Microbiologia

Departamento de Zoologia da Universidade de Coimbra

MICROBIOLOGIA
Antnio Verissimo
Paula Morais

Alguns testes para identificao de enterobactrias

A famlia Enterobacteriaceae inclui bactrias Gram (-), facultativas que em
condies anaerbias fermentam hidratos de carbono, formando vrios tipos de
produtos finais.
Consoante a natureza desses produtos finais do metabolismo fermentativo
reconhecem-se dois subgrupos de enterobactrias:
1- Enterobactrias que fermentam a cidos mistos.
2- Enterobactrias que fermentam a butanodiol.
Testes IMViC
Os testes designados por IMViC (Indol, vermelho de Metil, Voges-Proskauer e
Citrato) constituem uma bateria de quatro testes bioqumicos fundamentais para
diferenciar enterobactrias.
1- Teste de produo de Indol
Este teste permite qualificar este tipo de bactrias segundo a sua capacidade de
utilizar o aminocido triptofano como fonte de carbono e, ou energia.
Algumas enterobactrias possuem uma enzima chamada triptofanase que cataliza
a remoo do grupo indlico do triptofano. Assim enquanto indol acumula no meio
de cultura, como desperdcio, o resto da molcula de triptofano transformado a
piruvato e usado para satisfazer as necessidades nutricionais da bactria.
A produo de indol, a partir de triptofano, pode ento ser detectada cultivando
os microrganismos num meio rico no aminocido; triptona (digerido pancretico de
casena) constituda por inmeros polipeptideos que contm muitos resduos de
triptofano. A acumulao de indol no meio pode ser depois detectada adicionando
reagente de Kovac, que reagindo com o indol forma na superfcie do meio um
composto vermelho, no solvel em gua.

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Procedimento
- Com uma ana estril, inocular cada uma das enterobactrias em meio de
triptona 1,5%.
- Incubar as culturas a 37 C, durante 48 h.
- Adicionar 0,5 ml de reagente de Kovac ao meio de cultura.
- Agitar suavemente.
Resultado positivo (presena de indol) - composto vermelho / violeta
Resultado negativo (ausncia de indol) - reagente de Kovac no altera a sua cor.
1.a. Reagente de Kovac
p-dimetilaminobenzaldado
butanol
HCl concentrado

3.0 g
75 ml
25 ml

2. Teste do Vermelho de Metil

Este teste usado para detectar as enterobactrias que utilizam a fermentao a
cidos mistos. Como se referiu, algumas enterobactrias fermentam glucose (ou
outros hidratos de carbono) produzindo grandes quantidades de cidos, que baixam
o pH do meio de cultivo para alm de 5. A adio do indicador - vermelho de metil
permite detectar esse abaixamento do pH. O vermelho de metil vermelho quando
o pH inferior a 5,5; apresenta cor amarela se o pH for superior a 6.
Bactrias fermentadoras a cidos mistos podem ento ser detectadas se forem
cultivadas num meio pouco tamponizado, com glucose e, se depois de um
conveniente perodo de incubao se adicionar vermelho de metil ao meio de
cultivo.

Procedimento
- Com uma ana estril, inocular cada uma das enterobactrias em meio MR-VP (
Metyl Red- Voges Proskauer).
- Incubar as culturas a 37 C, durante 48 h.
- Retirar cuidadosamente 1 ml da cultura para um tubo de ensaio.1
- Adicionar, restante cultura, 5 gotas da soluo de vermelho de metil.
- Agitar muito suavemente.
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nesta poro da cultura que se realizar o teste de Voges-Proskauer. Por isso deve assegurar-se
que realizou este passo antes de prosseguir com a realizao do teste do vermelho de metil.
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Resultado positivo - desenvolvimento de cor vermelha (no laranja)

imediatamente a seguir adio do reagente.
Resultado negativo - a cultura adquire cor amarela ou laranja.

2.a. Meio MR-VP

peptona tamponizada
K2HPO4
glucose

7,0 g
5,0 g
5,0 g
por litro

2.b. Soluo de vermelho de metil

vermelho de metil
etanol 95%
H2O

0,1 g
300 ml
500 ml

3. Teste de Voges-Proskauer
Este teste permite identificar as enterobactrias que utilizam a fermentao a
butanodiol. Neste caso o principal produto acumulado o 2,3 butanodiol; no
entanto, o teste detecta a presena de acetona (intermedirio metablico na sntese
de butanodiol) no meio de cultivo.
A acetona (acetilmetilcarbinol) na presena de KOH forma uma soluo cor de
rosa; a adio de a-naftol acelera esta reaco. Uma vez que, em presena de
oxignio, 2,3 butanodiol retro-oxidado a acetona, a intensidade da reaco
aumentada pelo arejamento da soluo.

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Procedimento
- Adicionar a cada um dos tubos com 1 ml (retirados em 2.) 0.6 ml de
a-naftol a 5% em etanol absoluto.
- Agitar cuidadosamente.
- Adicionar 0.2 ml de uma soluo aquosa de KOH a 40%.
- Agitar cuidadosamente de forma a arejar a cultura.
- Incubar os tubos por um perodo de 15 a 60 min. Os tubos devem ser
incubados inclinados para aumentar a superfcie do meio exposta ao ar (a reao
dependente de O2).
Resultado positivo- O resultado positivo se for detectada a presena de
acetona no meio. Neste caso, desenvolve-se uma cor vermelha na
superfcie da cultura.
Resultado negativo- A cultura mantm uma cor homognea castanha.

4. Teste de Citrato
Este teste permite determinar a capacidade das enterobactrias em utilizar citrato
como fonte de carbono e energia, quando so cultivadas em condies aerbias.
O meio de Citrato de Simmons contm citrato como nica fonte de carbono e
amnia como fonte de azoto. Ao utilizar o citrato, o microorganismo remove o
citrato do meio levando acumulao de sdio e de alguma maneira deslocao
do pH, basificando o meio de cultivo. Este facto pode ser facilmente visualizado pela
viragem de cor do indicador (bromotimol azul) presente no meio de cultivo.

Procedimento
- Com uma ana estril, inocular cada uma das enterobactrias em meio de Agar
de Simmons.
- Incubar as culturas a 37 C, durante 48 h.
Resultado positivo - meio de cultura apresenta cor azul.
Resultado negativo - meio de cultura apresenta cor verde (cor inicial).
4.a. Agar de Simmons
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citrato de sdio
NH4H2PO4
NaCl
MgSO4
K2HPO4
bromotimol azul
agar

2.0 g
1,0 g
5,0 g
0,2 g
1,0 g
0,08 g
15,0 g
por litro

Sistema de identificao rpido

Em caso de doena (e no s) , por vezes, necessria a identificao rpida de
um determinado microrganismo.
A identificao de uma bactria envolve a utilizao de uma srie de meios
selectivos ou diferenciativos, com perodos de incubao entre 24 e 96 horas. H,
ainda, a somar a este perodo o tempo de preparao e feitura de meios.
Para resolver estes problemas e acelerar a identificao de um microrganismo,
utilizam-se sistemas multiteste miniaturizados. Existem vrios destes sistemas venda
no mercado. So constitudos por tubos ou tiras de plstico com compartimentos
que contm vrios tipos de meios de cultura. Permitem, assim, a realizao
simultnea de uma srie de testes com a consequente caracterizao da bactria.
Estes sistemas esto optimizados para fornecer bactria condies optimas de
modo a que o resultado seja rpido e seguro. A maioria dos fabricantes destes
sistemas fornecem um modo de identificao automtico.
Vai ser utilizado o sistema API tipo 20E concebido para identificao de
Enterobacteriaceas (e outras bactrias Gram-negativas, isoladas de espcimes
clnicos), desenvolvido e manufacturado por Analytab Products, Inc.
O sistema composto por 20 cmaras cada uma constituda por um tubo com
cpula. Cada tubo contm um meio desidratado de cultura diferente especfico para
cada teste. A galeria inoculada (e os meios re-hidratados) com uma suspenso em
salina da bactria que se pretende identificar. O sistema, aps inoculao, incubado
a 35 C e lido 18 a 24 horas depois.
A identificao feita aps determinao do perfil. O perfil um nmero com 7
dgitos (cada digito corresponde a um clculo do resultado de 3 testes) que
descodificado no Index de Perfis fornece a identificao da bactria.

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Procedimento
1- Utilize uma cultura, em meio slido, da bactria que quer identificar. A cultura
deve estar pura, com colnias bem isoladas e no ter mais de 24 horas de incubao.
2- Faa uma colorao de Gram utilizando parte (1/3) de uma colnia bem
isolada.
3- Faa o teste da oxidase utilizando mais um pouco da colnia. Para tal, coloque
2 gotas de uma soluo de N,N,N',N'-tetrametil-p-fenildiamina (TMPD) a
1%(mantida no escuro) num papel de filtro; retire um pouco da colnia com um
palito estril e esfregue no papel de filtro. O teste positivo se houver
desenvolvimento rpido (at 10s) de uma cor azul.
4- Prepare a suspenso da bactria para inocular a galeria:
- retire, com uma ana estril, um pouco da colnia escolhida e
resuspende-a num tubo com 5 ml de salina (0,9% NaCl).
A suspenso deve ficar ligeiramente turva.
5- Prepare a galeria:
- Coloque no fundo da caixa de incubao, 5 ml de gua
desmineralizada (para humidificar o ambiente) e tape.
- Retire a galeria, de uma forma assptica, e coloque-a dentro da caixa
de incubao.
6- Inocule a galeria:
- Abra a caixa e incline ligeiramente a galeria.
- Utilizando uma pipeta de pasteur, encha com a suspenso os tubos e
as cpulas das cmaras assinaladas. Deve encher devagar sem tocar com a
pipeta na cpula e deitando a gota de lado para evitar a formao de bolhas de ar no
fundo dos tubos.
Encha s o tubo das outras cmaras.
Encha, com parafina estril, as cpulas das cmaras com o nome
sublinhado.
- Tape a caixa de incubao com cuidado e ponha a incubar a 35C
por um perodo de 24 horas.
7- A partir da suspenso de inculo da galeria e aps inculao desta, retire uma
gota e espalhe numa caixa de Petri para verificar a pureza da suspenso. Incube a
35C, 24 horas.

8- Para ler a galeria:

- Leia e tome nota dos resultados de todos os testes que no requeiram
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a adio de reagentes. Utilize, para tal, a tabela que lhe foi fornecida. Os
resultados devem ser registados na folha prpria fornecida.
O teste da glucose deve ser positivo para que a bactria seja considerada
uma Enterobacteriacea.
- Para ler os testes que requerem a adio de reagentes:
- adicionar uma gota de 10% FeCl3 ao teste TDA
O desenvolvimento de uma cor castanha avermelhada considerada
uma reaco positiva.
- A leitura do teste VP necessita da adio cmara de uma gota
de KOH a 40% e uma gota de 5% a-naftol. Uma mudana de cor para
o vermelho indica uma reaco positiva.
- A leitura do teste do indol feita aps adio de uma gota do
reagente de Kovac cmara IND. A formao de um anel vermelho
indica uma reaco positiva.
- O teste da reduo de nitrato feito na cmara GLU. Adicionar
2 gotas de cido sulfanilico (0.8%) e 2 gotas de N,N,-dimetil-a-naftilamina
(0.5%). O teste positivo se houver desenvolvimento de uma cor vermelha ou
produo de bolhas de gs.
- Faa o teste da catalase adicionando uma gota de 1.5% H2O2
cmara MAN. A formao de bolhas de gs indica uma reaco
positiva.
9- Para determinar o perfil da bactria:
- Dar o valor correspondente a cada teste.
- Somar, dentro de cada quadrado, o valor dos testes positivos
obtendo, desta forma, um novo nmero com 7 dgitos.
- Procurar no Index de Perfis o perfil obtido e identificar a bactria.