Introduccin.

Durante esta prctica se hablar de la cintica enzimtica y los factores que la

afectan, es por eso que daremos una pequea introduccin acerca de este
tema, para que resulte ms sencilla la comprensin de la prctica.
La cintica enzimtica estudia la cintica de las reacciones catalizadas por
enzimas, es decir la velocidad con la que se lleva a cabo la reaccin, esta
velocidad se ve afectada por las condiciones en la que la reaccin se lleva
cabo, por ejemplo:

El pH ya que las enzimas dependen mucho del pH ya que si se realiza

una curva de la actividad enzimtica de acuerdo a este valor se
encuentra una campana casi simtrica en las cuales el punto mximo de
la campana es el pH ptimo y despus de este la actividad empieza a
decaer porque la enzima contiene grupos que pueden ionizarse en
medida del pH, esto hace que la enzima se desnaturalice.
El tiempo, la actividad enzimtica es lineal pero slo hasta un periodo de
tiempo determinado, las razones de este comportamiento son varias, la
primera porque se ha alcanzado el equilibrio es decir el sustrato se haya
agotado para formar ms producto,la segunda es porque la enzima
siendo protena empiece a desnaturalizarse con el tiempo y deje de
funcionar, la tercera que el producto de la reaccin sea un inhibidor de la
actividad enzimtica.
Se ha visto que al aumentar la temperatura se observa una aceleracin
de la actividad debido a la aceleracin del movimiento de las molculas
generado por el calor, pero a determinada temperatura la actividad
empieza a decrecer por desnaturalizacin de la enzima hasta perderse
en su totalidad.
La concentracin del sustrato, para poder explicar la influencia de este
parmetro en la actividad enzimtica tenemos que establecer lo
siguiente:

E+ S ES P+ E

De acuerdo con la ley de accin de masas la velocidad de reaccin ser

proporcional a la concentracin de E-S que a su vez depende de la
concentracin de E y S pero como E queda disponible al final de la reaccin se
puede calcular que la velocidad de la reaccin depende directamente de la
concentracin de S, aunque esto slo aplica en bajas concentraciones ya que a
concentraciones ms altas la velocidad ya no cambia llegando a lo que se
llama Vmx.. Esto es bien explicado en el modelo de Michaelis - Menten que se
expresa por la siguiente ecuacin y se grafica de la manera siguiente:

V=

V mx [ S ]
Km+ [ S ]

V= velocidad de la reaccin
Vmx. = velocidad mxima a la que trabaja la enzima
Km= la constante global de velocidades para cada enzima.

Sin embargo en el modelo anterior se dificulta el clculo de la V mx. por lo que

surge otro modelo de Lineweaver-Burk en el cual la ecuacin de MichaelisMneten se vuelve lineal y queda de la siguiente forma:

1
Km 1
1
=
+
v Vmax [S] Vmax
Donde :

Km 1
Vmax [S] = a la pendiente de la recta (m)

1
Vmax = la ordenada al origen (b)

Objetivos:

Conocer, comprender e interpretar el comportamiento de las enzimas

(ureasa) al ser enfrentadas frente a los diferentes factores que alteran la
velocidad enzimtica.
Mediante el uso de diferentes factores a controlar, tales como, pH (4.5,
6, 7.2, 8.5, 10) concentracin de sustrato (8, 7.5, 6.5, 3.5, 1),
temperatura (0C, temperatura ambiente,50C y 80C) y tiempo
(10,20,30,40,50 minutos), estos factores alteran la velocidad enzimtica.
Para comparar, justificar e interpretar las mejores condiciones de los
cuatro factores mencionados sobre los cuales la enzima logra su mxima
velocidad.

Resultados y Observaciones
Cuadro 1: Efecto del tiempo en la velocidad de reaccin
Cuadro que corresponde a la parte de la experimentacin que llevamos a cabo
Foto

Tiem
po
(Min)

V. de
tit.
blanco

V de
tit.
proble
ma

V de
tit.
corregi
do

moles
de urea
hidroliza
dos

10

.3 mL

.5 mL

.2mL

10

20

.3 mL

1.1 mL

.8 mL

40

30

.6 mL

1.3 mL

.7 mL

35

40

.1 mL

.5 mL

.4 mL

20

50

.4 mL

.5 mL

.1 mL

Observaciones: El volumen de titulacin fue obtenido a partir del volumen gastado

de HCl hasta el momento del vire de amarillo a color canela
Cuadro2: Efecto de la temperatura en la velocidad de reaccin
Tabla que corresponde a la parte de la experimentacin que llevamos a cabo
T(C)

Foto

V. de
tit.
blanc
o

V. de
tit.
proble
ma

V. de
tit.
corregi
do

moles
de urea
hidroliz
ada

.7

.1

-.6

-30

24

.8

.2

-.6

-30

50

.8

.9

.1

80

.8

.2

-.6

-30

Cuadro 3: Efecto del tiempo en la velocidad de reaccin

Resultados que se obtuvieron por mesa
Vol. De
titulacin
corregido

Mesa 1

Mesa 2

Mesa 3

tiempo
.2
10
.7
.5
.8
20
---.8
.7
30
.3
1.1
.4
40
.7
1.2
.1
50
.6
1.3
Cuadro 4: Efecto del pH en la velocidad de reaccin

Mesa 4

Mesa 5

.3
.4
.5
.6
.7

-3
.6
.9
1
.9

Resultados que se obtuvieron por mesa

Vol. De
titulacin
corregido

Mesa 1

Mesa 2

Mesa 3

Mesa 4

Mesa 5

pH
4.5
6
7.2
8.5
10

2.5
3.4
1.4
1.8
-.8

.5
3.7
2
-------------

1.5
4.1
.7
1.9
1.2

2.9
4
2.9
2.2
1.5

2.7
1
2.3
1.6
-------

Cuadro 5: Efecto de la concentracin en la velocidad de reaccin

Resultados que se obtuvieron por mesa
Vol. De
titulacin
corregido

Tubo [S]
1
2
3
4
5

Mesa 1

Mesa 2

Mesa 3

Mesa 4

Mesa 5

----------------

.8
1.7
2.5
3.8
2.7

.5
1.2
1,6
1.9
2.1

.7
1.5
1
2.3
----

----------------

Cuadro 6: Efecto de la temperatura en la velocidad de reaccin

Resultados que se obtuvieron por mesa
Vol. De
titulacin
corregido
T
0
24
50
80

Mesa 1

Mesa 2

Mesa 3

Mesa 4

Mesa 5

0
0
.1
0

.3
1.3
3.3
----

.3
.4
3.2
.4

.6
.5
.3
----

-------------

Anlisis de Resultados
Nuestros resultados no fueron exactos e incluso algunos datos numricos no
coinciden con el resto, debido a que la prueba depende mucho de la percepcin
que se tenga del color del indicador para detener la titulacin.

En el cuadro 3 estudiamos el efecto del tiempo en una reaccin enzimtica. Esta

prueba fue realizada a factores ptimos y constantes, en nuestros resultados
obtenidos encontramos que los tiempos en que hubo una mayor cantidad de
productos fue al dejar transcurrir la reaccin por 20 y 30 minutos, y al observar
nuestra curva observamos que la velocidad de reaccin desciende con el tiempo,
esto puede ser debido a varios factores como:

Que si la reaccin es significativamente reversible, la velocidad de la

reaccin inversa aumentara segn aumente la concentracin de producto,
por tanto descender la velocidad de transformacin de sustrato.
Si no se proporciona suficiente sustrato en exceso, su concentracin
descender significativamente durante el desarrollo de la reaccin
causando un descenso progresivo en la velocidad. (J.G. Morris, 2001)

Por lo que no se obtuvo una cantidad ptima de producto a los 10 min. debido a
que apenas estaba transcurriendo la reaccin y tampoco se obtuvo a los 40 y 50
min. debido a que quiz la concentracin de sustrato ya era mnima o que la
reaccin se hubiera regresado por la cantidad significativa de productos.
Al estudiar el efecto del pH en la velocidad de reaccin cuyos resultados podemos
observar en el cuadro 4, encontramos al llevar a cabo nuestra curva sali con una
forma de campano ms o menos simtrica, donde el valor mayor corresponde al
pH ptimo de la enzima; la mayora de los enzimas presentan un pH ptimo para
el cual su actividad es mxima; por encima o por debajo de ese pH la velocidad de
reaccin disminuye bruscamente. Este efecto se debe a que, al ser los enzimas de
naturaleza proteica, al igual que otras protenas, se desnaturalizan y pierden su
actividad si el pH vara ms all de unos lmites estrechos. De ah la conocida
importancia biolgica de los sistemas buffer. (Campbell y Reece, 2007). El pH
ptimo de la ureasa es de 7.2. (Macfaddin, 2003).
En el cuadro 5 observamos el efecto de la concentracin del sustrato en la
velocidad de reaccin, aqu se observ que la concentracin del tubo 4 fue la ms
ptima debido que en el tubo 5 descendi la cantidad de producto ya que en toda
reaccin catalizada por un enzima, si se mantiene constante la concentracin del
E, la velocidad de la reaccin aumenta exponencialmente al incrementarse la
concentracin del sustrato, ya que al existir ms molculas de sustrato es ms
probable el encuentro con la enzima y la formacin del complejo E-S. Este
aumento de velocidad es rpido para concentraciones bajas de sustrato y, a
medida que este aumenta, se va haciendo ms lento hasta que la concentracin
del sustrato alcanza un cierto valor, a partir del cual, aunque aumente la
concentracin del mismo, no aumenta la velocidad de la reaccin. Esto es debido
a que el enzima est saturada por el sustrato; es decir, todas las molculas del

enzima estn unidas al sustrato formando el complejo E-S. Cuando ocurre esto, se
dice que la reaccin ha alcanzado la velocidad mxima. (Fuentes, Castieiras y
Queralt, 2000). Al observar nuestra curva nos da como resultado una hiprbola
donde a un cierto valor de concentracin del sustrato se observa que la velocidad
de reaccin es constante, en este punto es donde se dice que se ha alcanzado la
velocidad mxima el resultado de esta hiprbola se da desarrollando el modelo
matemtico de Michaelis y Menten.
El efecto de la temperatura observado en el cuadro 6, donde se observa que la
temperatura a la cual se obtiene mayor producto es a 50 C al igual que con el pH
las enzimas poseen una temperatura ptima especifica donde alcanzan una
actividad mxima Esto se debe a que al aumentar la temperatura aumenta el
movimiento de las molculas y por tanto aumenta la probabilidad de encuentro
entre el S y el E, en cambio cuando se produce un brusco descenso de la
actividad es cuando se alcanza una temperatura crtica. Este efecto no es ms
que un reflejo de la desnaturalizacin trmica del enzima cuando se alcanza dicha
temperatura. (Curtis. Barnes. Schnek y Massarini, 2008). La curva obtenida al
igual que en pH fue en forma de campana donde el punto mximo corresponde a
la temperatura ptima de la ureasa que fue de 50 C.

Graficas
0.5 mL de urea

250 mol de urea 12 mol de urea 1 mmol

0.012 mmol urea
=
=
=0.0012 M
1 mL de urea
1000 mol
10 mL

1 mL de urea

250 mol de urea 250 mol de urea 1 mmol

0.25 mmol urea
=
=
=0.025 M
1 mL de urea
1000 mol
10 mL

2 mL de urea

250 mol de urea 500 mol de urea 1 mmol

0.5 mmol urea
=
=
=0.05 M
1mL de urea
1000 mol
10 mL

5 mL de urea

250 mol de urea 1250 mol de urea 1 mmol

1.25 mmol urea
=
=
=0.125 M
1mL de urea
1000 mol
10 mL

7.5 mL de urea

250 mol de urea 1875 mol de urea 1 mmol

1.875 mmol urea
=
=
=0.1875 M
1mL de urea
1000 mol
10 mL

Concentracin del
sustrato [s]
mmol/mL
x
0.0012
0.025
0.05
0.125
0.1875
Concentracin del
sustrato [s]
mmol/mL
x
0.0012
0.025
0.05
0.125
0.1875

VTC

mol de urea
hidrolizada
y

VTC

mol de urea
hidrolizada
y

0.8
1.7
2.5
3.8
2.7

40
85
125
190
135

Efecto de la [S] en actividad enzimtica de la ures

Velocidad de reaccin (mol de urea hidrolizada)

[S] (mmol/mL)

Inversa de [s]
mL/mmol
X

1
0.0012

Inversa de mol de
urea hidrolizada
Y
40

Velocidad enzimtica con

respecto a la [S]

40
20
8

85
125
190
135

1
0.1875

Al aplicar regresin lineal se obtiene

y=0.118 x +136.398

Donde segn la ecuacin de Lineweaver-Burk:

1
Km 1
1
=
+
v Vmax [S] Vmax

Y= la inversa de la velocidad
X= la inversa de concentracin del sustrato
-0.118= El cociente de la Km y la velocidad mxima.
136.398= Es la inversa de la velocidad mxima
Al aplicar esta ecuacin se obtienen los siguientes datos y la siguiente grfica

Inversa de [s]
mL/mmol
X

1
0.0012
40
20
8

1
0.1875

Inversa de velocidad
con regresin lineal
(1/mol)
Y
38.0647
131.678
134.038
135.454
135.7687

Grafico de Lineweaver-Burk que expresa la Km y Vmax.

160
140
120
100

Relacin de las inversas de

la velocidad con respecto
a la del sustrato

80
1/v (1/micromol )

60
40
20
0
200
0

600
400

1000
800

1/[S] (1/mmol/mL)

Concentracin del
sustrato [s]
mmol/mL
X
0.0012
0.025
0.05
0.125
0.1875

VTC

mol de urea
hidrolizada
y

0.5
1.2
1.6
1.9
2.1

25
60
80
95
105

Efecto de [S] en actividad enzimtica de ureasa

Velocidad de reaccin (mol

[S] mmol/mL

Inversa de [s]
mL/mmol
X

1
0.0012
40
20
8

1
0.1875

Inversa de 1/mol
de urea hidrolizada
Y
25
60
80
95
105

Al realizar regresin lineal se obtiene.

y=0.0752 x+86.6422
Inversa de [s]
mL/mmol
X

1
0.0012
40
20
8

Inversa de velocidad
con regresin lineal
(1/mol)
Y
23.9755
83.6342
85.1382
86.0406

de urea hidrolizada)

Velocidad enzimtica con

respecto a la [S]

1
0.1875

86.2411

Valores Y
100
90
80
70
60

Valores Y

50
40
30
20
10
0
0

100

200

Concentracin del
sustrato [s]
mmol/mL
x
0.0012
0.025
0.05
0.125
0.1875

300

400

500

600

700

VTC

mol de urea
hidrolizada
y

0.7
2.5
1.0
2.3
-

35
125
50
115
-

800

900

Efecto de la [S] en la activiad enzimtica de ureasa

Velocidad d recaccin (mol de urea hidrolizada)

[S] mmol/mL

Inversa de [s]
mL/mmol
X

1
0.0012

Inversa de mol de
urea hidrolizada
Y
35

40
125
20
50
8
115
Al hacer regresin lineal se obtiene=

y=0.0753+98.2144
Inversa de [s]
mL/mmol
X

1
0.0012
40
20
8

Inversa de velocidad
con regresin lineal
(1/mol)
Y
35.4644
95.2024
96.7084
97.612

Velocidad enzimtica con

respecto a la [S]

Valores Y
120
100
80
Valores Y
60
40
20
0
0

100

200

Concentracin del
sustrato [s]
mmol/mL
x
0.0012
0.025
0.05
0.125
0.1875

300

400

500

600

700

VTC

mol de urea
hidrolizada
y

800

900

Conclusiones:
Se puedo observar durante la titulacin el cambio del indicador de amarillo a
rojo-rosa y se obtuvieron los siguientes resultados como los mejores:
En el efecto a causea del tiempo fue de 20 y 30 minutos se llega a la mxima
velocidad, ya que la velocidad de reaccin desciende con el tiempo.
Durante el uso y la medicin del efecto de la enzima con efecto del pH ptimo
de la ureasa es de 7.2 ya que se llega a la mxima velocidad.
Para el caso de la concentracin de sustrato, el mejor volumen fue el de 3.5
(tubo 4) ya que si se mantiene constante la concentracin del E, la velocidad
de la reaccin aumenta exponencialmente al incrementarse la concentracin
del sustrato. Esto es debido a que el enzima est saturada por el sustrato; es

decir, todas las molculas del enzima estn unidas al sustrato formando el
complejo E-S. Al expresar los resultados de forma grafica el resultado es una
hiprbola donde se observa que la velocidad de reaccin es constante, en este
punto es donde se dice que se ha alcanzado la velocidad mxima el resultado
de esta hiprbola se da desarrollando el modelo matemtico de Michaelis y
Menten.
Sobre el efecto de la temperatura se observa que la mxima velocidad es a
50C ya que aumenta la probabilidad de encuentro entre el S y el E
Por ende se puede concluir que estos factores son cruciales para que la enzima
pueda llevar a cabo la degradacin de manera rpida, eficiente y seguir
conservando su actividad biolgica.

Bibliografa:
J.G. Morris, 2001, Fisicoqumica para bilogos, 2da edicin, Editorial reverte,
Barcelona, Espaa, pg. 277-278.
Campbell y Reece, 2007, Biologa, Sptima
Panamericana, Madrid, Espaa, pg. 152.

edicin,

Editorial

Medica

Macfaddin, 2003, Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de

importancia clnica, 3era edicin, Editorial medica Panamericana, Buenos Aires,
Argentina, pg. 398.
Fuentes, Castieiras y Queralt, 2000, Bioqumica clnica y Patologa molecular
volumen 1, Segunda edicin, Editorial Reverte, Barcelona, Espaa, pg. 448.
Curtis, Barnes, Schnek y Massarini, 2008, Biologa, Sptima Edicin, Editorial
Medica Panamericana, Madrid, Espaa, pg. 87.