PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADOR

ESCUELA DE BIOANLISIS
BIOQUIMICA CLINICA
LABORATORIO DE ANALISIS INSTRUMENTAL
LABORATORIO N 5
NOMBRE:
FECHA:
GRUPO:
TEMA:

Paola Pazmio
Ibeth Quinga
22/04/2016
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EXTRACCION Y ANALISIS DE COLORANTES NATURALES

1. OBJETIVO
Determinar el contenido de clorofila en una muestra de espirulina mediante
espectrofotometria de UV-VIS.

2. RESUMEN
Para esta prctica se tom como muestra las pastillas de espirulinas las
cuales fueron trituradas, se pes 0,5g de la muestra y fue colocada dentro
de un tubo con 10 mL de etanol al 90%, se llev al bao mara a una
temperatura de 35C a 45C por 5 minutos.
Despus fue llevado a un lugar oscuro por 15 minutos para que la clorofila
pueda dejar su sedimento, se centrifugo la muestra a 4000rpm/5min, en el
espectrofotmetro se midi la absorbancia a 665nm y 750nm en cubetas
plsticas. Se mide en 3 cubetas: la primera sirve de blanco con etanol, la
segunda es la muestra acidificada con 100m de HCL 0.1N (esperando 5
minutos se puede medir la muestra), la ltima es la muestra sin acidificar.

3. INTRODUCCIN
El fundamento de la espectroscopa se debe a la capacidad de las molculas
para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro
UVvisible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molcula
puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la
estructura atmica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza
inica, constante dielctrica), por lo que dicha tcnica constituye un valioso
instrumento para la determinacin y caracterizacin de biomolculas
(Skoog, 2010).
Las molculas pueden absorber energa luminosa y almacenarla en forma
de energa interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales
como la fotosntesis en plantas y bacterias. Cuando la luz (considerada
como energa) es absorbida por una molcula se origina un salto desde un
estado energtico basal o fundamental, E1, a un estado de mayor energa
(estado excitado), E2. Y slo se absorber la energa que permita el salto al
estado excitado. Cada molcula tiene una serie de estados excitados (o
bandas) que la distingue del resto de molculas (Riao, 2009).
Como consecuencia, la absorcin que a distintas longitudes de onda
presenta una molcula esto es, su espectro de absorcin constituye una

sea de identidad de la misma. Por ltimo, la molcula en forma excitada

libera la energa absorbida hasta el estado energtico fundamental. La
clorofila a es el pigmento comn a todos los organismos que realizan
fotosntesis con liberacin de oxgeno. Su concentracin se usa como
indicador de la biomasa del fitoplancton (Skoog, 2010).
Los mtodos de extraccin se basan en la transferencia del pigmento a un
solvente orgnico sin provocar cambios qumicos en la molcula y la
concentracin de la clorofila se cuantifica por absorbancia en un
espectrofotmetro. El pigmento es muy sensible a la degradacin
fotoqumica por lo que todas las manipulaciones deben hacerse en
condiciones de luz tenue (Riao, 2009).
Frmula para calcular la concentracin de clorofila a (Clo a) en g l-1 :

Clo =29.6 [(A665-A750)]- [(A665-A750)](v/V)L

A665 y A750 las absorbancias del extracto (sin acidificar)
Aa665 y Aa750 las absorbancias luego de la acidificacin
v: volumen del extracto (ml)
V: volumen de la muestra filtrada (l)
L: largo de la cubeta (cm).
El factor 29,6 incluye el coeficiente de absorcin especfico de la clorofila a
pura en etanol (en l/g cm).

4. MATERIALES

REACTIVOS:

Materiales
Balones aforados de 50 mL
Bao de calentamiento con temperatura ajustable
Centrifuga
Erlenmeyer de 250 mL
Espectrofotometro UV-VIS
Pipeta automatica 50-100 uL
Probetas graduadas
Tubos falcon para centrifuga

Etanol al 90%
HCl 0.1 N
Muestra de Espirulina
(Proporcionada por los
estudiantes)

5. RESULTADOS
LONGITUD DE
ONDA
Muestra sin HCl
Muestra con HCl

665

750

1.256
0.825

0.122
0.254

Calculo de la concentracin de clorofila a en g/L usando la

frmula:

Clo =29.6 [(A665-A750)]- [(A665-A750)](v/V)L

Clo = 29.6 [(1.256-0.122)]- [(0.825-0.254)](10ml)1cm
Clo = 29.6 [(1.134)]- [(0.571)] 10

Clo = 29.6 [0.563]10

Clo = 166.648

6. CUESTIONARIO
Porque es necesario realizar lecturas acidificando la muestra?
La molcula de clorofila se degrada naturalmente (por senescencia o
muerte celular) en feopigmentos (feofitina, clorofilida, etc.), que se
encuentran normalmente en la muestra. Estos pigmentos presentan
mximos de absorbancia a similares longitudes de onda que la clorofila a,
por lo que la absorbancia a 665 nm incluye la clorofila y los feopigmentos.
La clorofila a es susceptible de ser transformada en feopigmentos
acidificando con HCl (0.12 N). La diferencia entre la absorbancia de la
muestra sin acidificar y la acidificada permitir conocer el aporte de la
clorofila a sin productos de degradacin.
Se realiza la acidificacin porque la clorofila a puede ser sobreestimulada
incluyendo a los feopigmentos, que absorben cerca de la misma longitud de
la onda que la clorofila a al acidificarse la clorofila a pierde el tomo de
magnesio, convirtindose en feofitina a
Cuando la clorofila a pura es convertida en feofitina a pura por
acidificacin, la relacin es:

Absorbancia 664
=1.70
Absorbancia 664

Significa que no hay feofitina a, el estado fisiolgico de la clula es

excelente.
Feofitina a pura no se produce la reaccin al acidificar y la reaccin es:

Absorbancia 664
=1.0
A bsorbancia 664

Significa que todo es feofitina a. es estado fisiolgico de la clula es

senescente.
Cules son las principales interferencias en el mtodo?

Clorofila B
Clorofila C

Interfieren en forma negativa con la clorofila a y positiva con los

feopigmentos, esta interferencia es importante si son abundantes algas
pertenecientes a la clase clorofceas y/o proclorofitas.

Porque se realiza la lectura a 750 nm?

Se midi la absorbancia a 750 nm, ya que las clorofilas no absorben en esa
longitud de onda y son ms fciles de detectar sus cantidades.

7. INTERPRETACIN / DISCUSIN
Pueden existir interferencias en la muestra si la cantidad que se debe pesar
supera el nmero requerido.
Es importante controlar el tiempo del bao para evitar que la clorofila en la
muestra llegue a degradarse, la muestra debe mantenerse en un lugar
oscuro ya que la clorofila es fotosensible.
Se debe trabajar con los estndares del mtodo a utilizarse ya que pueden
alterar o cambiar de manera significativa los resultados, as como tambin
nos interfiere en los resultados las diferentes soluciones utilizadas, por lo
que debemos ser muy cuidadosos.

8. CONCLUSIN

Para realizar este mtodo se debe tomar en cuenta los estndares

para poder determinar los cambios que vamos a observar en la
espirulina.

Las ondas establecidas se determin porque las muestras se

dividieron en acidas y sin acidificar.

Se debera realizar el mismo experimento varias veces para

comprar las respuestas de laboratorio y tomar en cuenta un
resultado comprobado o estandarizado por la empresa fabricante
La concentracin y calidad de la espirulina depende de cmo se la
fbrica o genera.

9. BIBLIOGRAFA

SKOOG, D. (2010). Introduccin a la Qumica Analtica. 2o Edicin.

Barcelona-Espaa: Editorial Revert.
Riao, N. (2009). Fundamentos de Qumica Analtica Bsica.
Anlisis Cuantitativo. 3era Edicin. Manizales-Colombia: Editorial
Universidad de Caldas.