Algunos reactivos de este kit contienen productos de origen humano y/o animal.

Cuando se
ha utilizado plasma humano en la preparacin de estos reactivos, se excluye previamente la
presencia del antgeno HBs, de los anticuerpos anti-HCV, anti-HIV 1 y anti-HIV 2 con los
correspondientes anlisis.Sin embargo, ningn test puede garantizar de manera absoluta la
ausencia de agentes infecciosos. Por eso, estos reactivos de origen biolgico han de ser
manipulados con las precauciones habituales, ya que se trata de productos potencialmente
infecciosos.

ASSERACHROM PAI-1
Dosificacin inmuno-enzimtica del inhibidor-1
del activador del plasmingeno (PAI-1)

Contenido del kit de 96 determinaciones:

3 x 2 tiras de Reactivo 1 (Coated Strip)
3 viales de Reactivo 2 (Anti-PAI-1-Peroxidase)
3 viales de Reactivo 3 (TMB)
3 viales de Reactivo 4 (Dilution Buffer)
1 viale de Reactivo 5 (Washing Solution)
3 viales de Reactivo 6 (PAI-1 Calibrator)
3 viales de Reactivo 7 (PAI-1 Control)
1 soporte de tiras
1 tapa para la placa
(REF 00949)
Marzo 2015

5/ PRECAUCIONES
El estuche intacto se debe conservar a 2-8 C. Slo para uso diagnstico
in vitro. Estos reactivos slo deben ser utilizados por personal autorizado
del laboratorio. Utilizar nicamente reactivos de un mismo kit o de un
mismo lote.
Tener cuidado en el manejo de estos reactivos y las muestras. Los
residuos se eliminarn con arreglo a la reglamentacin local vigente.
IVD
Espaol 5

1/ UTILIZACIN DEL KIT

Determinacin antignica cuantitativa del inhibidor-1 del activador del
plasmingeno (PAI-1) mediante el mtodo ELISA (2).

2/ SUMARIO

Bioqumica del PAI-1

El inhibidor-1 del activador del plasmingeno es sintetizado, entre otros,
por las clulas endoteliales y los hepatocitos; tambin es liberado por las
plaquetas (7, 2). El PAI-1 es una glicoprotena de cadena sencilla, con
un peso molecular en torno a 50 000 daltons, que migra con las
-globulinas. Existe en forma activa o latente, combinado o no con el
activador tisular del plasmingeno (tPA). La vitronectina se liga al PAI-1
de origen plasmtico o plaquetario y lo estabiliza. El centro activo se
sita en la parte carboxi-terminal de la molcula.
El PAI-1 tiene una funcin importante en la regulacin de la fibrinlisis.
Forma junto con el tPA o la uroquinasa un complejo estoquiomtrico
reversible y despus irreversible (7, 9).
La regulacin del PAI-1 depende de dos grupos de sustancias (5):
las que actan sobre la clula endotelial modificando la tasa de
sntesis del PAI-1 (la trombina, la interleuquina 1, algunas endotoxinas
y factores de crecimiento aumentaran la sntesis del PAI-1);
las que actan directamente sobre la actividad del PAI-1 (protena C
activada).
Variaciones patolgicas
Se ha observado un aumento de la tasa del PAI-1 en numerosos casos
(7):
trombosis (4),
cnceres,
afecciones hepticas,
periodo postoperatorio,
shock sptico.
Adems, existe una relacin entre la tasa de PAI-1 y ciertos factores de
riesgo de arteriosclerosis, como la obesidad, la hiperinsulinemia y la
hipertrigliceridemia (7).
Se han descrito casos infrecuentes de deficiencia de PAI-1, asociados a
manifestaciones hemorrgicas (7).

3/ PRINCIPIO DEL TEST

Un soporte de plstico recubierto con anticuerpo monoclonal anti-PAI-1
humano (Reactivo 1) fija el PAI-1 contenido en el plasma a probar. El
PAI-1 fijado se revela con ayuda de un segundo anticuerpo monoclonal
marcado con peroxidasa (Reactivo 2), que se fija en un distinto
determinante antignico del PAI-1. La tasa de peroxidasa ligada se mide
por su actividad sobre el sustrato TMB (Reactivo 3). La intensidad de la
coloracin, tras detener la reaccin con un cido fuerte, es funcin de la
concentracin de PAI-1 presente inicialmente en el medio.

6/ OBTENCIN Y TRATAMIENTO DE LA MUESTRA

La obtencin de la muestra debe ajustarse a las recomendaciones para las
pruebas de hemostasia.
Un tratamiento inadecuado de la muestra sangunea puede provocar la
activacin de las plaquetas, produciendo as una liberacin del PAI-1
plaquetario (2). Por consiguiente, se pondr la mayor atencin posible en
la preparacin de la muestra.
Obtencin de la muestra
en tubo seco con una solucin de citrato trisdico 0,109 M: 1 vol. de
citrato en 9 vol. de sangre,
o, de preferencia, en tubo CTAD (6), que es un tubo especialmente
concebido para prevenir la activacin de las plaquetas.
Centrifugacin
Se cuidar al mximo la centrifugacin, de forma a limitar la alteracin
de las plaquetas, as como la cantidad de plaquetas residuales (8). As,
recoja preferiblemente el plasma de la parte superior del tubo.
Para plasma fresco, centrifugue 20 minutos a 2500 g.
Si los plasmas frescos no se emplean, antes de congelarlos,
centrifugue dos veces durante 20 minutos a 2500 g (para un total de
40 minutos) con decantacin entre las dos centrifugaciones.
Conservacin del plasma pobre en plaquetas
4 horas a 20 5 C
1 mes a 20 C. Atemperar la muestra a 37 C el tiempo necesario y
suficiente para que la descongelacin sea completa.

7/ PREPARACIN Y CONSERVACIN DE LOS REACTIVOS

Conservados a 2-8 C en su estado original, los reactivos son estables
hasta la fecha de caducidad indicada en el estuche.
Reactivo 1
Antes de abrir el envase, dejar el Reactivo 1 a temperatura ambiente
(18-25 C) durante 30 minutos; las tiras estn entonces listas para usar.
Empezar la dosificacin (ver el prrafo 9.4.) en cuanto se saquen las
tiras de su envase.
Reactivo 2
Reconstituir cada vial con 8 ml de Reactivo 4 (R4). Dejar que la solucin
se estabilice durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-25 C). A
continuacin, homogeneizar antes de usar con un agitador tipo Vortex.
Debido a las caractersticas del Reactivo 4, el Reactivo 2 es
sensibilizante tras su reconstitucin.
Estabilidad tras la reconstitucin: 4 horas a 20 5 C.
Reactivo 3
Mantener el Reactivo 3 a temperatura ambiente (18-25 C) durante
30 minutos. A continuacin, utilizar inmediatamente.
PRECAUCIONES: EVITAR CUALQUIER CONTACTO CON ELEMENTOS METLICOS O CON
AGENTES OXIDANTES.

4/ COMPOSICIN DEL KIT

Reactivo 1: tira de 16 pocillos, recubierta con fragmentos F(ab)2 de

anticuerpo monoclonal de ratn anti-PAI-1 humano.
Reactivo 2: anticuerpo monoclonal de ratn anti-PAI-1 humano ligado a
la peroxidasa, liofilizado.
Reactivo 3: vial de 8 ml de tetrametilbenzidina (TMB < 1 %), listo para
usar.
Reactivo 4: vial de 50 ml de tampn fosfato, listo para usar.
Reactivo 5: vial de 50 ml de solucin de lavado, concentrado 20 veces.
Reactivo 6: plasma humano liofilizado que contiene, despus de la
reconstitucin, una cantidad conocida de PAI-1 (ver la hoja incluida en el
kit).
Reactivo 7: plasma humano liofilizado que contiene, despus de la
reconstitucin, una cantidad conocida de PAI-1 (ver la hoja incluida en el
kit).

Reactivo 4
Mantener el Reactivo 4 (R4) a temperatura ambiente (18-25 C) durante
30 minutos antes de su utilizacin.
Estabilidad tras la apertura: 15 das a 2-8 C en ausencia de cualquier
contaminacin.
El Reactivo 4 contiene la mezcla 5-cloro-2-metil-2H-isotiazol-3-ona / 2-metil-2H-isotiazol-3ona (3:1). A la concentracin prevista (< 0,06 %), esta mezcla se clasifica como
sensibilizante.
Atencin
Puede provocar una reaccin alrgica en la piel.
Llevar guantes/prendas/gafas/mscara de proteccin.
EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con agua y jabn abundantes.

Reactivo 5
Diluir a 1/20 en agua destilada. Para dos tiras, utilizar 15 ml de
Reactivo 5 y completar hasta 300 ml con agua destilada.
Estabilidad tras la dilucin: 15 das a 2-8 C en ausencia de cualquier
contaminacin.
Si el Reactivo 5 presenta cristales, disolverlos manteniendo el vial
15 minutos a 37 C.

Reactivos 6 y 7
Reconstituir cada vial de Reactivos 6 (R6) y 7 (R7) con exactamente
0,5 ml de agua destilada. Mantener la solucin durante 30 minutos a
temperatura ambiente (18-25 C) para que se estabilice y, a
continuacin, homogeneizar antes de usar con un agitador tipo Vortex.
Estabilidad tras la reconstitucin: 4 horas a 20 5 C.

8/ REACTIVOS Y MATERIAL AUXILIARES

cido sulfrico 1 M (el cido sulfrico concentrado es aproximadamente

18 M).
Material de lavado.
Lector de placas a 450 nm.
Equipamiento habitual en los laboratorios de anlisis clnicos.

9/ PROCEDIMIENTO
9.1. Calibracin
La calibracin se efecta en tubos de plstico con el Reactivo 6.
Preparar la solucin inicial t diluyendo el Reactivo 6 a 1/10 en
Reactivo 4 (100 l de Reactivo 6 + 900 l de Reactivo 4). Esta solucin
constituye el punto ms alto de la calibracin y su valor se indica en la
hoja incluida en el kit. A partir de esta solucin inicial, preparar la
siguiente curva patrn con Reactivo 4.
Dilucin de los
diferentes puntos de la
curva
Reactivo 6 (l)

t/4

t/8

t/16

500

500

500

500

500

500

500

500

100

Solucin inicial o su
dilucin (l)
Reactivo 4 (l)

t/2

900

9.2. Plasmas a analizar

Los plasmas son diluidos en tubos de plstico a 1/10 en Reactivo 4
(100 l de plasma + 900 l de Reactivo 4) y, si es necesario, a 1/2 en
Reactivo 4 de esta dilucin a 1/10.
9.3. Control
El control de calidad se realiza con el Reactivo 7. Este reactivo se
analiza a 2 diluciones realizadas en tubos de plstico: una dilucin a
1/10 en Reactivo 4 y la dilucin a 1/2 en Reactivo 4 de esta dilucin a
1/10.
9.4. Dosificacin
Tras sacar las tiras de su embalaje, dispensar inmediatamente por
duplicado:
los calibradores as como los controles y plasmas diluidos a analizar
(en las 2 horas siguientes a su preparacin)
el Reactivo 4 (blanco reactivo).
Todos estos pipeteos sobre la placa deben efectuarse en menos de
10 minutos.

FIJACIN DEL
ANTGENO

Dispensar en el pocillo:
Muestra

200 l

Tapar los pocillos y mantener 1 hora a

temperatura ambiente (18-25 C).

Lavar 5 veces con Reactivo 5, y aadir inmediatamente:

FIJACIN DEL
INMUNOCONJUGADO

Reactivo 2

200 l

Tapar los pocillos y mantener 1 hora a

temperatura ambiente (18-25 C).
Lavar 5 veces con Reactivo 5, y aadir inmediatamente poniendo en
marcha un cronmetro:

COLORACIN

200 l
TMB (Reactivo 3)
Esperar exactamente 5 minutos a 18-25 C para
cada muestra, y a continuacin aadir:
H2SO4 1 M

50 l

Tras dispensar el cido en todos los pocillos, agitar la placa.

15 minutos a 1 hora tras detener la reaccin, medir la absorbancia a
450 nm (ajustar el 0 con el blanco reactivo).
Comentarios
- En cada lavado, llenar los pocillos con Reactivo 5 hasta el borde y
despus vaciarlos completamente; debe respetarse escrupulosamente
el nmero de lavados.
- No dejar nunca los pocillos vacos, si es necesario llenarlos con
Reactivo 5.
- No poner las tiras bajo una luz intensa.
- La temperatura influye en la intensidad de la coloracin obtenida. La
tcnica se ha optimizado para una temperatura de 22 2 C.

10/ RESULTADOS
En papel bilogartmico, representar en abscisas el valor del PAI-1 de los
diferentes puntos de la curva patrn y en ordenadas el valor de la
absorbancia correspondiente. Trazar la curva patrn (modo no lineal) y
obtener el valor del PAI-1 de las muestras analizadas:
para la dilucin a 1/10, los valores se leen directamente sobre la curva
para la dilucin a 1/2 de la dilucin a 1/10, los valores ledos sobre la
curva se multiplican por 2.
El resultado debe interpretarse en funcin del estado clnico y biolgico del
paciente.
Comprobar que los resultados obtenidos para el Reactivo 7 se sitan en el
intervalo indicado en la hoja incluida en el kit. Si no es el caso, asegurarse
del buen funcionamiento de todo el sistema: condiciones operativas,
reactivos, calibracin, plasma a analizar, etc. Si es necesario, repetir las
muestras.

11/ LIMITACIONES
La presencia de anticuerpos anti-ratn en ciertos sujetos puede producir
resultados errneos.
Con el uso de fragmentos F(ab)2 para la sensibilizacin de las tiras se
elimina la interferencia del factor reumatoide.

12/ INTERVALO DE REFERENCIA

La tasa de PAI-1 del plasma exento de plaquetas est comprendida, en
adultos, entre 4 y 43 ng/ml (2). Sin embargo, cada laboratorio debera
establecer sus propios valores normales.
La tasa de PAI-1 vara segn el nictmero, observndose las tasas ms
elevadas por la maana (3).
La tasa de PAI-1 aumenta en el transcurso del embarazo y luego
disminuye rpidamente despus del parto (1).

13/ CARACTERSTICAS DEL MTODO

Umbral de deteccin - Zona de medicin

Con el protocolo recomendado en este folleto, el umbral de deteccin es
de 1,5 ng/ml de PAI-1.
La zona de medicin se extiende de 1,5 a 130 ng/ml. Sin embargo, el
lmite superior de la zona de medicin para un lote determinado
corresponder a la tasa indicada en la hoja para el Reactivo 6.
Reproductibilidad
Se han realizado estudios de reproductibilidad con muestras normales y
anormales; los resultados obtenidos se indican en la siguiente tabla:
Reproductibilidad intra-serie

Reproductibilidad inter-serie

Muestra

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Muestra 4

_ n
X (ng/ml)
DS (ng/ml)
CV (%)

21
37,1
1,5
4,2

21
73,7
4,2
5,7

10
40,1
1,1
2,7

10
75,0
2,2
2,9

BIBLIOGRAFA
1. KRUITHOF E.K.O., TRAN-THANG C., GUDINCHET A., HAUERT J., NICOLOSO
G., GENTON C., WELTI H., BACHMANN F.: Fibrinolysis in pregnancy: a study of
plasminogen activator inhibitors. Blood, 69, 2, 460-466, 1987.
2. DECLERCK P.J., ALESSI M.C., VERSTREKEN M., KRUITHOF E.K.O., JUHANVAGUE I., COLLEN D.: Measurement of plasminogen activator inhibitor 1 in
biologic fluids with a murine monoclonal antibody-based enzyme-linked
immunosorbent assay. Blood, 71, 1, 220-225, 1988.
3. KLUFT C., JIE A.F.H., RIJKEN D.C., VERHEIJEN J.H.: Daytime fluctuations in
blood of tissue-type plasminogen activator (t-PA) and its fast-acting inhibitor
(PAI-1). Thromb. Haemostasis, 59, 2, 329-332, 1988.
4. NGUYEN G., HORELLOU M.H., KRUITHOF E.K.O., CONARD J., SAMAMA M.M.:
Residual plasminogen activator inhibitor activity after venous stasis as a criterion
for hypofibrinolysis: a study in 83 patients with confirmed deep vein thrombosis.
Blood, 72, 2, 601-605, 1988.
5. SCHLEEF R.R., LOSKUTOFF D.J.: Fibrinolytic system of vascular endothelial
cells. Haemostasis, 18, 328-341, 1988.
6. SIDELMANN J.: The influence of centrifugation load on platelet number and
PAI-1 antigen concentration in human plasma. Fibrinolysis, 8, 2, 148-149, 1994.
7. LIJNEN H.R.: Pleiotropic functions of plasminogen activator inhibitor-1.
J. Thromb. Haemostasis, 3, 35-45, 2005.
8. CLSI Document H21-A5: Collection, transport, and processing of blood
specimens for testing plasma-based coagulation assays and molecular
hemostasis assays; approved guideline. Fifth Edition, 28, 5, 2008.
9. RIJKEN D.C., LIJNEN H.R. : New insights into the molecular mechanisms of the
fibrinolytic system. J. Thromb. Haemostasis, 7, 4-13, 2009.

Los cambios significativos son indicados por las lneas punteadas en el margen.
DIAGNOSTICA STAGO S.A.S.
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