CINETICA ENZIMTICA

1. Introduccin
Las enzimas son generalmente protenas de alto peso molecular (15.000 < MW <varios
millones de daltons) que actan como catalizadores. Recientemente, se ha demostrado
que algunas molculas de ARN tambin son catalticas, pero la gran mayora de las
reacciones celulares estn mediadas por catalizadores de protenas. Molculas de ARN
que tienen propiedades catalticas son llamados ribozimas. Las enzimas son
catalizadores biolgicos especficos, verstiles, y muy eficaces, dando como resultado
velocidades de reaccin mucho ms altos en comparacin con reacciones catalizadas
qumicamente en condiciones ambientales. Se conocen ms de 2000 enzimas. Las
enzimas se nombran aadiendo el sufijo -asa hasta el final del sustrato, tal como
ureasa, o la reaccin catalizada, tales como alcohol deshidrogenasa. Algunas enzimas
tienen una estructura simple, tal como una cadena polipeptdica plegada (tpico de la
mayora de enzimas hidrolticas). Muchas enzimas tienen ms de una subunidad.
Algunas enzimas de protenas requieren un grupo no proteico para su actividad. Este
grupo es o bien un cofactor, tales como iones metlicos, Mg, Zn, Mn, Fe, o una
coenzima, tal como una molcula orgnica compleja, NAD, FAD, CoA, o algunas
vitaminas. Una enzima que contiene un grupo no proteico se llama una holoenzima. La
parte proteica de esta enzima es la apoenzima (holoenzima = apoenzima + cofactor o
coenzima). Las enzimas que se producen en varias formas moleculares diferentes, pero
catalizan la misma reaccin, se llaman isoenzimas. Algunas enzimas se agrupan para
formar complejos enzimticos. Las enzimas son sustrato especfico y se clasifican de
acuerdo con la reaccin que catalizan. Las principales clases de enzimas y sus
funciones se enumeran en la Tabla 3.1.
2. Como las enzimas trabajan
Las enzimas disminuyen la energa de activacin de la reaccin catalizada por la unin
del sustrato y formando un complejo enzima-sustrato. Las enzimas no afectan a la
variacin de energa libre o la constante de equilibrio. La figura 3.1 ilustra la accin de
una enzima desde el punto de vista activacin-energa. Por ejemplo, la energa de
activacin para la descomposicin de perxido de hidrgeno vara en funcin del tipo
de catlisis. La energa de activacin de la reaccin no catalizada en 20C es de 18
kilocaloras por mol (Kcal / mol), mientras que el valor para E catalizado
qumicamente (por platino coloidal) y catalizada enzimticamente (catalasa)
descomposicin son 13 y 7 Kcal / moles, respectivamente. Es decir, la catalasa acelera
la velocidad de reaccin en un factor de alrededor de 10 8. El lector debe notar que este
gran cambio en la tasa de cambio relativamente pequeo en energa de activacin se
debe a la dependencia exponencial de la tasa sobre la energa de activacin. En este
caso, la relacin de las tasas es exp (-7000/2*293)/exp (-18.000/2*293).
An no se entienden completamente los aspectos moleculares de la interaccin
enzima-sustrato.
Esta interaccin vara de un complejo enzima-sustrato a otro. Diversos estudios
utilizando de rayos X y espectroscopia Raman han revelado la presencia del complejo
enzima-sustrato (ES). La interaccin entre la enzima y su sustrato es por lo general por
las fuerzas dbiles. En la mayora de los casos, las fuerzas de van der Waals y enlaces
de hidrgeno son responsables de la formacin de complejos ES. El sustrato se une a
un sitio especfico en la enzima conocida como el sitio activo. El sustrato es una
molcula relativamente pequea y cabe en una cierta regin en la molcula de enzima,
que es una molcula mucho ms grande. El modelo ms simple que describe esta

interaccin es el modelo y llave de bloqueo, en la que la enzima representa la

cerradura y el sustrato representa la clave, tal como se describe en la Fig. 3.2.
En las reacciones catalizadas por enzimas multisustrato, las enzimas pueden contener
sustratos tales que las regiones reactivas de sustratos estn cerca el uno al otro y al
sitio activo de la enzima, que se conoce como el efecto de proximidad. Adems, las
enzimas pueden poseer los sustratos en ciertas posiciones y ngulos para mejorar la
velocidad de reaccin, lo que se conoce como el efecto de orientacin. En algunas
enzimas, la formacin de un complejo enzima-sustrato provoca ligeros cambios en la
forma tridimensional de la enzima. Este ajuste inducido del sustrato a la molcula de
enzima puede contribuir a la actividad cataltica de la enzima, tambin. Las enzimas
lisozima y carboxipeptidasa A se han observado para cambiar su estructura
tridimensional sobre la complejacin con el sustrato. Catlisis enzimtica se ve
afectada no slo por la estructura primaria de las enzimas, sino tambin por las
estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias. Las propiedades del sitio activo de
las enzimas y las caractersticas de plegado tienen un profundo efecto sobre la
actividad cataltica de las enzimas. Ciertas enzimas requieren coenzimas y cofactores
para su correcto funcionamiento. Tabla 3.2 enumera algunas enzimas y sus cofactores
y coenzimas.
3. CINTICA ENZIMTICA
3.1 Introduccin
Un modelo matemtico de la cintica de reacciones de sustrato nico catalizadas por
enzimas fue desarrollado por primera vez por VCR Henri en 1902 y por L. Michaelis y
Menten ML en 1913. Cintica de las reacciones catalizadas por enzimas simples se
refiere a menudo como la cintica de Michaelis-Menten o cintica de saturacin. Las
caractersticas cualitativas de la cintica enzimtica son similares a la cintica de
Langmuir-Hinshelwood (ver Fig. 3.3). Estos modelos se basan en datos de reactores por
lotes con un volumen de lquido constante en el que el sustrato inicial, [S0], y la
enzima, [E0], las concentraciones son conocidos. Ms complicadas interacciones
enzima-sustrato, tales como reacciones multisustrato multienzimtico pueden tener
lugar en los sistemas biolgicos. Una solucin de enzima tiene un nmero fijo de sitios
activos a la que se puede unir sustratos. En altas concentraciones de sustrato, todos
estos sitios pueden ser ocupados por sustratos o la enzima est saturada. Cintica de
saturacin se pueden obtener a partir de un esquema de reaccin simple que implica
una etapa reversible para la formacin del complejo enzima-sustrato y una etapa de
disociacin del complejo ES.
Se asume que el complejo ES se establece en su lugar rpidamente y la velocidad de la
reaccin inversa de la segunda etapa es insignificante. La suposicin de una segunda
reaccin irreversible a menudo lleva a cabo slo cuando la acumulacin del producto es
insignificante al comienzo de la reaccin. Dos enfoques principales utilizados en el
desarrollo de una expresin de la velocidad de las reacciones catalizadas con enzimas
son (1) enfoque rpido equilibrio y (2) enfoque constante cuasi-estado.
3.2 Modelos mecnicos para cintica enzimtica simple
Tanto la aproximacin constante cuasi-estado y la asuncin de equilibrio rpido
comparten los mismos pocos pasos iniciales en derivar una expresin de la velocidad
para el mecanismo en la ecuacin. 3,1, donde la tasa de formacin de producto es

Donde v es la velocidad de formacin de producto o consumo de sustrato en moles / ls.

La constante de velocidad k2 a menudo se denota como k cat en la literatura biolgica.
La tasa de variacin del complejo Enzima Sustrato es

Puesto que la enzima no se consume, la ecuacin de conservacin en los rendimientos

de la enzima
En este punto, se requiere una suposicin para lograr una solucin analtica.
3.2.1 La suposicin de equilibrio rpido.
Henri y Michaelis y Menten utilizan esencialmente este enfoque. Suponiendo un
equilibrio rpido entre la enzima y el sustrato para formar un [ES] compleja, podemos
utilizar el coeficiente de equilibrio para expresar [ES] en trminos de [S]. La constante
de equilibrio es:

Donde Km = k-1 / k1, que es la constante de disociacin del complejo ES.

Sustituyendo:

En este caso, la velocidad mxima de avance de la reaccin es Vm. Vm cambia si se

aade ms enzima, pero la adicin de ms sustrato no tiene influencia en Vm. Km es a
menudo llamada la constante de Michaelis-Menten, y el primer nos recuerda que fue
derivado al asumir equilibrio rpido en el primer paso. Un bajo valor de Km sugiere
que la enzima tiene una alta afinidad por el sustrato. Tambin, Km corresponde a la
concentracin de sustrato, dando la velocidad de reaccin media-mxima.
3.2.2 El supuesto estado cuasi-estacionario
En muchos casos la suposicin de equilibrio rpida tras la cintica de accin de masas
no es vlida, aunque la reaccin enzima-sustrato todava muestra una cintica de tipo
de saturacin.
Briggs y Haldane propusieron por primera vez utilizando la hiptesis de estado cuasiestacionario. En los sistemas ms experimentales se utiliza un sistema cerrado (reactor
discontinuo) en el que la concentracin inicial de sustrato es muy superior a la
concentracin inicial de la enzima. Sugieren que desde [E0] era pequeo, d [ES] / dt =
0. (Esta lgica es errnea. Ve usted por qu?) Las simulaciones por ordenador de la
evolucin en el tiempo real representado por las ecuaciones. 3.2, 3.3 y 3.4 han
demostrado que en un sistema cerrado la hiptesis del estado cuasi estacionario
mantiene despus de una breve transitoria si [S0]> [E0] (por ejemplo, 100X). Figura
3.4 muestra una tal evolucin en el tiempo.

Mediante la aplicacin de la suposicin estado cuasi-estacionario a la ecuacin. 3.3,

encontramos

Sustituyendo la ecuacin de conservacin de la enzima. 3.4 en la ecuacin. 3.9

Despejo ES

Substituyo la ecuacin anterior en 3.2

Donde Km es [(k-1 + k2) / k1] y Vm es k2 [E0]. Bajo la mayora de circunstancias

(experimentos simples), es imposible determinar si Km o Km es ms adecuado. Ya que
km resulta de la derivacin ms general, lo vamos a utilizar en el resto de nuestras
discusiones.
3.3 Determinacin experimental de los parmetros de velocidad de la cintica
tipo Michaelis-Menten
La determinacin de los valores de Km y Vm con alta precisin puede ser difcil. Por lo
general, los datos experimentales se obtienen a partir de experimentos de tasa inicial.
Un reactor discontinuo se carga con una cantidad conocida de sustrato [S0] y la enzima
[E0]. El producto (o concentracin de sustrato) se traza contra el tiempo. La pendiente
inicial de esta curva se estima (es decir, v = d [P] / dt | t = 0 = -d [S] / dt |t = 0). Este valor
de v depende entonces de los valores de [E0] y [S0] en la carga al reactor. Muchos de
estos experimentos se pueden utilizar para generar muchos pares de datos de v y [s].
Estos podran ser representados como en la Fig. 3.3, pero la determinacin precisa de
km de una parcela tal es muy difcil. En consecuencia, se han sugerido otros mtodos
de anlisis de dichos datos.
3.3.1 Lineweaver-Burk
La ecuacin

se puede linealizar en forma de doble recproco: Ecuacin 3.13

Un grfico de 1/v frente a 1/ [S] se obtiene una lnea recta con una pendiente de
Km/Vm y el eje y de intercepcin de 1/Vm, tal como se representa en la Fig. 3.5. Un
grfico de doble recproco da buenas estimaciones sobre Vm, pero no necesariamente
en el Km. Debido a que el error sobre el recproco de un punto de datos no es
simtrica, el lector debe tener cuidado en la aplicacin de anlisis de regresin
(mnimos cuadrados) para dichos grficos. Los puntos de datos a bajas concentraciones
de sustrato influyen en la pendiente y la interseccin ms que las altas
concentraciones de sustrato.
3.3.2 Grfico EadieHofstee

La ecuacin
puede reordenarse como: 3.14
Un grfico de v en funcin de V/ [S] resultado en una lnea de pendiente -Km y el eje y
en el origen de Vm, como se muestra en la Fig. 3.6. Diagramas Eadie-Hofstee pueden
estar sujetos a errores grandes, ya que ambos contienen coordenadas u, pero hay
menos sesgo en los puntos a baja [S].
3.3.3 Grfico Hanes-Woolf
Reordenando la ecuacin
obtenemos 3.15
Un grfico de [S] /v frente a [S] da como resultado una lnea de pendiente 1/Vm y el eje
y en el origen de Km/Vm, como se muestra en la Fig. 3.7. Esta trama se utiliza para
determinar con mayor precisin Vm.
3.3.4 Cintica por lotes (discontinuo). El curso temporal de la variacin de [S] en una
reaccin enzimtica por lotes puede determinarse a partir de:

Un grfico de 1/t ln [S0]/ [S] versus {[S0] - [S]}/t resulta en una lnea de pendiente
-1/km e intercepto de Vm/Km.
3.3.5 Interpretacin de Km y Vm
Mientras Km (o K'm) es un parmetro intrnseco, Vm no lo es. Km es nicamente una
funcin de los parmetros de velocidad y se espera que cambie con la temperatura o el
pH. Sin embargo, Vm es una funcin del parmetro de velocidad k2 y el nivel de la
enzima inicial, [E0]. Como [E0] cambia, tambin lo hace Vm. Por supuesto, k2 se puede
calcular fcilmente si [E0] se conoce. Para las preparaciones de enzimas altamente
purificadas puede ser posible expresar [E0] en trminos de mol/L o g/L.
Cuando la enzima es parte de una preparacin en bruto, su concentracin es en
trminos de "unidades". Una "unidad" es la cantidad de enzima que da una cantidad
predeterminada de la actividad cataltica bajo condiciones especficas. Por ejemplo,
una unidad sera la formacin de un mol de producto por minuto a un pH y
temperatura especificada con una concentracin de sustrato mucho mayor que el valor
de Km. La actividad especfica es el nmero de unidades de actividad por cantidad de
protena total. Por ejemplo, un lisado celular crudo podra tener una actividad
especfica de 0,2 unidades / mg de protena que, tras la purificacin puede aumentar a
10 unidades / mg de protena. Slo las enzimas que permanecen catalticamente
activas sern medidas. La enzima puede ser desnaturalizada si se desarrolla o tiene su
forma tridimensional alterada por pH extremos o la temperatura durante la
purificacin. La enzima desnaturalizada no tendr actividad.
Ejemplo 3.1 Para medir la cantidad de glucoamilasa en una preparacin de enzima
cruda, se aade 1 ml de la preparacin enzimtica en bruto que contiene 8 mg de
protena a 9 ml de una solucin de almidn 4,44%. Una unidad de actividad de

glucoamilasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 mol de glucosa por
min en una solucin de 4% de almidn Lintner a pH 4,5 y en 60C. Experimentos
velocidad inicial muestran que la reaccin produce 0,6 mol de glucosa / ml-min. Cul
es la actividad especfica de la preparacin de enzima en bruto?
Solucin: La cantidad total de glucosa producida es de 10 ml * 0.6 mol de glucosa/ mlmin o 6 mol de glucosa por min. La actividad especfica es entonces:

Vm debe tener unidades como mol producto / ml-min. Ya que Vm = k2*E0, las
dimensiones de k2 deben reflejar la definicin de unidades en E0. En el ejemplo
anterior, tuvimos una concentracin de enzima de 8 mg de protena / 10 ml de solucin
*0,75 unidades / mg de protena o de 0,6 unidades / ml. Si, por ejemplo, Vm = 1 mol /
ml-min, a continuacin, k2 = 1 mol / ml min dividido 0,6 unidades / ml o k2 = 1,67
mol / unidad- min
3.4 Modelos para cintica enzimtica ms compleja.
3.4.1 Enzimas alostricas
Algunas enzimas tienen ms de un sitio de unin de sustrato. La unin de un sustrato a
la enzima facilita la unin de otras molculas de sustrato. Este comportamiento se
conoce como alostrico o unin cooperativa y enzimas reguladoras muestran este
comportamiento. La expresin de la velocidad en este caso es:

Donde n = coeficiente de cooperatividad y n> 1 indica cooperatividad positiva. Figura

3.8 compara la cintica de Michaelis-Menten con la cintica de enzimas alostricos, lo
que indica una forma sigmoidal (forma de S) del grafico V-[S] para las enzimas
alostricos.
El coeficiente de cooperatividad puede ser determinada por la reordenacin de la
ecuacin anterior como:

Y trazando ln v/ (Vm - v) frente a ln [S] como se muestra en la Fig. 3.9

Figura 3.8
3.9

Figura

3.4.2. Cintica de Inhibicin enzimtica

Ciertos compuestos pueden unirse a enzimas y reducir su actividad. Estos compuestos
son conocidos por ser inhibidores de enzimas. Inhibiciones enzimticas pueden ser
irreversibles o reversibles. Inhibidores irreversibles tales como metales pesados
(plomo, cadmio, mercurio y otros) forman un complejo estable con la enzima y reducen
la actividad enzimtica. Tal inhibicin de la enzima se puede invertir solamente
mediante
el
uso
de
agentes
quelantes
tales
como
EDTA
(cido
etilendiaminotetraactico) y citrato. Los Inhibidores reversibles pueden disociarse ms
fcilmente de la enzima despus de la unin. Las tres clases principales de inhibiciones
reversibles de enzimas son inhibiciones competitivas, no competitivas, y anti
competitivas. El sustrato puede actuar como un inhibidor en algunos casos.
Los inhibidores competitivos son generalmente anlogos del sustrato y compiten con el
sustrato por el sitio activo de la enzima. El esquema de la inhibicin competitiva de la
enzima puede ser descrito como:

Suponiendo rpido equilibrio y con la definicin de:

Podemos desarrollar la siguiente ecuacin para la tasa de conversin enzimtica:

El efecto neto de la inhibicin competitiva es un incremento del valor de Km app y,

por tanto, la reduccin de la velocidad de reaccin. La inhibicin competitiva puede ser
superada por altas concentraciones de sustrato. Figura 3.10 describe la inhibicin
competitiva de la enzima en la forma de una grfica de doble recproco.
Inhibidores no competitivos no son sustrato anlogos. Los inhibidores se unen en sitios
distintos del sitio activo y reducen la afinidad de la enzima al sustrato. Inhibicin no
competitiva de la enzima puede ser descrita como sigue:

Con la definicin de:

Podemos desarrollar la siguiente ecuacin de la tasa:

El efecto neto de la inhibicin no competitiva es una reduccin en Vm. Las altas

concentraciones de sustrato no superan a la inhibicin no competitiva. Otros reactivos
necesitan ser aadidos para bloquear la unin del inhibidor a la enzima. En algunas
formas de inhibicin no competitiva Vm se reduce y Km se incrementa. Esto ocurre si
el complejo ESI puede formar el producto.
Inhibidores anticompetitivos se unen slo al complejo ES y no tienen afinidad por la
propia enzima. El esquema para la inhibicin no competitiva es:

Con la definicin de:

Podemos desarrollar la siguiente ecuacin para la velocidad de reaccin

El efecto neto de la inhibicin anticompetitiva es una reduccin de valores tanto en Vm

y Km. La reduccin de Vm tiene un efecto ms pronunciado que la reduccin de Km,
y el resultado neto es una reduccin en la velocidad (o tasa) de reaccin. La Inhibicin
anticompetitivas se describe en la Fig. 3.10 en la forma de una grfica de doble
recproco.
Las altas concentraciones de sustrato pueden causar la inhibicin en algunas
reacciones enzimticas, conocida como la inhibicin por sustrato. La inhibicin por
sustrato se describe grficamente en la Fig. 3.11.
El esquema de reaccin para la inhibicin anticompetitiva de sustrato es:
Figura 3.11: Tasa de reaccin con la misma Vm y Km si no hay inhibicin de sustrato
presente (lnea entre cortada) Comparacin de sustrato inhibido y reacciones
enzimticas desinhibidas.
Figura 3.11

Con la definicin de:

La asuncin de los rendimientos de rpido equilibrio:

Un grfico de doble recproco que describe la inhibicin por sustrato se da en la Fig.

3.10.
A bajas concentraciones de sustrato, [S] ^2 / KS1 << 1, y efecto de inhibicin no se
observa. La tasa es

Un grfico de 1/v frente a 1/ [S] resulta en una lnea de pendiente Km/Vm y la

interseccin de 1 / Vm.
En altas concentraciones de sustrato, Km / [S] << 1, y la inhibicin es dominante. La
tasa en este caso es:

Un grfico de 1/v frente a [S] da como resultado una lnea con pendiente 1/Ksi*Vm y la
interseccin de 1/Vm.
La concentracin del sustrato resultante en la tasa de reaccin mxima se puede
determinar estableciendo dv/d [S] = 0. La [S] max est dada por:

Ejemplo 3.2
Los siguientes datos se han obtenido para dos concentraciones de enzima iniciales
diferentes para una reaccin catalizada por la enzima.
a. Encontrar km
Ejemplo 3.3
La hidrlisis de la urea por la ureasa es una nica reaccin parcialmente comprendida y
muestra la inhibicin. Los datos para la hidrlisis de la reaccin se dan a continuacin.
Donde v = moles / l-min y I es la concentracin molar de inhibidor.
a. Determinar la constante de Michaelis-Menten (K m) para esta reaccin.
b . Qu tipo de reaccin de inhibicin es esto? Corroborar las respuestas.
c . Sobre la base de la respuesta a la parte b, cul es el valor de Ki?
3.5 Efectos del pH y temperatura
3.5.1 Efectos del pH. Ciertas enzimas tienen grupos inicos en sus sitios activos, y
estos grupos inicos deben estar en una forma adecuada (cido o base) para funcionar.
Las variaciones en el pH del medio resultan en cambios en la forma inica del sitio
activo y cambios en la actividad de la enzima y por lo tanto la velocidad de reaccin.
Los cambios en el pH tambin pueden alterar la forma tridimensional de la enzima. Por
estas razones, las enzimas son nicamente activos en un cierto intervalo de pH. El pH
del medio puede afectar a la velocidad mxima de reaccin, Km, y la estabilidad de la
enzima. En algunos casos, el sustrato puede contener grupos inicos, y el pH del medio
afecta a la afinidad del sustrato a la enzima.
El siguiente esquema puede ser usado para describir la dependencia de pH de la
velocidad de reaccin enzimtica para ionizar enzimas.

Con la definicin de:

Podemos derivar la siguiente ecuacin de velocidad:

Como resultado de este comportamiento, el pH ptimo de la enzima es entre pK1 y

pK2.
Para el caso de ionizante sustrato, en el siguiente esquema y la expresin de la tasa
puede ser desarrollada:

La prediccin terica del pH ptimo de las enzimas requiere un conocimiento de las

caractersticas del sitio activo de las enzimas, que son muy difciles de obtener. El pH
ptimo para una enzima generalmente se determina experimentalmente. La figura
3.14 representa la variacin de la actividad enzimtica con pH de dos enzimas
diferentes.
Figura 3.14. Los perfiles de pH-actividad de dos enzimas. (A) La actividad aproximada
para la tripsina; (B) la actividad aproximada de la colinesterasa.
3.5.2 Efectos de la temperatura. La velocidad de las reacciones catalizadas por
enzimas aumenta con la temperatura hasta un cierto lmite. Por encima de una cierta
temperatura, la actividad enzimtica disminuye con la temperatura debido a la
desnaturalizacin de la enzima. La figura 3.15 representa la variacin de la velocidad
de reaccin con la temperatura y la presencia de una temperatura ptima. La parte
ascendente de la figura. 3.15 se conoce como temperatura de activacin. La tasa vara
de acuerdo con la ecuacin de Arrhenius en esta regin.
Figura 3.15. Efecto de la temperatura sobre la actividad de una enzima. Aqu hemos
asumido un valor de Ea = 11 kcal / g-mol y Ed = 70 kcal / g-mol. La parte descendente

de la curva es debido a la desnaturalizacin trmica y se calcula suponiendo una

exposicin de 10 min a la temperatura. Tenga en cuenta que la naturaleza del
diagrama depender de la duracin de tiempo que la mezcla de reaccin se expone a
la temperatura de ensayo.

Donde Ea es la energa de activacin (kcal / mol) y [E] es la concentracin de la enzima

activa. Una grfica de ln (v) frente a 1 / T resulta en una lnea de pendiente -Ea / R.
La parte descendente de la figura. 3.15 se conoce como la temperatura de inactivacin
o desnaturalizacin trmica. La cintica de desnaturalizacin trmica se pueden
expresar como:

Donde [E0] es la concentracin de la enzima inicial y Kd es la constante de

desnaturalizacin. Kd tambin vara con la temperatura de acuerdo con la ecuacin de
Arrhenius.

Donde Ed es la energa de desactivacin (kcal / mol). Por consiguiente,

Las energas de activacin de las reacciones catalizadas por enzimas se encuentran

dentro del rango de 4 a 20 kcal / g mol (sobre todo de 11 kcal / g mol). Las energas de
desactivacin Ed varan entre 40 y 130 kcal / g mol (sobre todo de 70 kcal / g mol). Es
decir, la desnaturalizacin de la enzima por la temperatura es mucho ms rpida que
la activacin de la enzima. Un aumento de la temperatura de 30 a 40C resultado en
un aumento de 1,8 veces en la actividad de la enzima, pero un aumento de 41 veces
en la desnaturalizacin de la enzima. Las variaciones de temperatura pueden afectar
tanto a los valores Vm y Km de enzimas.
3.6 Sustratos insolubles
4. SISTEMAS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS
La restriccin de la movilidad de la enzima en un espacio fijo se conoce como la
inmovilizacin de enzimas. La inmovilizacin de enzimas ofrece ventajas importantes,
como la reutilizacin de la enzima y la eliminacin de los procesos de recuperacin y
purificacin de enzimas, y puede proporcionar un mejor entorno para la actividad
enzimtica. Puesto que las enzimas son caras, la reutilizacin del catalizador es crtica
para muchos procesos. Dado que algunas de las enzimas intracelulares son unidas a la
membrana, enzimas inmovilizadas proporcionan un sistema modelo para imitar y
entender la accin de algunas enzimas intracelulares unidas a la membrana. La pureza
del producto por lo general se mejor, y los problemas de manejo de efluentes se
minimizan por la inmovilizacin.

4.1 Los mtodos de inmovilizacin

Los principales mtodos de inmovilizacin se resumen en la Fig. 3.16. Las dos
categoras principales son el aprisionamiento y la inmovilizacin de superficie.
4.1.1 Atrapamiento. Atrapamiento es el recinto fsico de las enzimas en un espacio
pequeo. La matriz de atrapamiento y la membrana de atrapamiento, incluyendo la
microencapsulacin, son los dos principales mtodos de atrapamiento.
Matrices utilizados para la inmovilizacin de enzimas son generalmente materiales
polimricos tales como Ca-alginato, agar, ke-carragenina, poliacrilamida, y el colgeno.
Sin embargo, algunas matrices slidas tales como carbn activado, cermica porosa, y
tierra de diatomeas tambin se pueden utilizar para este propsito. La matriz puede
ser una partcula, una membrana, o una fibra. Cuando la inmovilizacin en una matriz
de polmero, la solucin de enzima se mezcla con la solucin de polmero antes de que
la polimerizacin se lleve a cabo. Gel polimerizado contiene enzimas que es ya sea
extruido o una plantilla se utiliza para dar forma a las partculas de una mezcla de
polmeros de la enzima lquida. Atrapamiento y unin superficial se pueden utilizar en
combinacin en algunos casos.
Membrana de atrapamiento de enzimas es posible; por ejemplo, unidades de fibra
hueca se han utilizado para atrapar una solucin de enzima, entre membranas
semipermeables finas. Las membranas de nylon, celulosa, polisulfona, y poliacrilato se
utilizan comnmente. Configuraciones, distintas de las fibras huecas, son posibles,
pero en todos los casos una membrana semipermeable se utiliza para retener
compuestos de alto peso molecular (enzima), al tiempo permite que compuestos de
pequeo peso molecular (sustrato o productos) tengan el acceso a la enzima.
Una forma especial de atrapamiento membrana es la microencapsulacin. En esta
tcnica, se forman esferas huecas microscpicas. Las esferas contienen la solucin de
enzima, mientras que la esfera est encerrada dentro de una membrana porosa. La
membrana puede ser polimrico o una fase enriquecida interfacial formada alrededor
de una microgota.
A pesar de las ventajas antes mencionadas, el atrapamiento de enzimas puede tener
sus problemas inherentes, tales como fugas de enzima en solucin, las significativas
limitaciones difusionales, la reduccin de la actividad enzimtica y la estabilidad, y la
falta de control de las condiciones microambientales. Fugas de la enzima puede ser
superada mediante la reduccin del PM del punto de corte de las membranas o el
tamao de poro de las matrices slidas. Limitaciones de difusin pueden ser eliminados
mediante la reduccin del tamao de partcula de las matrices y / o cpsulas. La
reduccin de la actividad enzimtica y la estabilidad son debido a las condiciones
microambientales desfavorables, que son difciles de controlar. Sin embargo, mediante
el uso de diferentes matrices e ingredientes qumicos, por las condiciones cambiantes
de procesamiento, y mediante la reduccin de tamao de partcula o cpsula, pueden
obtenerse condiciones microambientales ms favorables. La barrera de difusin es
generalmente menos significativa en microcpsulas en comparacin con perlas de gel.
4.1.2 Inmovilizacin de superficie. Los dos tipos principales de inmovilizacin de
enzimas en las superficies de materiales de soporte son la adsorcin y unin covalente.
La adsorcin es la unin de las enzimas en las superficies de partculas de soporte por
fuerzas fsicas dbiles, tales como fuerzas de van der Waals o de dispersin. El sitio
activo de la enzima adsorbida es generalmente no afectado, y la actividad casi lleno se
retiene sobre la adsorcin. Sin embargo, la desorcin de las enzimas es un problema

comn, especialmente en la presencia de fuertes fuerzas hidrodinmicas, desde que

las fuerzas de unin son dbiles. Adsorcin de las enzimas puede estabilizarse por
reticulacin con glutaraldehdo. Tratamiento glutaraldehdo puede desnaturalizar
algunas protenas. Los materiales de soporte utilizados para la enzima de adsorcin
pueden ser materiales inorgnicos, tales como almina, slice, vidrio poroso, cermica,
tierra de diatomeas, arcilla, y bentonita, o materiales orgnicos, tales como celulosa
(CMC, DEAE-celulosa), el almidn, carbn activado, y resinas de intercambio inico,
tales como Amberlite, Sephadex, y Dowex. Las superficies de los materiales de soporte
pueden necesitar ser pretratado (qumica o fsicamente) para la inmovilizacin eficaz.
La unin covalente es la retencin de las enzimas en las superficies de apoyo de la
formacin del enlace covalente. Molculas de enzima se unen para apoyar a travs de
material de ciertos grupos funcionales, tales como amino, carboxilo, hidroxilo, y grupos
sulfhidrilo. Estos grupos funcionales no deben estar en el sitio activo. Un truco comn
es bloquear el sitio activo inundando la solucin de enzima con un inhibidor
competitivo antes de la unin covalente. Los grupos funcionales sobre el material de
soporte se activan generalmente mediante el uso de reactivos qumicos, tales como
bromuro de ciangeno, carbodiimida, y glutaraldehdo. Materiales de apoyo con
diferentes grupos funcionales y los reactivos qumicos utilizados para la unin de
protenas covalente se enumeran en la Tabla 3.3.
Grupos de unin en la molcula de protena son generalmente grupos laterales (R) o
los amino o carboxilo de la cadena polipeptdica.
El entrecruzamiento de molculas de enzima entre s utilizando agentes tales como
glutaraldehdo, bis-diazo bencidina, y cido 2,2-disulfnico es otro mtodo de
inmovilizacin de enzimas. La reticulacin se puede lograr de varias formas diferentes:
enzimas pueden ser reticulada con glutaraldehdo para formar un agregado insoluble,
enzimas absorbidas pueden ser reticulados, o reticulacin puede tener lugar despus
de la impregnacin del material de soporte poroso con una solucin de enzima. La
reticulacin puede causar cambios significativos en el sitio activo de las enzimas, y
tambin puede dar lugar a graves limitaciones de difusin.
El ms adecuado material de soporte y mtodo de inmovilizacin varan dependiendo
de la enzima y su aplicacin particular. Dos criterios principales utilizados en la
seleccin de material de soporte son (1) la capacidad de unin del material de soporte,
que es una funcin de densidad de carga, grupos funcionales, porosidad, y la
hidrofobicidad de la superficie de apoyo, y (2) la estabilidad y la retencin de la
actividad enzimtica, que es una funcin de los grupos funcionales en el material de
soporte y condiciones microambientales. Si la inmovilizacin provoca algunos cambios
conformacionales en la enzima, o si los grupos reactivos en el sitio activo de la enzima
estn implicados en la unin, una prdida de la actividad enzimtica puede tener lugar
en la inmovilizacin. Por lo general, la inmovilizacin resulta en una prdida de la
actividad enzimtica y la estabilidad. Sin embargo, en algunos casos, la inmovilizacin
puede causar un aumento en la actividad enzimtica y la estabilidad debido a las
condiciones microambientales ms favorables. Debido a que las enzimas a menudo
tienen ms de un sitio funcional que se puede unir a la superficie, una preparacin de
enzima inmovilizada puede ser muy heterognea. Incluso cuando la unin no altera
estructura de la enzima, parte de la enzima se puede unir con el sitio activo orientada
lejos de la solucin de sustrato y hacia la superficie de apoyo, disminuyendo el acceso
del sustrato a la enzima. Retencin de la actividad vara con el mtodo utilizado. Tabla

3.4 resume la retencin de la actividad de la aminoacilasa inmovilizada por diferentes

mtodos.
4.2 Limitaciones de difusin en los sistemas de enzima inmovilizada
(inmovilizador)
Resistencias de difusin se pueden observar en los diferentes niveles de las enzimas
inmovilizadas. Estas resistencias varan dependiendo de la naturaleza del material de
soporte (poroso, no poroso), las condiciones hidrodinmicas que rodean el material de
soporte, y la distribucin de la enzima en el interior o en la superficie del material de
soporte. Ya sea que la resistencia a la difusin tiene un efecto significativo sobre la tasa
de velocidad de reaccin enzimtica depende de la velocidad relativa del tipo de tasa
de difusin y de reaccin, que se caracteriza por el nmero Damkhler (Da).

Donde [Sb] es la concentracin de sustrato en el lquido a granel (masa, mayor) (g /

cm3) y KL es el coeficiente de transferencia de masa (cm / s).
La tasa de conversin enzimtica puede estar limitada por la difusin del sustrato o
reaccin, dependiendo del valor del nmero de Damkhler. Si Da >> 1, la velocidad de
difusin es limitante. Para Da << 1, la velocidad de reaccin es limitante, y por Da = 1,
las resistencias de difusin y de reaccin son comparables. Difusin y reacciones
enzimticas puede ser simultnea, con las enzimas atrapadas en una matriz slida, o
pueden ser dos fenmenos consecutivos para enzimas adsorbidas.
4.2.1 Los efectos de difusin de las enzimas unidas a la superficie de
materiales de soporte no porosas.
Supongamos una situacin en la que las enzimas estn unidos y uniformemente
distribuidos en la superficie de un material de soporte no poroso, todas las molculas
de enzima son igualmente activas, y el substrato se difunde a travs de una fina
pelcula lquida que rodea la superficie de soporte para llegar a las superficies
reactivas, como se representa en la Fig. 3.17. Supongamos, adems, que el proceso de
inmovilizacin no ha alterado la estructura de la protena, y los parmetros cinticos
intrnsecos (Vm, Km) son inalterada.
Figura 3.17. Perfil de concentracin de
sustrato en una pelcula de lquido
alrededor de enzimas adsorbidas.
SS: concentracin de sustrato en la
superficie.
Sb: concentracin de sustrato mayor (a
granel)
Soporte solido no poroso
Enzima
Espesor de la pelcula

En estado estacionario, la velocidad de reaccin es igual a la tasa de transferencia de

masa:

3.53
Donde Vm es la velocidad mxima de reaccin por unidad de rea de superficie
externa y kL es el coeficiente de transferencia de masa lquida. Esta ecuacin es
cuadrtica en [Ss], la concentracin de sustrato en la superficie. Se puede solucionar
analticamente, pero la solucin es engorrosa. Adems, el valor de [Ss] no es
susceptible de dirigir la observacin experimental.
La ecuacin 3.53 puede resolverse grficamente como se muestra en la Fig. 3.18.
Dicha trama tambin hace que sea fcil de visualizar los efectos de los cambios de
parmetros tales como la velocidad de agitacin, cambios en la concentracin de
substrato en masa (granel), o carga de la enzima.
Figura 3.18. Solucin grfica de cantidad de reaccin por unidad de superficie para la
enzima inmovilizada sobre un catalizador no poroso. La curva A resulta a partir del
conocimiento de los parmetros cinticos basados en soluciones intrnsecas y la carga
de la superficie de la enzima (lado derecho de la Ec. 3.53). La lnea B es la ecuacin de
transferencia de masa (lado izquierdo de la ecuacin. 3.53). La interseccin de las dos
lneas es la velocidad de reaccin, u, que puede ser sostenido en el sistema. Se
muestran las respuestas para dos concentraciones de sustrato en masa diferentes.
Cuando en el sistema est fuertemente limitada la transferencia de masa, [Ss] = 0, ya
que la reaccin es rpida en comparacin con la transferencia de masa, y

Y el sistema se comporta como de pseudo primer orden.

Cuando en el sistema est limitando la reaccin (Da1), la velocidad de reaccin se
expresa a menudo como: (cuando el sistema es limitado por la reaccin)

Donde, con supuestos adecuados,

En estas circunstancias, la "constante" aparente de Michaelis-Menten es una funcin de

la velocidad de agitacin. Por lo general, Km, app se calcula experimentalmente como
el valor de [Sb], que da una media de la velocidad de reaccin mxima.
Ejemplo 3.4
Considere un sistema en el que una hoja plana de polmero recubierta con enzima se
coloca en un vaso de precipitados agitado. La tasa intrnseca mxima de reaccin (Vm)
de la enzima es 6*10-6 mol /s-mg de enzima. La cantidad de enzima unida a la
superficie se ha determinado que es 1*10 -4 mg de enzima / cm2 de soporte. En
solucin, el valor de Km se ha determinado que es 2*10 -3 mol / l. El coeficiente de
transferencia de masa se puede estimar a partir de correlaciones estndar para
calderas de agitacin. Suponemos en este caso un sistema muy mal mezclado donde
kL = 4,3*10-5 cm / s. Cul es la velocidad de reaccin cuando (a) la concentracin
mayor del sustrato es de 7*10-3 mol / l? (B) Sb = 1*10-2 mol / l
5. PRODUCCIN A GRAN ESCALA DE ENZIMAS
Entre las diversas enzimas producidas en gran escala son proteasas (subtilisina, cuajo),
hidrolasas (pectinasa, lipasa, lactasa), isomerasa (isomerasa de glucosa), y oxidasas
(glucosa oxidasa). Estas enzimas se producen utilizando cepas superproductoras de
ciertos organismos. La separacin y purificacin de una enzima de un organismo
requieren la interrupcin de las clulas, la eliminacin de restos de clulas y cidos
nucleicos, la precipitacin de protenas, ultrafiltracin de la enzima deseada,
separaciones cromatogrficas (opcional), cristalizacin y secado. El esquema de
proceso vara dependiendo de si la enzima es intracelular o extracelular. En algunos
casos, puede ser ms ventajoso usar clulas inactivas (muertas o de reposo) con la
actividad enzimtica deseada en forma inmovilizada. Este enfoque elimina los pasos de
separacin y purificacin de enzimas costosas y por lo tanto es econmicamente ms
factible.
El primer paso en la produccin a gran escala de enzimas es cultivar los organismos
que producen la enzima deseada. Produccin de enzimas se puede regular y las
condiciones de fermentacin se pueden optimizar para la sobreproduccin de la
enzima. Las proteasas se producen mediante el uso de cepas superproductoras de
Bacillus, Aspergillus, Rhizopus, y Mucor; pectinasas son producidas por Aspergillus
niger; lactasas son producidos por la levadura y Aspergillus; lipasas son producidas por
ciertas cepas de levaduras y hongos; isomerasa de glucosa es producida por
Flavobacterium arborescens o Bacillus coagulans. Despus de la etapa de cultivo, las
clulas se separan de los medios de comunicacin por lo general por filtracin o a
veces por centrifugacin. Dependiendo de la naturaleza intracelular o extracelular de la
enzima, ya sea de las clulas o el caldo de fermentacin se procesa adicionalmente
para separar y purificar la enzima. La recuperacin de enzimas intracelulares es ms
complicada y consiste en la interrupcin de las clulas y la eliminacin de restos de
clulas y cidos nucleicos. La figura 3.23 representa un esquema de una planta de
enzima que produce enzimas intracelulares.
En algunos casos, la enzima puede ser tanto intracelular y extracelular, lo que requiere
el procesamiento de ambos caldos y clulas. Enzimas intracelulares pueden ser
liberados mediante el aumento de la permeabilidad de la membrana celular. Ciertas
sales tales como CaCl2 y otros productos qumicos tales como dimetilsulfxido (DMSO)
y el cambio de pH se pueden usar para este propsito. Si la liberacin de enzimas no es
completa, entonces la disrupcin (interrupcin) celular puede ser esencial.

Los procesos utilizados para producir estas enzimas industriales tienen mucho en
comn con nuestros ltimos debates sobre los procesos para fabricar protenas a partir
del ADN recombinante.
Figura 3.23. Un diagrama de flujo para la produccin de una enzima extracelular.