UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CENTRO-OESTE

SETOR DE CINCIAS AGRRIAS E AMBIENTAIS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
DANIELLY DE CASTRO SCHUPCHEK
FELIPE M. BUCO
SAULO BALLS
SHARONN M. HARTMANN

AULA PRTICA N 5
ESPECTROFOTOMETRIA

Relatrio apresentado como requisito para

obteno de nota parcial, na disciplina de
Bioqumica do curso de Cincias Biolgicas da
Universidade

Estadual

do

Centro-Oeste

UNICENTRO.
Professora: Franciely Grose Colodi

GUARAPUAVA
2012

SUMRIO

1. INTRODUO........................................................................................................................03
2. OBJETIVOS.............................................................................................................................04
2.1 OBJETIVOS GERAIS...........................................................................................................04
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS...............................................................................................04
3. MATERIAIS E MTODOS....................................................................................................04
3.1 REAGENTES.........................................................................................................................04
3.2 PROCEDIMENTOS..............................................................................................................04
4. RESULTADOS E DISCUSSO.............................................................................................06
4.1 CURVA DE ABSORO.................................................................................................... 06
4.2 CURVA DE REFERNCIA OU CURVA DE CALIBRAO....................................... 07
4.3 DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS NA AMOSTRA
PROBLEMA.................................................................................................................................07
5. CONCLUSO..........................................................................................................................09
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...................................................................................10
7. APNDICE...............................................................................................................................11

1. INTRODUO
O termo medida fotomtrica foi definido originalmente como o ato de medir a
intensidade da luz, independente do comprimento de onda (energia). Neste tipo de medida
utilizada a espectrofotometria que se baseia na absoro da radiao nos comprimentos de onda
entre o ultravioleta e o infravermelho. O aparelho espectrofotmetro faz passar um feixe de luz
monocromtica atravs de uma soluo, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa
soluo. Um prisma contido no aparelho separa a luzem feixes com diferentes comprimentos de
onda. Assim possvel passar um feixe de luz monocromtica atravs da amostra. O equipamento
permite saber que quantidade de luz absorvida a cada comprimento de onda.
O conjunto das absorbncias aos vrios comprimentos de onda para um composto
chama-se espectro de absoro e varia de substncia para substncia. Como diferentes
substncias tm diferentes padres de absoro, a espectrofotometria permite identificar e
quantificar substncias com base no seu espectro. A quantificao realizada com a relao entre
quantidade de luz absorvida e concentrao da substncia. A absoro da luz tanto maior quanto
mais concentrada for a soluo por ela atravessada e quanto maior for a distncia percorrida pelo
feixe luminoso atravs da amostra. Esses princpios formam a Lei de Lambert Beer
Para

determinao

da

concentrao

de

um

soluto

em

uma

amostra

por

espectrofotometria, temos a comparao da absorbncia da amostra com uma soluo padro, na

qual j conhecida a concentrao do soluto. Em geral, utilizada uma soluo-padro com
diferentes concentraes (padres de referncia), que tem sua absorbncia determinada. Esses
padres so preparados diluindo-se a soluo-padro na proporo necessria para a obteno das
concentraes desejadas.
Com os valores de absorbncia e de concentrao conhecidos, pode-se traar um grfico
cujo perfil conhecido como curva-padro ou curva analtica. Nesse grfico, a reta indica a
proporcionalidade entre o aumento da concentrao e da absorbncia e a poro linear
correspondente ao limite de sensibilidade do mtodo espectrofotomtrico para o soluto em
questo.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Abordar a espectrofotometria como mtodo analtico na determinao da concentrao.
2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Determinar a curva de absoro do Reagente de Biureto em presena da protena

albumina;

Elaborar uma curva de calibrao para dosagem de protenas pelo mtodo do

Determinar a concentrao de protena em uma amostra-problema;

Exercitar a prtica de diluio na determinao da concentrao,

Montar a curva de referncia com auxlio do programa EXCEL no computador.

Biureto;

3 MATERIAIS E MTODOS
3.1 REAGENTES
Foram utilizados como reagentes: soluo padro de protena (albumina) 5 mg/mL,
amostra problema de concentrao desconhecida e reagente de Biureto.
3.2 PROCEDIMENTOS
Utilizamos seis tubos de ensaio que foram numerados de 1 a 6 para realizar o
experimento.
Cada tubo foi preparado da seguinte forma:
1 Tubo: (branco) 1,0 ml de gua destilada e 5,0 ml de reagente de biureto;
2 Tubo: 0,2 ml de soluo padro de protena (5mg/mL), 0,8 ml de gua destilada e 5,0
ml de reagente de biureto;

3 Tubo: 0,4 ml de soluo padro de protena (5mg/mL), 0,8 ml de gua destilada e 5,0
ml de reagente de biureto;
4 Tubo: 0,6 ml de soluo padro de protena (5mg/mL), 0,4 ml de gua destilada e 5,0
ml de reagente de biureto;
5 Tubo: 0,8 ml de soluo padro de protena (5mg/mL), 0,2 ml de gua destilada e 5,0
ml de reagente de biureto,
6 Tubo: 1,0 ml de soluo padro de protena (5mg/mL) e 5,0 ml de reagente de
biureto.
Logo aps todos os tubos estarem prontos, foram agitados e deixados de repouso por 10
minutos.
Depois de passado o tempo de repouso, calculou-se a concentrao final de cada um,
usando a formula C1 . V1 = C2 . V2, e anotamos os resultados na tabela abaixo:
TUBOS

CALCULO

CONCENTRAO

BRANCO

2
5 . 0,2 =
C2.1
1mg/ml

3
5 . 0,4 =
C2 . 1
2mg/ml

4
5 . 0,6 =
C2 . 1
3mg/ml

5
5 . 0,8 =
C2 . 1
4mg/ml

6
5 . 1,0 =
C2 . 1
5mg/ml

Ento, dando continuidade ao experimento, utilizou-se o espectrofotmetro para

determinar a curva de absoro do Reagente de Biureto em presena da protena albumina,
utilizando os tubos 1 e 6 do experimento montado, para determinar:
a)

Curva de absoro de protena com Reagente de Biureto;

b)

Curva de referncia para determinar a concentrao de uma amostra-problema,

c)

Concentrao de protenas na amostra-problema.

4. RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 CURVA DE ABSORO

Para determinar a curva de absoro, foi ligado o espectrofotmetro e colocado o
contedo dos tubos 1 e 6 em duas cubetas diferentes que foram inseridas ambas no interior do
equipamento.
O tubo 1 (branco) foi usado para calibrar/zerar o equipamento nos diferentes
comprimentos de onda () a serem analisados antes da leitura de absorbncia do tubo 6.
Verificou-se a absorbncia da soluo do tubo 6 em diferentes no espectrofotmetro,
anotando os valores de absorbncia para cada comprimento de onda utilizado na tabela abaixo:

1
2
3
4

(nm)
460
480
500
520

Absorbncia
0.107
0.142

5
6
7
8

(nm)
540
560
580
600

Absorbncia
0.156
0.154
0.142

De acordo com os resultados da tabela acima, foi montado um grfico correlacionando

comprimento de onda com absorbncia do tubo 6, e de acordo com o grfico, o
apresentou o ponto Maximo de absorbncia:

4.2 CURVA DE REFERNCIA OU CURVA DE CALIBRAO

tubo 5

Para calibrar/zerar o espectrofotmetro foi utilizado o tudo 1: 0 de absorbncia no

comprimento de onda que apresentou maior absorbncia conforme a curva de absoro.
Anotamos a absorbncia das solues dos tubos 2 a 6 na tabela abaixo:
TUBOS
ABSORBNCIA

1
Branco

2
0.030

3
0.059

4
0.092

5
0.120

6
0.156

4.3 DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS NA AMOSTRA

PROBLEMA
Foram separados dois tubos de ensaio e identificados como tubo A (amostra-problema) e
tubo B (amostra-problema diluda), e adicionaram-se os reagentes conforme tabela abaixo:
Reagentes (ml)
Amostra problema
gua destilada
Reagente de Biureto

Tubos
A
1,0
5,0

B*
0,5
0,5
5,0

Depois de preparados, os tubos foram deixados em repouso por 10 minutos.

Utilizau-se o tubo 1 para calibrar o espectrofotmetro: 0 de absorbncia no comprimento
de onda que apresentou maior absorbncia conforme a curva de absoro
Tubos
Absorbncia

A
0,080

B*
0,047

(*Fator de diluio da amostra = ___2_______)

Resultado do volume total dividido pela amostra que foi colocada. Fator de diluio
quantas vezes a amostra cabe no volume total aps a diluio.

Conforme os valores obtidos na curva de calibrao, a concentrao de protenas

(mg/mL) presente nas amostras problema utilizando regra de trs. Utilizamos como referencia
qualquer um dos valores obtidos na curva de calibrao:
Amostra problema absorbncia: 0, 047 concentrao: x
Tubo 2 absorbncia: 0,03 concentrao 1mg/ml
0, 047 -------------------x

0,03x= 0,047

0,03---------------------1

x= 0,047 / 0,03

x=1,57mg/ml.

Utilizando o programa EXCEL, encontramos a equao da reta referente a curva de

calibrao conforme grfico abaixo:

Finalmente, para calcular a concentrao de protenas (mg/mL) presente nas amostras

problema utilizando a equao da reta obtida com a curva de calibrao, obteve-se os seguintes
resultados:
Y= a.x + b (exclumos b porque passa no 0)
Tubo A: Abs = 0,03 . conc

0,08/0,03 = conc. Conc. = 2,7 mg/ml concentrao

original.
Tubo B: Abs = 0,03 . conc
diluda.

0,047/0,03 = conc.

Conc. = 1,6 mg/ml amostra

5 CONCLUSO
Com o experimento pudemos abordar a espectrofotometria para determinar as
concentraes de algumas amostras e a concentrao de protena na amostra problema,
conseguimos determinar a curva de absoro para o reagente de biureto em presena da protena
albumina. Tambm pudemos aplicar conhecimentos do programa EXCEL, elaborando a curva
de calibrao para dosagem de protena e montamos a curva de referencia agregando novos
conhecimentos ao experimento.
Ento conclumos que os objetivos do experimento foram alcanados com xito.

10

6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Universidade federal do rio grande do sul. Espectrofotometria. Disponvel em: <
http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/espectrodeantipiril.html>. Acesso em 28 de agosto de 2012.
NELSON, D.L.; COX, M.M. Lehninger: Principles of Biochemstry. 3ed. New York: Worth
Publishers, 2000. 1152p.

11

7. APNDICE
1.

Qual a finalidade e o fundamento da tcnica espectrofotomtrica?

A espectrofotometria o mtodo de anlises ptico mais usado nas investigaes

biolgicas e fisico-qumicas. O espectrofotmetro um instrumento que permite comparar a
radiao absorvida ou transmitida por uma soluo que contm uma quantidade desconhecida de
soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substncia.
Todas as substncias podem absorver energia radiante, mesmo o vidro que parece
completamente transparente absorve comprimentos de ondas que pertencem ao espectro visvel.
A gua absorve fortemente na regio do infravermelho.
A absoro das radiaes ultravioletas, visveis e infravermelhas dependem das
estruturas das molculas, e caracterstica para cada substncia qumica.
Quando a luz atravessa uma substncia, parte da energia absorvida (absorbncia): a
energia radiante no pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida.
A cor das substncias se deve a absoro (transmitncia) de certos comprimentos de
ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles
comprimentos de ondas no absorvidos.
2.

O que significa a linearidade dos mtodos colorimtricos e como ela

determinada?
Linearidade corresponde capacidade do mtodo de fornecer resultados diretamente
proporcionais concentrao da substncia em exame (analito).
3.

Que critrio deve ser usado para selecionar determinado comprimento de onda

para uma tcnica colorimtrica?

Deve-se levar em conta a relao entre quantidade de luz absorvida e concentrao da
substncia. A absoro da luz tanto maior quanto mais concentrada for a soluo por ela
atravessada e quanto maior for a distncia percorrida pelo feixe luminoso atravs da amostra.

12

4.

Qual o contedo e a finalidade do tubo branco?

O tubo 1 (branco) foi usado para calibrar/zerar o equipamento nos diferentes

comprimentos de onda () a serem analisados antes da leitura de absorbncia dos outros tubos. O
tubo branco foi preparado com 1,0 ml de gua destilada e 5,0 ml de reagente de biureto.
5.

De acordo com as Leis de Lambert-Beer, se um determinado composto apresenta

um mximo de absoro em 545nm e para uma concentrao de 3mg/mL foi obtida uma
absorbncia de 0,22, calcule a concentrao deste composto correspondente a uma absorbncia
de 0,15, sabendo-se que a linearidade do mtodo utilizado de 0,5 a 5mg/mL.
0,22-------------------------3
0,15-------------------------x

0,22x=0,45

x=0,45/0,22

x= 2,41