UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN DE AREQUIPA

FACULTAD DE: INGENIERIA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL : INGENIERIA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

PRACTICA N: 6
NUMERACION DE MICROORGANISMOS PSICROTROFICOS EN LA LECHE CRUDA

I.

OBJETIVOS
Conocer el mtodo de determinacin de microorganismos psicrotrficos y aplicarlo.
Determinar la cantidad de microorganismos presentes en las muestras de la leche cruda.

II.

REVISION BIBLIOGRAFICA
Los microorganismos psicrotrficos bajo este nombre genrico se agrupan todas aquellas especies con
capacidad para crecer a temperaturas de refrigeracin, comprendidas entre 4 y 20C. De forma estricta,
los microorganismos psicrtrofos presentan una temperatura ptima de desarrollo entre 10 y 20C,
aunque pueden llegar a crecer a valores inferiores a 5C. Seran, por tanto, especies tolerantes. En
oposicin, existen microorganismos que no slo toleran, sino que demandan valores trmicos en torno a
0C para mostrar un correcto grado de crecimiento. Son los denominados psicrfilos.
Especies Gram negativas
Especies Gram positivas

Achromobacter, Pseudomonas, Flavobacterium, Hafnia,

Proteus, Alcaligenes, Aeromonas, Klebsiella,
Enterobacter, Escherichia, Serratia, Acinetobacter
Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptococcus,
Staphylococcus, Micrococcus

Adems de las relacionadas en los anteriores cuadros, diferentes especies de reconocido carcter
patgeno, tales como Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes y Clostridium botulinum estn
capacitadas para desarrollase a bajas temperaturas.
De todos los tratamientos conocidos para reducir el desarrollo de microorganismos en la leche cruda el
ms utilizado es el descenso de la temperatura; sin embargo, los microorganismos psicrtrofos se han
reconocido como un problema recurrente en el almacenamiento, la refrigeracin y la distribucin de la
leche y otros productos lcteos perecederos, debido a que crecen fcilmente a bajas temperaturas.
Alrededor del ao 1960, se propuso el termino psicrtrofo para designar a aquellos microorganismos que
son capaces de crecer a temperaturas comprendidas entre los 0 y 7C, y producir colonias visibles o
turbidez, en un tiempo menor a 10 das, aunque su temperatura optima de crecimiento es mayor.
El principal representante de la flora psicrotrfica de la leche es pseudomonas fluorescens, ms del 50%
de la flora Gram negativa de la leche cruda esta representada por este gnero. Adems se ha descrito que
algunas de sus enzimas resisten temperaturas por encima de los 80C, por lo cual pueden causar
alteraciones aun en productos elaborados con leches pasteurizadas.
Aunque los microorganismos pueden ser finalmente destruidos, no sucede lo mismo con sus enzimas,
pudiendo actuar con posterioridad a los tratamientos trmicos. Esto provoca grandes problemas a la

industria lctea, en especial a aquellas dedicadas a la esterilizacion comercial de leche y productos

lcteos, ya que las enzimas resistentes al tratamiento trmico disponen de largos periodos para actuar. Por
ejemplo, las proteinasas liberadas producen alteraciones como deterioro de las casenas en la leche fresca,
problemas de gelificacin de leche larga vida, sabores amargos y disminucion del rendimiento en
productos lcteos.
Los defectos ms comnmente observados son el sabor frutas y amargo, los sabores ptridos, rancios a
papa, jabonosos y a pescado, que son asociados con protelisis y liplisis.
Los sabores amargos y ptridos usualmente se acompaan de la degradacin de la protena a pptidos y
su posterior transformacin en aminocidos; los sabores jabonosos y rancios son el resultado de la ruptura
de los lpidos en numerosos cidos grasos como butrico, caproico, caprlico, cprico y larico.
La calidad del agua en las instalaciones de ordeo y sus estrategias de uso son aspectos necesarios para
producir leche de calidad. El agua en el tambo puede ser utilizada para:
- El refrescado de la leche (75% a un 92% del consumo total del agua)
- El lavado de la maquina de ordear y del tanque de almacenamiento de leche
- La preparacin e higiene de la ubre de las vacas
- Las instalaciones
III.

PROCEDIMIENTO
III.1
Materiales
Tubos de dilucin
Medio Agar Plate Count
Pipetas estriles o pipeta automtica.
Muestras de leche
Peptona, para uso microbiolgico.
Bolsitas ziploc
Refrigeradora
III.2

EN EL LABORATORIO
III.2.1 Preparacin de la
Primero
se

sala
procede

desinfectar los mesones antes de comenzar la prctica.

Preparacin del agua peptonada

Medio usado como diluyente y para

enriquecimiento bacteriano a partir de alimentos
y otros materiales de inters sanitario.

CALCULOS

9.5g 1000ml
X240ml
X= 2.28g de Agua peptonada

Agregar los 2.28g de agua peptonada

a los 240ml de agua destilada.
Preparacin del Agar Plate Count
Para el examen bacteriolgico de comida, agua, leche
y otros productos lcteos.

22.5g 1000ml
X96ml
X= 2.16g de Agar Plate Count

CALCULOS

Se procede a tapar los matraces con las soluciones preparadas de agua de

peptona y el agar PLATE COUNT; tambin se tapa con pequeos algodones en las bocas de los
tubos de ensayo, posteriormente se envuelve con papel craft para luego llevar a la autoclave
(nuestro caso OLLA PRESION) para esterilizarlos a 121C por 15 minutos.

Esterilizacion
121C x 15

Preparacin de la muestra
MUESTRA: Leche cruda de vaca
Registro Sanitario: no tiene
Fecha de vencimiento: no tiene
Expendida al pblico.

Medir 10ml de la
Se aadi 10ml a los

muestra que es liquida.

90 ml del matraz que contena el agua

peptonada,

esterilizado.

ya

Se mezcla

uniformemente
Luego se procede a realizar las diluciones.(En este caso solo se

harn 4 diluciones)

10ml + 90ml

Se
pipeteo

a las

estriles alcuotas de 1ml a partir de la

100, 10-1,
10-2, 10-3 ,10-4.

placas
dilucin

petri
de

Agregar el agar Plate Count a cada caja petri y mezclar inmediatamente las alcuotas con el
agar mediante movimientos de vaivn y de rotacin de las placas petri.

Una vez solidificado el agar, colocar las placas dentro de la bolsita ziploc para que no
contamine la refrigeradora debido al desarrollo de los microorganismos que pasado el
tiempo va a ocurrir; luego llevar las placas a incubar en la refrigeradora a una temperatura
de 0-7C por 10 das.

Pasado
de

el

tiempo

contar separadamente colonias

microorganismos

psicrotrficos.

IV.RESULTADOS Y DISCUSIN

Factor de dilucin

N de colonias

Ufc/g de muestra

100

Nmero elevado

Nmero elevado

10-1

2020 colonias

2020 x 101 ufc/ml

10-2

237 colonias

237 x 102 ufc/ml

10-3

190 colonias

190 x 103 ufc/ml

Al
observar

los resultados: Se puede concluir que la cantidad de microorganismos presentes en cada placa es
demasiada, por lo tanto la leche tiene un tiempo de vida corto ya que estos microorganismos
producen enzimas termoestables que degradan algunos componentes de la leche deteriorando su
calidad y la de sus derivados.

 A
l observar el incremento de colonias en las dems placas se muestra la gran actividad
proteoltica sobre la fraccin de las casenas aumentando dicha actividad a medida que aumenta
el grado de contaminacin.
V.

CUESTIONARIO
1.
Haga una lista de microorganismos psicrfilos
Son los denominados psicrfilos los siguientes:
Especies Gram negativas

Especies Gram positivas

Achromobacter

Bacillus

Pseudomonas

Corynebacterium

Flavobacterium

Lactobacillus

Hafnia

Streptococcus

Proteus

Staphylococcus

Alcaligenes

Micrococcus

Aeromonas
Klebsiella
Enterobacter
Escherichia

2.

Por qu es importante la determinacin de psicrtrofos en la leche y productos lcteos?

De todos los tratamientos conocidos para reducir el desarrollo de microorganismos en la leche
cruda el ms utilizado es el descenso de la temperatura; sin embargo, los microorganismos
psicrtrofos se han reconocido como un problema recurrente en el almacenamiento, la refrigeracin
y la distribucin de la leche y otros productos lcteos perecederos, debido a que crecen fcilmente a
bajas temperaturas.
Aunque los microorganismos pueden ser finalmente destruidos, no sucede lo mismo con sus
enzimas, pudiendo actuar con posterioridad a los tratamientos trmicos. Esto provoca grandes
problemas a la industria lctea, en especial a aquellas dedicadas a la esterilizacion comercial de
leche y productos lcteos, ya que las enzimas resistentes al tratamiento trmico disponen de largos
periodos para actuar. Por ejemplo, las proteinasas liberadas producen alteraciones como deterioro
de las casenas en la leche fresca, problemas de gelificacin de leche larga vida, sabores amargos y

3.

disminucion del rendimiento en productos lcteos.

Desarrolle acerca de las caractersticas de listeria monocytogenes, que enfermedad de
transmisin alimentaria puede producir, sntomas y prevencin:

LISTERIA MONOCYTOGENES
El gnero Listeria est compuesto por bacterias gram positivas con bajo contenido G+C,
estrechamente relacionado con los gneros Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Streptococcus y
Staphylococcus.
Son bacilos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, no capsulados, catalasa positiva,
mviles entre 10 y 25C (Collins et al., 1991).
Listeria ha sido aislada de diferentes sitios ambientales, como; suelo, agua, efluentes, de una gran
variedad de alimentos y de heces humanas y animales. El habitat natural de estos microorganismos
es probablemente la materia orgnica vegetal en descomposicin y los rumiantes domsticos
contribuyen al mantenimientos de Listeria spp. en el ambiente rural a travs de un ciclo continuo de
enriquecimiento oral-fecal (Fenlon, 1999).
La amplia distribucin de L. monocytogenes se debe a la capacidad de sobrevivir durante perodos
de tiempo prolongados en diferentes medios.
El gnero Listeria comprende seis especies: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. innocua,
L. welshimeri y L. grayi. Las dos especies potencialmente patgenas son L. monocytogenes y L.
ivanovii.
L. monocytogenes no fue considerado un patgeno animal hasta fines de la dcada del 70. A
principios de los aos 80 emerge como uno de los patgenos humanos de origen alimentario ms
importante. A partir de ese momento, la literatura sobre Listeria comenz a incrementarse y a partir
de 1983 una serie de brotes epidmicos humanos en Norteamrica y Europa establecieron claramente
a la listeriosis como una grave infeccin alimentaria (Bille, 1990). Los alimentos ms
frecuentemente asociados con brotes y con alto nivel de riesgo son quesos y productos lcteos, pats
y salchichas, pescados ahumados, ensaladas y en general productos industrializados, refrigerados,
listos para el consumo, sin requerimientos de coccin o calentamiento previo (Farber and Peterkin,
1991). Los alimentos se pueden contaminar en cualquier eslabn de la cadena productiva, as como
tambin en el almacenamiento en fro.
En la actualidad, se estima que L. monocytogenes es la principal causa de muerte originada por
bacterias de origen alimentario en USA, aproximadamente se registran 2500 casos de listeriosis
humana por ao, incluyendo 500 muertes (Mead et al., 2006).
En rumiantes, la infeccin por Listeria es transmitida por consumo de silaje en mal estado, en el cual
la bacteria se multiplica rpidamente, dando lugar a brotes en ganado (Fenlon, 1999).
El genoma de L. monocytogenes fue secuenciado recientemente y posee un cromosoma circular de
2.944.528 pb con un promedio de G+C de 39%. Se han identificado 2853 genes, sin embargo al
35.3% no se les conoce funcin. En el caso de L. innocua posee un nico cromosoma circular de
3.011.209 pb con un contenido promedio de G+C del 37%. Dentro del gnero Listeria, estas dos
especies presentan alto grado de homologa en la secuencia del 16S rRNA, siendo las de mayor
cercana taxonmica (Von Both et al., 1999).
Listeria monocytogenes es un microorganismo telrico, muy extendido en el medio ambiente (suelo,
vegetacin, agua). Su temperatura ptima de crecimiento es de 30-37C, pero puede crecer incluso a
4C. Tiene una gran tolerancia a factores usados para controlar el desarrollo microbiano en los
alimentos, como alta acidez (pH 4.4), alta concentracin de sal (12%) y baja actividad de agua
(0,92), aunque la combinacin de estos factores disminuye la tolerancia.

Listeria monocytogenes es capaz de adherirse a las superficies (biofilms) de las instalaciones y

equipos, y por tanto contaminarlas.
Est reconocida actualmente en la sanidad humana como un agente patgeno de origen alimentario.
Puede encontrarse sobre todo en alimentos vegetales, embutidos y en los productos lcteos, en
particular quesos de pasta blanda. Aunque los alimentos contaminados son el origen de la mayora de
los casos de listeriosis, la mayor parte de las personas tiene poco riesgo de padecerla. La listeriosis
afecta esencialmente a personas con el sistema inmunitario debilitado o modificado, como los
inmunodeprimidos, los recin nacidos, las embarazadas, los pacientes tratados con corticoides y
personas de edad avanzada.
Listeria monocytogenes es una bacteria que produce listeriosis, una enfermedad que se manifiesta en
la mayora de los casos por encefalitis o meningoencefalitis, en los rumiantes adultos y por
septicemia con necrosis heptica focal en los rumiantes jvenes y monogstricos. Tambin pueden
producirse abortos en infeccin perinatal. La listeria es ubicua y extremadamente resistente a
condiciones ambientales adversas. Por tanto, puede convertirse en un problema para los ganaderos.
PATOFISIOLOGA DE LA INFECCIN POR LISTERIA MONOCYTOGENES
Existen dos formas de presentacin clnica de la infeccin:
a) listeriosis perinatal
b) listeriosis en el paciente adulto.
Las formas clnicas predominantes corresponden en ambos casos a la infeccin diseminada o a la
infeccin localizada en el sistema nervioso central. Es la infeccin de origen alimentario con mayor
tasa de mortalidad en humanos (20 al 30 % o mayor) a pesar del inicio del tratamiento antibitico
previo (McLauchlin, 1990).
La infeccin generalmente comienza alrededor de las 20 horas despus de la ingestin del alimento
contaminado en los casos de gastroenteritis (Dalton et al., 1997), mientras que el perodo de
incubacin para la forma invasiva es generalmente ms larga, alrededor de 20 a 30 das.(Lindan et
al.,1988). Los mismos perodos de incubacin han sido descritos para animales, tanto para la
gastroenteritis como para la forma diseminada.
Los casos espordicos tienen una tasa de incidencia muy baja, 2 a 8 casos anuales por milln de
poblacin en Europa y USA (Farber and Peterkin, 1991). Por este motivo, L. monocytogenes parece
tener un potencial patgeno ms bajo que otros microorganismos de transmisin alimentaria, lo cual
est de acuerdo con la dosis letal 50 (DL50), relativamente alta. El valor determinado para el ratn
infectado experimentalmente por va oral es de 109 y por va parenteral es de 105 a 106. La dosis
mnima requerida para la infeccin humana no ha sido determinada, pero el nmero de bacterias
detectadas en alimentos responsables de casos espordicos y epidmicos de listeriosis sugiere que es
alto. Esta dosis tambin depende de otros factores como el estado inmunolgico del husped.
a) Listeriosis feto materna y listeriosis neonatal
La infeccin se produce por invasin del feto por va placentaria y desarrollo de
corioamnionitis. Como consecuencia, puede ocurrir el aborto, generalmente a partir de los 5
meses de embarazo, el parto prematuro o el nacimiento a trmino con infeccin generalizada del
neonato, sndrome conocido como granulomatosis infantisptica.

Se caracteriza por la presencia de microabscesos piogranulomatosos diseminados en el cuerpo y

con alta mortalidad (Klatt et al., 1986). En la madre, la infeccin es generalmente asintomtica y
puede presentarse como un sndrome gripal leve con escalofros, fatiga, dolor de cabeza,
muscular y articular alrededor de 2 a 14 das antes del aborto.
La listeriosis neonatal tarda se observa con menos frecuencia. Generalmente ocurre de 1 a 8
semanas posteriores al parto y se presenta con un sndrome febril acompaado por meningitis y
en algunos casos gastroenteritis y neumona. La va de contaminacin del neonato es por
aspiracin de exudados maternos contaminados durante el parto. Tambin se han registrado
casos intrahospitalarios en unidades de neonatologa por transmisin horizontal a travs de
instrumental y las manos del personal de salud (Farber et al., 1991). La mortalidad de la
listeriosis neonatal tarda es ms baja (10 al 20%), pero al igual que la listeriosis temprana,
puede dejar secuelas tales como hidrocefalia y retraso psicomotor (Lorber, 1996).
b) Listeriosis del adulto
La infeccin ms frecuente en el adulto es la invasin del sistema nervioso central (SNC) (55 al
70% de los casos). Desarrolla generalmente como meningoencefalitis acompaada por cambios
severos de la conciencia, desordenes del movimiento y en algunos casos parlisis de los nervios
craneales. La mortalidad de la infeccin del SNC es del 20%, pero puede ser del 40 al 60% si
est asociada a una enfermedad de base. En ciertos grupos de riesgo, como enfermos de cncer,
L. monocytogenes es la causa ms frecuente de meningitis bacteriana (Lorber, 1996).
Otra forma frecuente de listeriosis es la bacteriemia o septicemia que tiene una alta tasa de
mortalidad (hasta el 70%), si est asociada a una enfermedad inmunosupresiva. Hay otras
formas clnicas atpicas (5 al 10% de casos) tales como endocarditis, miocarditis, arteritis,
neumona, pleuritis, hepatitis, colecistitits, peritonitis, abscesos localizados, artritis. En vacas la
forma ms frecuente es la mastitis (Blenden et al., 1987). Investigaciones de brotes alimentarios
han dado la evidencia de que un sndrome gastrointestinal es la manifestacin clnica de la
infeccin por L. monocytogenes (Aureli et al., 2000).
TRATAMIENTO
Los antibiticos de eleccin son la penicilina o la ampicilina solos o asociadas a gentamicina.
La combinacin de trimetoprima y sulfametoxazol se ha utilizado con xito en pacientes alrgicos a
penicilinas, considerndose en la actualidad una terapia alternativa.
PATOGNESIS
El motivo por el que L. monocytogenes produce una grave infeccin, se debe a la capacidad que
tiene de inducir su propia fagocitosis por clulas fagocticas y no fagocticas del husped, seguido
por la replicacin en el interior de las mismas y su transferencia directa a otra clula.
Como L. monocytogenes es un microorganismo intracelular, se disemina protegido de las defensas
del husped incluyendo anticuerpos y complemento (Cossart et al., 2003).
Antes de alcanzar el intestino, las bacterias ingeridas deben soportar el ambiente adverso del
estmago, al menos 13 protenas de estrs oxidativo y 14 protenas de shock txico, son inducidas
bajo condiciones de estrs en L. monocytogenes (Vzquez-Boland et al., 2001b).

Las bacterias ingresadas con el alimento son captados por los enterocitos o la clulas M prximas a
las placas de Peyer en el intestino delgado, multiplicndose luego en las clulas fagocticas. Las
bacterias son transportadas por los macrfagos del intestino al hgado o al bazo, donde son destruidas
por los neutrfilos y las clulas de Kupffer. Si la respuesta inmune mediada por clulas T del
husped es inadecuada, las listerias se multiplican en los hepatocitos y en los macrfagos y son
llevadas por la sangre a varios rganos, especialmente al cerebro y/o al tero, donde atraviesan la
barrera hematoenceflica o la placenta. Una intrincada serie de factores de virulencia son producidos
por L. monocytogenes para facilitar cada paso en su proceso de invasin.
VI.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Se concluye lo siguiente:
Al realizar el recuento de microorganismo psicrotrficos se demuestra que la leche utilizada tiene
un tiempo de vida til corto por la presencia de muchos microorganismos presentes, demostrando
el grado de contaminacin del producto.
El grado de contaminacin con bacterias determina el tiempo de vida til de la leche.

VII. BIBLIOGRAFIA
INFLUENCIA DE LAS BACTERIAS PSICROTROFICAS EN LA ACTIVIDAD PROTEOLITICA DE
LA LECHE. Novoa C.F., 2007. Dpto. de qumica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de

Colombia, [en lnea]. Disponible en:

< http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/remevez/article/viewFile/17712/18569>. [Consulta: 04 Diciembre 2013].

CALIDAD DE LECHE REQUERIDA POR LA INDUSTRIA , Lic. Qco. Ricardo Vera Apaza, [en lnea]
Disponible en: < http://www.infolactea.com/descargas/biblioteca/99.pdf >, [Consulta: 04 Diciembre 2013]