Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Laboratorio Bioqumica General
Grupo: 3FM1
Seccin: 1
Reyes Castaeda Jean

Introduccin.

La determinacin de la estructura primaria de una

protena suele denominarse secuenciacin. Existen varias
maneras de determinar la secuencia de aminocidos, el
primero en lograr esto fue Frederick Sanger, quien diseo
un mtodo capaz de determinar la secuencia de los
aminocidos en una protena, el cual consiste en el
marcaje del amino terminal a travs del uso del 1-Fluoro2,4-Dinitrobenceno (DNFB). Este compuesto qumico color
amarillo reacciona con los grupos amino libres en
condiciones ligeramente bsicas, formando los dinitrofenil
derivados (DNP-aa), tambin reaccionara con los grupos
imidazol, fenlicos y epsilon amino; por lo que se dar
una dinitrofenilacin en la cadena lateral de la Tirosina,
Histidina y Lisina.
Al hidrolizar el pptido o la protena ya dinitrofenilada, se
da una ruptura total de los enlaces peptdicos, lo que nos
da como resultado un hidrolizado que contendr
aminocidos libres y DNP derivados que se conservan
intactos, ya que su enlace es ms difcil de romper.
Los DNP de aminocidos terminales, a diferencia de los
dems DNP y de los aminocidos libres, son no polares
por lo que se pueden extraer muy fcilmente con un
disolvente
no
polar.
Estos DNP de aminos terminales son sometidos a una
cromatografa en capa fina o en papel Whatman; por lo
que se determina por comparacin con otros DNP
derivados de aminocidos, al amino terminal de la
protena.

Objetivo.

Identificar a
travs del
mtodo de
Sanger los
aminocidos que
contienen grupo
alfa-amino
terminal de las
cadenas de la
molcula de
hemoglobina.

dm
29
26
29
32
18
24
17
28

Dfm
44
44
44
44
44
44
44
44

Rf
0.65
0.59
0.65
0.72
0.40
.54
0.38
0.63

Al observar nuestra cromatografa realizada, podemos

apreciar claramente la formacin de unas manchas de
color amarillo que se localizaban a distintas longitudes,
esto se debe a que la cromatografa es un proceso por el
cual se separan los componentes de un compuesto y por
medio de muestras patrn comparar y observar que
componentes haba en nuestra muestra. En el caso de la
determinacin del amino terminal, usamos muestras de
aminos dinitrofenilados ya conocidos y las dejamos correr
en el cromatograma junto a nuestro problema.
Al comparar los Rf obtenidos en la muestra, con los de los
aminos dinitrofenilados, vemos que varan estos valores
en centsimas, por lo que podemos considerar esta
variacin como errores humanos, los cuales se pueden
deber a un mal marcaje del frente del solvente o al
marcar el centro de la mancha.
obtendremos el dinitrofenil (aportando el color amarillo)
del primer aminocido de la secuencia, elNH 2 terminal
(DNPaa), ms el resto de los aminocidos. Los resultados
que arroj el Cromatograma es una aproximacin mayor
de la mancha DNP P1 con el RF DNP Val, ms que
cualquier
otra
sustancia;
matemticamente
se
comprueba que el Derivado de Valina se acerc ms.

Conclusin.

En esta prctica se aprendi a utilizar el mtodo de

Sanger para la determinacin de aminocidos terminales
con el grupo alfa-amino libre. La protena usada para
este procedimiento fue la hemoglobina.

Resultados.
Imagen.-Cromatografa
papel.

DNP-Valina
DNP-Alanina
DNP-Acido Asp.
DNP-cido Glutmico
DNFB
DNP-Fenilalanina
Problema 1
Problema 2
Discusin de resultados

en

Para llevar a cabo la determinacin del aminocido Nterminal se pas por 4 etapas: 1.Dinitrofenilacion del
aminocido N-terminal de la protena, 2. Eliminacin del
DNFB que no reacciono, 3. Hidrolisis de la NDP-protena y
4. Identificacin del residuo N- terminal por cromatografa
en papel.
En base a nuestros resultados finales en los Rf obtuvimos
que el aminocido terminal de la hemoglobina es la
alanina lo que nos da a entender que nuestra hidrolisis no
fue completa ya que el aminocido terminal reportado en
la literatura es la valina.

Rf =

distancia recorrida de la muestra ( dm )

distanciarecorrida del solvente ( dfm )

Tabla.--- Comparacin de los Rf`s de los aminocidos en

el cromatograma.

Bibliografa
Mathews, C. K.; Van Holde, K. E.; Ahern, K. G.
Bioqumica. Tercera Edicin. Editorial Pearson Prentice
Hall pp. 173-176 (2009)

Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas
Laboratorio Bioqumica General
Grupo: 3FM1
Seccin: 1
Reyes Castaeda Jean
Voet Judith; W. Pratt Charlotte Fundamentos de
bioqumica. Edit. medica Panamericana, 2da edicin,

Buenos Aires, Argentina 2009, pg. 109 y 11