INFORME DE GENTICA Y BIOLOGA MOLECULAR

Alejandra vera; Allen catalina Snchez; Deisy Hernndez

Universidad de pamplona; faculta de ciencias bsicas; departamento de
microbiologa
Flujograma del procedimiento de extraccin de ADN

OBTENCIN DE UNA SOLUCIN

DE ADN
Se prepar un capilar con ayuda del mechero de bunsen sellando uno de los extremos del
capilar (pipeta Pasteur) doblando la punta tratando de hacer un gancho.

Se tom 3 ml de sangre en un tubo Falcn y se le aadi 9 ml de la solucin CLS (cell

lysis solution) del kit de promega, se mezcl invirtiendo el tubo unas cuantas veces, se
coloc a bao serolgico a una temperatura de 60C 5min y luego se dej a
temperatura ambiente durante 10min. Se pas a centrifugar en una ultracentrifugadora
cuntica en su mximo rpm por 10min se pudo observar la formacin del pellet
eliminado el sobrenadante (sangre).

Se tom el pellet y se re suspendi en 2.500 l de solucin solucin

salina EDTA (SSE) y se agit vigorosamente en el vortex.
Modificacin
Seguidamente se le adicion 2500 l de NaCL 4M y 500 l de SDS al 10% la cual fue sometido a
una temperatura de 60C durante 6 min hasta que alcanzo un cambio en la viscosidad, se someti
a enfriamiento en hielo por 10min.
Se le adicion 1250 l de isoproopanol de manera suave sobre las paredes del tubo formndose una
sobre capa, en este punto se manifiesta la formacin de una interfase, se introdujo en el tubo la
pipeta Pasteur y se gir para recoger el precipitado que se encontraba en la interfase
as

Una vez recogido la mayor cantidad posible del precipitado blanco se traslad el capilar
utilizando un micro tubo dejndolo drenar, luego de esto se traslad el capilar a un tubo de
microcentrifuga que contena 500 l de etanol al 70% enjugando durante 5min.

Seguidamente se pas el ADN (que estaba en el capilar) a otro micro tubo que contena 250 l de
etanol absoluto.

Luego de dos minutos de enjuague se retir el capilar y se dren el exceso de lquido se dej secar por
7 minutos, pasado el tiempo se localiz el capilar con el ADN en un tubo que contena una solucin
600 l de buffer TE (tubo 1) por 5 minutos. Logrando disolver el ADN con muy suave Agitacin. Se
observ la dispersin del ADN libremente.

El resto de volumen de la interfase encontrado de apariencia viscosa el cual

fue de (300 l) se traslad a un micro tubo (tubo2)

PURIFICACION
Se tom los tubos 1 y 2 y se les agreg un volumen de fenol saturado, posterior a esto se centrifug a
la mxima capacidad de la microcentrifuga y se observ la separacin de las fases, una acuosa y una
orgnica y la interfase que en el caso del tubo 2 no hubo separacin.

Con ayuda de una micropipeta se retir la fase acuosa (capa

superior) del tubo 1 a un nuevo tubo eppendorf obteniendo 600
l.
Se adicion a la fase acuosa un volumen de mezcla de fenol cloroformoisoamilico es decir 600 l y se mezcl durante 5 min. Luego se llev a
centrifugacin durante a mxima rpm durante 5 min. Observando las fases.

Posterior a la centrifugacin con ayuda de una micropipeta se retir del tubo 1 de la fase acuosa
450 l y se le adicion un volumen de cloroformo isoamilico es decir 450 l los cuales se
mezclaron y se llev a centrifugacin a mxima rpm durante 5 min.

PRECIPITACIN

Trascurrido el tiempo de centrifugacin se observ sobrenadante pero el pellet de AND no se observ

intuyendo que se encontraba en el cimiento del tubo se procedi a eliminar el sobrenadante.
Modificacin

Al final del proceso de extraccin se obtuvo 400 L de la fase acuosa (AND) y se mezclaron con
1000 L de etanol absoluto, y 40 l de acetato de sodio 3M, se mezcl, se ubic en hielo
durante 5 min y luego se centrifugo durante 11 min a mxima rpm.

Para lavar el ADN, al tubo donde quedo el pellet de ADN se adicion 500 L de
etanol al 70 % a temperatura ambiente, se agit en un vortex, se centrifugo
por 5 min a mxima rpm.

Se elimin el sobrenadante y se dej el tubo durante 10 min de

manera invertida para retirar el exceso de alcohol. Observando
de manera diminuta un trozo de material considerando que
fuese ADN dentro del tubo.

Despus de observar seco el tubo se disolvi el pellet en 50 L de buffer TE, rotulado

correctamente.

Anlisis de resultados

La tcnica de extraccin de cidos nucleicos en eucariotas, est relacionada con su

ubicacin en el ncleo celular y las propiedades fsicas y qumicas de todas las
biomolculas celulares.
La sangre contiene una serie de compuestos como protenas, lpidos, glbulos blancos,
glbulos rojos, plaquetas y plasma que pueden contaminar el ADN. El contaminante
principal del ADN en muestra de sangre es hemo, el componente no proteico de la
hemoglobina.
La mezcla homognea entre sangre y la solucin de lisis celular (CLS) como su nombre lo
indica produce la lisis de los glbulos rojos, solubilizando las membranas nucleares y
facilitando la liberacin de los cidos nucleicos, causando posteriormente la lisis en los
ncleos de los glbulos blancos para poder extraer el ADN ubicado en ellos.
Al re suspender el pellet en la solucin salina-EDTA(SSE) siendo una sustancia inhibidora
de la accin de las DNAsas se busc proteger a los cidos nucleicos de la accin de
estas enzimas sin poder observar este hecho a simple vista. Luego al adicionar la
solucin de lisis que contiene el detergente inico dodecil sulfato de sodio (SDS), se
observ una viscosidad siendo esta el producto de la dispersin de las lipoprotenas de
las membranas y desnaturalizacin de complejos protenicos, las sales de la solucin de
lisis, neutralizan las cargas negativas iniciando la precipitacin de los cidos nucleicos.
El resultado de la centrifugacin de la muestra obtenida, logr separar una fase slida
(pellet) restos de clulas, protenas, lpidos, de una fase acuosa (sobrenadante), que
contiene cidos nucleicos, hidrfilos y solubles en agua debido a sus grupos fosfato.
Con la adicin de isopropanol y con la formacin de una sobre capa se manifest la
interfase siendo deshidratacin y total precipitacin de los cidos nucleicos insolubles en
alcohol, ubicndose los cidos nucleicos en la interfase agua-alcohol.
Una vez lisadas las clulas un paso muy importante fue la concentracin del ADN (por
precipitacin con alcoholes), lavado (para eliminar restos de reactivos y solventes que
puedan inhibir la taq polimerasa) lo cual se logr usando etanol al 70 % siendo un
desnaturalizador activo de protenas y causando su precipitacin se confirma su accin
en el momento en el que se adicion fenol absoluto el cual despus de desproteinizar,
precipit los cidos nucleicos.
Seguidamente con la adicin de la solucin fenol-isopropanol se constat que el fenol
es quien diluye las protenas (el cloroformo diluye a su vez el fenol) por ser hidrfobas.
Como los cidos nucleicos por su contenido en fosfato, son hidrfilos se diluyen en la
fase acuosa separndose en la otra fase las protenas. Al trasferir la fase acuosa a otro
tubo y mezclar con etanol absoluto se produjo un precipitado blanquecino (cido nucleico)
siendo extrado con la micropipeta, previamente drenado y secado se coloc en una
solucin buffer TE buscando obtener la dispersin total del ADN lo cual se logr
satisfactoriamente.

El restante de volumen de la interfase encontrado de apariencia viscosa el cual fue

trasladado a un micro tubo (tubo2) se le realizo el mismo procedimiento que al micro tubo
que contiene el ADN y la solucin buffer Te, seguidamente mencionado.
Para la purificacin del ADN se tom los tubos y al agregarles un volumen de fenol
saturado y posterior a esto se centrifug observando la separacin de las fases, una
orgnica (ARN), una acuosa que es donde se encuentran los cidos nucleicos y la
interfase que seran las protenas (esta ltima se encuentra entre la fase orgnica y la
acuosa que en el caso del tubo 2 respectivamente no se observ separacin lo que
puede haber sido que solo se encuentran protenas y no ADN ya que este volumen hacia
parte de la interfase.
Despus de la separacin delas fases observadas al final de la centrifugacin se adicion
una mezcla de fenol cloroformo-isoamilico actuando de manera que el fenol como se
mencion anteriormente desproteiniza, el cloroformo desnaturaliza las protenas y el
isoamilico reduce la espuma, ayudando a la separacin y manteniendo las capas
separadas por la centrifugacin. Es nuevo se adicion una mezcla en este caso
cloroformo isoamilico buscando que con este tratamiento se remuevan todos los residuos
de fenol.
Como el pH puede influir y ser influido por un nmero de factores celulares, mantener un
pH estable es esencial para la extraccin del ADN. Como paso final se recuperan los
cidos nucleicos de la interfase, por centrifugacin y posterior deshidratacin se liberan
del agua y del alcohol y se disolvi el pellet que posiblemente se encontraba en el micro
tubo y se suspendi en una solucin buffer TE siendo importante porque puede mantener
un pH.