mL
Reemplazo de
cadera
7 horas
14 horas
SCU 002
70 mL
14 horas
MO 003
20 mL
Reemplazo de
cadera
6 horas
SCU 003
80 mL
13 horas
MO 004
21 mL
Osteosntesis
fmur
7 horas
MO 005
5 mL
80 mL
13 horas
Reemplazo de
cadera
9 horas
SCU 004
MO 006
10 mL
Reemplazo de
cadera
9 horas
MO 007
20 mL
Osteosntesis
fmur
9 horas
SCU 005
100 mL
12 horas
SCU 006
120 mL
14 horas
MO 008
20 mL
Osteosntesis
fmur
9 horas
SCU 007
100 mL
13 horas
MO 009
20 mL
Osteosntesis
fmur
9 horas
MO 010
27 mL
80 mL
13 horas
Reemplazo de
cadera
7 horas
SCU 008
MO 011
20 mL
Reemplazo de
cadera
5 horas
MO 012
20 mL
Osteosntesis
fmur
14 horas
MO 013
72 mL
Reemplazo de
cadera
6 horas
SCU 009
SCU 010
80 mL
80 mL
12 horas
12 horas
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

TASA DE GENERACION CELULAR PARA SCU

90
20 50 min SCU
80
70
60
50
40
30
20
10
0
SCU-002
SCU-005
SCU-007
M U EST R A S
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

TASA DE GENERACION CELULAR PARA MO

90
16 39 min MO
80
70
60
50
40
30
20
10
0
M O001A
M O001B
M O005A
M O006B
M O007B
M O008B
M O009B
M O010B
M O011B
M O013B
M O013C
M U EST R A S
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

TASA DE GENERACION CELULAR PARA MO-002
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
7 86.4 min MO
MO-002A
Mdula Cresta Iliaca
MO-002B
Mdula Acetbulo
MO-002C
Mdula Fmur
M U EST R A
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

con Wright
CMM-SCU
FIBROBLASTOS
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

con Wright
Fotografa 4. Muestras CMMSCU. Da 20 100X. A-E.
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

mesenquimales obtenidas de MO (microscopa invertida)
CMM-SCU
CMM-MO. 20X
CMM-MO. 40X
FIBROBLASTOS. 10X
FIBROBLASTOS. 20X
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

mesenquimales obtenidas de MO con tincin con Wright
Fotografa 6. Muestras CMM-MO. Da 10. 100X. A E. Muestras CMM-MO. Da 13. 100X F

fibroblastos. Da 10. 100X. I L.
H. Control
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
Evaluacin de la expresin de las protenas CD34, CD45, CD90 y CD105

CMM obtenidas de SCU y MO por medio de citometra de flujo.
Controles
SANGRE
PERIFRICA
Cuentas
SANGRE DE
CORDN
M1
100
101
102
103
104
FIBROBLASTOS
GINGIVALES
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

CMM obtenidas de SCU y MO por medio de citometra de flujo.
ANLISIS ESTADSTICO: IMF

DISTRIBUCIN DATOS: Prueba Shapiro WilK
No distribucin normal
(p<0.05)
(CD34 p=0.0164) (CD45 p=0.0022) (CD90 p=0.0957) (CD105 p=0.0025)
PRUEBA ESTADSTICA: Kruskal- Wallis

Existe evidencia estadsticamente significativa para decir que
durante los primeros das de cultivo (p=0.0040) y durante el primer
pase de las clulas (p=0.0001) el IMF de la expresin de los
antgenos utilizados fue diferente.
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

CMM MO por medio de citometra de flujo.
Expresin CD34: A. Cultivo Primario. B. Primer Pase

A
B
MUESTRAS
M 013C
M 013B
M 012
M 011
M 010
M 009B
M 008B
M 007B
M 006B
M 005A
M 002C
M 002B
M 002A
M 001B
IM F
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
M 001A
IM F
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
M002A M002C M006
M007
M008
M009
MUESTRAS
Valor IMF control fibroblastos no

marcados: 1.95
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

CMM de MO por medio de citometra de flujo.

A
B
EXPRESIN CD45EN CMM DE MO - 1 PASE
60
60
50
50
40
40
30
IM F
IM F
20
20
10
MUESTRAS
M 013C
M 013B
M 012
M 011
M 010
M 009B
M 008B
M 007B
M 0 0 6 B -1
M 005A
M 002C
M 002B
M 002A
M 001B
10
M 001A
30
0
M002A
M002C
M006
M007
M008
M009
MUESTRAS
Valor IMF control fibroblastos: 1.78

Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

A
B
20
20
15
15
IM F
IM F
10
10
MUESTRAS
M 013C
M 013B
M 012
M 011
M 010
M 009B
M 008B
M 007B
M 006B
M 005A
M 002C
M 002B
M 002A
M 001B
M 001A
0
M002A
M002C
M006
M007
M008
M009
MUESTRAS

Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

A
B

160
12
140
10
120
8
IM F
80
60
40
20
MUESTRAS
M 013C
M 013B
M 012
M 011
M 010
M 009B
M 008B
M 007B
M 006B
M 005A
M 002C
M 002B
M 002A
M 001B
0
M 001A
IM F
100
0
M002A
M002C
M006
M007
M008
M009
MUESTRAS

Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

PROMEDIO DE EXPRESION DE ANTIGENOS DURANTE CULTIVO PRIMARIO DE CMM
60
40,64
50
IM F
40
30
15,98
20
10
7,65
2,16
0
CD34
CD45
CD90
CD105
ANTIGENOS
p=0.0040
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

PROMEDIO DE EXPRESION DE ANTIGENOS DURANTE 1er PASE DE CMM
15
10
IM F
6,11
2,65
0,99
0,77
CD34
CD45
0
CD90
CD105
ANTIGENOS
p=0.0001
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
DISCUSIN
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

cordn umbilical y mdula sea
Eficiencia de
aislamiento y cultivo
de CMM de SCU: 30%
(Wexler S et al. 2003, Wagner W
et al.2005, Kern S et al. 2006)
Eficiencia de
aislamiento de CMM
a partir de MO: 100%
(Wexler S et al. 2003, Wagner
W et al.2005, Kern S et al.
2006)
Eficiencia de cultivo CMM a

partir de MO: 80%
(Alta susceptibilidad a
contaminacin)
(Wexler S et al. 2003, Kern S et al. 2006)
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
Establecimiento de tasa de generacin celular de las clulas

madre mesenquimales en sistema de cultivo establecido
Datos obtenidos son hipotticos,
obtenidos de literatura; precisos pero
no exactos, no comprobados
biolgicamente.
( Beyer N et al. 2006)
El tiempo que tardan las dos

fuentes es similar, MO tiene TGC
menor que SCU.
(Wagner W et al.2005, Kern S et
al. 2006)
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
Determinacin de caractersticas morfolgicas de las clulas

madre mesenquimales obtenidas en cultivo a partir de
microscopa invertida y tincin con Wright
Morfologa Fibroblastoide
(Wagner W. 2005, Beyer N. 2006, Kern S.
2006)
Morfologa CMM-SCU:
Crecen en filas, clulas no tan
alargadas con proyecciones
cortas
CMMCMM-SCU
(Muraglia A et al. 2000, Chang Y et al. 2006)
Morfologa CMM-MO: Crecen

en racimos, clulas alargadas y
delgadas con prolongaciones
extensas (Muraglia A et al. 2000, Chang Y
et al. 2006).
CMMCMM-MO
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
Determinacin de caractersticas morfolgicas de las

clulas madre mesenquimales obtenidas en cultivo a partir
de microscopa invertida y tincin con Wright
Morfologa Wright CMM:
CMM-SCU
CMM-SCU menor tamao

que CMM-MO
Presencia de vacuolas en
CMM-MO sugieren
enriquecimiento del medio
de cultivo (Bianchi G et al.
2003)
No existe literatura para

realizar comparacin de
datos obtenidos
CMM-MO
Vacuolas
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

Fenotipificacin: Da 10 de cultivo
probablemente existe
contaminacin con progenitores
hematopoyticos (Pittenger MF et
al. 1999).
CD90: No se consolida como un

buen
marcador
en
la
fenotipificacin de CMM
CD105: Se ratifica como un
marcador
celular
de
CMM
estable.
STRO-1: Marcador especfico
de CMM (no se realice
diferenciacin celular) (Gronthos S
et al. 1999, Bianco P et al. 2001)
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

Purificacin del cultivo al primer pase:
Disminuye expresin de marcadores
hematopoyticos.
(Pittenger MF et al. 1999, Kern S et al. 2006)
M1
10 0
10 1
10 2
CD34 FITC
10 3
10 4
M1
10 0
10 1
10 2
CD105 APC
10 3
10 4
Counts
Counts
M1
10 0
10 1
10 2
CD45 PerCP
10 3
10 4
M1
10 0
10 1
10 2
CD90 PE
10 3
10 4
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
CONCLUSIONES
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
El aislamiento de clulas madre mesenquimales

es ms eficiente a partir de mdula sea que de
sangre de cordn umbilical.
La muestra de mdula sea para el aislamiento
de clulas madre mesenquimales puede ser
extrada de cresta y/o fmur.
La Tasa de Generacin Celular de las clulas

madre mesenquimales, en nuestro sistema de
cultivo, fue mayor cuando la fuente de obtencin
era medula sea.
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.
No se observaron diferencias morfolgicas

significativas entre las CMM derivadas de SCU y
MO en microscopio invertido.
En la tincin con Wright no se observaron
diferencias morfolgicas entre las CMM de SCU y
MO pero si se establecieron diferencias con
respecto al control de fibroblastos gingivales.
Durante los primeros das de cultivo se observ
contaminacin
con
progenitores
hematopoyticos (34+/45+/90+)
La expresin de CD90 no constituye un marcador
de linaje especfico para CMM.
RECOMENDACIONES
Utilizar como fuente de obtencin para CMM mdula sea de cresta iliaca
y/o fmur.
Implementar el uso de Factor de crecimiento de fibroblastos para optimizar

el cultivo de CMM.
Iniciar los cultivos con un sistema de seleccin negativa con CD34 y CD45,
para evitar contaminacin con progenitores hematopoyticos.
Realizar la inmunofenotipificacin de las CMM con la determinacin de

STRO-1 y CD105.
Utilizar una lnea celular control de clulas madre mesenquimales como

HB10743/44/45 proporcionados por ATCC (http://www.atcc.org/)
Apoyar la fenotipificacin de las CMM a travs de la implementacin de

microscopa confocal
AGRADECIMIENTOS
La realizacin de este proyecto fue posible por el apoyo econmico de

Vicerrectora Acadmica de la Universidad Javeriana, a travs de la
convocatoria interna para el apoyo a grupos de investigacin 2005-2006
Al servicio de Ortopedia y Traumatologa del Hospital Universitario San

Ignacio, en especial al equipo de trabajo del Dr. Efran Leal
Al servicio de Ginecoobstetricia del Hospital Occidente de Kennedy E.S.E. por

su apoyo en la consecucin de las muestras de sangre de cordn umbilical
A los integrantes del grupo de Inmunobiologa y Biologa celular, a la

estudiante de maestra Amparo Arango por la donacion de los fibroblastos
gingivales utilizados en el estudio.
A la Dra. Viviana Rodrguez por acompaarnos y guiarnos en este proceso.
Proyecto:
Cultivo de Clulas Madre Mesenquimales a partir de
Sangre de Cordn Umbilical y Mdula sea.
GRACIAS
Jenny Andrea Ar
Arvalo R.
R. Diana Marcela P
Pez G.

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CULTIVO DE CLULAS MADRE MESENQUIMALES A PARTIR DE

SANGRE DE CORDN UMBILICAL Y MDULA SEA

JENNY ANDREA ARVALO ROMERO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

A Dios por permitirnos llegar a esta

por colaborarnos en el inicio de nuestro estudio y al

Hospital Occidente de Kennedy E.S.E, especialmente a la Doctora Amparo

Figura 1. Diagrama esquemtico de lineajes de diferenciacin de las Clulas

Figura 23. Expresin de CD45 en cultivos obtenidos de MO.........................80

Fotografa 1. Registro fotogrfico en recoleccin de Sangre de Cordn

Clulas Madre Adultas

Clulas Madre Hematopoyticas

Clulas Madre Mesenquimales

Unidad Formadora de Colonia

Regin Aorta Gnada Mesonefro

Sangre de Cordn Umbilical

Regin de Surcos Urogenitales

Regin aorta-dorsal que rodea al Mesnquimo

Protenas morfogenticas de hueso

Factor de Crecimiento Transformante

Factor de Crecimiento Transformante Beta

Unidad Formadora de Colonia de Fibroblastos

Buffer Salino Fosfatado

Suero Fetal Bovino

Enfermedad del Injerto contra el Hospedero

Clulas Madre Mesenquimales derivadas de Medula sea

CMM-SCU: Clulas Madre Mesenquimales derivadas de SCU

Tasa de generacin celular

ndice medio de Fluorescencia

Factor de crecimiento derivado de plaquetas

Factor de crecimiento epidermal

En las ltimas dcadas el significado de las clulas madre (CM) ha cobrado

imitan parcialmente a las clulas madre embrionarias, pero con algunas

2. MARCO TERICO Y REVISIN DE LITERATURA

2.1 Clulas madre: Generalidades

2.2 Clulas Madre Mesenquimales (CMM)

en diferentes tejidos de origen conectivo como

osteoblastos, condrocitos y adipocitos. (6). (Figura 1).

Figura 2. Diagrama esquemtico de la jerarqua de proliferacin de CMM.

Adaptado de: Roufosse C, Direkse N, Otto W, Wright N. Circulating mesenchymal

2.2.2 Ontogenia de las Clulas Madre Mesenquimales

inicialmente y si estn localizadas en asociacin en los lugares donde se

clulas se localizan especficamente en la regin aorta-gnada-mesonefro

Adaptado de: Mendes S, Robin C and Dzierzak E. Mesenchymal progenitor cells

En dichos estudios tambin se ha encontrado que diferentes regiones del

esta regin, en la regin AGM y en la regin AoM, pero la cantidad de

condrognicos en las regiones AGM, AoM y UGRs.

PROGENITORES/ 104 CELULAS

Tomado de: Mendes S, Robin C and Dzierzak E. 2005. Mesenchymal progenitor

encontrado en varios tejidos en diversas especies y en diferentes estados de

Int Ander et al.

Zvaifler et. al,

2.2.3 Localizacin de las Clulas Madre Mesenquimales

Respecto al aislamiento y cultivo de CMM a partir de tejido adiposo, estudios

2.2.4 Microambiente: Citoquinas involucradas y movilizacin de CMM

compartimentos separados, necesitando cooperacin entre todas ya que son

Figura 5. Representacin del Nicho de las Clulas Madre Mesenquimales

En investigaciones realizadas in vitro, se ha logrado mostrar el incremento en

Tabla 2. Caracterizacin fenotpica de CMM humanas.

2.2.5 Microambiente y diferenciacin hacia adipocitos, osteoblastos y

La naturaleza y las propiedades de un microambiente para las clulas madre

Figura 6. Modelos de diferenciacin de las CMM.

Basados en la informacin gentica y genmica de las CMM, se ha diseado