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ELECTROPHORESE CAPILLAIRE
OBJECTIFS
Comprendre les principes dune sparation par lectrophorse
Connatre les paramtres principaux qui dcrivent la sparation et lefficacit de la
sparation
104
7.2. Capillaires
silice fondue
SiOH SiO (pH > 3)
Double couche
couche diffuse (mobile)
couche fixe
7.3 Principes
La vitesse et la direction dpendent des tailles et des charges des ions (magnitude et signe)
Sparation danions ou de cations mais pas despces neutres
4e
105
cations
espces neutres
anions
7.4 Electro-osmose
7.4.1 Mobilit lectro-osmotique
Un facteur important qui contrle gnralement la migration des soluts est la mobilit lectroosmotique, O, due lcoulement de llectrolyte ou flux lectro-osmotique qui apparat aussi
bien en lectrophorse sur bande par effet du support, quen lectrophorse capillaire par effet
de la paroi interne du capillaire.
La paroi de silice est tapisse de groupements silanols qui se dprotonnent si le pH est
suprieur 2. Elle forme alors une couche polyanionique fixe. Par contre, en vis--vis, la
+
couche polycationique (positive) de llectrolyte, dont les ions H3O , se met en mouvement ds
quun champ lectrique est cre dans le capillaire, entranant toutes les espces prsentes. Ce
dplacement linaire de llectrolyte produit par la charge des ions et le champ tangentiel
appliqu, peut tre contrl, voire invers, en modifiant la surface, le pH, ou en ajoutant des
surfactants ioniques.
EO =
= viscosit du tampon
.
-1
E : champ lectrique (V cm )
106
dpendant du tampon
- constante dilectrique
- viscosit
- (pH, concentration)
dpendant de la composition du capillaire
-
7.4.2 Dbit lectro-osmotique
VEO =
E
4
.
-1
E=
V
L
V : potentiel appliqu
L : longueur du capillaire
potentiel appliqu
pH
temprature
solvants organiques
modification de la paroi du capillaire
dpendant du capillaire
- diamtre
- longueur
Exemples :
diamtre
-R
- I (V = IR)
- P (P = VI)
(donc, on peut augmenter V max)
longueur ( L)
- E (E = V/L)
- R (V = IR)
-I
- P (P = VI) chauffage
7.4.3.2 Effet du pH
SIOH2+SiOH+H+ SiO2H+
pH : normalement optimis pour la sparation et non pas le dbit lectroosmotique.
108
4e
Concentration
- adsorption dans la couche de Stern
-
-
- vEO
et si la temprature dest pas contrle, une augmentation de I :
I (courant) T :
Limitations : la concentration du tampon devrait excder la concentration de lchantillon
(10-100x)
Chauffage dans les capillaires
- pics plus larges
- viscosit du tampon (donc I)
- bullition du tampon
- dcomposition de lchantillon
Il vaut mieux utiliser un maximum de voltage sans excs de chauffage
7.4.3.4 Effet de la temprature
1 C (20 21 C)
2.4 %
et puisque
VEO =
E
4
2-4 % VEO
mais aussi 0.5 % (cte. dilectrique)
En gnrale, T VEO
Sil y a trop de chauffage, il en rsulte :
dcomposition de lchantillon
diffusion ( largeur des pics)
bullition du tampon
109
110
7.5 Electrophorse
7.5.1 Mobilit lectrophortique
Dans toute exprience dlectrophorse, un compos porteur dune charge lectrique migre,
sous influence du champ lectrique appliqu E une vitesse appele vitesse de migration
lectrophortique VEP qui dpend de sa mobilit lectrophortique EP.
EP est dfinie partir de sa vitesse de migration VEP observe dans un lectrolyte suppos
immobile et du champ lectrique
VEP = EP
.
EP =
q
=
L
6r VEP V
r = rayon hydrodynamique
q = charge (q = 0 : aucune sparation)
L dsigne la longueur totale du capillaire et V le potentiel appliqu ses extrmits. On verra
2 -1 -1
plus loin quon peut obtenir EP(cm .V .s ) partir dun lectrophorgramme, de manire
indirecte. On affecte la mobilit lectrophortique un signe (+ ou -) selon la nature cationique
ou anionique de lespce ; EP est nulle pour une espce globalement neutre. Ce paramtre
dpend, non seulement de la charge de lespce, mais de son diamtre et la viscosit de
llectrolyte.
Facteurs influenant la mobilit lectrophortique
Charge :
- pH important (macromolcules !)
-
|
NH3
+
2+
e.g. Zn
NH3
+
NH2
2-
4+ EDTA Zn - EDTA
Viscosit :
- Modifications de temprature ou de solvant (ajout dun modificateur organique)
Rayon hydrodynamique de lion
112
7.5.2 Dtermination de
VEP=
! distance
tR temps
( ) (!t )
!
VEP= t
obs
EO
EP= VEP
()
V
L
() ()
! L
EP= !
t obs t EO V
!L
(P+O)V
7.6.2 Rsolution ( R )
R=0.177(EP1EP2)
V
moy+EO)D
R = f ( V)
moy = O
mais
=
!
tm (moy +LO)V
7.6.3 Efficacit (
N)
6
Lefficacit thorique N, qui peut atteindre 10 plateaux au mtre, dune colonne de longueur
2 -1
totale L et de longueur effective l, peut tre calcule partir du coefficient de diffusion D (cm .s )
2
du solut choisi, donn par la loi dEinstein ( = 2Dtm) et de son temps de migration tm partir
des deux expressions quivalentes :
2
N= !
2DTm
N= app V !
2D L
()
N=16 t =5.54 t
w
w
1/ 2
( + )V
N= P . O
2 D
.
114
7.6.4 Slectivit ()
HPLC :
EC :
t t
= 2 m
t1 t m
t t
= 2 0
t1 t 0
V
= f 2
V1
= f 2
1
115
7.7 Dtection
116
Techniques complmentaires
Pics plus troits en EC
potentiels de 20'000 60'000 V
N
- 100'000 - 200'000 (EC)
- 5'000 - 100'000 (HPLC)
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