MANUAL PRCTICO DE MICROBIOLOGA - Tomo II: Microbiologa Ambiental II

Manacorda A. M., lvarez A. S, Pezzullo S. D. & Cuadros D. P.

Ao 2014

Captulo 4
PRUEBAS BIOQUMICAS:
DIFERENCIACIN E IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS
Objetivos

Conocer el fundamento de la realizacin de las diferentes pruebas bioqumicas.

Identificar las bacterias coliformes presentes en aguas contaminadas.

Introduccin
Las bacterias son capaces de modificar el ambiente que las rodea captando sustancias necesarias
para su multiplicacin y excretando productos resultantes de su metabolismo de desecho, como ser
enzimas, toxinas, metabolitos, entre otros. A su vez, las interacciones que establecen con el entorno
son caractersticas para cada tipo de bacteria. Esta especificidad depende del genotipo y se expresa
en un determinado grupo enzimtico. Por ello, la caracterizacin de dichas enzimas es una
herramienta til para la identificacin y clasificacin de bacterias.
Durante el estudio de las bacterias coliformes fecales, aquel grupo de bacterias que indicador de
contaminacin fecal por su existencia en las heces humanas y/o animales de sangre caliente, es
necesario recurrir a la identificacin de las bacterias presentes para establecer el riesgo relacionado
a la presencia de las mismas en el ambiente. El significado de los distintos tipos de coliformes que
existen en ecosistemas acuticos o en el suelo ha sido y es objeto de amplios estudios.
Para este fin se utilizan pruebas diferenciales, sabiendo que existen variaciones entre las cepas
taxonmicamente asignadas al grupo de los coliformes. Las bacterias consideradas como
coliformes pertenecen a la familia de Enterobacteriaceae, las cuales son gram negativas, bacilos o
cocobacilos, oxidasa negativo, anaerobias facultativas, capaces de reducir nitratos a nitrito, y
muchos gneros poseen flagelos, los que le otorgan la posibilidad de desplazarse. Esta familia de
bacterias posee una estructura antignica compleja, produce diversas toxinas y otros factores de
virulencia. Los gneros que se incluyen en esta familia son: Escherichia, Shigella, Salmonella,
Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia y Proteus, entre otros.
Se debe considerar que los bacilos gram negativos no fermentadores de lactosa, son bacterias no
pertenecen a la familia de las enterobacterias (como ser Pseudomonadaceae o Vibrionaceae) que
en muchas ocasiones comparten el ambiente y que poseen algunas caractersticas morfolgicas y
fisiolgicas similares a estas. Por lo cual, las pruebas bioqumicas debe ir dirigidas en primer lugar a
determinar las caractersticas principales de la familia, en segundo lugar a descartar la posible
presencia de generos de otras familias con caractersticas similares, y por ltimo, diferenciar entre
los gneros de la familia de inters.
Las pruebas bioqumicas consisten en evaluar la reaccin que tiene la cepa en estudio frente a un
determinado sustrato. Es importante destacar que la cepa provenga de un cultivo joven y puro, o
sea, que no est contaminado con microorganismos y que se encuentre en una fase de desarrollo
que presente el metabolismo activo para poder obtener resultados confiables. Para corroborar la
presencia de enterobacterias y confirmar caractersticas generales de la familia se debern realizar
pruebas como: coloracin de gram, oxidasa, catalasa y fermentacin de azcares. Luego, se
contina con la identificacin de enterobacterias en las que se utiliza comnmente un conjunto de
pruebas, denominadas IMViC, que contribuyen a distinguir entre los principales gneros que
componen esta familia. Para una identificacin total se puede recurrir a pruebas bioqumicas
adicionales como la prueba de la oxidasa, motilidad, catalasa, entre otras. En la tabla 4.1 se
presentan las pruebas bioqumicas usadas para identificar algunos de los gneros principales de
enterobacterias.
Tabla 4.1: Pruebas bioqumicas usadas para la identificar algunos de los gneros
principales de enterobacterias (Daz, 1999)

Yersinia

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Proteus

Serranta

Enterobcter

Klebsiella

Shigella

Salmonella

Prueba o Sustrato

Escherichia

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Rojo Metilo
+
+
+
+o+
+
Voges-Proskauer
+o+
+o- +oCitrato
+
+o+
+
+oBeta- lactosidasa
+
+o- +o+
+
+
+
Motilidad
+o+
+
+
+
Indol
+
+o- +oCNK (crecimiento en)
+o+
+
+
+
SH2 (sobre TSI)
+
+o- +oHidrlisis de la urea
+
+
+oFenilalanina desaminasa
+
Lactosa
+
+o- +o- +o+
Sorbitol
+
+
+o+
+
+
+oSacarosa
+o+o+
+
+
+o- +oArabinosa
+
+
+o+
+
+
Gas de la glucosa
+
+
+
+
+
+o+ o : indica que ocurre una variacin entre las especies, siendo positivas la mayora.

El procedimiento para realizar la diferenciacin de enterobacterias consiste en aislar la cepa en

estudio de un medio de cultivo selectivo y mantenindola en estado puro. El medio recomendado
para el desarrollo selectivo y diferencial de enterobacterias es Eosina Azul de Metileno (EMA,
Britania), ya que ofrece las condiciones necesarias para el desarrollo de bacterias gram negativas,
inhibiendo a la poblacin gram positiva, y en el que las colonias toman colores caractersticos para
los diferentes gneros.
Al tomar una colonia de un cultivo primario de un medio selectivo, hay que tener presente que
pueden existir clulas viables que no hayan formado colonias pero encontrarse alrededor de la
colonia de inters. Por ello, se debe de tener especial atencin en que se extraiga el inculo del
centro de una colonia, bien separada de otras colonias. Luego del tiempo de incubacin, de 24
horas, a 35 0,5C, se debe realizar una prueba de Gram, para confirmar la presencia de bacilos
gramnegativos no esporulados.
A partir del cultivo puro se realizan las diferentes pruebas. A continuacin se explica el fundamento,
procedimiento e interpretacin de los resultados de las pruebas: oxidasa, catalasa, movilidad,
fermentacin de azcares, produccin de cido sulfhdrico, fenilalanina, indol, rojo de metilo, voges
proskauer y citrato de sodio.
Prueba de la Oxidasa
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. Los citocromos son protenas
que forman parte de algunas protenas que conforman las cadenas transportadoras de electrones,
propias del metabolismo respirador. Determinar la presencia o ausencia de estas protenas
proporcionar informacin til para la clasificacin de grupos bacterianos. La prueba de la oxidasa
detecta la presencia de citocromo c oxidasa en la bacteria.
Se basa en la capacidad del colorante tetrametil-p-fenilendiamonio de oxidarse al ceder electrones
al citocromo c. Este colorante es incoloro en estado reducido y puede oxidarse rpidamente en
presencia del citocromo c, produciendo formas coloreadas. Por lo general, el sistema
citocromooxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y,
excepcionalmente, en algn microaerfilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de
actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la produccin de catalasa, ya que
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sta degrada el perxido de hidrgeno que se produce como consecuencia de la reduccin del
oxgeno y cuya acumulacin es txica. Las bacterias coliformes, son oxidasa negativas.
La cepa a estudiar para realizar esta prueba puede proceder de medios de cultivo como el agar
nutritivo o el agar de soja trptica. Este ltimo da resultados ms confiables por su ausencia de
carbohidratos.
El reactivo de la oxidasa ms recomendado es la solucin acuosa al 1% de diclorhidrato de
tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs), recin preparada o refrigerada no ms de 1
semana. Esta solucin es menos txica y mucho ms sensible que el correspondiente compuesto
dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod: clorhidrato de dimetil -p- fenilendiamina).
Procedimiento
1. Mtodo en placa directa
Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias desarrolladas en el agar de soja
trptica. No inundar toda la placa y no invertirla.
Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reaccin se produce en unos 1015 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.
Las colonias positivas desarrollan un color rosa, que vira progresivamente a marrn, rojo
oscuro y, por ltimo, negro.
2. Mtodo indirecto sobre papel
Colocar un trozo de papel de filtro (Whatman N1 o equivalente) de 3x3 cm aproximadamente
en una placa de Petri.
Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
Extender con el ansa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. El ansa debe ser de
un material no reactivo, como el platino (los materiales reactivos como el hierro o el alambre,
pueden producir resultados falsos). Tambin puede utilizarse una varilla de vidrio, o un
aplicador de madera o plstico.
La reaccin de color positiva se produce a los 5-10 segundos, desarrollndose un intenso color
prpura.
3. Discos embebidos
Preparar en tubo de hemlisis una suspensin densa del microorganismo en estudio en 0.2 ml
de agua destilada.
Colocar un disco de oxidasa
Dentro de los 30 segundos siguientes se producir un color rosado que se intensificar hacia el
fucsia cuando la reaccin es positiva.
Una reaccin lenta, pasando los 2 minutos, debe considerarse negativa.
Interpretacin de los resultados:
Esta tcnica permite diferenciar el grupo Enterobacteriaceae (que carecen de citocromo c) del
gnero Pseudomonas (que posee citocromo c). Otros resultados son: Vibrio spp. (+) y Aeromonas
spp. (+)
Prueba de la Catalasa
En los ambientes acuosos que contienen oxgeno disuelto, como el citoplasma de las clulas,
aparecen formas txicas derivadas del oxgeno. Las bacterias que viven en ambientes aerobios
necesitan un grupo enzimtico capaz de neutralizar estas formas txicas. Entre estas enzimas se
encuentra la catalasa que convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno molecular.
La prueba de la catalasa es positiva cuando una bacteria posee enzima catalasa, y por ello ante la
presencia de perxido de hidrgeno al 3% produce burbujas de oxgeno.
El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo
aerbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es letal para las
clulas bacterianas. La enzima catalasa transforma el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno de
acuerdo a la siguiente reaccin:
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H2O2 H2O + O2 (burbujas de gas)

Procedimiento
1. Prueba en portaobjetos

Transferir, con ansa, clulas del centro de una colonia bien aislada y joven (24 horas), a la
superficie de un portaobjetos en el que previamente se haya colocado una pequea gota de
agua. Emulsionar bien.

Aadir 1 o 2 gotas de perxido de hidrgeno al 3%. Se recomienda no aadir el organismo al

reactivo, especialmente si se utilizan ansas que contengan hierro, ya que se pueden producir
falsos positivos.
2. Prueba en tubos o en placas

Aadir unas gotas de perxido de hidrgeno al 3% directamente sobre la colonia desarrollada

en la superficie de una placa o tubo con Agar Nutritivo. Tener presente que el cultivo sea puro y
joven.
La rpida aparicin y produccin sostenida de burbujas de gas o efervescencia, indica una prueba
positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa (superxido
disminutasa o peroxidasas) tambin capaces de descomponer el perxido de hidrgeno, la
produccin de burbujas diminutas en poca cantidad, formadas luego de 20 a 30 segundos no se
consideran una prueba catalasa positiva.
Interpretacin de los resultados
La prueba de catalasa permite diferenciar bacterias aerobias o anaerobias facultativos de las
aerotolerantes y anaerobias estrictas. Las enterobacterias y el gnero Pseudomona spp. poseen
enzima catalasa (prueba positiva). Los gneros Streptococcus spp. y Clostridium spp. carecen de
enzimas catalasa (prueba negativa).
Prueba de Motilidad
Las bacterias pueden desplazarse por medio de sus flagelos. Una de las caractersticas de las
enterobacterias es su movilidad. Los flagelos se encuentran principalmente en las formas bacilares,
aunque existen otras formas mviles. El flagelo est constituido por molculas de una subunidad
protenica llamada flagelina. Esta protena es altamente antignica, los denominados antgenos H, y
algunas de las respuestas inmunitarias a la infeccin estn dirigidas contra estas protenas.
Para la determinacin de la presencia de flagelos se utiliza un medio semiblando para que permita
dicho movimiento, el cual se observa como crecimiento difuso.
Agar Nutritivo semislido (0,3 0,5 %)
Extracto de buey
3,0 gr
Peptona
10,0 gr
Cloruro de Sodio
5,0 gr
Agar
4,0 gr
Agua destilada c.s.p
1000 ml
pH final: 7,4
Agar semislido SIM
Triptena
Peptona
Sulfato de hierro y amonio
Tiosulfato de sodio
Agar
Agua destilada c.s.p
pH final: 7,3 0,2

20,0 gr
6,1 gr
0,2 gr
0,2 gr
3,5 gr
1000 ml

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Procedimiento

Inocular por puncin profunda (hasta 5 mm) con aguja. Incubar durante 1-2 das a 35C. Si el
resultado es negativo, incubar durante otros 5 das a 22- 25C.

Un crecimiento difuso a partir del punto de inoculacin se considera como resultado positivo (ver
Fig. 4.1).
Interpretacin de los resultados:
En la tabla 4.1 se indica la movilidad caracterstica de los algunos gneros de la familia
Enterobacterieaceae.
El gnero Pseudomona sp. presenta movilidad positiva.

Fig. 4.1: Cultivo en medio SIM: determinacin de movilidad,

produccin de cido sulfhdrico e indol

Prueba TSI (Triple Sugar Iron)

El agar Triple Azcar Hierro (TSI) es un medio de cultivo diferencial que permite estudiar la
capacidad de produccin de cido y gas a partir del metabolismo de la glucosa, sacarosa y lactosa
en un nico medio. Tambin permite la deteccin de la produccin de H 2S. Es un medio til para la
identificacin de enterobacterias.
El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan 2 cmaras de reaccin
dentro del mismo tubo. La porcin inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxgeno es
aerobia y la porcin inferior (fondo) est protegida del aire y es relativamente anaerobia.
El medio contiene 0,1 % de glucosa, 1 % sacarosa, 1 % de lactosa, sulfato ferroso, extractos
tisulares (sustrato protenico del crecimiento) e indicador de pH (rojo fenol).

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Agar TSI
Extracto de carne
Extracto de levadura
Peptona
Proteosa peptona
Lactosa
Sacarosa
Glucosa
Cloruro de sodio
Sulfato ferroso
Tiosulfato de sodio
Agar
Rojo fenol
Agua destilada c.s.p
pH final: 7,3 0,2

Ao 2014

3,0 gr
3,0 gr
15,0 gr
5,0 gr
10,0 gr
10,0 gr
1,0 gr
5,0 gr
0,2 gr
0,3 gr
12,0 gr
0,024 gr
1000 ml

Procedimiento

Inocular con aguja los tubos con agar TSI, realizando una puncin en profundidad y una estra
en la superficie. Para eso, introducir la aguja hasta 3 - 5 mm del fondo del tubo, al retirarla dejar
una estra sobre el slant (superficie del pico de flauta), sin necesidad de tomar inculo
nuevamente.
Incubar a 35C durante 24 horas.

Observar los colores producidos por la produccin o no de cido tanto en la superficie como en el
fondo del medio. Adems observar la produccin de precipitado negro (produccin de SH2) y
ruptura/desprendimiento del medio (produccin de gases CO2 e H2). En la Fig. 4.2 se ilustran
posibles resultados y su interpretacin.
Interpretacin de los resultados:
En la tabla 4.2 se pueden observar las principales especies de enterobacterias y el comportamiento
al ser cultivadas en este medio. Pseudomona aeruginosa (no enterobacteria) es representativa de
un metabolismo respiratorio, dando negativa la prueba de fermentacin de azcares.
-

Fermentacin de la glucosa: viraje a color amarillo en el fondo del slant. Si la bacteria fermenta
slo la glucosa, la superficie del slant la utilizar por va respiratoria y, donde la tensin de
oxgeno disminuya lo suficiente, emplear una pequea proporcin por va fermentativa. Esto
generar una pequea cantidad de cidos que sern neutralizados por las aminas derivadas de
la descarboxilacin oxidativa de las protenas (proceso que depende del oxgeno). Como
resultado, el medio mantendr su color rojo en la superficie, al no haber cambio de pH. Por el
contrario, las bacterias crecidas en la profundidad del slant emplearn desde el primer momento
la glucosa por va fermentativa, generando cidos que no sern neutralizados, provocndose un
descenso del pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiar a amarillo. Dos gneros que
presentan este comportamiento son Shigella spp. y Salmonella spp.

Fermentacin de la lactosa: viraje a color amarillo en la superficie del slant. Si la bacteria

fermenta la lactosa, los cidos producidos modifican el pH de la superficie del medio. En este
caso las aminas no son capaces de neutralizar la cantidad de cidos producidos en esta
fermentacin, ya que la lactosa se encuentra en el medio a mayor concentracin que la glucosa.
Como consecuencia, el color del medio en la superficie cambiar a amarillo. Un gnero que
presenta este comportamiento es E. coli fermenta la glucosa, la sacarosa y la lactosa, sin
produccin de H2S.

No-fermentacin de los azcares: el slant no cambia de color. Si la bacteria es aerobia estricta

(no fermentadora), el medio permanecer de color rojo. En este caso, los azcares son
respirados, degradndose completamente hasta CO 2, que se elimina y no modifica el pH. El
gnero Pseudomona spp. presenta este comportamiento.

Produccin de gas en la fermentacin: aparicin de burbujas, rotura o elevacin del agar del
fondo del tubo.
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Produccin de cido sulfhdrico: las cepas productoras de sulfhdrico (SH2) se distinguen por la
formacin de un precipitado negro de sulfuro de hidrgeno en el fondo del tubo, a partir del
tiosulfato, por ello el medio debe tener un pH mayor a 7,2. Algunas bacterias con respiracin
anaerobia son capaces de emplear el tiosulfato sdico como aceptor final de electrones en la
cadena transportadora. Como consecuencia, este compuesto se reduce a cido sulfhdrico, que,
2+
a su vez, reacciona con el hierro (Fe ) presente en el medio formando un precipitado negro de
2+
3+
sulfuro de hierro. Los iones Fe proceden de los iones Fe del citrato frrico y aparecen debido
a los cambios en los potenciales redox producidos al someter al autoclave el medio de cultivo.

Fig. 4.2: Cultivo en agar TSI: fermentacin de glucosa, lactosa y sacarosa,

produccin de gas y de sulfhdrico.
Tabla 4.2 : Interpretacin de los resultados en prueba TSI
Respuesta esperada
Fondo
Superficie SH2
Enterobacter aerogenes
AG
A
Escherichia coli
AG
A
Proteus vulgaris
AG
A
+
Shigella sonnei
A
NC o K
Salmonella typhimurium
A
K
+
Salmonella enteritidis
AG
K
+
Pseudomonas aeruginosa
K
K
AG: cido con gas (amarillo); A: cido (amarillo); K: alcalina (rojo)
Especies

Prueba de la Fenilalanina
Esta prueba es aplicada para determinar la capacidad de un microorganismo para desaminar la
fenilalanina a cido fenilpirvico por va enzimtica. El aminocido aromtico, fenilalanina, es
desaminado mediante un mecanismo oxidativo por una aminocido oxidasa, la enzima fenilalanina
desaminasa. La accin de la misma elimina un grupo amino (NH2) del aminocido, liberndolo en
forma de amonaco (NH3) y dejando un enlace doble -cetocido.
Para poner en evidencia este tipo de metabolismo se utiliza el agar fenilalanina, rico en este
aminocido. El agar se prepara en forma de pico de flauta. La presencia del cido fenilpirvico,
producido luego de la incubacin, se demuestra con el agregado de cloruro frrico en medio cido,
3+
el cual se forma un quelato de color verdoso entre el cido fenil pirvico y los iones Fe .

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Agar Fenialanina
DL-Fenilalanina
Extracto de levadura
Cloruro de Sodio
Fosfato disdico
Agar
Agua destilada c.s.p
pH final: 7,3 0,2
Reactivo Cloruro Frrico al 10 %
Cloruro frrico FeCl3
HCl concentrado
Agua destilada c.s.p

Ao 2014

2,0 gr
3,0 gr
5,0 gr
1,0 gr
12,0 gr
1000 ml

12,0 gr
2,5 ml
100 ml

Procedimiento

Sembrar en agar pico de flauta con abundante inculo, estriando en la superficie del slant (pico
de flauta).
Incubar 18 horas a 35 C.
Revelar con 0,2 ml de la solucin de cloruro frrico (FeCl3) al 10 %, inundando toda la estra de
desarrollo.

La lectura del resultado debe realizarse dentro de los 5 minutos de aadida la solucin de FeCl3,
para evitar la interpretacin de falsos positivos. La produccin de cido fenilpirvico, prueba positiva,
se evidencia por el desarrollo de un color verde oscuro en el slant al aadir la solucin.
Interpretacin de resultados:
La presencia de la enzima fenilalanina desaminasa es caracterstica del gnero Morganella morganii
biogrupo 1 y 2, Proteus spp. y Providencia spp., de la mayora de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae.

Pruebas IMViC
Prueba del Indol
El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias
que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con
produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica
importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos.
La enzima triptofanasa presentes en las bacterias degrada el aminocido triptfano a indol, que es
el compuesto que se detecta en este ensayo.
Si la bacteria posee esta enzima, ante la presencia del aminocido triptfano en el medio de cultivo
producir indol. De ser as, al aadir al medio el reactivo de Kovacs o el de Ehrlich, se producir un
anillo de color rojo en la superficie del caldo. Esto se debe a que el indol reacciona con el grupo
aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo, principio activo de ambos reactivos. De producirse el
anillo rojo en la superficie del caldo la prueba ser considerada positiva (ver Fig.4.1). La prueba es
considerada negativa, no hubo produccin de indol, cuando el anillo es color amarillo. Un color
naranja indica probable presencia de escatol, un producto de la degradacin del indol. El medio de
cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

Reactivo de Kovacs
Alcohol amlico o isoamlico
p-metilaminobenzaldehdo
HCl concentrado

75 ml
5,0 gr
5 ml

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Reactivo de Ehrlich
Etanol absoluto
p-dimetilaminobenzaldehdo
HCl concentrado
Caldo Triptfano
Digestato trptico de casena
L-triptofano
Cloruro de sodio
Agua destilada c.s.p
pH final: 7,5 0,1

Ao 2014

190 ml
2,0 gr
40 ml

10,0 gr
1,0 gr
5,0 gr
1000 ml

Procedimiento
1. Con caldo triptfano

Inocular con ansa una porcin de cultivo puro en 5 ml de medio de cultivo. Incubar a 35 0,5C
durante 24 2 horas.

Aadir 0,2 - 0,3 ml del reactivo y agtese.

Reposar 10 minutos y observar los resultados.

2. Con medio SIM

Sembrar por puncin profunda con aguja de inoculacin recta una porcin de cultivo puro e
incubar a 35C durante 24 horas.

Aadir 0,2 - 0,3 ml del reactivo y agtese.

Reposar 10 minutos y observar los resultados.

Interpretacin de los resultados: ver Tabla 4.2
Gneros con enzima triptofanasa: Edwarsiella (+), Escherichia coli (+)
Gneros sin enzima triptofanasa: Klebsiella pneumoneae (-), Salmonella (-), Enterobacter (-)

Prueba del Rojo de Metilo

Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de
enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan
por la fermentacin de la glucosa. Se conocen 2 tipos principales:
La fermentacin cido-mixta
La fermentacin del 2,3 butanodiol
En la fermentacin cido-mixta se forman, fundamentalmente: cido lctico, actico y succnico,
etanol, H2 y CO2. En la va del 2,3 butanodiol se forma: alcohol butanodiol, etanol, H2 y CO2 y
pequeas cantidades de cido (acetato y succinato).
En la prueba Rojo de Metilo tiene importancia el pH terminal, es decir, se evala la produccin de
cido a partir de la glucosa (fermentacin cido-mixta). El rojo de metilo es el indicador de pH
utilizado para determinar la acidez, tiene un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo).
El medio de cultivo utilizado es el caldo Clark y Lubs o el caldo RM/VP. Debido a que los productos
de desecho que se evalan estn en bajas concentraciones, se aconseja fraccionar el medio en
tubos pequeos con 2 ml de medio de cultivo.
Caldo RM/VP
Peptona
Glucosa
Fosfato de hidrgeno dipotsico (K2HPO4)
Agua destilada c.s.p
pH final: 6,9 0,2

5,0 gr
5,0 gr
5,0 gr
1000 ml

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Solucin indicadora Rojo de Metilo
Rojo de metilo
Etanol 95%
Agua destilada c.s.p
pH final: 6,9 0,2

Ao 2014

0,1 gr
300 ml
500 ml

Procedimiento

Inocular el caldo RM/VP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismo en

estudio
Incubar a 35C durante 5 das
Agregar una gota de la solucin indicadora Rojo de Metilo

Interpretacin de los resultados:

Los resultados positivos son aquellos que han producido aparicin de un color rojo, mientras que un
color amarillo constituye un resultado negativo. Los matices intermedios son resultados
cuestionables, que indican posiblemente una purificacin incompleta del cultivo (ver Fig. 4.3).
La fermentacin cido-mixta la realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son
cidos orgnicos (cidos frmico, actico, lctico y succnico) que provocan un fuerte descenso del
pH inicial del medio. Enterobacter aerogenes y Klebsiella pneumoniae son negativos.

Fig. 4.3: Prueba de Rojo de Metilo

Prueba de Voges- Proskauer
En la prueba de Voges-Proskauer se determina la va de fermentacin del 2,3 butanodiol (butilngliclica), un metabolismo propio de determinadas bacterias coliformes. El acetil-metil-carbinol
(acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino, y en
presencia de oxgeno, la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela mediante la reaccin del
diacetilo con -naftol, originando dicha mezcla un color rojo-fucsia.

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El medio de cultivo utilizado es el caldo Clark y Lubs o el caldo RM/VP, con las mismas
especificaciones realizadas para la prueba Rojo de Metilo respecto al volumen de cultivo. El reactivo
es una solucin de -naftol ms hidrxido de potasio.
Solucin de -Naftol
alfa-naftol purificado
5 gr
alcohol etlico absoluto
100 ml
Esta solucin, conservada a 5-10C, se mantiene
estable durante 2 semanas
Solucin de Hidrxido de Potasio
KOH
40 gr
Agua destilada
100 ml

Procedimiento

Inocular el caldo RM/VP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismo en

estudio
Incubar a 35C durante 48 hs.
Transferir 1 ml del caldo RM/VP con el desarrollo microbiano a un tubo limpio y agregar 0,6 ml
de solucin de naftol y 0,2 ml de la de KOH.
Leer el resultado antes de los 5 minutos de haber agregado las soluciones.

El resultado positivo viene dado por la aparicin a los minutos de un color rosa a carmes (ver Fig.
4.4).
Interpretacin de los resultados
La fermentacin butiln-gliclica la realizan las bacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter. Esta
prueba es negativa para Escherichia coli.

Fig. 4.4: Prueba Voges-Poskauer

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Prueba del Citrato de Sodio

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de
carbono y energa. Uno de los medios utilizados puede ser el agar Citrato de Simmons, el cual
contiene citrato de sodio como nica fuente de carbono, fosfato monoamnico como nica fuente de
fosfato en su metabolismo y azul de bromotimol como indicador de pH. nicamente las bacterias
capaces de metabolizar el citrato podrn multiplicarse en este medio. El metabolismo del citrato se
realiza, en aquellas bacterias que poseen la enzima citrato permeasa, quien participa en el ciclo del
cido ctrico. El desdoblamiento del citrato da como producto: oxalacetato y piruvato. El piruvato en
medio alcalino, presencia de iones amonio, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como
fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos.
Esta liberacin de iones bsicos generar la fuerte basificacin del medio que ser aparente por un
cambio de color del indicador de pH, de verde a azul. Este aumento de pH se visualiza por la
presencia del azul de bromotimol que vira a color azul a pH alcalino (a partir del pH 7,6).
Esta prueba se puede realizar con agar Citrato de Simmons o con caldo Citrato Koser.
Caldo Citrato de Koser
Fosfato de hidrgeno amonio sodio (NaNH4HPO4.H2O) 1,5 g
Fosfato de hidrgeno dipotsico
1,0 g
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)
0,2 g
Citrato de sodio dihidratado (en cristales)
3,0 g
Agua destilada c.s.p
1000 ml
pH 6,7 0,2
El medio preparado es incoloro, transparente y sin precipitaciones.
Agar Citrato de Simmons
Fosfato de hidrgeno amonio (NH4H2PO4 . H2O)
Fosfato de hidrgeno dipotsico
Cloruro de sodio
Citrato de sodio dihidratado
Sulfato de magnesio heptahidratado
Agar
Azul de bromotimol
Agua destilada c.s.p
pH 6,7 0,2
El medio preparado es color verde.

1,0 g
1,0 g
5,0 g
2,0 g
0,2 g
15,0 g
0,08 g
1000 ml

Procedimiento
1. Con caldo Citrato Koser

Inocular ligeramente con la cepa aislada y joven el medio lquido con aguja.
Incubar a 35 0,5C durante 72-96 horas

El resultado positivo se evidencia por un crecimiento variable con desarrollo de turbidez en el caldo
mientras que un resultado negativo implica la ausencia de crecimiento (ver Fig. 4.5).
2. Con agar Citrato de Simmons

Inocular el agar inclinado en el slant (pico) con una sola estra. Utilizar un cultivo de 24 horas en
un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos
positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo
Incubar a 35 0,5C durante 48 horas

La reaccin positiva se evidencia por desarrollo de la cepa a lo largo de la estra acompaado de un

color azul en el medio de cultivo. El resultado negativo consiste en la ausencia de crecimiento
manteniendo el color verde del medio (ver Fig. 4.6).
Interpretacin de los resultados
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Dentro de la familia Enterobacteriaceae esta capacidad de usar el citrato la tienen los siguientes
gneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin
embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer
con esos nutrientes.

Fig. 4.5: Prueba de Citrato con caldo

Citrato Koser con reaccin positiva

Fig. 4.6: Prueba de Citrato con agar

Citrato Simmons con reaccin positiva

Adems de los mtodos de identificaciones tradicionales existen otras alternativas para recurrir a la
identificacin de microorganismos, entre los que se encuentran: los sistemas de pruebas mltiples y
tcnicas biologa molecular.
Los sistemas de pruebas mltiples son alternativas tiles y econmicas, ya que se adquieren kit
comerciales que permiten realizar varias pruebas en simultneo con menor tiempo de incubacin, lo
que se traduce en mayor agilidad para obtener resultados. En la tabla 4,3 se presentan algunas de
las opciones de kit de identificacin que actualmente existen en el mercado.
Tabla 4.3 : Sistemas de pruebas mltiples
Nombre del sistema
API

Descripcin
Veinte microcpsulas en una tarjeta pueden proporcionar 21 resultados

Enterotube

Cilindro de plstico que contienen 12 compartimentos llenos de medio.

Se inoculan secuencialmente todos los compartimentos con una sola
aguja y se obtienen 15 resultados

Inolex Enteric 1&2

Micromtodo con 10 unidades capilares en una tarjeta. Dos tarjetas

distintas permiten obtener 20 resultados

Microlab ID

Micromtodo que permite 15 resultados en cuatro pasos.

Minitek

Discos impregnados de reactivo, colocados mecnicamente en

pequeos pocillos. 34 discos proporcionan 36 resultados

Por otro lado, se encuentra la identificacin de microorganismos por mtodos moleculares, un

campo en verdadero auge en la actualidad. La Microbiologa ha evolucionado en las ltimas
dcadas con el avance en el desarrollo de la Biologa Molecular, contribuyendo en la generacin de
nuevas tcnicas para diagnstico molecular, identificacin y tipificacin de bacterias, hongos, virus y
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parsitos, estudios epidemiolgicos, deteccin de factores de virulencia y deteccin de resistencia a

antimicrobianos. Dentro de las tcnicas moleculares para la identificacin de bacterias se
encuentran: amplificacin de cidos nucleco, secuenciacin y tipificacin del cido nucleco, ya sea
ADN o ARN.
La eleccin de la metodologa de identificacin de microorganismos ms adecuada depende de
diversos factores. Para obtener resultados vlidos y estandarizados, se deber seleccionar aquellas
pruebas que ofrezcan practicidad, claridad en la interpretacin, reproducibilidad de resultados y que
pueda ser asumida con los costos disponibles.

Bibliografa
American Public Health Association (APHA), American Water Works Association & Water Pollution
Control Federation. 1992. Standard Methods for the examination of Water and Wastewater.. APHA,
Washington, D.C.USA. Part 9000.
Daz, R.,Gamazo C., Lpez-Goi, I.. 1999. Manual Prctico de Microbiologa. Cap. 17: Pruebas
bioqumicas para identificacin bacteriana. 2 Ed. Editorial Masson S.A. Barcelona, Espaa. 61 pp.
Merino, L., Giusiano G. 2011. Manual de tcnicas moleculares para estudios microbiolgicos.
Asociacin Argentina de Microbiologa. Buenos Aires, Argentina. 100 pp.

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