HISTOQUIMICA

INMUNOCITOQUIMICA

INMUNOCITOQUMICA
INTRODUCCIN

La inmunocitoqumica tiene su origen a mediados de

1941, gracias al equipo de Albert H. Coons que consigui
marcar un anticuerpo con una sustancia fluorescente para
detectar la presencia de un antgeno en un tejido.
En este trabajo veremos los diferentes tipos y
aplicaciones que desarrolla esta tcnica que ayuda a
complementar el estudio citolgico.
Se basa en la utilizacin de monoclonales especficos,
que facilitan la identificacin de productos celulares y de
marcadores de superficie.

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FUNDAMENTO
La inmunocitoqumica es una tcnica para la localizacin de molculas
en los tejidos mediante el empleo de anticuerpos. Es una tcnica que
gracias a la oferta comercial de anticuerpos y a la estandarizacin de su
protocolo se ha convertido en un mtodo sencillo, rpido y muy potente.
Se basa en la gran especificidad y alta afinidad que tienen los
anticuerpos para reconocer a molculas y unirse a ellas. Adems, la
conjugacin o combinacin de los anticuerpos con enzimas o con
sustancias fluorescentes permite detectar cantidades nfimas de
molculas presentes en el tejido.
Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se usan en las tcnicas
inmunocitoqumicas son del tipo G, producidas por unas clulas del
sistema inmunitario denominados linfocitos B durante la respuesta
inmune. La produccin masiva de anticuerpos se produce en un animal
cuando le inyectamos una molcula, en este caso nuestra molcula
problema, que reconoce como extraa. Estos anticuerpos pasan al
suero sanguneo que se extrae del animal inmunizado y a partir del cual
se purifican. stos se usarn posteriormente en la tcnica
inmunocitoqumica. Las molculas complejas como la protenas tienen
en su estructura varios determinantes antignicos, es decir, lugares que
son capaces de desencadenar una respuesta inmune. Ello implica que
cada determinante antignico activar un clon, lnea de linfocitos B, que
producir anticuerpos contra l. Los anticuerpos de todos los clones de
linfocitos B activados por la molcula inyectada irn a parar al suero.
Cuando se emplean sueros purificados de este tipo en
inmunocitoqumica se dice que se estn empleando anticuerpos
policlonales. Existe una tcnica que perimite aislar y cultivar en el
laboratorio (in vitro) de forma inividualizada a cada uno de los clones de
linfocitos B activados durante la respuesta inmune. Cada uno de esos
cultivos producir un solo tipo de inmunoglobulina G que reconocer
slo a uno de los determinantes antignicos de la molcula inyectada. A

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estos anticuerpos se les denomina monoclonales ya que proceden de

linfocitos que producen inmunoglobulinas idnticas.

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Las inmunoglobulinas tipo G pueden dividirse en dos dominos: la

fraccin cristalizable y la variable. El dominio variable es el que se
encarga de reconocer al determinante antignico de nuestra molcula.
Hay dos sitios de unin por lo que cada inmunoglubulina podra
reconocer a dos molculas o determinantes antignicos, que han de
ser iguales. La fraccin cristalizable tiene una estructura similar para
todas las inmunoglubulinas G producidas por los individuos de una
misma especie.
Para que un anticuerpo se una a su determinante antignico
localizado en una molcula, sta no debe alterarse. De otro modo ese
determinante antignico no ser reconocido por el anticuerpo. Por ello
el proceso de fijacin del tejido debe elegirse para preservar al
mximo a la molcula que queremos detectar. As, se usan diferentes
fijadores segn el tipo de molcula en la que estemos interados.
Tambin es necesario considerar el mtodo de obtencin de
los cortes. Inclusiones en parafina pueden daar las molculas por lo
que en la mayora de los casos se suele trabajar con cortes de
vibratomo o con secciones obtenidas por congelacin.
Las inmunoglobulinas, aunque se unan a la molcula que
queramos detectar, no son visibles con el microscopio por lo que la
tendremos que conjugar (unirla) a otras molculas que nos den una
seal visible. Estas molculas que aportan visibilidad a los
anticuerpos suelen ser de dos tipos: molculas fluorescentes y
enzimas. Las primeras se pueden observar con el microscopio de
fluorescencia mientras que las segundas pueden convertir
determinados sustratos solubles en productos insolubles y
coloreados. La seal aparece all donde est la sustancia fluorescente
o el enzima, que es donde se ha unido la inmunoglubulina.
El mtodo del marcado con sustancias fluorescentes tiene una
serie de ventajas que veremos ms adelante, pero tiene la desventaje
de que no son marcajes permanentes puesto que la luz emitida por la
molcula fluorescente se desvanece con el tiempo. Sin embargo, las
secciones procesadas con anticuerpos unidos a enzimas pueden
deshidratarse, montarse y mantenerse permanentemente para su

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obeservacin. Las enzimas habituales que se unen a las

inmunoglobulinas son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina.

La conjugacin directa de un marcador (enzima o fluorescente) con la

inmunoglobulina se denomina mtodo de deteccin directa. Hoy en da
se suele emplear el mtodo de deteccin indirecta, que consiste en
colocar una serie de intermediarios entre la inmunoglobulina y la
molcula marcadora. Inicialmente se us el mtodo indirecto
denominado peroxidasa-antiperoxidasa (PAP; ver figura anterior), pero
actualmente es ms frecuente usar el mtodo del complejo avidinabiotina-peroxidasa (ABC; ver figura anterior). El mtodo indirecto permite
una mayor versatilidad de la tcnica y mayor intensidad de seal frente a
una misma cantidad de antgeno.

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La inmunofluorescencia se basa en las propiedades de los fluorocromos.

Son molculas que emiten luz visible cuando se les ilumina con una
determinada longitud de onda. Aunque la inmunofluorescencia se puede
usar para detectar a una sola molcula tisular, su verdadero potencial se
muestra cuando necesitamos una mltiple inmunodeteccin, es decir,
dos o ms molculas presentes en una misma clula o matriz
extracelular de forma simultnea. Esto es posible porque existe una gran
variedad de fluorocromos que son capaces de emitir luz visible tras ser
excitados con diferentes longitudes de onda, luego seleccionando el
intervalo de longitudes onda con el que iluminamos un tejido podemos
excitar de modo individual, y secuencial, varios fluorocromos que
hayamos usado, unidos a inmunoglubulinas diferentes, para detectar
molculas diferentes. Tomando fotografas tras cada excitacin y
superponiendo dichas imgenes podemos averiguar si las molculas se
expresan, por ejemplo, en la misma clula.

Deteccin de la
molcula tirosina
hidroxilasa mediante
inmunocitoqumica
usando un anticuerpo
primario sin marcar, un
anticuerpo secundario
conjugado con biotina y
el complejo avidiabiotina-peroxidasa.

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Inmunocitoqumica con deteccin indirecta y enzimtica. La seccin se obtiene de tejido previamente

fijado. Inmediantemante despus se incuban en una solucin de bloqueo que satura los posibles sitios de
unin inespecfica, gracias a una alta concentracin de protena como la albmina de suero bovino. Tras
cada paso de unin de anticuerpos o del complejo avidina-biotina-peroxidasa se procede a lavar los
cortes en una solucin tamponada de fosfato (tampn fosfato), en la que tambin van disueltos los
anticuerpos. La reaccin de la peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidina y el perxido de
hidrgeno, en un producto insoluble y coloreado visible con el microscopio ptico.

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Deteccin con inmunofluorescencia de dos antgenos en una seccin de tejido nervioso: la molcula calbindina (a la
izquierda) y parvoalbmina (a la derecha), usando fluorescena y texas red como fluorocromos, respectivamente, mediante
un mtodo de marcaje indirecto. Se pueden observar cuerpos celulares y prolongaciones nerviosas. Las flechas blancas
indican clulas que poseen ambas protenas (calbindina y parvoalbmina) mientras que la flechas azules indican cuerpos
celulares que slo expresan parvoalbmina. Obsrvense las zonas oscuras, negativas, en la imagen de la izquierda.

Deteccin simultnea de dos molculas situadas en misma seccin mediante inmunofluorescencia. La razn de que los dos
anticuerpos primarios procedan de dos animales diferentes es que los anticuerpo secundarios, obtenidos de otro animal,
normalmente cabra u oveja, inmunizados con las inmunoglobulinas de ratn y conejo, respectivamente, es lo que permite a
cada anticuerpo secundario reconocer y unirse a un anticuerpo primario determinado y no al otro.

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APLICACIONES DE LA INMUNOCITOQUMICA
Se emplea para diferentes aplicaciones; se emplea para la
diferenciacin de tumores, cuando es necesario localizar un tumor
primario desconocido, para determinar la naturaleza de micrometstasis,
para tipificar linfomas y leucemias, con el fin de precisas el tratamiento
para la deteccin de factores de valor predictivo como los receptores de
estrgenos y de progesterona en casos de cncer de mama y para
contribuir a establecer tratamientos adecuados en cncer de mama.
Las aplicaciones son incontables, cualquier antgeno es demostrable
siempre que se cuente con el anticuerpo correspondiente y hoy en da la
lista de estos anticuerpos es largusima. Los protocolos de investigacin
incluyen la bsqueda de sustancias de los ms variadas e impensables.

Entre otras aplicaciones encontramos:

Morfometra
Identificacin Celular
Metstasis de Origen Desconocido
Diagnstico Diferencial de las Neoplasias; en algunos casos, tumores
de distinta estirpe, distinto pronstico y distinto tratamiento, tienen
una apariencia histolgica prcticamente indistinguible. No pocas
veces el diagnstico diferencial entre un linfoma y un carcinoma
indiferenciado, solo puede hacerse con certeza aplicando una
sencilla tcnica de inmunomarcacin que no representa ningn
procedimiento adicional para el paciente y cuyo costo es despreciable
si se le compara con el resultado de un diagnstico errneo.
DIFERENCIA
Inmunocitoqumica: localizacin de molculas en clulas en cultivo mediante
anticuerpos marcados
Inmunohistoqumica: localizacin de molculas en tejidos

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INMUNOCITOQUIMICA:
Las tcnicas de inmunocitoqumica permiten la identificacin, sobre
muestras citolgicas, de antignicos especficos de distintas lneas de
diferenciacin y funcionalismo celular.
Es una tcnica sencilla que tiene diferentes aplicaciones: se emplea
para la diferenciacin de tumores, cuando es necesario localizar un
tumor primario desconocido, para determinar la naturaleza de
micrometstasis, para tipificar linfomas y leucemias, con el fin de
precisar el tratamiento, para la deteccin de factores de valor predictivo
como los receptores de estrgenos y de progesterona en casos de
cncer de mama, y para contribuir a establecer tratamientos adecuados
en cncer de mama (Herb2).
En el laboratorio se realizan:
Marcadores epiteliales: Citoqueratinas, Antgeno de membrana
epitelial, Antgeno carcinoembrionario (EMA) Ca125, etc.
Marcadores Mesenquimticos: Vimentina, Desmina, Actina
musculoespecfica, etc.
Marcadores linfoides: Antgeno comn leucocitario (CD45), etc.
Otros: S100, Hmb45, Cromogranina, Enolasa neuroespecfica
(NSE). etc.
Gonadotrofina Corionica, etc.
Marcadores especficos de mama: Receptores de estrgeno (RE)
y Receptores de Progesterona (RP), calpinina, Her2, etc.
IMPORTANTE:
Comunquese con el laboratorio para informarse de los requisitos y
preparacin necesaria para el estudio.

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Conclusin
La Inmunocitoqumica son tcnicas basadas en la demostracin de una
reaccin antgeno-anticuerpo en las clulas valindose de la
fluorescencia el cual nos ser de gran utilidad en el diagnstico de
tumores y metstasis.
Es importante recalcar que por medio de esta tcnica y el uso de
anticuerpos (marcadores tumorales) se puede demostrar la presencia de
diversos productos celulares en las clulas Blanco.
Se trata de una tcnica de diagnstico asociada a la citopatologa
convencional, de usos cada vez ms frecuente o habitual, cuyos
beneficios estn ms que probados con costos poco significativos, como
para representar en realidad un ahorro para las obras sociales.

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BIBLIOGRAFIA
http://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/5inmuno.php
http://www.citolab.com.uy/estudios/inmunocitoqu
imica
http://servicios.unileon.es/formacionpas/files/2014/02/TINCI%C3%93NINMUNOCITOQUIMICA.pdf
http://bvs.sld.cu/revistas/hih/vol11_1_95/hih08195
.htm
http://www.bvs.sld.cu/revistas/hih/vol17_1_01/hih
10101.htm
http://www.portalesmedicos.com/diccionario_me
dico/index.php/Inmunocitoquimica