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CARRERA-VEGA
2015
POR:
TESIS
CARRERA-VEGA
2015
II
CARRERA-VEGA
2015
III
CARRERA-VEGA
2015
AGRADECIMIENTOS
A MIS PADRES: Raymundo Carrera Garca y Silvia Vega Ortiz. Gracias por
todo el apoyo incondicional que me brindan da con da, por sus esfuerzos,
sacrificios y consejos que me han permitido crecer como persona. Por la
confianza que han depositado en m y por darme las herramientas necesarias
para seguir por la vida superando obstculos y construyendo nuevos sueos.
IV
CARRERA-VEGA
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DEDICATORIA
Dios, a ti te dedico este gran logro. Siempre puse mi fe en ti porque s que tus
tiempos son perfectos. Tu que siempre me cuidas, te pido que con tu luz me
acompaes a lo largo de mi vida personal y profesional.
Padres, a ustedes tambin les dedico este trabajo que realice con tanto esfuerzo
y dedicacin, esfuerzos que tambin han sido suyos e inspirados en ustedes.
Por todo el ayer, les dedico todo mi maana.
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2015
INDICE GENERAL
1. INTRODUCCION ......................................................................................... 2
2. JUSTIFICACION .......................................................................................... 4
3. HIPOTESIS.................................................................................................. 5
4. OBJETIVOS:................................................................................................ 5
4.1.
4.2.
5.1.1.
5.1.2.
pH ................................................................................................... 8
5.1.3.
Oxgeno en el medio....................................................................... 9
5.1.4.
Temperatura ................................................................................... 9
5.1.5.
5.1.5.1.
Agar MRS............................................................................... 10
5.2.
5.3.
5.4.
5.5.
5.6.
5.6.1.
Clasificacin de bacteriocinas....................................................... 20
5.6.2.
5.6.3.
5.6.4.
5.6.5.
5.7.
CARRERA-VEGA
2015
5.7.1.
5.7.2.
5.8.
5.8.1.
5.8.2.
5.8.3.
5.8.4.
5.8.5.
5.9.
Bacterias patgenas............................................................................ 28
5.9.1.
5.9.2.
5.9.3.
5.10.2.
5.10.3.
5.10.4.
Purificacin ................................................................................... 34
6.1.2.
6.1.3.
6.2.
VII
6.3.
CARRERA-VEGA
2015
6.3.1.
6.3.2.
Monitoreo ...................................................................................... 40
6.3.3.
6.4.
6.4.1.
6.4.2.
Cuantificacin de ADN.................................................................. 42
6.4.3.
ADN
43
6.4.4.
6.4.5.
7.3.
7.3.1.
7.3.2.
pH ................................................................................................. 54
7.3.3.
7.4.
7.4.1.
7.4.2.
7.4.3.
8. CONCLUSIONES ...................................................................................... 59
9. BIBLIOGRAFIA .......................................................................................... 60
10. ANEXOS .................................................................................................... 63
VIII
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2015
INDICE DE FIGURAS
CARRERA-VEGA
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CARRERA-VEGA
2015
INDICE DE TABLAS
XI
CARRERA-VEGA
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RESUMEN
Las bacteriocinas producidas por las Bacterias cido Lcticas (BAL), son
pptidos antimicrobianos con capacidad de inhibir microorganimos patgenos
perjudiciales para la salud humana, por lo tanto representan una excelente
estrategia para evitar el uso de conservadores qumicos.
En el presente proyecto se logr realizar la purificacin de ocho cepas de
Bacterias Acido Lcticas (BAA, BS1, LC1, LC2, BD, BD2, X y XE) observando
sus caractersticas macroscpicas y microscpicas de cada una. Se evalu la
produccin de biomasa haciendo un especial nfasis en las bacteriocinas
producidas para evaluar su efecto antimicrobiano e inhibitorio contra tres
bacterias patgenas (Salmonella typhi, Staphylococcus aureus y Escherichia
coli), utilizando el mtodo de Difusin en disco (Kirby y Bauer). Estas son
sustancias
antimicrobianas
que
han
demostrado
ser
eficaces
como
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2015
1. INTRODUCCION
En la actualidad se ha implementado la bsqueda de cmo evitar el uso de
conservadores
qumicos.
La
utilizacin
de
aditivos
con
propiedades
Cabe mencionar que estas bacterias no slo producen cidos orgnicos, sino
tambin tienen la capacidad de producir otras sustancias, como: Perxido de
hidrogeno (H2O2), Acetaldehdo, Radicales libres y otros metabolitos como
molculas no proteicas y bacteriocinas. El trmino bacteriocina fue usado
inicialmente por Jacob en 1953 para designar protenas con actividad
antibacteriana.
Las bacteriocinas que producen las bacterias cido lcticas son las sustancias
antimicrobianas ms interesantes, ya que debido a su naturaleza proteica, son
inactivadas por las enzimas proteolticas del tracto gastrointestinal y no son
txicas, ya que son rpidamente digeridas por las proteasas en el tracto digestivo
humano, inactivndose sin llegar a formar compuestos secundarios. Esta
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CARRERA-VEGA
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Para llevar a cabo este estudio, las bacterias cido lcticas se incubaran dando
las mejores condiciones de crecimiento para obtener una excelente produccin
de biomasa y por consiguiente una deseable produccin de bacteriocinas y
evaluar su efecto antimicrobiano contra bacterias patgenas (Salmomella typhi,
Staphylococcus aureus y Escherichia coli). Las cepas de BAL fueron reactivadas
para su identificacin del gnero y la especie mediante la tcnica de
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secuenciacin del gen 16s. Este proceso incluye la produccin de clulas del
cultivo, la extraccin de ADN de las cepas, as mismo se mide la cantidad y
calidad de ADN y finalmente se amplific el gen 16s por PCR.
2. JUSTIFICACION
En la actualidad, se han identificado serios problemas relacionados directamente
con las limitadas formas de conservacin de los alimentos frescos, sumando al
hecho de la continua exigencia de disminuir y prohibir cada vez ms el uso de
conservadores y aditivos qumicos en los alimentos, debido a los efectos
adversos que puedan causar en la salud del consumidor. Esto obliga a la
bsqueda de metodologas alternativas para conservar los alimentos. El uso de
bacterias cido lcticas (BAL) en la bioconservacin de alimentos ha tomado
gran importancia en los ltimos aos debido a la capacidad para controlar
microorganismos patgenos y alterantes. La bioconservacin se refiere a la
extensin de la vida til de los alimentos usando una microflora natural o
controlada y sus productos antibacteriales.
Con esta informacin surge una gran preocupacin en reducir el uso de aditivos
qumicos en la conservacin de alimentos, y por consiguiente aumentar la
conservacin de alimentos a travs de agentes antimicrobianos naturales, para
el bienestar de los consumidores. Por lo tanto, en esta investigacin se desea
complementar un poco ms el conocimiento e informacin acerca del uso de
aditivos biolgicos, para esto es necesario analizar el comportamiento de
diferentes cepas de bacterias acido lcticas aisladas de muestras de leche y
mejorar sus condiciones para obtener resultados deseables en su actividad
inhibitoria.
4
CARRERA-VEGA
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3. HIPOTESIS
Las caractersticas macroscpicas y microscpicas de las diferentes cepas de
BAL son muy variables, debido a la fuente de donde se aislaron. Durante la
fermentacin, a mayor periodo de incubacin las cepas producen mayor cantidad
de bacteriocinas. El efecto antimicrobiano de las bacteriocinas depende del
tiempo y la temperatura aplicada durante el calentamiento del extracto. La
extraccin de ADN de las Bacterias cido lcticas da la certeza del gnero y la
especie del microorganismo aislado.
4. OBJETIVOS:
4.1.
Objetivo General.
4.2.
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Objetivos especficos.
5. REVISION DE LITERATURA
Entre 1857 y 1863 Louis Pasteur estudio la fermentacin acido lctica. Lister en
1877 obtiene el primer cultivo puro de Streptococcus lactis.
A principios del siglo XX E. Metchnikov estudio los efectos benficos del
consumo de leche fermentada al apreciar la longevidad y buena salud de los
campesinos blgaros que consuman grandes cantidades de yogurt, y concluy
que las bacterias lcticas aportadas por la misma favorecan la flora intestinal y
generaban sustancias que impedan el desarrollo de bacterias patgenas. A
causa de su investigacin Metchnicov recibi el Premio Nobel en 1908. (Olivera,
J. 2011).
5.1.
Las bacterias del cido lctico son organismos inmviles, de forma bacilar o
esfrica
(Figura
1),
no
esporulados,
anaerobios,
microaeroflicos
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Las bacterias del cido lctico son todas anaerobias aerotolerantes que crecen
fcilmente sobre la superficie de medios slidos expuestos al aire. Sin embrago,
son incapaces de sintetizar ATP por respiracin, lo cual es un reflejo de su
incapacidad para sintetizar citocromos y otras enzimas que contengan grupos
hemo. Aunque pueden realizar oxidaciones limitadas de unos cuantos
compuestos orgnicos, mediadas por enzimas flavoprotecas, bien sean
oxidasas o peroxidasas, estas oxidaciones no se acompaan de formacin de
ATP. Los rendimientos del crecimiento en las bacterias del cido lctico no son,
por consiguiente, afectados por la presencia o ausencia de aire, constituyendo
la descomposicin fermentativa de los azcares como fuente de ATP en ambas
condiciones.
Una caracterstica comn en las bacterias del cido lctico es la carencia de
superxido dismutasa y el precisar grandes cantidades de manganeso en el
medio de crecimiento; ello indica que el Mn2+ puede ser empleado en el grupo
como sustituto de la superxido dismutasa. De hecho, el nico miembro en el
que se ha demostrado actividad superxido dismutasa detectable es
Streptococcus.
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5.1.2. pH
Una caracterstica fisiolgica definitiva de las bacterias del cido lctico es su
elevada tolerancia a los cidos. Las BAL son cidos tolerantes pudiendo crecer
algunas a valores de pH tan bajos como 3.2, otras a valores tan altos como 9.6,
y la mayora crece a pH entre 4 y 4.5, permitindoles sobrevivir naturalmente en
medios donde otras bacterias no aguantaran la aumentada actividad producida
por los cidos orgnicos (Ramrez R. J. et al., 2011).
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5.1.4. Temperatura
Con respecto a las temperaturas en se desarrollan estos microorganismos, los
hay: Mesfilos, que crecen entre 25-30C y termfilos, cuyo rango de
temperatura se encuentra entre 40-44C.
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5.1.5.1.
Agar MRS
Las bacterias cido lcticas crecen bien en el medio MRS tanto lquido (caldo)
como slido (agar). El agar MRS fue desarrollado por Man, Rogosa y Sharpe, y
por su formulacin permite el adecuado desarrollo de lactobacilos y otras
bacterias cido lcticas.
La proteasa peptona, el extracto de carne, el extracto de levadura y la glucosa
constituyen la fuente nutritiva, ya que aportan nitrgeno, carbono, vitaminas y
minerales. El citrato de amonio acta como agente inhibitorio del crecimiento de
bacterias Gram negativas. El agar es el agente gelificante (Britanialab).
5.2.
Hacia 1920, S. Orla Jensen sealo que las bacterias del cido lctico podan
dividirse en dos subgrupos bioqumicos, que se distinguen por los productos
formados a partir de la glucosa: Los homofermentadores convierten la glucosa,
de modo casi cuantitativo, en cido lctico; Los heterofermentadores
la
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Figura 3. Ruta de Embden Meyerhof Parnas (EMP) por la que las bacterias
homofermentadoras del cido lctico convierten la glucosa en cido lctico.
11
Figura
4.
Ruta
del
catabolismo
de
la
glucosa
por
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las
bacterias
Glucosa + O2
12
Fructosa + NADH + H+
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Manitol + NAD+
3 Fructosa
5.3.
Clasificacin en gneros
Lactobacillus,
Lactococcus,
Lactosphaera,
Leuconostoc,
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5.4.
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15
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Bebidas fermentadas
a base de leche
Quesos
Mantequilla madura
Crema cida
Yakult
Bacterias principales
Lactobacillus bulgaricus,
Lactobacillus casei,
Lactobacillus acidophilus,
Streptococcus
thermophilus.
Lactobacillus herveticus,
Streptococcus lactis,
Streptococcus cremoris
Streptococcus lactis,
Streptococcus
diacetilactis.
Lactobacillus lactis,
Streptococcus
diacetilactis
Streptococcus lactis
Streptococcus cremoris
Lactobacillus cremoris
Streptococcus lactis spp.
Diacetilactis
Lactobacillus casei
Usos
Provee sabor, gusto suave
y delicado y promueve la
cuajada, mejora la dijestion,
absorcin, contribuye a
promover la salud.
Adiciona sabor, contribuye
a promover la salud.
Promueve
el
cuajado,
provee aroma y sabor.
Promueve moderado sabor
agrio y aroma.
Promover
sabor
caracterstico
(pequeas
cantidades de acetaldehdo
y grandes cantidades de
diacetilo.
Promueve moderado sabor
agrio y aroma, contribuye a
promover la salud.
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Bifidobacterium
5.5.
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5.6.
CARRERA-VEGA
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Cepa
Masa
Productora
molecular
Estabilidad
Sensibilidad
Espectro de
Referencia
inhibicin
(Da)
Lacticina
Lactococcus
Lactis
Proteinasa K,
N.D.
DPC3147
tripsina,
Ac.
Actico,
Bacilo,
Ryan y col.,
1996
100C/10min.
pronasa E,
Enterococcus,
pH <5;
quimotripsina,
Lactobacillus,
catalasa
pepsina
Lactococcus,
Leuconostoc,
Listeria,
Pediococcus,
Staphylococcus,
Streptococcus,
Diplococina
Lactococcus
lactis
5,300
-75C
spp.
T > 4C;
quimotripsina,
Cremoris 346
tripsina,
Lactococcus,
Rogers,
lactis
1928;
spp.
Cremoris
pronasa,
Oxford,
1944
pepsina
Lactococina I
Lactococcus
lactis
6,000
spp.
Cremoris AC1
Lactococinas
Lactococcus
NyM
lactis
spp.
100C/30
Enzimas
min.
proteolticas
Lactococcus,
Geis y col.,
Clostridium
1983.
N.R.
Van Belkum
pH=4.5-7
N.D.
N.D.
N.D.
y col., 1991
Cremoris 9B4
18
Lactococina
Lactococcus
lactis
5,300
N.D.
N.D.
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N.R.
Van Belkum
spp.
y col., 1991.
Cremoris 9B4
Bacteriocina
Lactococcus
S50
lactis
N.D.
N.D.
N.D.
N.R.
Kojic y col.,
spp.
1991.
Diacetylactis
S50
Curvacina A
Lactobacillus
3,000-
100C/3 min.
Proteinasa K,
Lactobacillus,
Tichaczez y
curvatus
5,000
Pepsina
Tripsina
Leuconostoc,
col., 1992
LTH
1I74
Carnobacteria,
Listeria
spp.,
Micrococcus,
Staphylococcus
Lacticina A
Lactobacillus
N.D.
N.D.
delbrueckii spp.
60C/10 min.,
proteasas
Lactis
Lacticina B
Lactobacillus
N.D.
N.D.
60C/10 min.,
proteasas
Lactis
Lactobacillus
Toba y col.,
delbrueckii spp.
1991
Lactis
delbrueckii spp.
Sakacina M
Lactobacillus
Lactobacillus
Toba y col.,
delbrueckii spp.
1991
Lactis
4,640
sake 148
80C/60 min.
150C/9 min.
Pepsina,
Lactobacillus,
Sobrino
col., 1991
tripsina,
Leuconostoc,
papana,
Carnobacteria,
proteasa.
Listeria,
Staphylococcus
Sakacina P
Lactobacillus
3,000-
100C/30 min
Proteinasa K,
Lactobacillus,
Tichaczez y
5,000
Pepsina
tripsina
Leuconostoc,
col., 1992
Carnobacteria,
Enterococcus,
Listeria
Carnocina
Carnobacterium
UI49
pisccola UI49
3,610
121C/15
Enzimas
Lactobacillus,
Stoffels
min. pH<8
proteolticas
Pediococcus,
col., 1992.
Carnobacteria,
Lactococcus
Enterocina A
Enterococcus
4,282
N.D.
N.D.
Listeria
faecium
Aymerich y
col., 1996
CTC492
Enterocina B
Enterococcus
N.D.
N.D.
N.D.
faecium T136
L.
Casaus
monocytogenes,
col., 1997
L. innocua
Enterocina P
Enterococcus
faecium P13
N.D.
100C/60
Enzimas
min.
proteolticas
L.
Cintas
monocytogenes,
col., 1997.
121C/15
L. innocua,
min.
S. aureus,
pH= 2-11,
C. perfringens,
C. botulinum
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contienen
aminocidos
pocos
frecuentes
tales
como
la
dehidroalanina (DHA), dehidrobutirina (DHB), lantionina y D-metillantionina, generados por transformaciones postranscripcionales de los
aminocidos ordinarios: serina, treonina, y cistena (Liu y Hansen, 1990).
Incluye a la nisina, lactinina 481, carnocina UI49 y la lactocina S.
Clase II. Formada por pptidos no lantibiticos (<10 KDa), estables frente
al calor. Incluye a la pediocina PA-1, lactococinas A, B y M, leucocina A,
sakacinas A y P, entre otras. Adicionalmente de esta clase se han definido
cuatro subgrupos:
IIc: Formado por pptidos con el grupo tiol activado y que requieren para
su accin que los residuos de cistena se encuentren reducidos. La
bacteriocina caracterstica de este subgrupo es la lactococina B.
IId: Est formada por un grupo variable de pptidos lineares entre los
cuales se encuentra la lactocoquina A de L. lactis.
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Clase III. Formada por pptidos de gran tamao (> 30 KDa) muy
termolbiles. Incluyen las helveticinas J y V-1829, la acidofilucina A y las
lactaninas A y B.
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Listeria seeligeri
Listeria welchii
Proteus mirabilis
Pseudomona aeruginosa
Pseudomona fluorescens
Salmonella enteritidis
Salmonella infantis
Salmonella lyphimurium
Shiguella sp.
Stahhylococcus Aureus
Staphylococcus carnosus
Staphylococcus epidermis
Mycobacterium tuberculosis
Bacteriocinas
Sakacina A
Lactocina-S, Lactostrepcin-5, Nisina, Pediocina-A,
Pediocina-AcH, Sakacina-A.
Nisina
Nisina
Termofilina
Nisina
Lacticina-481, Nisina, Temofilina.
Nisina
Nisina, Pediocina-AcH, Sakacina-A, Sakacina-P.
Nisina, Reuterina
Nisina, Pediocina-A, Pediocina-AcH,Pediocina-VTT,
Reuterina, Termofilina.
Nisina, Pediocina-A.
Lacticina-481, Lactocina-S, Pediocina-AcH.
Reuterina, Termofilina.
Lactacina-481, Lactocina-S, Pediocina-A, PediocinaAcH.
Pediocina-A, Pediocina- AcH, Pediocina-PAC1.
Curvacina-A, Enterocina-1146, Lactacina-S, Lacticina481, Leucocin-A, Nisina, Pediocina-A, Pediocina-AcH,
Pediocina-JD, Reuterina, Sakacina-A y Sakacina-P.
Pediocina A
Lacticina-481, Pediocina-A.
Nisina
Termofilina
Termofilina
Reuterina, Termofilina.
Pediocina-VTT, Reuterina.
Reuterina, Termofilina.
Reuterina, Termofilina.
Nisina, Lacticina-481, Pediocina-A, Pediocina-AcH,
Plantaricina-S.
Curvacina, Lacticina-481, Lactocina-S, Pediocina-AcH.
Nisina
Nisina
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estructura de estos pptidos, -hlice o -laminar, pueden formar dos caras, una
hidroflica y otra hidrofbica creando oligmeros que pueden atravesar la
membrana formando poros. El lado apolar de la molcula se situar prxima a
los lpidos de la membrana y el lado polar al centro del poro. Como consecuencia,
se observa una prdida de iones K+, ATP y, en algunos casos aminocidos y
molculas pequeas. La prdida de estas sustancias origina a su vez una
prdida del potencial de la membrana, consumo de las reservas energticas
celulares, descenso de la sntesis del ADN, ARN y protenas, originando la
muerte celular (McAuliffe et al., 2001). Algunos miembros de la clase I, como la
nisina, han demostrado un modo de accin dual. La nisina, se une a la pared
celular mediante atracciones elstrostticas, lo cual se facilita debido a la carga
positiva de este pptido y las cargas negativas de los componentes de la pared
celular. Posteriormente, la nisina se une al lpido II, el transportador principal de
las subunidades de peptidoglicano desde el citoplasma a la pared celular, y por
lo tanto proviene la sntesis correcta de la pared celular, provocando la formacin
de un poro trasnmembranal permitiendo la salida de aminocidos y ATP, lo que
conduce a la muerte celular (Cotter et al., 2005).
El mecanismo de accin de las bacteriocinas de la clase III bacteriolisinas es
menos complejo con respecto a los lantibiticos y los no-lantibiticos, ya que
actan directamente sobre la pared celular de las bacterias Gram positivas lo
que conduce a la muerte y lisis de la clula (Cotter et al., 2005).
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Figura 7. Modo de accin de los lantibiticos (Clase I), no-lantibiticos (Clase II)
y bacteriolisinas (Clase III). (Adaptado de Cotter et al., 2005).
CARRERA-VEGA
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5.7.
CARRERA-VEGA
2015
CARRERA-VEGA
2015
27
CARRERA-VEGA
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5.9.
Bacterias patgenas.
actividad
antimicrobiana
contra
bacterias
patgenas
tales
como:
28
CARRERA-VEGA
2015
CARRERA-VEGA
2015
30
5.10.1.
CARRERA-VEGA
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Mtodos de extraccin
Para extraer los cidos nucleicos del material biolgico es preciso provocar una
lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de
los restos de clulas. El procedimiento de lisis idneo suele consistir en un
equilibrio de tcnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material
inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para
preservar el cido nucleico. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los
siguientes:
Rotura mecnica (trituracin, lisis hipotnica, etc.).
Tratamiento qumico (detergentes, reduccin con tioles, etc.).
Digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.).
5.10.2.
31
5.10.3.
CARRERA-VEGA
2015
5.10.4.
La tcnica de la PCR, fue ideada por Kary Mullis a mediados de los ochenta, y
ha revolucionado la gentica molecular al hacer posible un mayor acercamiento
al estudio de los genes. Es un procedimiento rpido para la amplificacin
enzimtica in vitro de un segmento especfico de ADN.
32
CARRERA-VEGA
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Por esta razn elegir el ADNr para la identificacin de especies constituye una
buena alternativa, ya que es una regin con mayor presencia en las especies
bacterianas y es un agente de vital importancia en la sntesis de protenas. Esto
permite ver variaciones dentro de una misma especie, y as identificar sepas del
producto en cuestin (Surez Ramrez et al., 2007).
5.10.5.
Electroforesis de PCR
(Surez
6. MATERIALES Y METODOS
La investigacin
CARRERA-VEGA
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6.1.
Muestras de BAL
Fuente
BAA
Leche materna
BS1
Leche materna
LC1
Leche de cabra
LC2
Leche de cabra
BD
Leche materna
BD2
Leche materna
XE
Leche de vaca
Leche de vaca
6.1.1. Purificacin
Se prepar una cantidad especfica de medio MRS (Man, Rogosa y Sharpe) con
un pH de 6.5, se esteriliz en una autoclave a 121C durante 15 minutos y se
vaco en cajas Petri agregando 20 ml del medio a cada caja, en este proceso se
utiliz una campana de flujo laminar vertical (Scorpion Scienctific, Modelo: A
80000), donde los materiales utilizados estaban previamente esterilizados, esto
con el objetivo de eliminar cualquier contaminacin por microorganimos no
deseados.
La siembra de las BAL se realiz en una campana de flujo laminar bajo
condiciones aspticas, se tom una azada de cada cepa y se sembr sobre el
agar utilizando el mtodo de estriado por agotamiento para disminuir la carga
microbiana. Las cajas inoculadas se etiquetaron y se sellaron correctamente con
parafilm (plstico flexible) para evitar su contaminacin, se metieron en un frasco
(Figura 11), se le inyecto nitrgeno para dar condiciones anaerbicas y despus
se incubaron (Incubadora arsa, Modelo: AR-130D) a 37C durante 48 Horas.
Cuando las cepas crecieron, se tom un inoculo de una colonia aislada (Figura
12) y se resembr en una nueva caja petri con agar MRS, este procedimiento se
repiti (Tres veces) hasta obtener un cultivo puro.
34
CARRERA-VEGA
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Figura 12. Colonias aisladas de BAL sembradas por el mtodo de estriado por
agotamiento para reducir la poblacin microbiana.
6.1.2. Morfologa macroscpica y microscpica
Del cultivo puro obtenido se visualizaron todas las caractersticas macroscpicas
(Forma, color y tamao de las colonias) y especficas de cada cepa. En cambio,
para observar la morfologa microscpica (forma y color de la bacteria) se tom
un inoculo del mismo cultivo (Cultivo puro) y se realiz un frotis sobre un
portaobjeto previamente lavado y desinfectado, despus se hizo una tincin de
Gram (Anexo 1) a la muestra, se agreg una gota de aceite de inmersin y se
observ con el objetivo 100X en un microscopio (LABOMED, Modelo: CxL) para
asegurar su purificacin y su morfologa (Figura 13) especfica de una BAL.
35
CARRERA-VEGA
2015
Figura 14. Frascos con caldo MRS inoculados con cepas de BAL en
condiciones anaerbicas.
Para mantener las cepas en conservacin se hizo una mezcla de glicerol al 10%
y leche descremada al 10% en 100 ml de agua destilada. Se agreg 10ml de la
mezcla a cada frasco que contena el medio de cultivo y se homogeniz
suavemente. Despus, con una micropipeta se tom un mililitro de la mezcla
homogenizada y se vaco en un tubo eppendorf (Figura 15), estos tubos se
mantienen en congelacin a una temperatura de -22C para conservar las cepas.
36
CARRERA-VEGA
2015
6.2.
temperatura.
centrifugacin.
el
extracto
mediante
una
37
CARRERA-VEGA
2015
I = Inhibicin
S = Salmonella typhi
E = E. coli
A = S. aureus
38
6.3.
CARRERA-VEGA
2015
En esta etapa se realiz una fermentacin en jugo de aloe vera para analizar las
cinticas de crecimiento de las dos mejores cepas productoras de bacteriocinas
con mayor efecto antimicrobiano. Para su anlisis se utiliz jugo de aloe vera
como medio de crecimiento para las BAL y se determin la produccin de
biomasa por espectrofotometra, el pH y azucares totales presentes en el medio.
aloe vera.
39
CARRERA-VEGA
2015
CARRERA-VEGA
2015
6.4.
41
CARRERA-VEGA
2015
260.0 nm
280.0 nm
g/ml
g Totales
(Cdigo)
Abs1
Abs 2
(Abs1)/(Abs2)
(Abs1)(100)(50)
( g/ml)(0.05)
42
CARRERA-VEGA
2015
43
CARRERA-VEGA
2015
para observar las bandas de las muestras y capturar una foto con el Software
UVP para asegurar la calidad del ADN. Se utilizaron lentes especiales para evitar
el contacto directo con los rayos UV.
44
CARRERA-VEGA
2015
Concentracin
Cantidad (1 muestra)
10 X
2.5 l
Mg Cl2
25 mM
1.5 l
Primer 27 F
15 pmol
0.83 l
Primer 1492 R
15 pmol
0.83 l
DNTPS
25 mM
0.2 l
Enzima Taq-Plimeraza
5 unidades/l
0.2 l
Agua deshionizada
18 l
TOTAL........
24 l
TEMPERATURA
CICLO
2 minutos
94 C
1 minuto
94 C
1 minuto
TM
1 minuto
72 C
10 minutos
72 C
Infinito ()
4 C
45
CARRERA-VEGA
2015
Finalizado el proceso, se realiz una electroforesis del producto obtenido con gel
de agarosa al 3% para identificar las muestras amplificadas. El producto de PCR
se mantienen en congelacin a -20 C.
CARRERA-VEGA
2015
la cmara se conecta a una fuente de poder (Labnet; Modelo E0303) uniendo los
polos (Rojo y negro) adecuadamente y se deja correr el gel a 90 Voltios durante
30 o 45 minutos. Trascurrido el tiempo, el gel se pone sobre un Transiluminador
(UVP; M-20V) se conecta a la corriente y se enciende la luz UV para observar
las bandas y la posible amplificacin del gen 16s del ADN ribosomal en las
muestras analizadas.
7. RESULTADOS Y DISCUSIONES
7.1.
47
CARRERA-VEGA
2015
BAA
BS1
LC1
LC2
IMAGEN
DESCRIPCION
Colonias medianas de forma
circular, borde entero, superficie
lisa,
consistencia
cremosa,
elevacin convexa, y color
blanco con apariencia brillante.
48
BD
BD2
XE
CARRERA-VEGA
2015
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CARRERA-VEGA
2015
IMAGEN
DESCRIPCION
Bacteria Gram positiva (color
morado) con forma de cocos
unidos en racimo.
BAA
BS1
LC1
50
CARRERA-VEGA
2015
XE
51
CARRERA-VEGA
2015
7.2.
Las bacteriocinas producidas por las BAL presentan diferentes modos de accin.
Por lo tanto, de los diferentes tratamientos a los que fueron sometidos los
extractos, el ms ptimo fue a 80C durante 30 minutos,
donde el efecto
CEPAS
BAA
BS1
15,45
22,05
LC1
LC2
51
56
19,8
17,55
43,75
43,75
BD
66,5
19,2
39,55
BD2
XE
50
0
18,3
17,55
41,3
35
66
16,8
37,45
52
CARRERA-VEGA
2015
114,55
117,3
125,25
120,25
109,6
52,55
19,8
BAA
37,5
BS1
LC1
LC2
BD
BD2
XE
Cepas de BAL
7.3.
De la etapa anterior se tomaron las cepas X y BD por ser las mejores bacterias
productoras de bacteriocinas con efecto antimicrobiano, y se realiz una
fermentacin en Jugo de aloe vera para evaluar la capacidad de adaptacin de
las mismas en un medio diferente al caldo MRS. Se determin la produccin de
biomasa, el pH y los azucares totales mediante un muestreo cada 4 horas en un
periodo
de
51
horas.
La
produccin
de
biomasa
se
realiz
por
espectrofotometra.
En la figura 29 se puede observar que en la cepa X no se aprecia una fase de
adaptacin ya que la produccin de biomasa es ms rpida, los nutrientes se
agotan y la curva decrece en menos tiempo. En cambio, la cepa BD se reproduce
ms lentamente por lo que se observa una excelente fase de adaptacin en el
medio, los nutrientes se mantienen un poco ms y se requiere ms tiempo para
que la curva empiece a decrecer.
53
CARRERA-VEGA
2015
0,90
0,80
Absorbancia
0,70
0,60
0,50
0,40
0,30
BD
0,20
0,10
0,00
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (h)
7.3.2. pH
Una caracterstica fisiolgica de las BAL es su elevada tolerancia a los cidos.
Estas bacterias son cidos tolerantes pudiendo crecer en medios muy cidos o
muy alcalinos, y la mayora crece a pH entre 4 y 4.5.
El cambio de pH durante la fermentacin fue aumentando, y este ocurri a partir
de la inoculacin de las cepas (X y BD). En la figura 30 se puede observar el
comportamiento de pH en los dos medios de cultivo. Al inicio de la fermentacin
ambos medios tenan un pH de 4.3, este fue variando mientras transcurran las
horas, y al finalizar el monitoreo se obtuvo un pH de 5.1 en ambas cepas, es
decir, las cepas de BAL analizadas se desarrollaron mejor en medios ligeramente
cidos.
54
CARRERA-VEGA
2015
5,20
5,10
5,00
4,90
pH
4,80
4,70
4,60
BD
4,50
4,40
4,30
4,20
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (h)
55
CARRERA-VEGA
2015
20
18
Azucares Totales
16
14
12
10
BD
6
4
2
0
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (h)
Figura 31. Consumo de Azucares totales por las BAL en el jugo de aloe vera.
7.4.
56
CARRERA-VEGA
2015
260.0 nm
280.0 nm
g/ml
g Totales
BAA
BS1
LC1
LC2
BD
X
XE
BD2
0.050
1.253
0.993
0.126
0.136
0.075
0.115
0.040
0.030
0.589
0.472
0.083
0.096
0.055
0.058
0.030
1.617
2.127
2.104
1.542
1.417
1.576
1.983
1.333
250.0
6,265.0
4,965.0
630.0
680.0
375.0
575.0
200.0
12.5
313.25
248.25
31.5
34.0
18.75
28.75
10.0
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CARRERA-VEGA
2015
Figura 32. Electroforesis con gel de agarosa al 1% para verificar la calidad del
ADN a travs de las bandas marcadas. En la parte superior se observan los
cdigos de cada muestra.
Figura 33. Electroforesis del producto obtenido de la PCR con gel de agarosa al
3%. Los mascadores moleculares se encuentran al inicio y al final de las
muestras.
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8. CONCLUSIONES
La morfologa macroscpica de las de BAL varo principalmente en el tamao
de las colonias. Las caractersticas de color, forma, borde, consistencia,
elevacin y apariencia fueron similar en todas las colonias obtenidas. Mediante
la tincin de Gram se asegur la pureza de los cultivos y se observ la morfologa
microscpica de las BAL. Todas las cepas resultaron tener forma cocoide y
pertenecan a las Gram positivas, siendo esta una caracterstica que las
identifica.
Las bacteriocinas obtenidas de la fermentacin en caldo MRS mostraron una
mayor actividad antimicrobiana sometida a un tratamiento de 80C durante 30
minutos, es decir, su estructura es muy resistente a altas temperaturas y no
alcanza a provocar su desnaturalizacin, por lo que siguen llevando a cabo su
funcin antimicrobiana. El mtodo de difusin en disco, result una tcnica muy
apropiada para determinar este factor.
En la evaluacin antimicrobiana la Salmonella typhi se tom como la de mayor
importancia en su inhibicin, seguido del S. aureus y E. coli. Por lo tanto, las
bacteriocinas producidas por la cepa BD y X tienen mayor efecto antimicrobiano
con las tres bacterias patgenas analizadas y muy especficamente contra
Salmonella typhi. Esto las identifica como las dos mejores cepas productoras de
bacteriocinas con efecto antimicrobiano.
De los parmetros analizados en la cintica de crecimiento, la cepa BD mostr
mejor adaptacin en el sustrato. El consumo de azucares de esta bacteria es
muy lento, esto le permite tener una mejor fase de adaptacin y una excelente
produccin de biomasa en comparacin con la cepa X.
Los primers utilizados para la identificacin molecular de las BAL no lograron
amplificar el gen 16s del ADN ribosomal, por lo que se recomienda cambiar la
secuencia de los primers a utilizar.
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9. BIBLIOGRAFIA
Abee, T. (2005). Bacteriocins: modes of action and potencials in food
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Ingeniera Agroindustrial. Pg. 45.
Beristain Bauza, S. C., Palou E. y Lpez Malo, A. (2012). Bacteriocinas:
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Castro Albornoz, G. y Valbuena Colmenares, E. (2009). Biopreservacin:
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Luiz
Moreira
Dos
Santos.
(1993).
AISLAMIENTO
and food
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10. ANEXOS
ANEXO 1: TINCION DE GRAM
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien
la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en
este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga
elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de
bacterias). Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente:
el Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se
cubre con solucin Yodada durante 1 - 2 min y se lava de nuevo con agua,
decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina
(color de contraste) durante 1 2 min. Lavar y secar. Las bacterias grampositivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. (Santambrosio E., et al.
2009).
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Tubos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Volumen patrn
Dextrosa (L)
Fenol 80%
(L)
H2SO4
(L)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
200
200
200
200
200
200
200
200
200
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
Abs 1
Abs 2
Abs 3
PROMEDIO
0,432
0,428
0,424
0,43
0,505
0,485
0,484
0,49
0,53
0,518
0,513
0,52
0,593
0,585
0,587
0,59
0,643
0,64
0,639
0,64
0,684
0,687
0,674
0,68
0,765
0,742
0,737
0,75
0,794
0,788
0,787
0,79
0,857
0,855
0,858
0,86
CURVA PATRON
Absorvancia
1,00
0,80
0,60
0,40
y = 0,0526x + 0,3751
0,20
R = 0,997
0,00
0
10
15
20
25
30
35
40
[ ] Dextrosa en g/L
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BAA
LC1
LC2
BS1
BD2
BD
XE
REP.
SALMONELLA
ESCHERICHIA COLI
STAPHYLOCOCCUS
AUREUS
Dim. 1
Dim. 2
PROM.
(cm)
(cm)
(cm)
0
0
0
R1
Dim. 1
(cm)
0
Dim. 2
(cm)
0
PROM.
(cm)
0
Dim. 1
(cm)
1,4
Dim. 2
(cm)
1,3
PROM.
(cm)
1,35
R2
1,5
1,3
1,4
R3
1,2
1,2
1,2
R1
1,1
1,05
1,3
1,4
1,35
1,3
1,2
1,25
R2
1,1
1,1
1,1
1,3
1,3
1,3
1,4
1,3
1,35
R3
0,9
0,9
0,9
1,3
1,3
1,3
1,2
1,1
1,15
R1
1,4
1,3
1,35
1,4
1,2
1,3
R2
0,9
0,9
0,9
1,1
1,05
1,3
1,2
1,25
R3
1,4
1,5
1,45
1,1
1,1
1,1
1,2
1,2
1,2
R1
0,9
0,9
0,9
R2
1,1
1,1
1,1
R3
R1
1,3
1,2
1,25
1,2
1,1
R2
1,4
1,4
1,4
1,2
1,1
1,15
R3
1,3
1,3
1,3
R1
1,3
1,2
1,25
1,4
1,3
1,35
R2
1,4
1,2
1,3
1,3
1,3
1,3
1,1
1,1
1,1
R3
1,4
1,5
1,45
1,2
1,2
1,2
1,3
1,3
1,3
R1
1,2
1,2
1,2
R2
1,1
1,1
1,1
R3
1,3
1,1
1,2
R1
1,1
1,2
1,15
1,2
1,2
1,2
1,1
1,1
1,1
R2
1,4
1,3
1,35
1,1
1,2
1,15
1,2
1,2
1,2
R3
1,4
1,5
1,45
0,9
0,9
0,9
65
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