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Profesor asistente, Departamento de Nutricin y Bioqumica, Facultad de Ciencias Bsicas, Pontificia Universidad
Javeriana. Bogot, D.C.; 2 ND, Departamento de Nutricin y Bioqumica, Facultad de Ciencias Bsicas, Pontificia Universidad Javeriana. Bogot, D.C.; 3 Profesor asociado, director Grupo de Investigacin en Hormonas, Depto. de Qumica,
Universidad Nacional de Colombia, Bogot, D.C.
Palabras clave: IGF-I (factor de crecimiento similar a la insulina-1), GH (hormona de crecimiento), IGF-IR (receptor
para el factor de crecimiento similar a la insulina-1), GHR (receptor para la hormona de crecimiento), rhIGF-I (factor de
crecimiento similar a la insulina-1 recombinante humano), malnutricin proteica, sistema inmune.
Introduccin
Se ha sugerido que
los efectos
inmunomoduladores
de la hormona de
crecimiento (GH) y el
factor de crecimiento
similar a la insulina
(IGF-I) pueden ser
explicados en trminos
de sus acciones
anablicas/
somatognicas y
moduladoras del estrs
en clulas del sistema
inmune. El dficit de
protenas y caloras
induce un estado
catablico o de estrs
nutricional, con efectos
deletreos sobre el
sistema inmune. El
presente estudio
investig los cambios
sobre el eje GH/IGF-I
esplnico inducidos por
la malnutricin proteica
y el efecto de la infusin
de rhIGF-I. Se utilizaron
ratas normales en
crecimiento alimentadas con dietas
isocalricas que diferan
en el contenido de
protena (0%, 4%, 12%
54
55
Materiales y mtodos
Diseo experimental
Ratas macho de la raza SpragueDawley de 5 semanas de edad se obtuvieron del Instituto Nacional de Salud,
Bogot, D.C. Luego de una semana de
preadaptacin las ratas fueron mantenidas individualmente en cajas metablicas, con libre acceso a agua y a su
respectiva dieta durante un perodo de 12
das. Las ratas se alimentaron con cuatro
dietas diferentes en el contenido de protena (ICN, USA): 0, 4, 12 y 20%. (Las dietas son isocalricas y proporcionan 3.8
Kcal/g dieta). Para cada animal se pes
la racin que consumira durante todo el
experimento; al final, la parte no consumida fue nuevamente pesada. Los animales cuyo peso estaba alrededor de 120
g fueron aleatoriamente asignados a cada
una de las 4 dietas. El da 5 del experimento, una bomba miniosmtica, Alzet
2002, fue implantada en la espalda del
animal bajo anestesia (Rompun: Ketalar:
Salina 1:2:3). La minibomba liberaba 28
l/da, la cual se llen con aproximadamente 300 l de solucin de IGF-I recombinante (suministra 250 g/da de rhIGF-I)
o vehculo (cido actico 0.1 M). De esta
forma por cada dieta se tenan dos grupos, uno recibiendo infusin de rhIGF-I y
el otro vehculo durante 7 das. Al final del
perodo los animales fueron sacrificados
y los respectivos tejidos procesados y
analizados de acuerdo al protocolo experimental. Los protocolos y procedimientos de ciruga estuvieron conformes a las
normas para utilizacin de animales de
experimentacin del Instituto de
Biotecnologa de la Universidad Nacional
de Colombia y del Instituto Nacional de
Salud, Bogot, Colombia.
Muestras de sangre fueron tomadas
del plexo orbital usando anestesia con ter
el da 0,5 y 12. 0,5 mL de sangre fueron
tomados, se obtuvo el suero el cual se
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alicuot y guard a 20C hasta ser procesado para las determinaciones hormonales y protenas de unin del IGF-I.
Aproximadamente un 10% del bazo, fue
procesado para obtener suspensiones
celulares y procesadas por citometra de
flujo para la determinacin de subpoblaciones linfocitarias y receptores de GH e
IGF-I. El resto de tejido fue congelado inmediatamente en nitrgeno lquido y procesado para los estudios de expresin de
mRNA.
La orina y las heces fueron recolectadas diariamente para cada animal. Un
pool se hizo para los cinco primeros das
del experimento, y otro pool para los 7
das restantes. El contenido de nitrgeno en orina y heces fue realizado siguiendo el mtodo estandarizado en el
laboratorio descrito en Snchez-Gmez
et al., 1999 (11).
Modelo estadstico
La dieta fue aleatorizada dentro del tratamiento. Tratamientos: T1, T2. Dietas: d1,
d2, d3, d4. Dado que el experimento no
poda ser completado al mismo tiempo los
grupos fueron escogidos al azar, 12 ratas
cada vez. Dos ratas eran escogidas cada
vez hasta completar 6 animales por grupo: T1d1, T1d2, T1d3, T2d1, T2d2, T2d3.
Los resultados fueron analizados usando
anlisis de varianza de dos vas ANOVA.
Las comparaciones mltiples entre las
medias se realizaron usando la prueba de
Duncan, seguido de la prueba no
paramtrica Wilcoxon usando el programa SAS (SAS Institute, Inc., 1999). Las diferencias se consideraron significativas
cuando los valores de P < 005.
Resultados
Efecto del consumo variable de protena en la dieta y administracin continua de rhIGF-I sobre el peso corporal y
consumo de alimento.
Figura 1
Efecto del contenido de protena en la dieta en ratas normales durante 5 das
(A) y de la administracin continua de rhIGF-I (barras negras) o vehculo
(barras abiertas) durante 7 das (B). Los valores estn expresados como
la media sem para n=6 ratas en cada grupo a rhIGF-I vs. vehculo
alimentados con la misma dieta P < 0.05.
Tabla 1
Estado nutricional de ratas con infusin continua de rhIGF-I o vehculo
% protena en dieta
12
20
Vehculo
Consumo totala
Consumo/PCc
8 0.8b
0.49 0.05
11 0.83
0.57 0.04
13.8 0.56
0.57 0.02
12.3 0.43
0.58 0.04
rhIGF-I
Consumo totala
Consumo/PCc
7.2 0.73b
0.47 0.04b
9.2 1b
0.5 0.04b
13.7 0.97
0.59 0.02
17.1 0.9
0.79 0.07
Los valores estn expresados como la media SEM de n = 6 ratas en cada grupo. aConsumo
de alimento (consumo da(g)/animal). cConsumo de alimento (Consumo(g)/Peso final
corporal(g)/animal) b P < 0.01 vs. Vehculo o rhIGF-I 20%.
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Balance de nitrgeno
El comportamiento anterior se corrobor mediante el balance de nitrgeno.
Para el da 5, las ratas alimentadas con
dieta 0% de protena presentaban balance negativo (-18.2 5 mgN/kg/da) (figura 2A). Para el da 12, este balance, se
redujo para el grupo que recibi rhIGF-I a
-9.3 1 y para el que recibi vehculo a 6.3 1.5 mgN/kg/da, sin diferencia significativa entre estos dos grupos. La
interaccin entre contenido de protena en
Figura 2
Balance de nitrgeno en ratas alimentadas con dietas 0, 4, 12 y 20% de
contenido de protena durante 5 das (A) y efecto de la administracin
continua durante 7 das de rhIGF-I (barras negras) o vehculo (barras
abiertas) (B). Los valores estn expresados como la media sem para n=6
ratas en cada grupo. a rhIGF-I vs. vehculo en la misma dieta P< 0.05.
58
la dieta e infusin de rhIGF-I fue estadsticamente significativa (P < 0.05) en las ratas alimentadas con 20% de protena,
donde la infusin de rhIGF-I caus un incremento del 20% en el balance de nitrgeno comparado con el respectivo control
(3090 185 vs. 3781 284 mgN/kg/da).
No se observ diferencia significativa en
los grupos alimentados con 4 12% recibiendo rhIGF-I o vehculo (figura 2B).
Efecto del consumo variable de protena en la dieta y la administracin de
rhIGF-I sobre el tamao del bazo
El peso del bazo disminuy significativamente con relacin a la disminucin
del contenido de protena consumida en
la dieta. En ratas que recibieron infusin
de vehculo el peso del bazo disminuy
Figura 3
Efecto del contenido de protena ingerida en la dieta durante 12 das sobre el
peso del bazo en ratas que recibieron durante 7 das infusin continua de
rhIGF-I (barras negras) y ratas control que recibieron vehculo (barras
abiertas). Los pesos estn expresados como la relacin peso tejido (mg)/
peso corporal (g). Los valores estn expresados como la media sem para
n=6 ratas en cada grupo. a rhIGF-I vs. Control consumiendo la misma dieta
P < 0.01; b rhIGF-I consumiendo 20% vs. rhIGF-I consumiendo 12, 4, 0% P< 0.05;
c
vehculo consumiendo 20% vs. vehculo consumiendo 12, 4, 0% P< 0.05.
59
La restriccin proteica durante los primeros 5 das caus una reduccin aproximada del 55 y 70% en los niveles
circulantes de IGF-I en ratas alimentadas
con dietas 4 y 0% de contenido de protena comparado al grupo que recibi 20%
(550 60 ng/mL vs. 220 30 y 150 50
ng/mL) figura 4A. La infusin continua de
rhIGF-I durante 7 das subsiguientes restableci los niveles circulantes en ambos
grupos (489 139 y 600 112, para los
animales alimentados con 4 y 0% protena respectivamente); mientras que en los
grupos control que recibieron vehculo, los
niveles fueron an ms reducidos (179
18 y 118 17 ng/mL en los grupos 4 y
0%) figura 4B. En los grupos 12 y 20% que
recibieron vehculo los niveles circulantes
fueron incrementados significativamente,
850 60 ng/mL y 785 55 ng/mL respectivamente comparado a los niveles el
da 0 5. Los animales en estos dos grupos dietarios que recibieron infusin de
rhIGF-I, los niveles circulantes fueron
incrementados a 1986 67 y 3827 373
ng/mL respectivamente.
Efecto del consumo variable de protena en la dieta y administracin continua de rhIGF-I sobre los niveles
circulantes de IGFBPs
60
Figura 4
Efecto del consumo variable de protena en la dieta sobre los niveles
circulantes de IGF-I durante 5 das (A) y administracin continua de rhIGF-I
durante 7 das (B), niveles circulantes de insulina (C) y niveles circulantes de
GH (D) en ratas normales con infusin de rhIGF-I (barras negras) o vehculo
(barras abiertas). Los valores estn expresados como la media sem para
n=6 ratas en cada grupo. a rhIGF-I vs. Control en la misma dieta P < 0.05;
b
Control alimentado 20% vs. Control alimentado 12, 4 0%. c rhIGF-I
alimentado dieta 20% vs. rhIGF-I alimentado dieta 12, 4 0% P < 0.05. Los
valores estn expresados como la media sem para n=6 ratas en cada
grupo. En figura D valores individuales para n=9-12 ratas en cada grupo;
animales recibiendo infusin continua de rhIGF-I (cuadrados abiertos) o
vehculo (rombos negros).
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Figura 5
Efecto del consumo de protena variable (0 - 20%) durante 12 das en ratas
normales con infusin continua de rhIGF-I (barras negras) y de vehculo
(barras abiertas) sobre los niveles circulantes de IGFBP-3. Las protenas del
suero fueron separadas por electroforesis PAGE-SDS 4-20%, transferidas a
nitrocelulosa 0.22 m, incubadas con 125I-IGF-I y expuestas a pelcula MS
Kodak. La cuantificacin se hizo por exposicin de las membranas a
pelculas del PhosphoImager. Los valores estn expresados como la media
sem para n=6 ratas en cada grupo. a rhIGF-I vs. control alimentados con la
misma dieta P < 0.01; b Control alimentado 20% vs. Control alimentado dieta
12, 4 0% P < 0.01; c rhIGF-I alimentado 20% vs. rhIGF-I alimentado 12,
4 0%. P < 0.01.
62
Tabla 2
Distribucin de linfocitos en el bazo de ratas normales
% protena
En dieta
% linfocitos T CD4+
% linfocitos B
Vehculo
rhIGF-I
*P
valor
Vehculo
rhIGF-I
*P
valor
% linfocitos T CD8+
Vehculo
rhIGF-I
*P
valor
42.5 2
39.1 0.9 34.6 2 NS 29.5 1.3 30.8 1.9 NS 17.3 0.9 19.3 1.3 N S
12
34.3 3.6 29 1.7 NS 26.7 1.7 28.8 1.4 NS 15.7 0.8 15.8 1.3 NS
20
34.7 2.3 33.7 3 NS 28.5 1.4 27.5 2.3 NS 16.5 1.1 19.2 2
NS
Los datos estn expresados como la media sem para n= 6 ratas en cada grupo. NS: no significante.
63
Figura 6
Efecto del contenido de protena ingerida en la dieta sobre la expresin de las
protenas de unin al IGF, IGFBP-2 (A) y IGFBP-3 (B), IGFBP-4 (C), IGFBP-6 (D)
en ratas normales con administracin continua de rhIGF-I (barras negras) o
vehculo (barras abiertas) durante 7 das. Los valores estn expresados como
la media sem para n=6 ratas en cada grupo a Vehculo vs. rhIGF-I con la
misma dieta, P < 0.01; b Vehculo alimentado 20% vs. Vehculo alimentado 12,
4 0% protena, P < 0.01; c rhIGF-I alimentado 20% vs. rhIGF-I alimentado 12,
4 0% protena, P < 0.001.
64
Figura 7
Efecto del contenido de protena ingerida en la dieta sobre la expresin del
receptor para hormona de crecimiento (GHR) en bazo de ratas normales
con administracin continua de rhIGF-I (barras negras) o vehculo (barras
abiertas) durante 7 das. Porcentaje de linfocitos B GHR+ determinados por
citometra de flujo (A) y niveles de mRNA para el GHR determinados por
ensayo de proteccin de RNAsas(B). a Vehculo vs. rhIGF-I con la misma
dieta, P < 0.01; b Vehculo alimentado 20% vs. Vehculo alimentado 12, 4
0% protena, P < 0.01; c rhIGF-I alimentado 20% vs. rhIGF-I alimentado 12,
4 0% protena, P < 0.001.
Figura 8
Efecto del contenido de protena ingerida en la dieta sobre la expresin del
receptor para IGF-I (IGF-IR) en bazo de ratas normales con administracin
continua de rhIGF-I (barras negras) o vehculo (barras abiertas) durante 7
das. Porcentaje de linfocitos B GHR+ determinados por citometra de flujo
(A) y niveles de mRNA para el GHR determinados por ensayo de proteccin
de RNAsas (B). Los valores estn expresados como la media sem para
n=6 ratas en cada grupo. a Vehculo vs. rhIGF-I con la misma dieta, P < 0.01;
b
Vehculo alimentado 20% vs. Vehculo alimentado 12-, 4- 0% protena,
P < 0.01; c rhIGF-I alimentado 20% vs. rhIGF-I alimentado 12-, 4- o 0%
protena, P < 0.001.
65
Discusin
La hormona de crecimiento (GH) y el
IGF-I estimulan el crecimiento somtico,
el desarrollo y regulan varias funciones
fisiolgicas. Se conocen acciones directas e indirectas de la GH en el crecimiento y el metabolismo. Los efectos directos
son mediados por el receptor de la GH
(GHR) y se cree que son independientes
del IGF-I. Las acciones indirectas de la
GH son mediadas por la sntesis de IGF-I
inducida por la GH, el cual es producido
principalmente en el hgado (75%) y muchos otros tejidos (7). El IGF-I y la GH tanto en circulacin como localmente,
podran estar regulando los efectos del
IGF-I sobre el crecimiento, desarrollo y
metabolismo. Algunos estudios de proliferacin y diferenciacin in vivo han mostrado que la GH y el IGF-I tienen efectos
sobre clulas del sistema inmune (8, 9).
Estudios in vitro igualmente han demostrado el efecto de estas hormonas sobre
la proliferacin y diferenciacin de clulas de origen linfoide, dando relevancia
al papel que desempea el eje local GH/
IGF-I (12, 13). Los estudios originales con
ratones knockout confirmaron que el
desarrollo de la gran mayora de los tejidos, sino todos, era regulado en alguna
medida por el sistema IGF- I (14).
En esta investigacin el concepto de
malnutricin protenica se refiere a la condicin nutricional cuando el animal consume dieta con contenido de protena del
4 0%. Esta condicin conlleva a una detencin o disminucin del crecimiento corporal, disminucin aguda en niveles
circulantes de IGF-I, insulina, y protena de
unin 3 al IGF-I.
Influencia de la cantidad de protena dietaria sobre los niveles circulantes
de GH e IGF-I
Se conoce que dos neuropptidos de
origen hipotalmico, la hormona libera-
66
Uno de los objetivos de esta investigacin fue estudiar los efectos de los niveles circulantes de IGF-I y GH sobre el
bazo durante la malnutricin proteica. En
las ratas que recibieron infusin continua
de rhIGF-I, el bazo aument de tamao
consistentemente en los cuatro grupos
dietarios. Este hecho sugiere que el IGF-I
circulante y la protena dietaria son factores importantes para este efecto. En la
medida que los niveles sricos de IGF-I
disminuyeron con la reduccin en el contenido de protena dietaria, el peso de este
tejido tambin disminuy; lo cual es una
evidencia adicional del efecto directo del
IGF-I circulante sobre el tamao del bazo.
La distribucin relativa de linfocitos en
el bazo fue afectada por la restriccin de
protena. En la rata la restriccin de protena durante 12 das aument el porcentaje de linfocitos B; la infusin
continua de rhIGF-I durante 7 das no
mostr un efecto significativo sobre estos valores. El hecho de no haber encontrado cambios en la poblacin relativa de
linfocitos en animales alimentados con
dietas de 4, 12 y 20% de protena sugiere que un nivel de 4% de protena es la
concentracin crtica para mantener el
equilibrio en un organismo. Podra considerarse que los cambios observados en
los animales con dieta 0% corresponden
a mecanismos regulatorios para mantener el equilibrio homeosttico del organismo en condiciones de restriccin de
protena dietaria; lo que estara de acuerdo con la hiptesis planteada recientemente por Dorshkind y Horseman (26) para
explicar el mecanismo modulador de estas hormonas en el sistema inmune.
Estos fenmenos pueden estar asociados con cambios en algunos elementos
del eje GH/IGF-I tanto a nivel de circulacin como locales. Para indagar este mecanismo se analiz la expresin de genes
tales como el GHR, IGF-IR, IGF-I, e
IGFBPs en el bazo. En las ratas alimenta-
67
68
Los altos niveles circulantes de IGFBP1 e IGFBP-3 incrementan la vida media del IGF-I.
Referencias
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
69
70
receptor expresion in the rat splenic Blymphocytes. Biomedica 2004; 24: 403-412.